CN103397017B - 膜片钳实验内面向外式膜片形成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞膜片钳实验中内面向外式膜片的构建方法，该方法包括，按照常规技术手段进行内面向外式膜片钳实验，当电流记录过程中检测到的电流信号减小或消失时，将电极从浴液中提起暴露于空气中，用恒定压强、流速均匀的气流，对准电极尖端吹气，吹气完成后，将电极放入浴液中，此时囊泡消除，内面向外式膜片形成。本发明方法简单方便，能快速有效的使电极尖端形成的囊泡破裂并形成单层膜片，特别适用于膜片钳技术内面向外式构型形成中容易产生囊泡及囊泡结构稳定、不易破裂的状况，可克服内面向外式膜片钳实验中电极尖端易形成囊泡的缺陷，提高实验成功率。

Description

膜片钳实验内面向外式膜片形成方法

技术领域

本发明涉及一种细胞膜片钳实验的改进方法，特别涉及一种膜片钳的内面向外式膜片形成的方法，属于生物细胞实验领域。

背景技术

内面向外式，即inside-out模式，是膜片钳实验中很重要和常用的方式，在这种构型下，细胞膜的内侧面暴露于实验浴液中，通过置换浴液或直接在浴液中加入测试物质，可以较易改变细胞内侧的离子或物质浓度，也能把酶或药物等直接加入膜的内侧面，是研究调控物质对通道内口的作用以及胞内调控物质对单通道电流特性影响的必须手段。

在形成细胞膜内面向外式构型的过程中，先用微管玻璃电极与细胞膜接触，经负压抽吸形成高阻封接，然后提起电极，将电极尖端钳制的细胞膜从细胞上撕脱下来，由于细胞膜的流动性，电极尖端游离的细胞膜残片自发融合在一起，形成细胞膜囊泡。浴液中的各种离子对囊泡的稳定性有很大的影响，其中Ca²⁺与蛋黄卵磷脂头基有很强的结合能力，浴液中Ca²⁺的存在可以使细胞膜磷脂双层之间作用力的平衡状态发生改变，进而改变磷脂双分子层中疏水链的排列，使膜增厚、刚性增强，囊泡结构更稳定。因此，在常规技术方案中，往往需要将电极提出液面，短暂暴露在空气中，使囊泡破裂才能形成内面向外式构型，再放入浴液中进行测试。

然而，当使用高钙溶液时，由于钙离子浓度的升高，组成囊泡的磷脂双分子层的稳定性随之增强，主要表现在以下几个方面：

一方面，Ca²⁺与蛋黄卵磷脂头基有很强的结合能力，浴液中Ca²⁺的增高可以使细胞膜磷脂双层之间作用力的平衡状态发生改变；另一方面，由于高浓度溶液的静电屏蔽作用，膜表面电荷的相互作用势减小，结果使相互作用斥力也随之减小；再一方面，由于离子浓度的升高，使磷脂分子相互之间绑定地更加紧致。此外，随着离子浓度的增加，使极性亲水端的相互作用不断减弱，同时，疏水链之间的相互作用能不断增加，即斥力减弱，引力增强，两者共同作用使磷脂双层膜趋于更加稳定，囊泡结构更加牢固，不易破裂。

在传统inside-out模式膜片钳实验中，使用高钙浴液时，电极尖端游离细胞膜残片自发融合形成的囊泡结构更加牢固，稳定性更强，在空气中短暂暴露无法有效的使该囊泡破裂形成单层膜片，或者电极尖端的囊泡在空气中暴露后形成了单层膜片，但稳定性差，浸入高钙浴液后囊泡又再次形成，类似情况都无法进行后续的实验操作。按照现有的常规技术方案，在发生电极尖端囊泡无法有效破裂或反复形成的现象时，实验人员只有被迫终止实验，这严重影响inside-out模式膜片钳实验的成功率及实验效率。因此，如何能够使电极尖端形成单层膜片不仅是inside-out模式膜片钳实验的技术要点和技术难点，更是提高实验成功率和实验效率的关键所在。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中进行inside-out模式膜片钳实验时玻璃微电极尖端游离细胞膜会自动融合形成囊泡，并且经过常规方案处理后仍不能使囊泡破裂形成单层膜片的缺陷，提供一种快速有效消除囊泡，形成内面向外式膜片的实验方法。本发明的方法能保证后续实验能够顺利进行，显著提高了膜片钳实验的成功率。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种膜片钳实验内面向外式膜片形成方法，用常规技术手段进行内面向外式膜片钳实验，在实验过程中，当电流记录过程中检测到的电流信号减小或消失时，表明电极尖端游离细胞膜融合形成了囊泡，将电极从浴液中提起暴露于空气中，直接对电极尖端的游离细胞膜融合形成的细胞膜囊泡吹气，使该细胞膜囊泡破裂，将电极放入浴液中，内面向外式膜片形成。

上述膜片钳实验内面向外式膜片形成方法中，所述电极尖端游离细胞膜融合形成的囊泡，可以是实验过程中电极尖端钳制的细胞膜从细胞上撕脱后首次形成的囊泡；也可以是经过常规空气中短暂暴露处理后形成的内面向外式膜片在浴液中又再次融合形成的囊泡。

上述膜片钳实验内面向外式膜片形成方法中，对细胞膜囊泡吹气的气压强度，最好为0.3～0.5mbar；吹气时间最好为0.5～1.5秒。

进一步，所述吹气过程是在距离电极尖端20-30cm处，使用脚踏式充气筒吹气，气流压强为0.3～0.5mbar，吹气持续时间为0.5～1.5秒。

进一步，所述吹气过程是在距离电极尖端20-30cm处，用微型电动空气泵吹气，气流压强为0.3～0.5mbar，吹气持续时间为0.5～1.5秒。吹气完成后，电极尖端的细胞膜囊泡破裂，将电极放入浴液中，内面向外式膜片再次形成。

吹气过程中，吹气强度要适宜。使用脚踏式充气筒、微型电动空气泵或其他方式吹气都要保持气流速度均匀，气流强度适宜，最好的压强0.3～0.5mbar，吹气强度大于0.5mbar容易破坏细胞膜与电极间的高阻封接甚至使细胞膜脱落，气流强度小于0.3mbar又难以使囊泡破裂。

吹气过程中，吹气时间要适宜。吹气时间应保持在合适的范围，最好保持在0.5～1.5秒，时间过长可能导致电极尖端液体蒸发过度，损坏电极与细胞膜间的高阻封接，甚至使细胞膜干裂脱落。吹气时间较短可能造成细胞膜囊泡破裂效果不理想甚至无法破裂。

吹气过程中，吹气方向要适宜。优选气流与电极轴向成一夹角的方向经过，最好从垂直于电极轴向的方向经过，与电极尖端开口平面平行。电极与细胞膜形成高阻封接后，由于电极负压吸引的作用，电极尖端处的细胞膜大部分向电极内凹陷，同时在电极尖端仍然有未向电极内凹陷的游离细胞膜残片，在细胞膜磷脂双分子层亲水基团、疏水基团相互作用力及细胞膜流动性的作用下，电极尖端游离的细胞膜残片自动融合到一起，形成中间包含液体的囊泡结构。气流与电极轴向成一夹角（夹角大于15°，小于等于165°），特别是从垂直于电极轴向的方向经过，与电极尖端开口平面平行，电极尖端的游离细胞膜残片在气流中被有效的分割成较小膜片并可能脱落，而由于负压作用，待测试的细胞膜都凹向电极内部，不会受到气流的破坏。因此，电极与细胞膜的高阻封接不受影响。

所述常规技术手段进行inside-out膜片钳实验包括，（1）用微管玻璃电极与细胞膜接触，经负压抽吸形成高阻封接；（2）提起电极，将电极尖端钳制的细胞膜从细胞上撕脱下来，形成内面向外式构型膜片，将膜片放入浴液中进行测试。所述微管玻璃电极可以是购买的成品微管玻璃电极，也可以使用新拉制的微管电极。用微管玻璃电极与细胞膜接触，经负压抽吸形成高阻封接的具体过程包括：用细塑料管以反向充灌方式灌电极液入电极尖端，若含有气泡，可手持微电极使其尖端朝下，用手指轻弹几下管壁即可排除，然后再将微电极安装在电极夹持器上。用注射器向电极内施加正压（1～2cm水柱），微管电极在微推进器帮助下进入浴液，电极内施予的正压可以防液气表面颗粒堵塞微管电极尖端；调节放大器，补偿液接电位至零。同时由膜片钳放大器向微管电极内发放电压为5mV、波宽40ms的方波脉冲信号，用于观察封接过程。微推进器将微管电极送入到接触细胞时，撤去正压。当电极尖端轻触到细胞表面时其应答电流变小（至1/3～1/2），给微管电极尖端管腔内施加负压（10～20cm水柱），若在计算机屏幕上看到应答电流突然下降至零，电流噪声随之减少，计算机采集软件显示封接阻抗约10～100GΩ时，则提示微管电极尖端与细胞形成近似电绝缘，说明高阻抗封接（Giga seal）形成。这时的膜片为细胞贴附式膜片，图2中20A为典型的电流记录图。借助微推进器拖动电极离开细胞，则电极尖端可拽下一小片细胞膜片，若此时的实验浴液为低钙液，则可将细胞膜内侧（通道内口）暴露于浴液，即细胞膜内面向外式（inside-out）构型形成，图2中30A为典型的电流记录图。

上述实验方法在测试重组表达人体血管平滑肌大电导钙激活钾通道（BKCa）的HEK-293细胞中的应用。

上述实验方法在内面向外膜片钳实验测试急性酶分离的细胞、原代培养的细胞以及成熟的细胞系中的应用。

本发明涉及的方法适用于急性酶分离的细胞、原代培养的细胞以及成熟的细胞系等，如在内面向外式膜片钳实验中遇到类似的囊泡频繁重复形成或囊泡不易破裂形成单层膜片的情况，可使用本发明涉及的改进方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

由于细胞膜的流动性，电极尖端游离的细胞膜残片容易自动融合在一起，形成细胞膜囊泡，特别是当浴液为高钙离子浴液时，细胞膜囊泡结构稳定，采用常规方法难以使囊泡破裂。本发明的方法将电极提出液面暴露在空气中，直接对电极尖端的游离细胞膜融合形成的细胞膜囊泡吹气，使该细胞膜囊泡破裂，将电极放入浴液中，形成内面向外式膜片；也可以将电极提出液面在空气中短暂暴露，当囊泡不能自动破裂或破裂后又再次形成时，再对细胞膜囊泡吹气。该方法操作简单易行，能够快速有效的将细胞膜形成的囊泡破坏并形成单层膜片，避免了将电极长时间或多次暴露在空气中而损坏高阻封接的风险，提升了内面向外式膜片钳技术的成功率和实验效率，与现有常规技术方案相比，实验成功率从45%提高到95%。

附图说明：

图1：传统膜片钳实验常用的4种记录模式图；

图2：本发明的膜片钳实验内面向外式膜片形成图及其典型电流记录图；

图3：图2中电流信号20A；

图4：图2中电流信号30A；

图5：图2中电流信号30B；

图6：图2中电流信号30C；

图7：图2中电流信号30D。

图中标记解释：10-电极尖端与细胞接触并形成低阻封接，20-微管电极尖端管腔内施加负压吸附细胞膜形成高阻封接，30-用微推进器移动电极后，电极尖端从细胞表面拉起了单层细胞膜，40-经过负压脉冲抽吸处理后电极尖端处细胞膜破裂。20A为细胞贴附式记录模式下记录到的电流信号特征图谱，30A为细胞膜在低钙溶液中形成的典型的内面向外式膜片及记录到的电流信号特征图，30B为细胞膜在高钙溶液中，电极尖端细胞膜自动融合形成囊泡及该模式下记录到的电流信号特征图，30C为囊泡破裂形成典型的内面向外式膜片后再次融合形成囊泡的过程及该过程的电流信号特征图，30D为电极尖端的囊泡在空气中经吹气处理后形成内面向外式膜片及在该模式下记录到的内面向外式电流信号特征图。

具体实施方式

以下以重组表达人源血管平滑肌大电导钙激活钾通道（BKCa）的HEK-293细胞为例，详细说明本发明的操作方法和步骤。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

一、液体配制

电极液：D-aspartic acid40mM、KOH40mM、KCl100mM、HEPES10mM、CaCl₂1mM。

低钙浴液：D-aspartic acid100mM、KOH100mM、KCl40mM、HEPES10mM、EGTA1mM、游离Ca²⁺浓度10^-5mM。

高钙浴液：D-aspartic acid100mM、KOH100mM、KCl40mM、HEPES10mM、EGTA1mM、游离Ca²⁺浓度10^-4mM。

所有液体加入10mM Glucose，调节渗透压至284mOSM，调节pH值至7.4，使用前经0.45μm滤膜过滤。

二、细胞准备

本发明用稳定表达大电导钙激活钾通道（BKCa）的HEK293细胞进行测试。在培养皿中放入小片的细胞爬片，将细胞悬液滴在细胞爬片上，放入37℃5%CO₂培养箱中，待细胞贴壁后用于实验。

三、微管电极的制备

采用常规二步法完成，电极尖端直径约1μm，在抛光与涂抹绝缘树脂后，充灌电极液。电极尖端直径大小决定电极尖端阻抗（充灌电极液之后，通常电极尖端阻抗3～5MΩ用于全细胞实验，7～8MΩ用于单通道实验）。

四、高阻抗封接形成

1、在常温或恒温条件下，将细胞贴壁良好的载玻片移入有浴液的浴槽中，在倒置相差显微镜下选择立体感强、活性好的细胞进行实验。

2、使用新拉制的微管电极，用注射器反向充灌，即用拉细的聚乙烯胶管从电极尾部插入到电极尖端，注入溶液。电极液充灌量不超过电极长度的1/3。充灌后用左手夹住电极使其尖端向下，用右手指轻弹电极排出电极尖端的少许气泡，然后再将微电极安装在电极夹持器上。

3、当微管电极在微推进器帮助下进入浴液时，用注射器向电极内施加正压（1～2cm H₂O），以防液气表面颗粒堵塞微管电极尖端；调节放大器上pipetteoffset旋钮，补偿液接电位至零。同时由膜片钳放大器向微管电极内发放电压为5mV、波宽40ms的方波脉冲信号，用于观察封接过程。

4、微推进器将微管电极送入到即将接触细胞时，撤去正压，并继续向选定的细胞表面推进，当电极尖端轻触到细胞表面时其应答电流变小（至1/3～1/2），这时只要给微管电极尖端管腔内施加负压（10～20cm H₂O），若在计算机屏幕上看到应答电流突然下降至零，电流噪声随之减少，则提示微管电极尖端与细胞形成近似电绝缘，其阻抗约10～100GΩ，说明高阻抗封接（giga seal）形成，这时的膜片为细胞贴附式膜片，通过电极给予电极尖端细胞膜电位钳制，即可引出单通道电流，图2中20A为典型的电流记录图（钳制膜电位为+40mV）。表现为通道开关，通道电流随机出现，同一水平的电流幅值一致（如图2中20A中约9pA）的电流特征。

五、传统膜片内面向外式构型的形成

细胞贴附式膜片形成后，借助微推进器拖动电极离开细胞，则电极尖端可拽下一小片细胞膜片，采用低钙液作为实验浴液为低钙液时，将细胞膜内侧（通道内口）暴露于浴液，即膜片钳实验的内面向外式（inside-out）膜片形成，对膜片进行-10～+70mV的电压钳制，表现为通道活动和电流幅度随膜电位增加而增加的现象。根据不同钳制电压下的通道电流幅度值和对应膜电位值构建电流－电压关系曲线(I-V曲线)，并对I-V曲线进行直线回归，可以获得直线斜率即单通道电导值。对20个膜片的通道电流构建I-V曲线获取电导值并作统计学处理获得该通道电导值为229.5±8.1pS，反转电位为-0.11±0.08mV(n=20)。图2中30A为典型的电流记录图。

浴液为高钙浴液时，提起电极，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来后自发融合形成囊泡，图2中30B为该状态下的典型电流记录图。将电极提出液面，在空气中暴露3秒后再次入水，最初囊泡破裂，形成内面向外式膜片，但随后细胞膜又立即再次融合成囊泡，图2中30C为该过程的典型电流记录图。电流幅度从通常的10pA（钳制膜电位为+40mV）逐渐减小至5pA以下，甚至电流完全消失。再一次将电极提出水面在空气中短暂暴露，再放入浴液中进行测试，囊泡结构仍然无法破裂，无法形成内面向外式构型，无法继续测试。

随机选择了结构典型、形态完整、折光性好的BK/HEK293细胞40例在高钙浴液中进行测试，其中18例细胞经空气中短暂暴露处理后可形成内面向外式构型，可记录到典型的BK电流，表现为如图2中30B中的约10pA（钳制膜电位为+40mV）幅值的开关随机的通道电流事件；另外12例细胞在空气中暴露处理后，最初囊泡破裂，形成了内面向外式膜片，但随后囊泡又再次形成，再次于空气中暴露处理仍无法形成内面向外式膜片；其余10例细胞在空气中暴露处理后，囊泡未破裂，无法形成内面向外式膜片，再多次空气中暴露处理仍无法形成内面向外式膜片。结果表明，在高钙浴液中，用现有的在空气中短暂暴露的方法处理，有18例细胞可形成典型的内面向外式膜片，记录到典型的电流信号，试验成功率为45%。

六、吹气法处理后的膜片内面向外式构型的形成

在高钙浴液中，电极尖端细胞膜再次形成囊泡，再次在空气中短暂暴露仍无法使囊泡破裂。此时，将电极提出浴液，在距离电极尖端20-30cm处，以垂直于电极轴向，即平行于电极尖端开口平面的方向，对准电极尖端吹气，气压强度为0.3～0.5mbar，吹气时间为0.5～1.5秒，吹气完成后，将电极放入浴液中，内面向外式膜片再次形成。图2中30D电流记录图显示内面向外构型再次形成。

在上述传统膜片内面向外式构型的形成实验中，使用高钙浴液时，随机选择的40例细胞中有22例细胞经空气中短暂暴露处理后，囊泡仍无法破裂或多次反复形成，无法继续测试。这些无法测试的细胞均进行吹气处理，结果表明，其中20例细胞可再次形成稳定的内面向外式膜片，并记录到典型的电流信号，表现为如图2中30A中的约10pA（钳制膜电位为+40mV）幅值的开关随机的通道电流事件，不再出现电流幅度减小或电流消失的现象；实验结果表明，中速的气流吹动电极尖端可以有效的使囊泡破裂，形成稳定的内面向外式膜片。与现有的传统技术方案相比，本发明改进后的内面向外式膜片钳技术试验成功率由45%提高到95%。

在内面向外式膜片钳测试过程中，电极与细胞膜形成高阻封接后提起电极将细胞膜撕脱，由于电极负压吸引的作用，电极尖端处的细胞膜大部分向电极内凹陷，同时在电极尖端仍然有未向电极内凹陷的游离细胞膜残片，在细胞膜磷脂双分子层亲水基团、疏水基团相互作用力及细胞膜流动性的作用下，电极尖端游离的细胞膜残片融合到一起，形成中间包含液体的囊泡结构。常规技术方案中，将电极在空气中短暂暴露主要是使电极尖端游离膜片融合部位液体挥发，从而使刚刚融合，结构尚未稳定的融合部位裂开，形成单层膜片。将电极再次放入浴液中后，在浴液中多种离子的作用下，电极尖端的游离细胞膜容易再次融合形成囊泡，尤其在浴液中有钙离子存在时，电极尖端的游离细胞膜残片更易融合形成囊泡，随着钙离子浓度的升高，囊泡结构的稳定性明显增强。因此，常规方案处理后，电极尖端的游离细胞膜残片依然存在，再次放入高钙浴液中后，极易再次融合成囊泡并且结构更加牢固，再次提出电极在空气中短暂暴露无法使囊泡破裂，并且在空气中长时间或多次暴露容易破坏电极与细胞膜间的高阻封接。

本发明的吹气方法是将电极提起后对尖端吹气，气流从垂直于电极轴向的方向经过，与电极尖端开口平面平行，电极尖端的游离细胞膜残片在气流中被分割成较小膜片并可能脱落，而由于负压作用凹向电极内的细胞膜不被破坏。同时，根据优选的吹起方向对气流压强、流速及吹气时间进行优化，使吹气过程既能不破坏凹向电极内的待测细胞膜，不破坏电极与细胞膜间的高阻封接，又能有效破坏游离在电极尖端的细胞膜残片。因此电极再次放入高钙浴液中后，由于大部分待测细胞膜向电极内凹陷，并且电极尖端游离的细胞膜残片在吹气过程中已经被损坏变小甚至脱落，很难再次融合形成囊泡。经过本发明的方法处理后电极尖端多余的游离细胞膜残片被破坏，缺少了形成囊泡的必备条件，无论置换浴液中的离子浓度或离子种类都不会影响电极尖端细胞膜的内面向外式构型。

Claims (5)

1.一种膜片钳实验内面向外式膜片实验方法，按照常规技术手段进行内面向外式膜片钳实验，其特征在于，当电流记录过程中检测到的电流信号减小或消失时，将电极从浴液中提起暴露于空气中，用恒定压强的气流，对准电极尖端吹气，吹气完成后，将电极放入浴液中，内面向外式膜片形成；

吹气过程中气流的压强为0.3～0.5 mbar；

吹气过程是在距离电极尖端20-30cm处向电极尖端吹气；

吹气时间为0.5～1.5秒；

吹气过程中气流的方向为与电极轴向成15°~165°角。

2.根据权利要求1所述的实验方法，其特征在于，吹气过程是用脚踏式充气筒或微型电动空气泵吹气。

3.根据权利要求1所述的实验方法，其特征在于，吹气过程中的最佳气流方向为垂直于电极轴向的方向，并且与电极尖端开口平面平行。

4.如权利要求1-3任意一项所述的实验方法在测试表达人体血管平滑肌大电导钙激活钾通道的培养的HEK-293细胞中的应用。

5.如权利要求1-3任意一项所述的实验方法在急性酶分离的细胞、原代培养的细胞以及成熟的细胞系内面向外式膜片钳实验中的应用。