CN103396788A - 一种新型pH响应荧光分子探针及其应用 - Google Patents

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本发明公开了一种新型pH响应荧光分子探针，具有如下结构的通式：
Figure 2013103109764100004DEST_PATH_IMAGE002
其中，n=1-5；R1为具有1至8个碳原子的烷基链；R2为连接在苯并咪唑环4、5、6、7、4′、5′、6′、7′位的氢、氟、氯、溴、碘、甲氧基、乙氧基或硝基。本发明还公开了该新型荧光分子探针在pH响应荧光检测领域的应用。本发明的新型pH响应荧光分子探针检测波长很宽，从紫外线到可见光（<520nm）均可激发。通过结合激光共聚焦扫描显微技术，还可获取该新型荧光分子探针在生命体系不同区域的荧光成像。与现有的pH响应荧光分子探针相比，本发明制备方法简单，与激发光的位移值大。

Description

一种新型pH响应荧光分子探针及其应用
技术领域
本发明涉及荧光分子探针技术领域，尤其涉及一种新型利用分子内氢键调控的pH响应荧光分子探针及其应用。
背景技术
生命环境的pH值是一项重要的生理参数, 它在细胞、酶和很多人体组织活动中起到重要指示作用, 如细胞增殖、细胞凋亡、抗药性、离子传输、肌肉收缩等等. 因此监测生命环境的pH值的变化对于生命细胞行为研究和神经系统研究具有重要意义。 一般情况下, 生命细胞环境存在两种pH范围, 一种是pH 6.8~7.4, 如细胞质；另一种是pH 4.5~6.0,即酸性的细胞器, 如溶酶体. 正常范围的细胞pH环境有利于细胞生长, 而生命pH环境异常往往与癌症、阿尔茨海默病等病症相关联. 因此, 对生命环境的pH值的测量在生命科学领域具有十分重要的意义。
目前生命环境的pH值其测试方法主要有微电极法，需要电驱动，在生命体系内使用不便。
发明内容
荧光光谱法是一种基于光学信号建立的检测方法，具有高灵敏性、高选择性、快速可目视性以及可逆向进行等优点。本发明就是为了解决上述现有技术存在的问题而提供一种新型pH响应荧光分子探针，该探针由共轭多烯连接两侧苯并咪唑环组成。在特定pH条件下生成分子内氢键，使分子形成共平面构型，产生荧光增强效应。
本发明的另一目的是提供该新型荧光分子探针在pH响应荧光检测领域的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种新型pH响应荧光分子探针，具有如下结构的通式：
Figure 251828DEST_PATH_IMAGE001
其中，n=1-5；R1为具有1至8个碳原子的烷基链；R2为连接在苯并咪唑环4、5、6、7、4′、5′、6′、7′位的氢、氟、氯、溴、碘、甲氧基、乙氧基或硝基。
该荧光分子探针的制备按下式进行，参照文献中与之具相似母体结构（菁染料）的合成方法（感光科学与光化学, 1999, 17(1): 66-72）。
Figure 2013103109764100002DEST_PATH_IMAGE002
    
该化合物在酸性、中性和碱性条件下分别对应着一种互变结构状态, 具有双pKa值, 即：
Figure 2013103109764100002DEST_PATH_IMAGE003
该荧光分子探针在pH近中性条件下生成分子内氢键，使分子形成共平面构型（B构型），产生荧光增强效应。如上所示, 在pH近中性条件下, 分子（B结构）中一个咪唑环上自身存在带正电荷的氮原子, 该侧磺酸基团以负离子形式存在, 从而构成内盐, 而探针分子的另一侧的磺酸基则与磺酸根负离子构成分子内氢键, 从整体几何构型上大大增强了探针分子的共面性, 也即增强了探针分子左右两侧部分的共轭程度, 从而增强该探针分子的荧光发射能力；而在酸性（A构型）和碱性（C构型）条件下, 由于电荷的排斥效应, 两个丙磺酸基被排斥于分子两侧, 难以形成分子内氢键, 探针分子整体的几何构型平面性不好, 共轭程度很差,该探针分子的荧光发射能力则被大大削弱。
较佳地，所述pH近中性条件，pH范围为6-10。
较佳地，所述荧光增强效应，其荧光增强倍数为10-300。B构型对A、C构型的荧光增强倍数为10-300。
本发明还包括该新型荧光分子探针在pH响应荧光检测领域的应用。采用荧光法，荧光分子探针在溶液中对pH值有荧光强度响应。
较佳地，所述溶液的溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种。
较佳地，所述荧光分子探针的检测使用浓度为1 μM-300 mM。
较佳地，所述pH响应荧光的识别通过观察其荧光颜色变化来实现。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的新型pH响应荧光分子探针检测波长很宽，从紫外线到可见光（< 520 nm）均可激发。通过结合激光共聚焦扫描显微技术，还可获取该新型荧光分子探针在生命体系不同区域的荧光成像。
本发明的新型pH响应荧光分子探针，与现有的pH响应荧光分子探针相比, 制备方法简单，与激发光的位移值（Stocks位移）大。
附图说明
图1为本发明实施例1采集到的典型pH-荧光响应谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。
实施例1
一种新型利用分子内氢键调控的pH响应荧光分子探针，具有以下分子结构式：
Figure 107657DEST_PATH_IMAGE005
制备方法如下：
在装有搅拌子、冷凝管、温度计的100 mL三口烧瓶中, 放入50 mL乙醇, 加入小块0.58 g金属钠, 待钠完全溶解后, 加入3.51 g 1-乙基-2-甲基-3-磺丙基-5,6-二氯苯并咪唑内铵盐和0.74 g三氯乙醛, 搅拌并加热回流反应1小时. 然后冷却至室温, 过滤, 用乙醇洗涤, 真空干燥, 得粗品. 硅胶柱层析纯化可得到紫红色晶体, 即探针:1,1′-二乙基-3,3′-二磺丙基-5,5′,6,6′-四氯咪碳菁钠盐。
采用荧光法在溶液中对探针pH响应荧光性能进行测定：将该荧光分子探针以20 μM的浓度分散于二甲基亚砜-水（体积比1：9）中，控制不同pH条件，分别以500 nm光激发，对596 nm处的荧光峰进行采集得到如图1所示的pH-荧光响应谱，其强荧光区域为pH 8.3-9.3，荧光增强倍数为120。
实施例2
本实施例中荧光分子探针具有以下分子结构式：
Figure 2013103109764100002DEST_PATH_IMAGE006
采用荧光法在溶液中对探针pH响应荧光性能进行测定：将该荧光分子探针以30 μM的浓度分散于二甲基亚砜-水（体积比1：9）中，控制不同pH条件，分别以500 nm光激发，对605 nm处的荧光峰进行pH-荧光响应谱测量，其强荧光区域为pH 7.8-8.9，荧光增强倍数为90。
实施例3
本实施例中荧光分子探针具有以下分子结构式：
Figure 101021DEST_PATH_IMAGE007
采用荧光法在溶液中对探针pH响应荧光性能进行测定：将该荧光分子探针以20 μM的浓度分散于乙醇中，控制不同pH条件，分别以450 nm光激发，对572 nm处的荧光峰进行pH-荧光响应谱测量，其强荧光区域为pH 7.7-8.5，荧光增强倍数为82。
实施例4
本实施例中荧光分子探针具有以下分子结构式：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
采用荧光法在溶液中对探针pH响应荧光性能进行测定：将该荧光分子探针以20 μM的浓度分散于二甲基亚砜中，控制不同pH条件，分别以510 nm光激发，对622 nm处的荧光峰进行pH-荧光响应谱测量，其强荧光区域为pH 6.8-7.8，荧光增强倍数为158。
对比例
本对比例中的探针具有以下分子结构式：
Figure 855350DEST_PATH_IMAGE009
采用荧光法在溶液中对探针pH响应荧光性能进行测定：将该荧光分子探针以20 μM的浓度分散于二甲基亚砜中，控制不同pH条件，分别以500 nm光激发，对617 nm处的荧光峰进行pH-荧光响应谱测量，在pH 3-12区域内荧光增强波动倍数<3，不具有实用性pH响应价值。
实施例5
本实施例中荧光分子探针具有以下分子结构式：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
采用荧光法在溶液中对探针pH响应荧光性能进行测定：将该荧光分子探针以1μM的浓度分散于乙腈中，控制不同pH条件，分别以533 nm光激发，对645 nm处的荧光峰进行pH-荧光响应谱测量，其强荧光区域为pH 6.0-6.6，荧光增强倍数为300。
实施例6
本实施例中荧光分子探针具有以下分子结构式：
Figure 530045DEST_PATH_IMAGE011
采用荧光法在溶液中对探针pH响应荧光性能进行测定：将该荧光分子探针以300 mM的浓度分散于N,N-二甲基甲酰胺中，控制不同pH条件，分别以501 nm光激发，对586 nm处的荧光峰进行pH-荧光响应谱测量，其强荧光区域为pH 9.2-10.0，荧光增强倍数为10。
以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

Claims (9)

1.一种新型pH响应荧光分子探针，其特征在于，具有如下结构的通式：
Figure 2013103109764100001DEST_PATH_IMAGE001
其中，n=1-5；R1为具有1至8个碳原子的烷基链；R2为连接在苯并咪唑环4、5、6、7、4′、5′、6′、7′位的氢、氟、氯、溴、碘、甲氧基、乙氧基或硝基。
2.如权利要求1所述的新型pH响应荧光分子探针，其特征在于，所述荧光分子探针在pH近中性条件下生成分子内氢键，使分子形成共平面构型，产生荧光增强效应。
3.如权利要求2所述的新型pH响应荧光分子探针，其特征在于，所述pH近中性条件，pH范围为6-10。
4.如权利要求2所述的新型pH响应荧光分子探针，其特征在于，所述荧光增强效应，其荧光增强倍数为10-300。
5.一种如权利要求1所述的新型荧光分子探针在pH响应荧光检测领域的应用。
6.如权利要求5所述的新型荧光分子探针在pH响应荧光检测领域的应用，其特征在于，采用荧光法，荧光分子探针在溶液中对pH值有荧光强度响应。
7.如权利要求6所述的新型荧光分子探针在pH响应荧光检测领域的应用，其特征在于，所述溶液的溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种。
8.如权利要求6所述的新型荧光分子探针在pH响应荧光检测领域的应用，其特征在于，所述荧光分子探针的检测使用浓度为1 μM-300 mM。
9.如权利要求6所述的新型荧光分子探针在pH响应荧光检测领域的应用，其特征在于，所述pH响应荧光的识别通过观察其荧光颜色变化来实现。
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