CN103394045A - 一种中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中医药领域，尤其涉及一种中药组合物及其制备方法和应用。该中药组合物由以下重量份的原料制成：黄芪750份、莪术500份、骆驼蓬子250份、茯苓62.5份、蟾酥2.5份、冬凌草125份、柴胡250份。该组合物对传统扶正散结汤剂的处方进行了调整，减少了药材的用量，但通过采用新的制备方法，针对药物中的有效成分，分别对不同的药物采用不同的提取方式，从而保证了有效物质的转移率，该中药组合物可以用于制备治疗晚期肝癌的药物，且剂型不再如传统的扶正散结汤剂需要服用前经长时间的煎煮过程，且剂量准确，便于保存，且性质稳定，给患者的服用提供了方便，也避免了传统汤剂不良口感给患者带来的不必要的痛苦。

Description

一种中药组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中医药领域，尤其涉及一种中药组合物及其制备方法和应用。

背景技术

中医虽无肝癌的病名，但对其症状、病因早有记载，根据肝癌具有右上腹肿块这个症状，部分医家认为《内经》记载的“在右胁下覆大如杯”；《诸病源候论》所说的“肝积”等病症中可能包含本病。中医认为肝癌和其他的癌症一样，病因分外因和内因，外感病邪与内伤七情，与饮食失调有关，多见于老年人和脾肾衰败之人。其病机是因机体的脏腑阴阳气血失调，外来的致病因素与机体内部所产生的病理因素如痰、湿、气、瘀等相博结，日久结毒成癌。肝癌，主要以两胁疼痛，腹部（肝区）肿块，腹胀纳差，恶心呕吐，渐则可以出现黄疸、臌胀为主症。其根本原因是正虚本亏，感受邪毒，邪毒内侵入干肝，气机受阻，痰浊内生，血脉壅滞，久而形成肿块，发为本病。如《医宗必读积聚》曰：“积之成也，正气不足，而后邪居之”。机体正气不足，邪气聚肝不散，是激发肝部癌变的主因。而正虚本亏以肝脾二脏亏虚为主。年高之人脾气渐虚，肝肾日衰，若七情、饮食、毒物等不良因素长期作用于机体，使气血痰湿毒凝聚于肝，得不到脾运之正化，便凝结成浊物，聚而变成肝癌。肝癌形成之后又嗜血耗气，使正气更虚，邪气更实。可见在肝癌的病理变化中，正虚与邪实并存，正气亏虚为病本，邪气聚结为其标，正虚不但是肝癌的易患因素，正不敌邪，癌瘤无羁，也是肝癌迅速增长的加重因素。而邪实往往以痰结湿聚、血瘀、瘤毒内阻等病理形式出现。在肝癌的标本定位中，整体正虚为本，局部瘤肿为标，正与邪的彼此起伏变化，反映着肝癌的动态标本特征。

从第一个癌细胞在肝脏内形成发展到患者有自觉症状，大约需要2年的时间。在此期间，患者可无任何症状或体征，仅有少数患者可出现食欲减退、上腹闷胀、腹痛、乏力、食欲不振等症状，还有一些患者可出现轻度的肝肿大、黄疸和皮肤瘙痒。但在一般情况下，这些症状很难被人们所重视，因此临床上很多肝癌患者往往在发现时其病情就已经进入了中、晚期。中、晚期症状主要有肝痛、乏力、消瘦、黄疸、腹水等。晚期肝癌指出现黄疸、腹水、远处转移及恶病质，无法手术切除，生存期约2个月。肝癌进入晚期后，随着正气的耗竭，癌变迅速增长，肆虐转移，病机动变多端，或阳郁化热出现发热，或肝络破溃出现出血，或癌体雍阻气道出现脘腹憋闷，此时癌瘤当从毒邪治。其实，从某种意义上说，癌瘤本身就具备毒邪的性质，致癌因子对肝的专一性侵害，病因属癌毒；患癌之后癌瘤肆虐，侵润转移，病情难以控制，病性具备“毒”的性质。病至晚期，癌体增大或转移，嗜血耗气，治疗的目的是遏制癌瘤增长，并使软化缩小，制止扩散转移。从癌瘤病理性质而言，肿物为痰湿瘀毒凝结，治宜解毒、化痰、消瘀。此外，中晚期肝癌增大或转移，病以邪气结实为主，但正虚必然存在，标实为急，本虚为缓，在重点败毒散结抗癌的同时不可不扶正。临床实践证实，在癌肿迅速增长阶段，补益扶正可抑制癌瘤生长，所谓扶正可以抗邪，扶正与败毒散结消瘀在抑制癌体增长中具有相辅相成的作用。

传统验方——扶正散结汤的药物组成具体为：黄芪18g、莪术12g、骆驼蓬子6g、茯苓1.5g、蟾酥30mg、冬凌草6g、柴胡6g。其制备方法为：将茯苓研成细粉并与蟾酥配研混匀，其余黄芪等五味加水400mL，武火沸腾5分钟，改文火煎煮1小时，过滤，取汁，药渣再加水400mL，武火沸腾2分钟，改文火煎煮30分钟，过滤，取汁，两次汁液混匀约300mL；将茯苓、蟾酥混匀后的细粉平分三份，每份用约100mL药液冲服，一日三次，4周为一个周期，共服用两个周期。此方所治之晚期原发性肝癌诸证皆因正气虚损，气血痰湿凝聚于肝，聚而成形所致。本发明提供的中药组合物胶囊制剂针对气滞血瘀、脾虚湿盛型的肝癌病，症见胁下痞块，痛如锥刺，痛牵腰背，固定不移，入夜痛剧，恶心，食少神疲，肢软乏力，心悸气短，脘腹胀闷，呃逆嗳气，或伴腹水，大便不实，舌暗体略胖，脉弦虚。肝癌至晚期，因毒瘀久羁，耗伤气血，正气大虚，故见食少神疲、肢软乏力；心失所养则心悸气短；气虚鼓动无力，加之湿阻气机，故见脘腹胀闷、恶心、呃逆嗳气；甚则水湿停聚，伴见腹水；气、血、痰、湿久结不去，聚而成形，故见胁下痞块，痛如锥刺，痛牵腰背，固定不移；舌暗胖苔腻，脉弦虚，乃气虚血瘀夹湿之象。治宜益气扶正，活血消癥，健脾渗湿之法。方中黄芪味甘，微温，归脾肝经，具有补气升阳，行滞通痹之功效，能大补脾肺之气，并可借补气之功以生血，《日华子本草》谓其“助气，长肉，补血”，《别录》谓其“补丈夫虚损，五劳羸瘦”，用其补气生血以固本，大补元气以促血行，利尿以除水湿，故用为君药。莪术辛，苦，湿，归肝、脾经，长于行气破血散结，《药品化义》记载：“莪术味辛性烈，专攻血中之气，主破积消坚，去积聚痞块”，长于治疗腹部包块、积聚；骆驼蓬子味辛，苦，凉，可宣肺气、消肿毒，两药相配，活血败毒，消癥止痛，共为臣药。君臣相配，益气活血，解毒消癥，扶正祛邪，标本兼顾。茯苓味甘、淡，性平，具有利水渗湿、益脾和胃、宁心安神之功用，用之健脾渗湿，与黄芪相使为用，益气补脾行水；蟾酥味甘辛，性温，解毒消肿，《本草汇言》记载：“能化解一切郁瘀壅滞诸疾，如积毒、积块之证，有攻毒拔毒之功”，本方用之以毒攻毒，消除肿瘤；冬凌草味苦、甘、性微寒，具有清热解毒，活血止痛之功，与骆驼蓬、蟾酥相配以增强解毒止痛之功，以上三味药相配，健脾祛湿，解毒消癥止痛，共为佐药。柴胡疏肝解郁，升举阳气，与莪术相配，畅达气血，并引诸药达于肝经，具有靶向定位给药之功效，为佐使药。诸药合用，益气健脾以固本，解毒、活血、祛湿以治标，扶正祛邪，标本兼顾，共奏益气扶正，活血消癥，健脾渗湿之功。临床应用表明：扶正散结汤治疗晚期原发性肝癌有较好的临床疗效，可提高患者生活质量，延长生存期，增强免疫功能，缩小瘤体。且无明显不良反应发生。

然而，虽然扶正散结汤在临床应用中表现出了对晚期肝癌良好的治疗效果，但是，其却没有得到广泛的应用。究其原因，服用方式成为了该汤剂无法广泛应用的最大障碍。传统中药汤剂需每日三次服用，服用前需要经过长时间的煎煮过程，且煎煮的时间、加水量的多少，火力的大小都需要严格控制，但这对于普通患者而言，并不容易做到。因此，传统中药的煎煮过程给患者带来了极大的不便。另一方面，传统中药汤剂口感不佳，而服用量却不少，这也给患者带来了不必要的痛苦。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种中药组合物及其制备方法和应用。该组合物处方中各组分经提取制成组合物，使得服用方便，且有效成分含量更高并不易降解。

本发明提供的中药组合物，由以下重量份的原料制成：黄芪750份、莪术500份、骆驼蓬子250份、茯苓62.5份、蟾酥2.5份、冬凌草125份、柴胡250份。

本发明提供的中药组合物对扶正散结汤剂处方中各组分的含量进行了调整，减少了莪术、骆驼蓬子和冬凌草的用量，从而使其比例更加合理。

本发明还提供了该中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取茯苓，经清洗、、去皮后，干燥、粉碎，得粒度为100目的茯苓粉；取蟾酥，干燥后，以体积分数为60%的乙醇水溶液浸泡并搅拌制得浸膏，经干燥、粉碎，获得粒度为100目的蟾酥粉；取62.5份茯苓粉、2.5份蟾酥粉，与水混合，经湿法制粒，灭菌、干燥、粉碎，获得粒度为100目的第一中间产物；

步骤2：取黄芪750份、柴胡250份，经清洗、以水第一浸泡120min、切片后，烘干，以水第二浸泡2小时，煎煮2次，每次3小时，经第一过滤收集第一滤液弃第一滤渣；

步骤3：取莪术500份，经切片、干燥，以水第三浸泡2小时，以水蒸气蒸馏法提取，获得莪术油及第二中间产物；取莪术油及其5倍质量的β-环糊精，制得莪术油的β-环糊精包合物；取第二中间产物经第二过滤，收集第二滤液和滤渣；

步骤4：取骆驼蓬子、冬凌草，清洗后，经烘干粉碎，与经干燥的第二滤渣混合，以体积分数为95%的乙醇水溶液浸泡1小时后，加热回流提取3次，每次2小时，经第三过滤收集第三滤液弃第三滤渣，浓缩至相对密度为1.30获得第三中间产物；

步骤5：取第一滤液、第二滤液和第三中间产物混合，减压浓缩至相对密度为1.30，获得第四中间产物；

步骤6：取第一中间产物、第四中间产物和莪术油的β-环糊精包合物，混合，经减压干燥、粉碎，即得；

其中相对密度在50℃测得。

作为优选，步骤1中灭菌具体为：80℃加热灭菌3次，每次1小时，灭菌间隔时间为24小时，灭菌间隔温度为20℃～30℃。

作为优选，步骤1中取62.5份所述茯苓粉、2.5份所述蟾酥粉与水混合，其中茯苓粉和蟾酥粉的质量之和与水的质量之比为1：1。

作为优选，步骤2中第二浸泡水的质量为黄芪与柴胡质量之和的10倍。

作为优选，步骤2中煎煮中水的质量为黄芪与柴胡质量之和的10倍。

作为优选，步骤2中切片的厚度为2mm。

作为优选，第一过滤的粒度为350目。

作为优选，步骤3中切片的厚度为5mm。

作为优选，步骤3中所述第三浸泡中，水的质量为莪术质量的8倍。

作为优选，步骤3中水蒸气蒸馏提取的压强为0.04Mpa，时间为8h。作为优选，莪术油的β-环糊精包合物的制备方法具体为：

步骤1：取莪术油5倍质量的β-环糊精，溶解于60℃的水中，制得β-环糊精溶液；

步骤2：60℃，搅拌β-环糊精溶液，滴加莪术油，获得混合溶液；

步骤3：取混合溶液，搅拌60分钟，2℃～10℃静置12小时，经抽滤、干燥、粉碎，过100目筛，即得。

作为优选，第二过滤的粒度为350目。

干燥作为优选，第三过滤的粒度为350目。

作为优选，步骤4加热回流提取中，经烘干粉碎的骆驼蓬子、冬凌草和经干燥滤渣的质量之和与体积分数为95%的乙醇水溶液的质量比为1：10。

优选的，3次提取加入乙醇水溶液的体积一致。

作为优选，步骤4中的粉碎粒度为20目。

作为优选，步骤5中减压浓缩的温度为60℃，压强为-0.08MPa。

作为优选，步骤6中减压干燥的温度为60℃，压强为-0.08MPa。

作为优选，步骤6中粉碎的粒度为100目。

以本发明提供的制备方法制备的中药组合物。

本发明提供的中药组合物中黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。春秋二季采挖，除去须根和根头，晒干。黄芪治疗晚期肝癌的有效成份为黄芪总苷和黄芪多糖。黄芪总苷具有皂苷的通性，极性较大，易溶于水、热甲醇和乙醇；黄芪多糖易溶于水，不溶于乙醇及其它有机溶剂。故采用水煎提取，虽然这与传统扶正散结汤剂的制备方式基本一致，但经检测可知黄芪甲苷的转移率提高了一倍以上。

莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.的干燥根茎。冬季茎叶枯萎后采挖，洗净，蒸或煮至透心，晒干或低温干燥后除去须根和杂质。莪术治疗晚期肝癌的有效成份为莪术油和姜黄素，这两者皆不溶于水，姜黄素溶于乙醇及冰醋酸，故采用水蒸气蒸馏提取莪术油，将莪术油加入β-环糊精饱合水溶液中，制成环糊精包合物，冷藏静置12小时，低温干燥。将莪术油分子包合或嵌入β-环糊精（β-CD）的筒状结构内形成超微粒分散物即为β-环糊精包合物，该包合物分散效果好，易于吸收；且释药缓慢；β-环糊精为碳水化合物，能被人体吸收、利用，进入人体后断缝开环，释放出莪术油，其β-环糊精本身形成直链低聚糖，参与代谢，无积蓄作用，无毒。这种β-环糊精包合物，增加了莪术油的稳定性，可防止莪术油氧化、水解，减少挥发。使液体莪术油粉末化，减少了莪术油的不良反应和不适气味，可控制β-环糊精内莪术油的释放，从而调节释药速度。为了防止其它治疗本病的次要有效成份及少量姜黄素丢失，将莪术水蒸气蒸馏后的水提物350目筛网滤过，滤液备用。药渣用乙醇回流提取姜黄素（Curcumin）：分子式C₂₁H₂₀O₆，分子量368.37，mp.183℃。由于姜黄素不溶于水而溶于乙醇，故此提取方法较传统汤剂传统汤剂水煎提取效果能明显提高，实验表明：本发明提供的组合物与传统扶正散结汤剂相比姜黄素转移率提高了一倍以上。

骆驼蓬子为蒺藜科植物骆驼蓬Peganum harmala L.的干燥成熟种子。夏秋果实成熟时割取地上部分，打下种子，除去杂质，晒干。骆驼蓬子治疗本病的有效成分为总生物碱，而该总生物碱中的主要有效成分为骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱，这两种主要有效成分在水中溶解度小，提取不完全，传统扶正散结汤剂用水煎提取不能得到很好的效果，而由于这两种主要有效成分在乙醇中溶解度较大，故采用乙醇回流提取较为适宜。同传统扶正散结汤剂相比，本发明提供的中药组合物中总生物碱含量提高了一倍以上。

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw）Wolf.的干燥菌核。多于7～9月采挖，挖出后除去泥沙，堆置“发汗”后，摊开晾至表面干燥，再“发汗”，反复数次至现皱纹，内部水分大部分散失后，阴干，称为“茯苓个”。茯苓治疗本病的有效成份为茯苓多糖、茯苓素和茯苓醇。其中茯苓糖（Pachymose）为主成分，含量84.2%。另有报道β-茯苓聚糖（β-Pachyman）为主成分，约占干品的75%，茯苓多糖在水、丙酮、乙醚中皆不溶，茯苓素在乙醇、水中不溶，无论是水和乙醇都无法提取，加之在处方中用量小，故采用生药原粉入药，低温干燥。

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥分泌物。多于夏、秋二季捕捉蟾蜍，洗净，挤取耳后腺和皮肤腺的白色浆液，加工，干燥。蟾酥治疗本病的有效成分为脂蟾毒配基、蟾毒灵和华蟾毒精。脂蟾毒配基（Resibufogenin）：异名惹斯蟾蜍苷元。分子式C₂₄H₃₂O₆。无色板状结晶，mp.118℃～119℃（丙酮一环己烷）。为蟾蜍中含量最高的活性成分；蟾毒灵（Bufalin）：分子式C₂₄H₃₄O₄，分子量386.mp.235℃～236℃（醋酸乙酯）华蟾毒精（Cinobufagin）即华蟾酥毒基：分子式C₂₆H₃₄O₆，分子量442。无色板状结晶，mp.215℃～216℃（氯仿一环己烷）。由于蟾酥的有效成分复杂，进一步提取难度大，加之在处方中用量少，生物活性强，故采用生药原粉入药。

冬凌草为唇形科植物碎米桠Rabdosia rubescens（Hemsl）Hara的干燥地上部分。夏、秋二季茎叶茂盛时采割，晒干。冬凌草含有单萜、倍半萜、二萜、三萜等一系列萜类化合物。贝壳杉烯类二萜是冬凌草中主要化学成分，其中冬凌草甲素、乙素为治疗本病的有效成分。冬凌草甲素（Oridonin），异名冬凌草素、延命草宁。分子式C₂₀H₂₈O₆，分子量364.42.无色棱柱状结晶、味苦，mp.248℃～250℃（分解），[α]_D ¹⁷-46⁰(C=1.0，吡啶)。冬凌草乙素（Rubescensine B）：异名Ponicidin。分子式C₂₀H₂₆O₆，分子量362.17.无色针状结晶（甲醇），mp.238℃～241℃，[α]_D ²³-107⁰（C=0.12，吡啶）。此两种有效成分，在水中难溶，在乙醇中易溶，故采用乙醇加热回流提取，实验表明，采用本发明提供的方法制备中药组合物冬凌草甲素的转移率同传统扶正散结汤剂相比较，提高了四倍以上。

柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根。习称北柴胡。春、秋二季采挖，除去茎叶和泥沙，干燥。柴胡治疗本病的有效成分为柴胡皂苷A和柴胡皂苷D及柴胡多糖。柴胡皂苷A（Saikosaponin A）：分子式C₄₂H₆₈O₁₃，分子量780.96.mp.225℃～232℃,[α]_D+46⁰(乙醇)，易溶于水、乙醇，难溶于苯、乙醚、石油醚。柴胡皂苷D（Saikosaponin D）：分子式C₄₂H₆₈O₁₃，分子量780.96，mp.212℃～218℃,[α]_D+37⁰（乙醇），易溶于水、甲醇、乙醇、难溶于苯、乙醚、石油醚，柴胡多糖易溶于水。故采用水煎提取，同传统汤剂传统汤剂煎煮的提取方式基本一致。但有效成分的转移率却提高了一倍以上。

可见，黄芪和柴胡抗肝癌有效成分皆具有水溶性，由于水为一种极性溶媒，根据这些抗癌有效成分的化学性质互无明显不良影响而设计两药混提，并且，实验结果表明这两种药材中含有皂苷、高级脂肪醇、甾醇等具有表面活性的两性物质，在共煎中可能形成胶团，增加药物有效成分的溶出而发挥其增溶作用。莪术中所含的姜黄素，骆驼蓬子中所含的总生物碱，冬凌草中所含的冬凌草甲素和冬凌草乙素皆为抗肝癌的有效成分，且皆难溶于水，易溶于乙醇，且这些成分的化学性质互无明显不良影响而设计群药混提，共同采用乙醇加热回流提取。而其中的茯苓和蟾酥细粉，既承担了原料的角色，又承担了辅料的角色，茯苓和蟾酥且皆为原生物粉入药。

本发明还提供了本发明中药组合物在制备治疗晚期肝癌药物中的应用。

作为优选，药物的剂型为胶囊剂或片剂。

本发明提供的中药组合物，由以下重量份的原料制成：黄芪750份、莪术500份、骆驼蓬子250份、茯苓62.5份、蟾酥2.5份、冬凌草125份、柴胡250份。本发明提供的组合物对传统扶正散结汤剂的处方进行了调整，减少了药材的用量，但通过采用新的制备方法，针对药物中的有效成分，分别对不同的药物采用不同的提取方式，从而保证了有效物质的转移率，因此，尽管本发明提供的中药组合物减少了某些药物的用量，但是药效并未受到影响。并且，本发明提供的中药组合物可以用于制备治疗晚期肝癌的药物，而该药物的剂型不再如传统的扶正散结汤剂需要服用前经长时间的煎煮过程，且剂量准确，便于保存，可以随身携带，且性质稳定，给患者的服用提供了方便，也避免了传统汤剂不良口感给患者带来的不必要的痛苦。

附图说明

图1示本发明提供的中药组合物胶囊制剂中填充颗粒的吸湿曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种用于治疗晚期肝癌的中药组合物及其制备方法和制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1生药中有效成分含量测定

1）、黄芪多糖含量测定

实验方法为：绘制标准曲线：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖（批号：110928-200915，供含量测定用）对照品250mg，置50mL容量瓶中，加水至刻度摇匀，制成使每1mL含无水葡萄糖5mg的溶液。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，分别置于碘量瓶中，各精密加入斐林试液20mL，煎沸3分钟，放冷，加盐酸（6mol/L）10mL，立即以硫代硫酸钠液（0.1mol/L）滴定至淡黄色，加淀粉指示液2mL，继续滴定至蓝色消失。另以水5mL同法操作为空白对照，以空白消耗硫代硫酸钠试液的mL数与各管消耗硫代硫酸钠液mL数之差为纵坐标，葡萄糖的mL数（换算成葡萄糖的mg数）为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：称取供试品甲、乙两份，每份约230mg，精密称定，分别加乙醇20mL，充分振摇，离心（3000r/min）10min，弃去上清液，沉淀加水20mL，充分振摇，离心（3000r/min）10min，上清液水浴蒸干，加水5mL使溶解；甲份（作总糖测定）加6mol/L盐酸溶液5mL，煮沸30min后，放冷，加酚酞指示液8滴，用3mol/L氢氧化钠溶液调至粉红色（显中性）；以下甲、乙两份皆按标准曲线制备项下方法自“精密加入斐林试液20mL”起，依法测定。以空白与供试品溶液消耗硫代硫酸钠mL数之差，分别在标准曲线上查得相对应的mg数，按下式计算出黄芪总多糖在药材中的提取率（%）。

G_总：由标准曲线查得的总糖mg数

W_总（甲）：甲份供试品换算成药材重量（mg）

G_还：由标准曲线查得的还原糖mg数

W_还（乙）：乙份供试品换算成药材重量（mg）

计算出黄芪总多糖在药材中的提取率（%）

按干燥品计算，含黄芪多糖不得少于2.5%。

注：斐林试剂：

甲液：硫酸铜6.25g，加水稀释至100mL。

乙液：酒石酸钾钠18.70g，氢氧化钠12.50g，加水稀释至100mL。

丙液：碘化钾15g，加水稀释至50mL。

将甲、乙、丙液临用时混合，摇匀，即得。

对不同产地黄芪中黄芪多糖含量的测定结果如表1所示。

2)、骆驼蓬总生物碱含量测定

测定方法：取待测样品中粉约l0g，精密称定，置索氏提取器中，加95%乙醇20OmL、加热回流5小时，至生物碱提尽，提取液回收乙醇，加10%盐酸使PH为2～3，充分振摇后，移置分液漏斗中，用三氯甲烷分三次振摇提取，每次10mL，弃去三氯甲烷液，酸水溶液用10%Na₂CO₃中和至PH为10，将沉淀物离心，沉淀物用乙醇洗至蒸发皿中，干燥，通过碱性氧化铝-硅胶（6：4）混合层析柱（内径1.5cm，长12cm），用氯仿100mL洗脱，回收氯仿，干燥，精密称定，即得。

按干燥品计算，含骆驼蓬总生物碱不得少于2.5%。

对不同产地骆驼蓬子中中骆驼蓬生物碱含量的测定结果如表1所示。

3）、茯苓多糖的含量测定

测定方法：取待测品约0.5g，精密称定，加温度为3℃的2%NaOH液25mL，搅拌10min，同温放置3h，离心；取上清液，加10%醋酸中和使呈中性，过滤，弃去滤液，沉淀分别依次用水、丙酮、乙醚各洗涤两次，每次100mL，弃去洗涤液，沉淀干燥，得固体物，精密称定，精密称取0.25g，溶于50mL二甲基亚砜中，加水60mL，使沉淀，离心，沉淀物分别依次用水、丙酮、乙醚各10mL洗涤一次，沉淀物用二甲基亚砜溶解，转移至蒸发皿中，105℃干燥4小时，精密称定。

按干燥品计算，含茯苓多糖不得少于60.0%。

对不同产地茯苓中茯苓多糖含量的测定结果如表1所示。

4）柴胡皂苷a、d含量测定

按照高效液相色谱法（中国药典2010年版附录ⅥD）测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm。理论板数按柴胡皂苷a峰计算应不低于10000。色谱条件为0～50min流动相A25%→90%，流动相B75%→10%；50～55min，流动相A90%，流动相B10%

对照品溶液的制备：取柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷d对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含柴胡皂苷a0.4mg、柴胡皂苷d0.5mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取第一滤液干燥制得的干膏细粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25mL，密塞，30℃水温超声处理（功率200W，频率40kHz）30分钟，滤过，用甲醇20mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

对不同产地柴胡中柴胡皂苷a、d含量的测定结果如表1所示。

5）、冬凌草甲素的含量测定

按照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（55:45）为流动相；检测波长为239nm。理论板数按冬凌草甲素峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备：取冬凌草甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，放置30分钟，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

对不同产地冬凌草中冬凌草甲素含量的测定结果如表1所示。

6）、黄芪甲苷含量测定方法如下：

照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（32:68）为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取干膏细粉1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇100mL，超声处理（功率250W，频率35KHz）30分钟，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水10mL使溶解，放冷，通过D₁₀₁型大孔吸附树脂柱（内径为1.5cm，柱高12cm），以水50mL洗脱，弃去水液，再用70%乙醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶液，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得，

对不同产地黄芪中黄芪甲苷含量的测定结果如表1所示。

7）、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基总含量测定方法如下：

照高效液相色谱法（中国药典2012年版一部VI D）测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（44：56）为流动相；检测波长为292nm。理论板数按华蟾酥毒基峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备：取华蟾酥毒基对照品、脂蟾毒配基对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL各含华蟾酥毒基、脂蟾毒配基50μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物，研细，取约3.5g，精密称定，置索氏提取器中，加入乙醚50mL，加热回流5小时，滤过，滤液加活性炭0.3g，振摇，放置5分钟，滤过，用乙醚10mL分次洗涤滤器及滤渣，合并滤液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解。转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

对不同产地蟾酥中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基总含量的测定结果如表1所示。

8）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定方法参见中国药典2010年版一部284页提供的方法）

9）、莪术挥发油含量的测定方法（参见中国药典2010年版一部258页提

供的方法）

表1生药中有效成分含量测定

由表1可知：

产地为黑龙江的黄芪按干燥品计算，（以下皆按干燥品计算）含黄芪甲苷为0.067%（标准规定≥0.040%）；毛蕊异黄酮葡萄糖苷为0.052%（标准规定≥0.020%）；黄芪多糖为3.8%（标准规定≥2.5%；产地为四川的蓬莪术含挥发油1.8%（mL/g）（标准规定≥1.5%）；产地为新疆的骆驼蓬子含总生物碱为3.5%（标准规定≥2.5%）；产地为安徽的茯苓含茯苓多糖80.9%（标准规定≥60.0%）；产地为河南的蟾酥含华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为7.5%（标准规定≥6.0%）；产地为济源的冬凌草含冬凌草甲素为0.27%（标准规定≥0.25%）;产地为黑龙江的北柴胡含柴胡皂苷a、d总量为0.40%（标准规定≥0.30%）。

实施例2药材浸润时间考察

干燥的中药材，因失水而发生皱缩，成分固结于细胞中，细胞的半透性在干燥后被破坏，药材中的有效成分能被浸出溶媒溶解浸出。在煎煮法及乙醇回流提取法中因药材表面蛋白质受热而凝固，淀粉而糊化，妨碍水分及乙醇渗入药材内部，影响有效成分提取，故在提取前应加适量溶剂浸泡后再进行提取较为有利。因此，必须进行浸润时间的考察。由于药材粒径是影响中药材提取率的重要条件，粉碎的愈细，粉粒表面积愈大，愈有利于浸出。但药材粉粒过细时虽能提高浸出效率，浸液却不易过滤，反而造成有效成分的损失。

经多次预示结果：

黄芪、柴胡2mm切片，莪术5mm切片为宜。

骆驼蓬子、冬凌草及莪术提取挥发油后的药渣粉碎成粗粉（过20目筛）为宜。

按处方比例分别称取黄芪2mm饮片75g，柴胡2mm饮片25g，各加5倍量水浸泡，每隔30分钟观察一次浸润程度，浸透时间皆为120分钟；

按处方比例分别称取骆驼蓬子粗粉25g，莪术药渣粗粉50g，冬凌草粗粉12.5g，各加5倍量95%乙醇浸泡，每隔20分钟观察一次浸润程度，浸透时间皆为60分钟。故采用煎煮及水蒸汽蒸馏前先浸泡2小时为宜，95%乙醇回流提取前先浸泡1小时为宜。

实施例3第一中间产物的制备条件筛选

取茯苓除去杂质，洗净，干燥，精密称取三份，每份25g粉碎，过100目筛，获得茯苓粉，再分别精密称取该三份细粉的重量，收粉率分别为98.8%、99.1%、99.4%，平均为99.1%；

取1g蟾酥捣碎，加2倍量体积分数为60%的乙醇水溶液浸渍，时常搅动至呈稠膏状，干燥，精密称取三份，粉碎，过100目筛，获得蟾酥粉，精密分别称取该三份细粉的重量，收粉率分别为99.3%、99.5%、99.4%，平均为99.4%。

由于茯苓、蟾酥中有些对抗肝癌有效的成分对热不稳定，加热可使其活性快速损失，灭菌比较困难；紫外照射灭菌，因穿透力不强，灭菌效果不佳，在对茯苓和蟾蜍充分洗净的前提下，对茯苓和蟾酥这两种中药混合物采用低温间隙灭菌。

首先，取62.5g茯苓粉和2.5g蟾酥粉，加取6.5mL水，采用水湿法制粒，80℃加热灭菌三次，每次1小时，两次灭菌间隙为20～30℃保持24小时，每次加热后取样，减压（60℃，-0.08MPa）干燥，分别密封室温放置七天，微生物限度检测结果见表2。

表2低温间隙灭菌效果

菌种	灭菌前	第一次灭菌	第二次灭菌	第三次灭菌
					细菌(应≤1000个/g)	不可计	1400	1000	＜10
霉菌(应≤100个/g)	3000	250	100	＜10
					大肠杆菌(不应检出)	检出	未检出	未检出	未检出
沙门菌(不应检出)	未检出	未检出	未检出	未检出
					活螨(不应检出)	未检出	未检出	未检出	未检出

表2结果表明，80℃加热灭菌三次，每次1小时，两次加热间隙室温保持24小时，微生物限度检查各项检测指标皆符合规定，证明此方法可行。

实施例4：第一滤液的制备条件筛选

以加水量、煎煮次数、每次煎煮时间为考察因素，进行三因素三水平L9（34）正交实验。由于黄芪治疗肝癌的有效成分为黄芪总苷（AST）和黄芪多糖（APS），柴胡治疗肝癌的有效成分为柴胡皂苷a和柴胡皂苷d及柴胡多糖，故将其总皂苷及总多糖作为设计权重系数的依据，并以综合评分作为提取效果的衡量指标。将煎煮出的总皂苷和总多糖在黄芪和柴胡药材中所占的百分比例及煎煮出的柴胡皂苷a和d的总量在柴胡药材中所占的百分比例为评价指标，筛选最佳水煎工艺条件（总皂苷、总多糖及柴胡皂苷a、d总量的权重系数分别为0.4、0.4、0.2）

1、取黄芪750g，柴胡250g。除杂，洗净，润透，分别切成2mm片，烘干，精密称定，加水浸泡2小时，按表3所示正交条件进行水煎提取，将提取后的药液用350目滤布滤过，分别收集滤液，即为第一滤液。

表3黄芪、柴胡水煎提取正交试验因素水平表

2、提取效果检测：

首先对所得第一滤液进行前处理，具体为：滤液减压（60℃，-0.08Mpa）浓缩至相对密度为1.30（50℃测得）的稠膏，减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎过100目筛，得干膏细粉，精密称定干膏细粉总量。采用干膏细粉对提取效果进行检测，以总皂苷、总多糖及柴胡皂苷为检测对象，检测方法具体为：

2.1总皂苷含量测定：

取第一滤液干燥制得的干膏细粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20mL，超声处理（功率250W，频率50KHz）30分钟，放冷，滤过，滤液加乙醚50mL，振摇，放置至澄明，弃去上清液，沉淀分次加甲醇（20mL，10mL，5mL）加热使溶解，放冷，滤过，合并甲醇液，浓缩至15～20mL，放冷，加乙醚50mL，振摇，同上法处理，合并甲醇液，置以恒重的蒸发皿中，于水浴上蒸发至干，在105℃干燥至恒重，计算，即得。换算出总苷在黄芪和柴胡药材中的提取率（%）。

2.2总多糖含量测定：

制备标准曲线，精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖（批号：110928-200915，供含量测定用）对照品适量，加水制成每1mL含无水葡萄糖5mg的溶液。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，分别置于碘量瓶中，各精密加入斐林试液20mL，煎沸3分钟，放冷，加盐酸（6mol/L）10mL，立即以硫代硫酸钠液（0.1mol/L）滴定至淡黄色，加淀粉指示液2mL，继续滴定至蓝色消失。另以水5mL同法操作为空白对照，以空白消耗硫代硫酸钠液的mL数与各管消耗硫代硫酸钠液mL数之差为纵坐标，葡萄糖的mL（换算成葡萄糖的mg数）数为横坐标，绘制标准曲线。

分别称取两份第一滤液干燥制得的干膏细粉，每份约230mg，分别命名为甲份、乙份精密称定，分别加乙醇20mL，充分振摇，离心（3000r/min）10min，弃去上清液，沉淀分别加水20mL，充分振摇，滤过，滤液蒸干，加水5mL使溶解；甲份（作总糖测定），加盐酸液（6mol/L）5mL，煮沸30分钟，放冷后，加酚酞指示液8滴，用氢氧化钠液（3mol/L）调至粉红色，以下甲、乙两份皆按标准曲线制备项下的方法自“精密加入斐林试液20mL”起依法测定。以空白与供试品消耗硫代硫酸钠体积之差，分别在标准曲线上查得相对应的质量。按下式计算多糖的百分含量，

G总：由标准曲线查得的总糖mg数

W总（甲）：甲份供试品药材重量（mg）

G还：由标准曲线查得的还原糖mg数

W还（乙）：乙份供试品药材重量（mg）

计算出总多糖在黄芪和柴胡药材中提取率（%）

注：本法是以测转化糖的形成测定样品中总糖的含量。斐林试剂除能与转化糖作用外，还可能氧化样品中带游离醛、酮基的其他还原性物质，目前暂予忽略不计。

2.3柴胡皂苷a、d含量测定

照高效液相色谱法（中国药典2010年版附录Ⅵ D）测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表4中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm。理论板数按柴胡皂苷a峰计算应不低于10000。高效液相色谱条件如表4所示：

表4检测柴胡皂苷a、d含量的高效液相色谱条件

对照品溶液的制备：取柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷d对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含柴胡皂苷a0.4mg、柴胡皂苷d0.5mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取第一滤液干燥制得的干膏细粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25mL，密塞，30℃水温超声处理（功率200W，频率40kHz）30分钟，滤过，用甲醇20mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。正交实验设计如表5所示，检测结果如表6所示：

表5第一滤液制备正交试验因素水平表

表6第一滤液检测结果

注：水煎提取正交试验三个评价指标，采用综合评分法进行数据分析总皂苷和总多糖含量权重系数皆为0.4，柴胡皂苷a、d总量权重系数为0.2.

总皂苷评分=总皂苷量/最大总皂苷量×0.4×100

总多糖评分=总多糖量/最大总多糖量×0.4×100

柴胡皂苷a、d总量评分=柴胡皂苷a、d总量/最大柴胡皂苷a、d总量×0.2×100

综合评分=总皂苷评分+总多糖评分+柴胡皂苷a、d总量评分

从表5中极差R值大小显示，各因素对提取效果影响大小顺序为A>B>C，再从各因素水平来看（K值分析），因素A为K2>K3>K1，因素B为K3>K2>K1，因素C为K3>K2>K1。从表5直观分析，最佳水煎提取条件为A2B2C3。考虑到大生产实际情况，有必要对各因素下水平的显著性进行方差分析，结果见表7。

表7第一滤液提取效果方差分析

注：方差分析计算

平方和 $S^2=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2;$

均方 $M=\frac{S^2}{n-1};$

F值

其中，M_误=MD

查F分布临界值表，得F0.05（2.2）=19.00

                    F0.01（2.2）=99.00

表7方差分析结果表明：A、B、C因素皆有非常显著性意义（P值皆<0.01），结合表6的直观分析，最佳水煎提取条件为A2B2C3，即每次加水量为原药材的10倍，加热煎煮两次，每次3小时。据此条件验证三批，结果见表8。

表8黄芪、柴胡水煎提取验证试验结果

试验号	药材总重量(g)	总皂苷(%)	总多糖(%)	柴胡皂苷a、d总量(%)
					1	100	4.13	4.98	0.37
2	100	4.15	4.99	0.38
					3	100	4.14	4.99	0.37
平均		4.14	4.99	0.37

表8表明，验证试验结果与正交最佳水煎提取条件试验结果一致，确定第一滤液的制备条件为：每次加10倍量水煎煮两次，每次3小时。在此工艺条件下，柴胡皂苷α、d总量的转移率为92.5%（原药材含量为0.40%）。

实施例5莪术油的制备条件筛选

以压力、加水量、蒸馏时间为考察因素，进行三因素三水平L₉（3⁴）正交实验，本实验莪术取用量皆为处方量。将莪术除去杂质，以水浸泡120min，洗净，蒸8h，切5mm片，干燥，精密称取500g。置中间有筛板的搪瓷缸内，分别加药材量不同倍数的水浸泡2h，缸上接挥发油接收器及冷凝装置，在不同压力环境下，分别蒸馏不同时间，从馏出液中分离出莪术油，精密量取，以莪术油在原药材中的百分含量（mL/g）为考核指标，优选出莪术油制备正交试验设计如表9所示，检测结果如表10所示。

表9水蒸气蒸馏提取正交试验因素水平表

表10莪术油制备正交试验检测

从表10中极差R值大小显示，各因素对提取效果影响大小顺序为C>A>B，再从各因素水平来看（K值分析），因素A为K₂>K₁>K₃，因素B为K₃>K₂>K₁，因素C为K₂>K₃>K₁。从表10直观分析，最佳水蒸汽蒸馏提取条件为A₂B₁C₂。考虑到大生产实际情况，有必要对各因素水平的显著性进行方差分析，结果见表11

表11各因素提取莪术油效果方差分析

表11方差分析结果表明：A因素影响有显著意义（P<0.05）；B因素影响有显著性意义（P<0.05）；C因素影响有非常显著性意义（P<0.01），结合表8的直观分析，最佳水蒸汽蒸馏提取条件为A₂B₁C₂，即加水量为原药材的8倍，在0.04Mpa压力下蒸馏8小时。据此条件验证三批，结果见表12。

表12莪术油最佳水蒸汽蒸馏提取条件的验证

试验号	药材重量(g)	压力(MPa)	加水量(倍)	提取时间(h)	莪术油含量(%)
						1	500	0.04	8	8	1.60
2	500	0.04	8	8	1.61
						3	500	0.04	8	8	1.60
平均					1.60

表12实验结果表明，验证试验结果与上述优选结果一致，即莪术油水蒸汽蒸馏最佳提取条件为：加水量为原药材重量的8倍，浸泡2h，在0.04Mpa压力下蒸馏8小时。在此工艺条件下，莪术油的转移率为88.4%（原生药含量为1.81%）。提取莪术油后除莪术油外的部分为第二中间产物，取第二中间产物经第二过滤，收集第二滤液和第二滤渣。

实施例6莪术油β-环糊精包合物制备条件筛选

为了防止莪术挥发油的氧化、水解，减少挥发，使成固态粉末，掩盖不适气味，提高其生物利用度，采用饱和水溶液法：将β-环糊精配成饱和水溶液，加入莪术挥发油，混合30min以上，使挥发油与β-环糊精形成包合物后析出，将析出的包合物过滤，用乙醚洗去未经包合的挥发油，干燥，即得，其具体操作方法如下：

当温度为60℃时，β-环糊精在水中的溶解度为80g/L。精密称取β-环糊精8g，溶于60℃100mL水中，制成环糊精饱和水溶液。以莪术挥发油加入量（g），滴完后继续搅拌时间（h）及冷藏（2～10℃）静置时间（h）为考察因素，进行三因素三水平L₉（3⁴）正交实验。精密称取不同重量的莪术挥发油，在不断搅拌下缓缓滴入60℃恒温的β-环糊精饱和溶液中，滴完后继续搅拌不同时间，冷藏不同时间后析出白色沉淀，抽滤，用乙醚洗涤沉淀物三次，每次10mL，将沉淀物干燥，粉碎过100目筛，精密称定总重量，计算出包合率，正交实验设计如表13所示，正交实验检测结果如表14所示：

表13莪术油β-环糊精包合正交实验设计表

表14莪术油β-环糊精包合实验检测

从表14中极差R值大小显示，各因素对包合效果影响大小顺序为A>B>C，再从各因素水平来看（K值分析），因素A为K₁>K₂>K₃，因素B为K₂>K₁>K₃，因素C为K₂>K₃>K₁。从表12直观分析，最佳β-环糊精对莪术油的包合条件为A₁B₂C₂。考虑到大生产实际情况，有必要对各因素下水平的显著性进行方差分析，结果见表15：

表15β-环糊精包合效果方差分析

表15方差分析结果表明：A因素影响有非常显著性意义（P<0.01）；B因素影响有显著性意义（P<0.05）；C因素影响无显著性意义（P>0.05），结合表12的直观分析，在温度为60℃的100mLβ-环糊精饱合溶液中，莪术油的最佳加入量为1.6g，继续搅拌时间为1小时，冷藏静置时间为12小时是最佳包合条件。

分别精密称取β-环糊精8g，溶于温度为60℃的β-环糊精12.5倍量的水中，保温。分别称取莪术油1.6g，在搅拌下缓缓滴加莪术油于β-环糊精溶液中，滴完后分别继续搅拌1小时，冰箱冷藏放置12小时，分别用乙醚洗涤三次，每次10mL，弃去醚液,干燥，分别计算包合收得率，验证三批，结果见表16。

表16莪术油β-环糊精最佳包合条件的验证

表16实验结果表明，验证试验结果与上述优选结果一致，即：精密称取β-环糊精8g，溶于60℃12.5倍质量的水中，保温。精密称取莪术油1.6g，在搅拌下缓缓滴加莪术油于β-环糊精溶液中，滴完后继续搅拌60分钟，冰箱静置12小时，干燥，粉碎，过100目筛，即得。也就是说，β-环糊精的用量为莪术油的5倍，加水量为β-环糊精的12.5倍，包合温度恒定为60℃，继续搅拌时间为1小时，冷藏静置时间为12小时为最佳包合条件。在此条件下的平均包合率为83.71%。

实施例7第三中间产物的制备条件筛选

（1）乙醇加热回流提取正交试验优选提取工艺

固定加热提取三次的前提下，以乙醇浓度，每次加乙醇量为所提取中药材的倍数及提取时间为考察因素，进行三因素三水平L₉（3⁴）正交试验，并以骆驼蓬总生物碱、冬凌草甲素及姜黄素的含量分别在三味中药材中所占的百分比例为评价指标（以下皆同），筛选最佳乙醇回流提取工艺条件。骆驼蓬总生物碱、冬凌草甲素及姜黄素含量的权重系数分别为0.3、0.3、0.4，由于这三种成分皆为治疗肝癌的有效成分，故将其作为设计权重系数的依据，由于莪术在处方中用量大，且为臣药，故将其权重系数设计为0.4，并以综合评分作为提取效果的衡量指标。

实验方法：精密称取除杂，洗净，烘干并粉碎成粗粉后的骆驼蓬子250g，冬凌草125g，莪术为500g提取挥发油后的干药渣粗粉，混合后加入不同提取浓度和不同药材重量倍数的乙醇，浸泡1小时，按正交条件进行三次不同时间的加热回流提取，药液用350目滤布过滤，滤液回收乙醇，减压（60℃，-0.08Mpa）浓缩至相对密度为1.30（50℃测得）的稠膏，即为第三中间产物。减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎过100目筛，得干膏细粉，精密称定干膏细粉总量。三种治疗肝癌有效成分含量测定方法如下：

A.骆驼蓬总生物碱的含量测定

取本实施例制得的干膏细粉l0g，精密称定，置索氏提取器中，加95%乙醇200mL、加热回流5小时，至生物碱提尽，提取液回收乙醇，加10%盐酸使PH为2～3，充分振摇后，移置分液漏斗中，用三氯甲烷分三次振摇提取，每次10mL，弃去三氯甲烷液，酸水溶液用10%碳酸钠中和至PH为10，将沉淀物离心，沉淀物用95%乙醇洗至蒸发皿中，干燥，通过碱性氧化铝-硅胶（6：4）混合层析柱（内径1.5cm，长12cm），用氯仿100mL洗脱，回收氯仿，干燥，精密称定，即得。

B.冬凌草甲素的含量测定

照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（55:45）为流动相；检测波长为239nm。理论板数按冬凌草甲素峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备：取冬凌草甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本实施例制得的干膏细粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，放置30分钟，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

C.姜黄素的含量测定

照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ D）测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-4%冰醋酸溶液（48:52）为流动相；检测波长为430nm。理论板数按姜黄素峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备：取姜黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含10μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本实施例制得的干膏细粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取上清液1mL，置20mL量瓶中，加甲醇稀释，定容，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。分别求得本实施例制得的干膏细粉中上述成分分别在三味中药材中的百分含量，正交实验设计如表17所示，实验检测结果如表18所示。

表17正交实验设计

表18乙醇加热回流提取正交试验检测结果

注：乙醇加热回流提取三个评价指标，采用综合评分法进行数据分析，总生物碱、冬凌草甲素、姜黄素含量的权重系数分别为0.3、0.3、0.4。

总生物碱含量评分=总生物碱含量/最大总生物碱含量×0.3×100

冬凌草甲素含量评分=冬凌草甲素含量/最大冬凌草甲素含量×0.3×100

姜黄素含量评分=姜黄素含量/最大姜黄素含量×0.4×100

综合评分=总生物碱含量评分+冬凌草甲素含量评分+姜黄素含量评分

从表18中极差R值大小显示，各因素对提取效果影响大小顺序为A>B>C，再从各因素水平来看（K值分析），因素A为K₃>K₂>K₁，因素B为K₃>K₂>K₁，因素C为K₁>K₃>K₂，从以上直观分析，最佳醇提条件为A₃B₂C₁。考虑到大生产实际情况，有必要对各因素下水平的显著性进行方差分析，结果见表19。

表19各实验提取效果方差分析

注：方差分析计算：

平方和 $S^2=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{(X_i-\stackrel{\&OverBar;}{X})}^2;$

均方 $M=\frac{S^2}{n-1};$

F值

其中，（M_误=M_D）。

查F分布临界值表，得F_0.05（2，2）=19.00

                   F_0.01（2，2）=99.00

从表19方差分析结果表明，因素A对提取效果有非常显著性意义（P<0.01），因素B对提取效果有显著性意义（P<0.05），因素C对提取效果无显著性意义（P>0.05）；结合表₁₆的直观分析，最佳醇提条件定为A₃B₂C₁，即乙醇浓度为95%，每次加药材10倍量95%乙醇，加热提取三次，每次2小时。据此条件验证三批，结果见表20：

表20乙醇加热回流提取验证试验结果

试验号	药材重量（g）	总生物碱含量（%）	冬凌草甲素含量（%）	姜黄素含量（%）
					1	875	3.20	0.21	0.16
2	875	3.21	0.22	0.15

3	875	3.19	0.22	0.16
					平均		3.20	0.22	0.16

表20显示，验证试验结果与正交最佳醇提条件试验结果一致。因此，确定骆驼蓬、冬凌草和本发明实施例5提供的第二滤渣的醇提条件为：95%乙醇10倍量，加热回流提取三次，每次2小时。

（2）醇提次数的选择

取本发明实施例4对莪术油提取后剩余第二中间产物，经过滤收集滤渣并干燥；

精密称取骆驼蓬子250g，冬凌草125g，除杂，洗净、烘干并粉碎成粗粉后与500g滤渣混合后加入95%浓度的10倍量乙醇（每次回流提取皆加10倍量提取浓度乙醇），浸泡1小时，每次回流提取2小时，药液用350目滤布滤过，滤液回收乙醇，减压（60℃，-0.08Mpa）浓缩至相对密度为1.30（50℃测得）的稠膏，为第三中间产物。减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎过100目筛，得干膏细粉，精密称定干膏细粉总量。

总生物碱、冬凌草甲素及姜黄素的含量测定方法同前。

分别求得干膏粉中上述成分分别在三味中药材中的百分含量，试验结果见表21：

表2195%乙醇提取次数的选择试验

*指前三次95%乙醇提取各成分含量在该成分提取总量中所占的百分比例。

**指第四次95%乙醇提取各成分含量在该成分提取总量中所占的百分比例。

试验结果表明，第四次95%乙醇提取各成分含量在该成分提取总量中所占的百分比例很小；说明三次95%乙醇回流提取已基本完全，为了省时节能，减少乙醇用量，故采用95%乙醇加热回流提取三次的生产工艺。在此生产工艺条件下，骆驼蓬总生物碱的转移率为91.4%（原生药含量为3.5%）；莪术中姜黄素的转移率为94.2%（原生药含量为0.17%）；冬凌草甲素的转移率为80.77%（原生药含量为0.27%。）

实施例8第四中间产物的制备条件筛选

处方中黄芪75g、柴胡25g，，洗净，润透，切成2mm片，烘干，精密称定。加10倍质量水，浸泡2小时，煎煮两次（每次皆加10倍质量水），每次3小时，350目滤布过滤，合并滤液，备用。将莪术50g，略泡，洗净，蒸软，切5mm片，干燥，精密称定。置中间有筛板的搪瓷缸内，加8倍量水浸泡2h，缸上接挥发油接收器及冷凝装置，在0.04Mpa压力下蒸馏8小时。过滤，滤液备用。药渣干燥，粉碎，过20目筛，备用。从馏出液中分离出莪术油，过滤获得滤渣，备用。将骆驼蓬子25g、冬凌草12.5g，洗净，烘干，粉碎，过20目筛，精密称定，加入上述滤渣。加10倍质量95%乙醇，浸泡1小时，回流提取三次（每次皆加10倍量95%乙醇），每次2小时，350目滤布趁热过滤，合并滤液，回收乙醇，浓缩液与上述黄芪、柴胡滤液及莪术滤液合并，采用不同的温度浓缩至相对密度为1.30（50℃测得）的稠膏，即为第四中间产物。减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎，过100目筛，精密称定为干膏细粉，并以药材中治疗肝癌的有效成分：黄芪甲苷、姜黄素、冬凌草甲素、柴胡皂苷a、d总量在各药材中的百分含量及干膏细粉得率为评价指标，筛选最佳浓缩温度。各成分的权重系数皆定为0.2，并以综合评分作为评价最佳浓缩温度的指标。各成分含量测定方法及综合评分计算方法皆同前，干膏粉量以实际称量为准，

采用不同的温度浓缩至相对密度为1.30（50℃测得）的稠膏，减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎，过100目筛，精密称定，并以药材中治疗肝癌的有效成分：黄芪甲苷、姜黄素、冬凌草甲素、柴胡皂苷a、d总量在各药材中的百分含量及干膏细粉得率为评价指标，筛选最佳浓缩温度。各成分的权重系数皆定为0.2，并以综合评分作为评价最佳浓缩温度的指标。各成分含量测定方法及综合评分计算方法皆同前，干膏粉量以实际称量为准，

黄芪甲苷含量测定方法如下：

照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ D）测定。

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（32:68）为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本实施例制备的干膏细粉1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇100mL，超声处理（功率250W，频率35KHz）30分钟，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水10mL使溶解，放冷，通过D₁₀₁型大孔吸附树脂柱（内径为1.5cm，柱高12cm），以水50mL洗脱，弃去水液，再用70%乙醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶液，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得，计算出黄芪甲苷在黄芪药材中的百分含量。浓缩温度的考察结果见表22。

表22浓缩温度对第四中间产物品质的影响

试验结果表明，60℃(-0.08Mpa)为最佳浓缩温度。据此条件验证三批，结果见表23

表23最佳浓缩温度验证试验结果

表23显示，验证试验结果，与上述最佳浓缩温度试验结果一致，故浓缩温度确定为60℃（-0.08Mpa）。在此工艺条件下，制得的第四中间产物中黄芪甲苷的转移率为91.04%（原生药含量为0.067%）。

实施例9减压干燥方法筛选

处方中黄芪75g、柴胡25g，，洗净，润透，切成2mm片，烘干，精密称定。加10倍质量水，浸泡2小时，煎煮两次（每次皆加10倍质量水），每次3小时，350目滤布过滤，合并滤液，备用。将莪术50g，略泡，洗净，蒸软，切5mm片，干燥，精密称定。置中间有筛板的搪瓷缸内，加8倍量水浸泡2h，缸上接挥发油接收器及冷凝装置，在0.04Mpa压力下蒸馏8小时。过滤，收集第二滤渣和第二滤液备用。药渣干燥，粉碎，过20目筛，备用。从馏出液中分离出莪术油，过滤获得滤渣，备用。将骆驼蓬子25g、冬凌草12.5g，洗净，烘干，粉碎，过20目筛，精密称定，加入第二滤渣。加10倍质量95%乙醇，浸泡1小时，回流提取三次（每次皆加10倍量95%乙醇），每次2小时，350目滤布趁热过滤，合并滤液，回收乙醇，获得第三中间产物，与本发明实施例4制备的第一滤液及本发明实施例5制备的第二滤液合并，采用不同的温度浓缩至相对密度为1.30（50℃测得）的稠膏，即为第四中间产物加入采用实施例3中提供的最优方法制备的第一中间产物6.5g，以及采用本发明实施例6筛选的方法以50g莪术制备的莪术油β-环糊精包合物，充分混匀，采用不同温度干燥，粉碎，过100目筛，即得本发明提供的中药组合物。精密称定，并以药材中治疗肝癌的有效成分：黄芪甲苷、姜黄素、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基总量、冬凌草甲素、柴胡皂苷a、d总量在各药材中的百分含量为评价指标，筛选最佳干燥温度。将各有效成分的权重系数皆定为0.2，并以综合评分作为最佳干燥温度的指标，各成分含量测定方法及综合评分计算方法皆同前，

华蟾酥毒基和酯蟾毒配基总含量测定方法如下：

照高效液相色谱法（中国药典2012年版一部VI D）测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（44：56）为流动相；检测波长为292nm。理论板数按华蟾酥毒基峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备：取华蟾酥毒基对照品、脂蟾毒配基对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL各含华蟾酥毒基、脂蟾毒配基50μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的本实施例制得的中药组合物，研细，取约3.5g，精密称定，置索氏提取器中，加入乙醚50mL，加热回流5小时，滤过，滤液加活性炭0.3g，振摇，放置5分钟，滤过，用乙醚10mL分次洗涤滤器及滤渣，合并滤液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解。转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。蟾酥抗癌有效成分华蟾酥毒基和酯蟾毒配基总量的转移率为97.33%（原生药含量为7.5%。）

检测结果见表24。

表24不同温度干燥产物品质检测

实验结果表明，60℃(-0.08Mpa)为最佳干燥温度。据此条件验证三批，结果见表25。

表25最佳干燥温度验证试验结果

表25显示，验证试验结果，与上述最佳干燥温度试验结果一致，故干燥温度确定为60℃（-0.08Mpa）。

实施例10本发明提供中药组合物制备方法与传统扶正散结汤剂制备方法对比

1）关于黄芪和柴胡的提取

a、传统汤剂提取工艺：

取黄芪75g、柴胡25g加8.3倍量水，武火沸腾5分钟，改文火煎煮1小时，过滤，取汁，药渣再加8.3倍量水，武火沸腾2分钟，改文火煎煮30分钟，过滤，取汁，两次汁液混匀，减压（60℃，-0.08MPa）浓缩成相对密度1.30（50℃测得）的稠膏，减压（60℃，-0.08MPa）干燥，粉碎成细粉，精密称定。

b、本发明提供的黄芪、柴胡水煎提取工艺

黄芪75g、柴胡25g，除去杂质，柴胡除去残茎，洗净，润透，切成2mm片，烘干，精密称定，加10倍量水，浸泡2小时，煎煮两次（每次皆加10倍量水），每次3小时，350目滤布过滤，合并滤液，减压（60℃，-0.08MPa）浓缩至相对密度1.30（50℃测得）的稠膏，减压（60℃，-0.08MPa）干燥，粉碎成细粉，精密称定。

C、黄芪、柴胡水煎煮提取工艺与原传统汤剂传统汤剂水煎提取效果分析。

采用三种治疗肝癌的有效部位及有效成分：总皂苷、总多糖、柴胡皂苷a、d总量作为衡量提取效果的指标，对原传统汤剂传统汤剂水煎提取工艺与最佳优选水煎提取工艺进行提取效果分析，三种成分含量测定方法同前，结果见表26。

表26黄芪、柴胡传统汤剂传统汤剂水煎提取与最佳优选水煎提取效果分析

表26实验结果表明，最佳优选水煎提取工艺各抗癌有效部位及有效成分的百分含量皆为传统汤剂传统汤剂水煎提取有效部位及有效成分百分含量一倍以上，故而，在本发明提供的处方中，虽然将传统汤剂中这两种中药材的用量减少了一半，但对疗效不会产生影响。

2）关于骆驼蓬子、冬凌草及滤渣的提取

A、传统汤剂传统汤剂提取工艺：

取骆驼蓬子250g，冬凌草125g，莪术500g，加8.3倍量水，武火沸腾5分钟，改文火煎煮1小时，过滤，取汁，药渣再加8.3倍量水，武火沸腾2分钟，改文火煎煮30分钟，过滤，取汁两次汁液混匀，减压（60℃，-0.08Mpa）浓缩成1.30（50℃测得）的稠膏，减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎成细粉，精密称定。

B、乙醇加热回流提取工艺：

取骆驼蓬子250g，冬凌草125g，莪术500g，莪术水蒸气蒸馏提取挥发油后的药渣干燥粗粉与骆驼蓬、冬凌草粉碎成的粗粉混匀，用10倍量95%乙醇加热回流提取三次，每次2小时，350目滤布过滤，滤液减压（60℃，-0.08Mpa）浓缩成1.30（50℃测得）的稠膏，减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎成细粉，精密称定。采用三种治疗肝癌的有效成分：总生物碱、冬凌草甲素、姜黄素在原药材中的百分含量作为衡量提取效果的指标对原传统汤剂传统汤剂水煎提取工艺与乙醇加热回流提取工艺进行提取效果分析，三种成分含量测定方法同前，结果见表27。

表27传统汤剂传统汤剂水煎提取与95%乙醇加热回流提取效果分析

表27实验结果表明，95%乙醇加热回流提取与传统汤剂水煎剂有效成分提取效果比较，总生物碱含量前者是后者的2倍；冬凌草甲素含量前者是后者的4倍；姜黄素含量前者是后者的2倍。故而，并将原传统汤剂中骆驼蓬子和莪术这两味中药材的用量减少一半，将冬凌草日用量减为原传统汤剂的1/4后，尽管原传统汤剂中各味药的用量减少了一半，但对晚期肝癌患者的治疗效果无影响。

实施例11本发明提供的中药组合物的制备

采用本发明实施例2～9筛选而得的最佳制备方法，制备本发明提供的中药组合物，具体为：

将62.5g茯苓除去杂质，充分洗净，及时削去外皮，干燥、粉碎，过100目筛，获得粒度为100目的茯苓粉，精密称定。

将2.5g蟾蜍充分洗净，挤取耳后腺和皮肤腺的白色浆液，加工，干燥，捣碎，加2倍量体积分数为60%的乙醇水溶液浸渍，时常搅动至呈稠膏状，干燥，粉碎，过100目筛，获得粒度为100目的蟾酥粉，精密称定。

采用配研法将蟾酥粉与茯苓粉充分混匀，加1倍量水湿法制粒，80℃加热灭菌三次，每次1小时，两次加热间隙室温保持24小时，减压（60℃，-0.08MPa）干燥，粉碎，过100目筛，获得粒度为100目的第一中间产物。

将750g黄芪、250g柴胡除去杂质，柴胡除去残茎，洗净，润透，切成2mm片，烘干，精密称定。加10倍量水，浸泡2小时，煎煮两次（每次皆加10倍量水），每次3小时，350目滤布过滤，合并滤液，获得第一滤液。

将称取500g莪术，切5mm片，干燥，精密称定。置中间有筛板的搪瓷缸内，加8倍量水浸渍2h，缸上接挥发油接收器及冷凝装置，在0.04Mpa压力下蒸馏8小时。过滤，收集第二滤液和滤渣，取滤渣干燥，粉碎，过20目筛，获得480g干燥滤渣，备用。从馏出液中分离出莪术油，精密称定共获得7.8g莪术油，备用。

称取莪术油重量的5倍的β-环糊精，溶于60℃β-环糊精质量12.5倍量水中，始终保持恒温，在不断搅拌下缓缓滴加莪术油于β-环糊精溶液中，滴完后继续搅拌60分钟，冷藏静置12小时，抽滤，干燥，粉碎成细粉，精密称定，获得46.8g莪术油的β-环糊精包合物，备用。

将250g骆驼蓬子、125g冬凌草，洗净，烘干，粉碎，过20目筛，精密称定，加入干燥滤渣480g。加10倍量95%乙醇，浸泡1小时，回流提取三次（每次皆加10倍质量的95%乙醇），每次2小时，350目滤布过滤，合并滤液，回收乙醇，浓缩液，获得第三中间产物。

取所述第一滤液、所述第二滤液和及第三中间产物合并，减压（60℃，-0.08Mpa）浓缩至相对密度为1.30（50℃测得）的稠膏，加入上述蟾酥、茯苓灭菌后的混合物及β-环糊精包合物，充分混匀，减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎，过65目筛得干膏粉，即为本发明提供的中药组合物499.7g。

实施例12本发明提供组合物的片剂的制备

称取黄芪75kg、莪术50kg、骆驼蓬子25kg、茯苓6.25kg、蟾酥0.25kg、冬凌草12.5kg、柴胡25kg。

将茯苓除去杂质，充分洗净，，及时削去外皮，干燥，粉碎，过100目筛，精密称定；将蟾蜍充分洗净，挤取耳后腺和皮肤腺的白色浆液，加工，干燥，捣碎，加2倍量体积分数为60%的乙醇水溶液浸渍，时常搅动至呈稠膏状，干燥，粉碎，过100目筛，精密称定。采用配研法将蟾酥细粉与茯苓细粉充分混匀，加1倍量水湿法制粒，80℃加热灭菌三次，每次1小时，两次加热间隙室温保持24小时，减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎，过100目筛。将黄芪、柴胡除去杂质，柴胡除去残茎，洗净，润透，切成2mm片，烘干，精密称定。加10倍量水，浸泡2小时，煎煮两次（每次皆加10倍量水），每次3小时，350目滤布过滤，合并滤液，备用。将莪术除去杂质，略泡，洗净，蒸软，切5mm片，干燥，精密称定。置中间有筛板的搪瓷缸内，加8倍量水浸渍2h，缸上接挥发油接收器及冷凝装置，在0.04Mpa压力下蒸馏8小时，过滤，滤液备用，药渣干燥，粉碎，过20目筛，备用。从馏出液中分离出莪术油，精密称定。称取莪术油重量5倍量的β-环糊精，溶于60℃β-环糊精12.5倍量水中，始终保持恒温，在不断搅拌下缓缓滴加莪术油于β-环糊精溶液中，滴完后继续搅拌60分钟，冷藏静置12小时，抽滤，干燥，粉碎，过100目筛，精密称定。将骆驼蓬子、冬凌草除去杂质，洗净，烘干，粉碎，过20目筛，精密称定，加入上述莪术的干燥药渣。加10倍量95%乙醇，浸泡1小时，回流提取三次（每次皆加10倍量95%乙醇），每次2小时，350目滤布过滤，合并滤液，回收乙醇，浓缩液与上述黄芪、柴胡滤液及莪术水蒸汽蒸馏后的滤液合并，减压（60℃，-0.08Mpa）浓缩至相对密度为1.30（50℃测得）的稠膏，加入上述蟾酥、茯苓灭菌后的混合物及β-环糊精包合物，充分混匀，减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，压制成10万片，每基片重0.5g，包糖衣，即得中药片剂，为糖衣片，除去糖衣后显棕黄色至棕褐色，气微，味微苦。

实施例13本发明提供组合物的胶囊剂的制备条件筛选

（1）颗粒休止角的测定

胶囊剂的填充分装，要求物料具有良好的流动性，以保证分装剂量的准确。流动性可用测定休止角的方法进行控制。休止角的测定采用固定漏斗法，即将三个漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上适宜高度处，使漏斗下口距坐标纸的距离为H，将粉碎过不同筛网的的物料倒入最上面的漏斗中，直到最下面漏斗形成的药粉的圆锥体尖端接触漏斗口为止，此时由坐标纸测出圆锥体底部直径，计算出休止角（t_gɑ=H/R）。一般要求胶囊剂填充物料的休止角控制在35℃以下，测定结果见表28。

表28通过不同筛网的颗粒剂流动性试验

序号	筛网（目）	H（cm）	R（cm）	tgɑ	ɑ
						1	50	5.0	7.62	0.656	33.25°
2	65	5.0	7.84	0.638	32.54°
						3	80	5.0	7.19	0.695	34.78°

休止角3﹥1﹥2，休止角愈小，流动性愈好。故在装胶囊前粉碎，过65目筛为宜。

（2）颗粒吸湿性考察

取颗粒约2g，置称量瓶中，精密称定，共12份，分为两组，每组6份，敞开称量瓶，分别放入相对湿度为30.00%，42.76%，57.70%，75.28%，84.26%,92.48%的环境中，在25℃培养箱中放置48小时，取出称量瓶，加盖后精密称定，计算吸水率，结果见表29。以水分含量为纵坐标，相对湿度为横坐标，绘制吸湿曲线，如图1所示。

表29各相对湿度条件下颗粒的吸湿情况（n=2）

相对湿度（RH）	30.00	42.76	57.70	75.28	84.26	92.48
							平均吸水率（%）	2.6	3.2	4.8	13.2	19.6	30.1

从吸湿曲线可以看出，随着环境相对湿度的增加，颗粒吸湿率也在增加，其吸湿曲线的拐点在60%，因此在进行产品的生产及包装时应控制环境的相对湿度在60%以下。

（3）成型工艺研究

取本发明实施例11制备的中药组合物，在湿度为60%以下的条件下，过65目筛得干膏粉，精密称定，按临床研究用质量标准检验合格后装胶囊，将经抛光并检测合格的胶囊，压制入铝塑板，最后进行外包装。试制出三批样品，批号为：20110603、20110606、20110609，按处方量投料，各制成1000粒，试验结果见表30：

表30成型工艺研究试验结果

表30:试验结果表明，本品在该工艺条件下生产的胶囊成型较好，三批样品的提取率和总收粉量基本稳定。证明该生产工艺重现性良好。

（4）每粒装量的确定

根据上述成型工艺研究结果，本实施例制备的胶囊剂一个处方量进入水煎及95%乙醇提取的中药材共计1875g：

平均提取率：（20.69%+20.72%+20.65%）÷3＝20.69%

干膏粉平均收得量：1875g×20.69%＝387.94g

莪术油平均提取重量：（7.8g+7.6g+7.9g）÷3＝7.8g

莪术油β-环糊精包合物平均收得量：（46.8g+45.6g+47.4g）÷3＝46.6g茯苓、蟾蜍细粉加入量：62.5g+2.5g＝65g

平均每粒装量：（387.94g+46.6g+65g）÷1000＝499.54g÷1000＝0.49954g≈0.5g

结论：该胶囊剂其规格确定为每粒装0.5g。

（5）去包装湿度加速实验

取上述胶囊适量，除去内外包装，分别放入相对湿度75%（饱和氯化钠溶液）、92.5%（饱和硝酸钾溶液）的两个密闭的干燥器内，将两个干燥器放入温度为25℃的恒温箱中，放置10天，定时取出。采用中国药典2010年版一部附录Ⅸ H烘干法测定水分，以观察其水分含量稳定性情况，结果如表31所示，结果表明，该胶囊放置10天，各个取样点获得的实际分析数据与0天比较，吸湿增重均在5%以下，未见明显吸潮，水分含量较稳定，说明无明显引湿性。

表31本发明提供的中药组合物胶囊去包装湿度加速试验结果

（6）、中试样品试验数据

按照本发明实施例1～8筛选的工艺参数，分别按原处分量的20倍、30倍和50倍投料，进行中试放大试验，进一步验证该工艺的可行性。试制出三批中试样品，批号：20111201、20111203、20111205，试验方法如下：

取茯苓除去杂质，充分洗净，，及时削去外皮，干燥、粉碎，过100目筛，精密称定；将蟾蜍充分洗净，挤取耳后腺和皮肤的白色浆液，加工，干燥，捣碎，加2倍量体积分数为60%的乙醇水溶液浸渍，时常搅动至呈稠膏状，干燥，粉碎，过100目筛，精密称定。采用配研法将蟾酥细粉与茯苓细粉充分混匀，加1倍量水湿法制粒，80℃加热灭菌三次，每次1小时，两次加热间隙室温保持24小时，减压（60℃，-0.08Mpa）干燥，粉碎，过100目筛。将黄芪、柴胡除去杂质，柴胡除去残茎，洗净，润透，切成2mm片，烘干，精密称定，加10倍量水，浸泡2小时，煎煮两次（每次皆加10倍量水），每次3小时，350目滤布过滤，合并滤液，备用。将莪术除去杂质，略泡，洗净，蒸软，切5mm片，干燥，精密称定。置中间有筛板的搪瓷缸内，加8倍量水浸渍2h，缸上接挥发油接收器及冷凝装置，在0.04Mpa压力下蒸馏8小时，滤过，滤液备用，蒸渣干燥，粉碎，过20目筛，备用。从馏出液中分离出莪术油，精密称定。称取莪术油重量5倍量的β-环糊精，溶于60℃β-环糊精12.5倍量水中，始终保持恒温，在不断搅拌下缓缓滴加莪术油于β-环糊精溶液中，滴完后继续搅拌60分钟，冷藏静置12小时，抽滤，干燥，粉碎，过100目筛，精密称定，备用。将骆驼蓬子、冬凌草除去杂质，洗净，烘干，粉碎，过20目筛，精密称定，加入上述莪术的干燥药渣，加10倍量95%乙醇，浸泡1小时，加热回流提取三次（每次皆加10倍量95%乙醇），每次2小时，350目滤布过滤，合并滤液，回收乙醇，浓缩液与上述黄芪、柴胡滤液及莪术水蒸汽蒸馏后的滤液合并，减压（60℃，-0.08MPa）浓缩至相对密度为1.30（50℃测得）的稠膏，加入上述蟾酥、茯苓灭菌后的混合物及β-环糊精包合物，充分混匀，减压（60℃，-0.08MPa）干燥，粉碎，过65目筛得干膏粉，精密称定，中间体检验合格后装胶囊（每粒装0.5g），将抛光并灯检合格后的胶囊，压制成铝塑板，最后进行外包装，试验结果见表32。

表32三批中试样品试验数据表

按临床研究用质量标准和微生物限度检查均符合规定，检验结果见三批中试样品检验报告书。表32中三批中试样品试验结果表明，本发明提供的中药组合物胶囊制剂提取率和成品率基本稳定，进一步证明了该生产工艺重现性良好，成品率皆在98.3%以上，证明该工艺切实可行。

（7）本实施例制备的的中药组合物胶囊制剂的稳定性试验

取本发明制备的中试样品，除去内外包装，开口放置：

1、置于温度为60℃的恒温箱中放置10天，于0.5、10天分别取样检测，进行高温试验。

2、置于密封的底部装有KNO₃饱和溶液（25℃，相对湿度92.5%）的干燥器内，将干燥器置于温度为25℃的恒温箱中放置10天，于0.5、10天分别取样检测，进行高湿试验。

3、于照度为4500I_X±500I_X条件下放置10天，在0.5、10天分别取样检测，进行强光照射试验。

上述实验结果表明：高温、高湿、强光对本品外观性状未见明显影响，与0天比较，上述三种因素对本品的水分检查、崩解时限和含量测定皆未见明显影响，各取样点实际分析数据与0天检测结果比较，其变化率皆小于5%。

A、加速稳定性试验：

经对本实施例制备的中药组合物胶囊制剂三批中试样品，按恒温（40℃±2℃）、恒湿（75℃±5℃）加速试验六个月，定期对其性状、水分、崩解时限、含量等项进行稳定性项目考察，试验结果表明，各项被检查指标均符合本品临床研究用质量标准，故认为本品质量稳定。

B、长期稳定性试验：

经对本实施例制备的中药组合物胶囊制剂三批中试样品，市售包装，在温度30℃±2℃，相对湿度65℃±5℃的条件下放置18个月，定期对其性状、水分、崩解时限、含量等项进行稳定性考察，试验结果表明，各项被检测指标均符合本品临床研究用质量标准，各个取样点获得的实际分析数据与0月检测结果比较其变化率皆小于5%，故认为本品质量稳定，进一步证明了采用铝塑包装作为本品内包装是合理的，切实可行的，本品可采用密封，置常温库贮藏。

实施例14本发明制备的中药组合物胶囊剂的毒理学试验

（1）急性毒性反应：

本发明实施例13提供的中药组合物胶囊制剂给昆明种小鼠灌胃未测出LD₅₀，24小时内给药2次，观察14天，小鼠无死亡。其最大受试药物量为40g/kg，相当原药材133.36g/kg，约为临床人拟用量的465.12倍。在此剂量下未观察到本发明提供的中药组合物胶囊制剂的急性毒性反应。

（2）长期毒性试验：

本发明实施例13提供的中药组合物胶囊制剂六个月长期毒性试验，共分四个组，大剂量组（38只大鼠♀♂各半），中剂理组（38只大鼠♀♂各半），小剂量组（38只大鼠♀♂各半），空白对照组（38只大鼠♀♂各半）。空白对照给及大中小各剂量组采用连续灌胃给药六个月，大剂量6g/kg，为临床用量的70倍，中剂量3g/kg，为临床用量的35倍；小剂量1.5g/kg，为临床用量的17.5倍。

观测项目包括一般性观察和全面观测。检测内容有血液学检查10项（红细胞、血红蛋白、红细胞容积、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、白细胞总数及其分类、血小板、网织红细胞、凝血时间）、血液生化学检查18项（总胆红素、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷草/谷丙、碱性磷酸酶、血糖、总胆固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐、肌酸激酶、及钠离子、钾离子和氯离子）以及脏器指数和病理组织学检查32项（包括心、肝、脾、肺、肾、脑、垂体、唾液腺、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、脊髓（颈、胸、腰）、主动脉、食管、气管、胃、十二指肠、胰腺、小肠、大肠、脊髓、肾上腺、肠系膜淋巴结、膀胱、坐骨神经、子宫（♀）、卵巢（♀）、乳腺（♀）、前列腺（♂）、睾丸（♂）、附睾（♂）、胸骨）。

结果：一般观察：无死亡或濒死大鼠，大鼠毛色清洁，行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状均正常；大鼠体重大、中剂量增长高于对照组；大鼠饲料摄入量增长不大，血液学检查10项指标检查与对照组比较无明显差异，无剂量关系。血液生化学检查18项指标显示：对照组、大剂量、小剂量个别动物生化值偏高，必个体差异；个别生化值与对照组虽有显著性差异，但也无剂量关系，与药物无必然联系。提示，本药对血液生化指标无明显影响。脏器系数显示，三个月、六个月、恢复期各剂量组脏器指数与对照组比较无显著性差异。病理组织学检查显示，未见明显毒性靶器官。

结论：本发明提供的中药组合物胶囊制剂的安全剂量为6g/kh，相当于临床拟用量的70倍。

综上：本发明实施例13提供的中药组合物胶囊制剂急性毒性试验其最大受试药物量为40g/kg，约为临用人拟用量的465.12倍，在此剂量下未观察到本发明提供的中药组合物胶囊制剂的急性毒性反应。本发明实施例13提供的中药组合物胶囊制剂6个月长期毒性试验其安全剂量为6g/kg，相当于临床拟用量的70倍，亦未观察到明显毒副作用和毒性靶器官。本品药效，犬有效剂量0.135g/kg，相当人用量的1.575倍；大鼠有效剂量0.72g/kg，相当人用量的8.4倍；小鼠有效剂量0.9g/kg，相当人用量的10.5倍。同等动物大鼠，安全剂量为有效剂量的8.33倍。提示本品可以进行进一步临床试验。

本发明实施例13提供的中药组合物胶囊制剂药效小鼠起效剂量为0.5g/kg，为临床拟用量5倍。

本发明实施例13提供的中药组合物胶囊制剂大鼠长毒安全剂量为6.6g/kg，为临床拟用量的66倍，为小鼠药效起效剂量的13.2倍。

实施例15本发明制备的中药组合物胶囊剂的毒理学试验

采用小鼠H₂₂移植瘤模型及裸鼠SMMC-7721移植瘤模型，观察本发明实施例13提供的中药组合物胶囊剂对其抑瘤作用、延长生命时间的影响；测定对荷H₂₂小鼠体液免疫、细胞免疫功能的影响，测定对SMMC-7721裸鼠脾脏中肿瘤坏死因子（TNF）及自然杀伤细胞（NK）的活性，测定对荷H₂₂小鼠的抗应激作用，实验设置给予相同剂量的传统汤剂的阳性对照。具体实验如下：

（1）本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对荷H₂₂小鼠实体瘤的影响；

（2）本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对SMMC-7721裸鼠实体瘤的影响；

（3）本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对荷H₂₂小鼠腹水瘤小鼠生存时间的影响；

(4)本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对荷H₂₂小鼠干扰素（IFNα-1b）活性的影响；

(5)本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对荷H₂₂小鼠白细胞介素（IL-2）活性的影响；

(6)本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对免疫低下荷H₂₂小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响；

(7)本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对免疫低下荷H₂₂小鼠溶血素抗体生成的影响；

(8)本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对SMMC-7721裸鼠肿瘤坏死因子（TNF）活性的影响；

(9)本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对SMMC-7721裸鼠脾脏自然杀伤细胞（NK）活性的影响；

（10）本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对免疫低下荷H₂₂小鼠抗应激（游泳）作用的影响；

（11）本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对免疫低下荷H₂₂小鼠抗应激（耐缺氧）作用的影响；

（12）本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂对免疫低下荷H₂₂小鼠抗应激（转棒）作用的影响。

结果：本发明提供的中药组合物胶囊剂及传统汤剂给药量分别为2.0g/kg、1.0g/kg、0.5g/kg时（折合生药7.76、3.88、1.94g/kg，相当临床拟用量的20、10、5倍）：

对荷H₂₂小鼠实体瘤三批实验平均瘤重明显减小(P﹤0.01)，本发明提供的中药组合物胶囊剂的平均抑瘤率分别为54.57%、44.11%、30.76%。

对人肝癌SMMC-7721裸鼠实体瘤三批实验平均瘤重明显减小(P﹤0.01，P﹤0.05)，本发明提供的中药组合物胶囊剂的平均抑瘤率分别为52.81%、40.78%、30.25%。

对荷H₂₂小鼠腹水瘤三批实验的生存时间明显延长(P﹤0.01，P﹤0.05)，本发明提供的中药组合物胶囊剂对平均生命延长率分别为44.88%、26.65%、14.18%。

本发明提供的中药组合物胶囊剂的及传统汤剂对荷H₂₂小鼠干扰素（IFNα-1b）及白细胞介素2（IL-2）的活性水平无明显影响(P>0.05)；

本发明提供的中药组合物胶囊剂的及传统汤剂能增强荷H₂₂小鼠的碳粒廓清能力，使吞噬指数明显升高（P﹤0.01，P﹤0.05）；

本发明提供的中药组合物胶囊剂的及传统汤剂能明显增强荷H₂₂小鼠的溶血素抗体生成能力(P﹤0.01)；

本发明提供的中药组合物胶囊剂的及传统汤剂能增强人肝癌SMMC-7721裸鼠的肿瘤坏死因子（TNF）及自然杀伤细胞（NK）的活性(P﹤0.01，P﹤0.05)；

本发明提供的中药组合物胶囊剂的及传统汤剂能明显延长荷瘤小鼠负重游泳时间及常压缺氧条件下的生存时间(P﹤0.01，P﹤0.05)；

本发明提供的中药组合物胶囊剂的及传统汤剂能明显延长转棒实验中小鼠转棒时间(P﹤0.01，P﹤0.05)。

结论：本发明提供的中药组合物胶囊制剂具有明显的抑制肿瘤生长、延长生存时间作用，增强荷H₂₂小鼠的碳粒廓清能力，使吞噬指数明显升高，增强荷H₂₂小鼠的溶血素抗体生成能力，增强裸鼠脾脏中肿瘤坏死因子（TNF）及自然杀伤细胞（NK）的活性，并具有一定的抗应激作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料制成： 

黄芪750份、莪术500份、骆驼蓬子250份、茯苓62.5份、蟾酥2.5份、冬凌草125份、柴胡250份。 

2.如权利要求1所述中药组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

步骤1：取茯苓，经清洗、去皮后，干燥、粉碎，得粒度为100目的茯苓粉；取蟾酥，干燥后，以体积分数为60%的乙醇水溶液浸泡并搅拌制得浸膏，经干燥、粉碎，获得粒度为100目的蟾酥粉；取62.5份所述茯苓粉、2.5份所述蟾酥粉与水混合，经湿法制粒，灭菌、干燥、粉碎，获得粒度为100目的第一中间产物； 

步骤2：取黄芪750份、柴胡250份，经清洗、以水第一浸泡120min、切片后，烘干，以水第二浸泡2小时，煎煮2次，每次3小时，经第一过滤收集第一滤液弃第一滤渣； 

步骤3：取莪术500份，经切片、干燥，以水第三浸泡2小时，以水蒸气蒸馏法提取，获得莪术油及第二中间产物；取所述莪术油及其5倍质量的β-环糊精，制得莪术油的β-环糊精包合物；取第二中间产物经第二过滤，收集第二滤液和第二滤渣； 

步骤4：取骆驼蓬子250份、冬凌草125份，清洗后，经烘干粉碎，与经干燥的所述第二滤渣混合，以体积分数为95%的乙醇水溶液浸泡1小时后，加热回流提取3次，每次2小时，经第三过滤收集第三滤液弃第三滤渣，浓缩至相对密度为1.30，获得第三中间产物； 

步骤5：取所述第一滤液、所述第二滤液和所述第三中间产物混合，减压浓缩至相对密度为1.30，获得第四中间产物； 

步骤6：取所述第一中间产物、所述第四中间产物和所述莪术油的β-环糊精包合物，混合，经减压干燥、粉碎，即得； 

其中所述相对密度在50℃测得。 

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述灭菌具体为：80℃加热灭菌3次，每次1小时，灭菌间隔时间为24小时，灭菌间隔 温度为20℃～30℃。 

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中取62.5份所述茯苓粉、2.5份所述蟾酥粉与水混合，其中所述茯苓粉和蟾酥粉的质量之和与所述水的质量之比为1：1。 

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述第二浸泡中，所述水的质量为黄芪与柴胡质量之和的10倍。 

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一过滤的粒度为350目。 

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述水蒸气蒸馏提取的压强为0.04Mpa，时间为8h。 

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述莪术油的β-环糊精包合物的制备方法具体为： 

步骤1：取所述莪术油5倍质量的β-环糊精，溶解于60℃的水中，制得β-环糊精溶液； 

步骤2：60℃，搅拌所述β-环糊精溶液，滴加所述莪术油，获得混合溶液； 

步骤3：取所述混合溶液，搅拌60分钟，2℃～10℃静置12小时，经抽滤、干燥、粉碎，过100目筛，即得。 

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤5中所述减压浓缩的温度为60℃，压强为-0.08MPa。 

10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤6中所述减压干燥的温度为60℃，压强为-0.08MPa。 

11.由权利要求2～10任一项所述方法制备的中药组合物。 

12.如权利要求1或11所述的中药组合物在制备治疗晚期肝癌药物中的应用。 

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊剂或片剂。 

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