CN103384667A - 作为PI3K/mTOR抑制剂的苯并氧氮杂卓及其使用和生产方法 - Google Patents

作为PI3K/mTOR抑制剂的苯并氧氮杂卓及其使用和生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及mTOR的抑制剂及其药学上可接受的盐或溶剂化物，及其使用方法。所述抑制剂通常具有结构式I及其药学上可接受的盐，其中变量如本文所定义。

Description

作为PI3K/mTOR抑制剂的苯并氧氮杂卓及其使用和生产方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年11月24日提交的美国临时申请No.61/417,165的优先权益，其通过引用并入本文。
序列表
本申请通过引用整体并入了2011年11月23日创建并于2011年11月23日随函提交的命名为“10-024_Sequence.txt”(16.7KB)的序列表。
发明背景
技术领域
本发明涉及蛋白激酶及其抑制剂的领域。具体而言，本发明涉及PI3K和/或哺乳动物雷帕霉素(rapamycin)靶蛋白(mTOR)信号转导途径的抑制剂及其使用和制备方法。
发明背景
PI3K途径调节细胞生长、增殖和存活，并且在人肿瘤中受异常调节的频率高。在肿瘤中PI3K途径活化通过多种机制发生，包括PIK3CA基因(编码PI3Ka的p110亚单位)的普遍突变和扩增或脂质磷酸酶PTEN的下调。在PI3K下游，mTOR通过其两种不同的信号转导复合物mTORC1和mTORC2控制细胞生长和增殖。考虑到PI3K信号转导对关键细胞功能的作用，靶向PI3K和mTOR的抑制剂可对具有PIK3CA或Ras的活化突变、PTEN缺失的肿瘤或在生长因子信号转导中上调的肿瘤的患者群体提供治疗性益处。
最近研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号转导对癌细胞生长、存活、运动力和代谢有显著影响。在癌症中通过几种不同的机制活化PI3K途径，包括编码关键组分的基因的体细胞突变和扩增。另外，PI3K信号转导可在肿瘤微环境中对非癌细胞起整体功能。因此，对研发作为治疗各种形式的癌症的方式的PI3K同种型的抑制剂，尤其是II类同种型PI3K-α、PI3K-β和PI3k-γ仍然有兴趣。
例如，磷脂酰肌醇3-激酶-α(PI3Kα)，一种双重特异性蛋白激酶，由85kDa调节亚单位和110kDa催化亚单位构成。由该基因编码的蛋白质表示使用ATP磷酸化PtdIns、PtdIns4P和PtdIns(4，5)P2的催化亚单位。通过多个机制抑制细胞生长的肿瘤抑制因子PTEN可使PIK3CA的主要产物PIP3去磷酸化。将蛋白激酶B(AKT1、PKB)转移至细胞膜依次需要PIP3，其中通过上游激酶磷酸化和活化PIP3。通过PIK3CA/AKT1途径介导PTEN对细胞死亡的影响。
PI3Kα已经牵连于细胞骨架重组、细胞凋亡、囊泡运输、增殖和分化过程的控制。PIK3CA拷贝数和表达增加与许多恶性肿瘤相关，例如卵巢癌(Campbell等，Cancer Res2004，64，7678-7681；Levine等，Clin Cancer Res2005，11，2875-2878；Wang等，Hum Mutat2005，25，322；Lee等，Gynecol Oncol2005，97，26-34)、宫颈癌、乳癌(Bachman等，Cancer Biol Ther2004，3，772-775；Levine，等，见上文；Li等，Breast Cancer Res Treat2006，96，91-95；Saal等，Cancer Res2005，65，2554-2559；Samuels和Velculescu，Cell Cycle2004，3，1221-1224)、结直肠癌(Samuels等，Science2004，304，554；Velho等，Eur J Cancer2005，41，1649-1654)、子宫内膜癌(Oda等，Cancer Res.2005，65，10669-10673)、胃癌(Byun等，Int J Cancer2003，104，318-327；Li等，见上文；Velho等，见上文；Lee等，Oncogene2005，24，1477-1480)、肝细胞癌(Lee等，同上)、小细胞和非小细胞肺癌(Tang等，Lung Cancer2006，51，181-191；Massion等，Am J Respir Crit Care Med2004，170，1088-1094)、甲状腺癌(Wu等，J Clin Endocrinol Metab2005，90，4688-4693)、急性骨髓性白血病(AML)(Sujobert等，Blood1997，106，1063-1066)、慢性骨髓性白血病(CML)(Hickey和Cotter J Biol Chem2006，281，2441-2450)和成胶质细胞瘤(Hartmann等，Acta Neuropathol(Berl)2005，109，639-642；Samuels等，见上文)。
哺乳动物靶蛋白mTOR是整合细胞生长、增殖和存活的细胞外和细胞内信号的蛋白激酶。来自细胞表面受体的细胞外促有丝分裂生长因子信号转导和运输缺氧压力、能量和营养状况的细胞内途径全部汇聚于mTOR。mTOR存在于两种不同复合物中：mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)。mTORC1是转录和细胞生长(经由其底物p70S6激酶和4E-BP1)的关键介质并且经由血清和糖皮质激素活化的激酶SGK促进细胞存活，然而mTORC2促进促存活激酶AKT的活化。考虑到其在细胞生长、增殖和存活中的主要作用，在癌症和其它疾病中mTOR信号转导往往调节异常或许并不令人惊讶(Bjornsti和Houghton Rev Cancer2004，4(5)，335-48；Houghton和Huang Microbiol Immunol2004，279，339-59；Inoki，Corradetti等，NatGenet2005，37(1)，19-24)。
mTOR是PIKK(PI3K相关激酶)非典型激酶家族的成员，包括ATM、ATR和DNAPK，并且其催化结构域与PI3K的催化结构域同源。PI3K信号转导调节异常是肿瘤细胞的常见功能。一般而言，可将mTOR抑制视为例如以下讨论的其中牵连PI3K信号转导的许多肿瘤类型中的一种策略。
mTOR抑制剂可能在治疗许多癌症中有用，包括以下：乳癌(Nagata，Lan等，Cancer Cell2004，6(2)，117-27；Pandolfi N Engl J Med2004，351(22)，2337-8；Nahta，Yu等，Nat Clin Pract Oncol2006，3(5)，269-280)；套细胞淋巴瘤(MCL)(Dal Col，Zancai等，Blood2008，111(10)，5142-51)；肾细胞癌(Thomas，Tran等，Nat Med2006，12(1)，122-7；Atkins，Hidalgo等，J Clin Oncol2004，22(5)，909-18；Motzer，Hudes等，J Clin Oncol2007，25(25)，3958-64)；急性骨髓性白血病(AML)(Sujobert，Bardet等，Blood2005，106(3)，1063-6；Billottet，Grandage等，Oncogene2006，25(50)，6648-6659；Tamburini，Elie等，Blood2007，110(3)，1025-8)；慢性骨髓性白血病(CML)(Skorski，Bellacosa等，Embo J1997，16(20)，6151-61；Bai，Ouyang等，Blood2000，96(13)，4319-27；Hickey和Cotter BiolChem2006，281(5)，2441-50)；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(Uddin，Hussain等，Blood2006，108(13)，4178-86)；肉瘤的几种亚型(Hernando，Charytonowicz等，NatMed2007，13(6)，748-53；Wan和Helman Oncologist2007，12(8)，1007-18)；横纹肌肉瘤(Cao，Yu等，Cancer Res2008，68(19)，8039-8048；Wan，Shen等，Neoplasia2006，8(5)，394-401)；卵巢癌(Shayesteh，Lu等，Nat Genet，1999，21(1)，99-102；(Lee，Choi等，Gynecol Oncol2005，97(1)26-34)；子宫内膜肿瘤(Obata，Morland等，Cancer Res1998，58(10)，2095-7；Lu，Wu等，Clin Cancer Res2008，14(9)，2543-50)；非小细胞肺癌(NSCLC)(Tang，He等，Lung Cancer2006，51(2)，181-91；Marsit，Zheng等，Hum Pathol2005，36(7)，768-76)；小细胞癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌(Massion，Taflan等，Am JRespir Crit Care Med2004，170(10)，1088-94)；一般的肺部肿瘤(Kokubo，Gemma等，Br J Cancer2005，92(9)，1711-9；Pao，Wang等，Pub Library of Science Med2005，2(1)，e17)；结直肠肿瘤(Velho，Oliveira等，Eur J Cancer2005，41(11)，1649-54；Foukas，C1aret等，Nature，2006，441(7091)，366-370)，尤其是表现出微卫星不稳定性的肿瘤(Goel，Arnold等，Cancer Res2004，64(9)，3014-21；Nassif，Lobo等，Oncogene2004，23(2)，617-28)、KRAS突变的结直肠肿瘤(Bos CancerRes1989.49(17)，4682-9；FearonAnn N Y Acad Sci1995，768，101-10)；胃癌(Byun，Cho等，Int J Cancer2003，104(3)，318-27)；肝细胞肿瘤(Lee，Soung等，Oncogene2005，24(8)，1477-80)；肝脏肿瘤(Hu，Huang等，Cancer2003，97(8)，1929-40；Wan，Jiang等，Cancer Res Clin Oncol2003，129(2)，100-6)；原发性黑素瘤及相关的肿瘤厚度增加(Guldberg，thor Straten等，Cancer Res1997，57(17)，3660-3；Tsao，Zhang等，Cancer Res2000，60(7)，1800-4；Whiteman，Zhou等，Int J Cancer2002，99(1)，63-7；Goel，Lazar等，J Invest Dermatol126(1)，2006，154-60)；胰腺肿瘤(Asano，Yao等，Oncogene2004，23(53)，8571-80)；前列腺癌(Cairns，Okami等，Cancer Res1997，57(22)，4997-5000；Gray，Stewart等，Br J Cancer1998，78(10)，1296-300；Wang，Parsons等，Clin CancerRes1998，4(3)，811-5；Whang，Wu等，Proc Natl Acad Sci U S A1998，95(9)，5246-50；Majumder和Sellers Oncogene2005，24(50)7465-74；Wang，Garcia等，Proc Natl Acad Sci U S A2006，103(5)，1480-5；(Lu，Ren等，Int J Oncol2006，28(1)，245-51；Mulholland，Dedhar等，Oncogene25(3)，2006，329-37；Xin，Teitell等，Proc Natl Acad Sci U S A12006，03(20)，7789-94；Mikhailova，Wang等，Adv Exp Med Biol2008，617，397-405；Wang，Mikhailova等，Oncogene2008，27(56)，7106-7117)；甲状腺癌，尤其是间变形亚型的甲状腺癌(Garcia-Rostan，Costa等，Cancer Res2005，65(22)，10199-207)；滤泡性甲状腺癌(Wu，Mambo等，J Clin Endocrinol Metab2005，90(8)，4688-93)；间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)；错构瘤、血管平滑肌脂肪瘤、TSC相关和分散性淋巴管肌瘤病：Cowden病(Cowden’s disease)(多发性错构瘤综合征)(Bissler，McCormack等，N Engl J Med2008，358(2)，140-151)；硬化性血管瘤(Randa M.S.Amin Pathology International2008，58(1)，38-44)；Peutz-Jeghers综合征(PJS)；头颈癌(Gupta，McKenna等，ClinCancer Res2002，8(3)，885-892)；神经纤维瘤病(Ferner Eur J HumGenet2006，15(2)，131-138；Sabatini Nat Rev Cancer2006，6(9)，729-734；Johannessen，Johnson等，Current Biology2008，18(1)，56-62)；黄斑变性；黄斑水肿；骨髓性白血病；全身性红斑狼疮；和自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)。
发明概述
以下仅仅总结了本发明的某些方面而实际上并非旨在限制。以下更全面地描述了这些方面和其它方面和实施方案。本说明书中引用的所有参考据此通过引用整体并入。如果本说明书的明确公开内容和通过引用并入的参考之间矛盾，应以本说明书的明确公开内容为准。
我们认识到PI3K和mTOR在生物学过程和疾病状态中的重要作用，并因此意识到，这些蛋白激酶的抑制剂将合需要，如2010年5月25日提交的序列号PCT/US2010/036032中所证明，其全部内容通过引用并入本文。相应地，本发明提供了抑制、调控和/或调节PI3K和/或mTOR并且在哺乳动物的过度增生性疾病(例如癌症)的治疗中有用的化合物。本发明还提供了制备所述化合物的方法，使用此类化合物治疗哺乳动物，尤其是人的过度增生性疾病的方法和含有此类化合物的药物组合物。
本发明的第一方面提供了式I的化合物
Figure BDA00003557632000061
或其单一异构体或立体异构体混合物，任选为其药学上可接受的盐，其中
RW为
Figure BDA00003557632000062
其中：
Ra和Rb各自独立地为-CO(C1-C6)烷基、-CO2(C1-C6)烷基、-SO2-(C1-C6)烷基、-NHSO2-(C1-C6)烷基、O-(C1-C6)烷基、O-(C1-C6)卤代烷基、O-(C1-C6)亚烷基-OR”’，其中R”’为H或(C1-C6)烷基
R1为H、(C1-C6)烷基)、NH2、NH(C1-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C7)-环烷基、NHCO2(C1-C6)烷基或N((C1-C6)烷基)2；
X为N或CH；
R4为H或卤代；
Q为N、C-H或C-(C1-C6)烷基、C-CN或C-CF3；
R6为H、(C1-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-NH2、(C1-C6)亚烷基-NH(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-NH(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)亚烷基-N(C1-C6)烷基)2、NH2、NH(C1-C6)烷基、羟烷基、(C1-C6)亚烷基-O(C1-C6)烷基、NH(C1-C6)亚烷基NH2、NH(C1-C6)亚烷基-环烷基、-NH(C1-C6)亚烷基-杂环烷基、N((C1-C6)烷基)2、(C1-C6)亚烷基-NHSO2-(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-NH(C＝O)-(C1-C6)烷基、-(C＝O)-NH2、-(C＝O)-(C1-C6)烷基、-(C＝O)-NH(C1-C6)烷基、-(C＝O)-N(C1-C6)烷基))2、-NHSO2-(C1-C6)烷基、-S(O)-(C1-C6)烷基、-SO2-(C1-C6)烷基、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C6)烷基、-SO2N((C1-C6)烷基)2、-CN、(C4-C7)杂环烷基、(C1-C6)亚烷基-(C3-C7)杂环烷基、硝基、(C1-C6)亚烷基-CN、NH(C1-C6)亚烷基-NH(C1-C6)烷基、NH(C1-C6)亚烷基-N((C1-C6)烷基)2或(C1-C6)亚烷基-OC(O)-(C1-C6)烷基，其中R6中的任一亚烷基经1、2或3个独立为卤代或羟基的基团任选取代，并且其中当任一亚烷基为-CH2-时，-CH2-的其中一个氢可被(C1-C3)卤代烷基任选置换；
R7为H、卤代、-NH2、硝基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、R7为-CF3、卤代(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、NH(C1-C6)烷基或N((C1-C6)烷基)2；
Y为N或C-R8，其中R8为H、卤代、(C1-C6)烷基、NH2、NH(C1-C6)烷基、N((C1-C6)烷基)2、(C2-C6)烯基、(C1-C6)亚烷基-O(C1-C6)烷基、羟烷基、(C1-C6)亚烷基-CO2(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-CO2H、苯基、-CF3、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、(C1-C6)亚烷基-(C3-C7)环烷基、COH、CO2H、-CO2(C1-C6)烷基、CN、(C1-C6)亚烷基-CN、(C1-C6)亚烷基-C≡C-H、(C1-C6)亚烷基-C≡C-(C1-C6)烷基、-C≡C-H、-C≡C-(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-苯基；其中R8中的任一苯基经1、2或3个基团任选取代，所述基团独立为卤代或烷基的；或
R7和R8连同与之连接的原子可连在一起形成任选含多达两个选自N-H、N-(C1-C6)烷基、O、SO和SO2的杂原子的5、6或7元饱和、部分不饱和或不饱和环，并且其中由R7和R8形成的环经1或2个独立地为烷基、烷氧基或卤代的基团任选取代；并且
Z为N或C-R9，其中R9为H、卤代或(C1-C6)烷基；并且
其中Q和Z中至少一个为N。
这个方面的实施方案可包括下列一种或多种。所述化合物为式Ia或I-2的化合物。
所述化合物为式Ia的化合物。
Figure BDA00003557632000082
所述化合物为式Ib的化合物。
所述化合物为式Ic-1或Ic-2的化合物。
Figure BDA00003557632000092
所述化合物为式Id的化合物，其中R4为H或F。
Figure BDA00003557632000093
所述化合物为式Ie的化合物。
Figure BDA00003557632000101
所述化合物为式I的化合物，其中R4为H。
另一方面，本发明提供了式1或表1的化合物或其单一立体异构体或异构体混合物，任选为其药学上可接受的盐或溶剂化物和2)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
另一方面，本发明提供了包含式I或表1的化合物或其单一立体异构体或异构体混合物，任选为其药学上可接受的盐或溶剂化物和2)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
本发明的另一方面是一种抑制mTOR体内活性的方法，所述方法包括向患者施用PI3K/mTOR-抑制有效量的式I或表1的化合物或其单一立体异构体或异构体混合物，任选为其药学上可接受的盐或溶剂化物或其药物组合物。在这个和其它方面和本文提供的实施方案中，所述化合物为PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ的抑制剂或其它PI3K同种型组合。
另一方面，本发明提供了治疗疾病、病症或综合征的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的式I化合物或其单一立体异构体或异构体混合物，任选为其药学上可接受的盐或溶剂化物，或包含治疗有效量的式I或表1的化合物或其单一立体异构体或异构体混合物，任选为其药学上可接受的盐或溶剂化物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
在本发明的另一方面中提供了一种治疗有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括：(a)如果所述肿瘤在PI3K-α激酶结构域中包含突变，向受试者施用PI3K-α选择性抑制剂、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合；或(b)如果所述肿瘤在PI3K-α螺旋结构域中包含突变，向受试者施用PI3K-α选择性抑制剂和PI3K-β选择性抑制剂的组合、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-β选择性抑制剂，其中PI3K-α选择性抑制剂、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合为式I或表1的化合物。
另一方面，本发明提供了一种鉴定PI3K同工酶的选择性抑制剂的方法，所述方法包括：(a)使在PI3K-α中携带第一突变的第一细胞与候选抑制剂接触；(b)使在所述PI3K-α中携带野生型PI3K-α、PTEN无效突变或第二突变的第二细胞与候选抑制剂接触；和(c)测量所述第一和第二细胞中的AKT磷酸化，其中与所述第二细胞相比，所述第一细胞中的AKT磷酸化降低鉴定所述候选试剂为选择性PI3K-α抑制剂，其中PI3K-α选择性抑制剂、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合为式I或表1的化合物。
另一方面，本发明提供了一种为具有包含PI3K-α的肿瘤的癌症患者确定治疗方案的方法，所述方法包括：确定所述PI3K-α的氨基酸1047和/或545中存在或不存在突变；其中如果所述PI3K-α在位置1047处有突变，所述方法包括向癌症患者施用治疗有效量的PI3K-α选择性抑制剂化合物或双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合；或其中如果所述PI3K-α在位置545处有突变，所述方法包括向癌症患者施用治疗有效量的PI3K-α选择性抑制剂和PI3K-β选择性抑制剂的组合或双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合；其中PI3K-α选择性抑制剂、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合为式I或表1的化合物。
另一方面，用于诊断、治疗或筛选的细胞包括从源自以下的肿瘤或癌症获得的癌症或肿瘤细胞：乳癌、套细胞淋巴瘤、肾细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、NPM/ALK转化的间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、间变性大细胞淋巴瘤、血管瘤、成胶质细胞瘤或头颈癌，其中PI3K-α选择性抑制剂、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合为式I或表1的化合物。
发明详述
缩写和定义
全篇中下列缩写和术语具有所示含义：
缩写 含义
br 宽
℃ 摄氏度
d 二重峰
dd 双二重峰
dt 双三重峰
DCM 二氯甲烷
DIEA或DIPEA N，N-二异丙基-N-乙胺
DMA N，N-二甲基乙酰胺
DME 1，2-二甲氧基乙烷
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
dppf 1，1’-二(二苯基膦)二茂铁
EI 电子轰击离子化
g 克
GC/MS 气相色谱法/质谱法
缩写 含义
h或hr 小时
HPLC 高压液相色谱法
L 升
LC/MS 液相色谱法/质谱法
M 克分子或摩尔浓度
m 多重峰
MeOH 甲醇
mg 毫克
MHz 兆赫(频率)
min 分钟
mL 毫升
μL 微升
μM 微克分子
μmol 微摩尔
mM 毫克分子
mmol 毫摩尔
mol 摩尔
MS 质谱分析
N 正常或常态
nM 毫微克分子
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
NMR 核磁共振光谱
q 四重峰
rt 室温
s 单峰
t或tr 三重峰
THF 四氢呋喃
符号“-”指单键，“＝”指双键，“≡”指三键，指单键或双键。当占用与符号连接的双键末端上的任一位置，即双键的E或Z几何构型不确定时，符号
Figure BDA00003557632000132
指双键上的基团。当从其母体公式中移除描绘基团时，符号用于理论上裂解的键的末端，以便将所述基团与其母体结构式分开。
当描绘或描述化学结构时，除非另外明确说明，假定所有碳具有氢取代以符合四价。例如，在以下示意图左手侧的结构中暗含有9个氢。在右手侧结构中描绘了9个氢。有时，在文本公式中将结构中的特殊原子描述为具有作为取代的氢(明确定义的氢)，例如-CH2CH2-。本领域的普通技术人员理解，前面提到的描述技巧在化学领域中常见以提供对其它复杂结构的简短和简单描述。
如果将基团“R”描绘为“漂浮”在环系上，例如下式：
Figure BDA00003557632000142
则，除非另外定义，只要形成稳定结构，取代基“R”可留在环系的任何原子上，假定置换描绘、暗含或明确定义的来自其中一个环原子的氢。
当将基团“R”描绘为存在于含有饱和碳的环系上时，例如下式：
Figure BDA00003557632000143
其中，在该实例中，“y”可大于1，假定各置换当前描绘、暗含或明确定义的环上的氢；则，除非另外定义，当所得结构稳定时，两个“R”可留在相同碳上。在另一实例中，相同碳，包括所述碳上的两个R可形成环，从而与描绘的环产生例如下式中的螺环结构：
关于本发明的化合物，“施用”及其变型(例如，“施用”化合物)指向需要治疗的动物体系引入化合物或化合物的前药。当与一种或多种其它活性试剂联合提供本发明的化合物或其前药(例如，手术、辐射和化疗等)时，将“施用”及其变型各自理解为包括同时和依次引入化合物或其前药和其它试剂。
“烯基”指2-6个碳原子的直链单价烃基或3-6个碳原子的支链单价烃基，所述基团含有至少一个双键，例如乙烯基、丙烯基、1-丁-3-烯基和1-戊-3-烯基等。
“烷氧基”指其中R是如本文所定义的烷基的-OR基团。实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基等。
“烷基”指1-6个碳原子的直链饱和单价烃基或3-6个碳原子的支链饱和单价烃基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基(包括所有异构形式)或戊基(包括所有异构形式)等。
“亚烷基”指1-6个碳原子的直链饱和单价烃双基或3-6个碳原子的支链饱和单价烃双基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基等。
“炔基”指2-6个碳原子的直链单价烃基或3-6个碳原子的支链单价烃基，所述基团含至少一个三键，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔-2-基等。
“氨基”指-NH2。
“芳基”指单价6-14元、单或双碳环，其中单环为芳香族而双环中至少一个环为芳香族。除非另有说明，只要化合价规则允许，基团的化合价可位于基团内任何环的任何原子上。代表性实例包括苯基、萘基和茚满基等。
“芳烷基”指如本文所定义，经一个或两个如本文所定义的芳基，例如苄基和苯乙基等取代的烷基。
“环烷基”指3-10个碳环原子的单环或稠环双环、饱和或部分不饱和(但是非芳香族)、单价烃基。稠合双环烃基包括螺环和桥环环系。除非另有说明，只要化合价规则允许，基团的化合价可位于基团内任何环的任何原子上。一个或两个环碳原子可被-C(O)-、-C(S)-或-C(＝NH)-基团置换。更具体地，术语环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己基或环己-3-烯基等。
“二烷基氨基”指其中R和R’是如本文所定义的烷基或其N-氧化物衍生物或受保护衍生物的-NRR’基团，例如二甲基氨基、二乙基氨基、N，N-甲基丙基氨基或N，N-甲基乙基氨基等。
“稠环系”指含有桥环或稠环的多环环系；即，其中两个环在其环结构中有一个以上的共用原子。在本申请中，稠环系不一定全部为芳香族环系。通常，但是不一定，稠环系共用邻位原子，例如萘或1，2，3，4-四氢-萘。本发明的稠环系本身具有通过稠环系的单个环原子与之连接的螺环。在一些实例中，如本领域的普通技术人员所了解，芳香体系上的两个相邻基团可稠合在一起形成环结构。稠环结构可含有杂原子并且可经一个或多个基团任选取代。
“卤素”或“卤代”指氟、氯、溴和碘。
“卤代(C1-C6)烷基”和“(C1-C6)卤代烷基”指经一个或多个卤素，具体地1、2、3、4、5或6个卤原子取代的烷基，例如三氟甲基、2-氯乙基和2，2-二氟乙基等。
“杂芳基”指5-14个环原子，含有一个或多个，具体地1、2、3或4个环杂原子的单环或稠合双环或三环单价基团，其中每个杂原子独立地为-O-、-S(O)n-(n为0、1或2)、-N＝、-NH-或N-氧化物，其余环原子为碳，其中包含单环基团的环为芳香族并且其中包含双环基团的至少一个稠环为芳香族。任何包含双环基团的非芳香环的一个或两个环碳原子可被-C(O)-、-C(S)-或-C(＝NH)-置换。稠合双环基团包括桥环系。除非另有说明，只要化合价规则允许，基团的化合价可位于杂芳基任何环的任何原子上。当化合价点位于氮上时，RX不存在。更具体地，术语杂芳基包括但不限于1，2，4-三唑基、1，3，5-三唑基、酞亚胺基、吡啶基、吡咯基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、吲哚基、2，3-二氢-1H-吲哚基(包括，例如，2，3-二氢-1H-吲哚-2-基或2，3-二氢-1H-吲哚-5-基等)、异吲哚基、吲哚啉基、异吲哚啉基、苯并咪唑基、苯并二氧杂环戊烯-4-基、苯并呋喃基、噌啉基、吲哚嗪基、萘啶-3-基、酞嗪-3-基、酞嗪-4-基、蝶啶基、嘌呤基、喹唑啉基、5，6，7，8-四氢喹唑啉基、喹喔啉基、四唑基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、苯并噁唑基、喹啉基、5，6，7，8-四氢喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基(包括，例如，四氢异喹啉-4-基或四氢异喹啉-6-基等)、吡咯并[3，2-c]吡啶基(包括，例如，吡咯并[3，2-c]吡啶-2-基或吡咯并[3，2-c]吡啶-7-基等)、苯并吡喃基、2，3-二氢苯并呋喃基、苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯基、2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、6，7-二氢-5H-环戊并[b]吡啶基、6，7-二氢-5H-环戊并[c]吡啶基、6，7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶基、5，6，7，8-四氢-5，8-乙烷喹唑啉-4-基和6，7，8，9-四氢嘧啶并[4，5-b]吲哚嗪-4-基及其N-氧化物和受保护的衍生物。
“杂环烷基”指3-8个环原子的饱和或部分不饱和(但是非芳香族)单价单环基团或5-12个环原子的饱和或部分不饱和(但是非芳香族)单价稠环或螺环双环基团，其中有一个或多个，具体地1、2、3或4个环杂原子，其中每个杂原子独立地为O、S(O)n(n为0、1或2)、-NH-或-N＝，其余环原子为碳。一个或两个环碳原子可被-C(O)-、-C(S)-或-C(＝NH)-置换。稠合双环基团包括桥环系。除非另有说明，只要化合价规则允许，基团的化合价可位于基团内任何环的任何原子上。当化合价点位于氮原子上时，Ry不存在。更具体地，术语杂环烷基包括但不限于氮杂环丁烷基、吡咯烷基、2-氧代吡咯烷基、2，5-二氢-1H-吡咯基、哌啶基、4-哌啶酮基、吗啉基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、四氢吡喃基、2-氧代哌啶基、硫代吗啉基、巯基吗啉基、六氢氮杂卓、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、噁唑啉基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、奎宁环烷基、异噻唑烷基、八氢环戊并[c]吡咯基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、十氢异喹啉基、2，6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-基、四氢呋喃基和四氢吡喃基及其衍生物和N-氧化物和受保护的衍生物。
“苯基烷基”指如本文所定义，经一个或两个苯基取代的烷基。
“任选”或“任选地”指，随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且描述包括所述事件或情况发生的例子和不发生的例子。本领域的普通技术人员将理解，关于描述为含有一个或多个任选取代基的任何分子，仅意在包括空间实用和/或合成可行的化合物。除非另有说明，“经任选取代”指术语中的所有后续修饰。以下在“经取代的”定义中呈现了一系列示例性任选取代基。
“氧代”指经双键连接的氧。
将本文所述每个反应的“产量”表示为理论产量的百分比。
“代谢产物”指在动物和人体内通过代谢或生物转化生成的化合物或其盐的分解或最终产物；例如，通过氧化、还原或水解生物转化为更具极性的分子，或生物转化为偶联物(对生物转化的讨论，见Goodman和Gilman，″The Pharmacological Basis of Therapeutics″附录8，Pergamon Press，Gilman等(编辑)，1990)。如本文所使用，本发明化合物或其盐的代谢产物可在体内为所述化合物的生物活性形式。在一个实例中，可使用前药，以致在体内释放生物活性形式，代谢产物。在另一实例中，偶然发现了生物活性代谢产物，即，未采用前药设计本身。根据本公开，本领域的技术人员已知对本发明化合物的代谢产物的活性的测定。
为了本发明的目的，“患者”包括人和其它动物，尤其是哺乳动物和其它生物。因此，所述方法适用于人治疗和兽医应用。在一个具体实施方案中患者为哺乳动物，并且在一个更具体的实施方案中患者为人。
化合物的“药学上可接受的盐”指药学上可接受并且具有母体化合物的所需药理活性的盐。应理解，药学上可接受的盐是无毒的。在通过引用并入本文的Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985或均通过引用并入本文的S.M.Berge等，“Pharmaceutical Salts，”J.Pharm.Sci.，1977；66：1-19中可找到关于适合的药学上可接受的盐的其它信息。
药学上可接受的酸加成盐的实例包括与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，以及有机酸例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡庚糖酸、4，4’-亚甲基二-(3-羟基-2-烯基-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸、对甲苯磺酸和水杨酸等形成的盐。
药学上可接受的碱加成盐的实例包括当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子置换形成的盐，例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。特定盐为铵、钾、钠、钙和镁盐。源自药学上可接受的无毒碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺盐，经取代胺，包括天然的经取代胺、环胺和碱离子交换树脂。有机碱的实例包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、葡甲胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺、聚胺树脂等。示例性有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。“铂”和“含铂试剂”包括(例如)顺铂、卡铂和奥沙利铂。
“前药”指在体内转化(通常迅速地)，例如在血液中通过水解转化以产生上式e的母体化合物的化合物。常见实例包括但不限于具有载有羧酸部分的活性形式的化合物的酯和酰胺形式。本发明化合物的药学上可接受的酯的实例包括但不限于烷基酯(例如具有约1至约6个碳原子)，烷基为直链或支链。可接受的酯还包括环烷基酯和芳烷基酯，例如但不限于苄基。本发明化合物的药学上可接受的酰胺的实例包括但不限于伯酰胺、仲酰胺和叔烷基酰胺(例如具有约1至约6个碳原子)。可根据常规方法制备本发明化合物的酰胺和酯。在T.Higuchi和V.Stella，“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”，A.C.S.Symposium Series第14卷和Edward B.Roche编辑的BioreversibleCarriers in DrugDesign，American Pharmaceutical Association andPergamon Press，1987中提供了对前药的全面讨论，二者通过引用并入本文。
“治疗有效量”是当向患者施用时，改善疾病症状的本发明化合物的量。组成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、疾病状态及其严重程度、待治疗患者的年龄等变化。通常可由本领域的普通技术人员考虑到其知识和本公开确定治疗有效量。
疾病、病症或综合征的“预防(preventing)”或“预防(prevention)”包括抑制疾病在人中出现，即使疾病、病症或综合征的临床症状不受所述疾病、病症或综合征影响或易患所述疾病、病症或综合征，但是尚未经历或表现出所述疾病、病症或综合征的症状的动物体内发展。
如本文所使用，疾病、病症或综合征的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括(i)抑制所述疾病、病症或综合征，即，阻止其发展；和(ii)减轻所述疾病、病症或综合征，即，引起所述疾病、病症或综合征消退。如本领域中所知，调节全身与局部递送、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病状严重程度可能必需，并且将由本领域的普通技术人员经常规实验确定。
本文公开的化合物还包括所有药学上可接受的同位素变体，其中至少一个原子被具有相同原子序数，但原子量与通常在自然界发现的原子量不同的原子置换。适合包括在公开化合物中的同位素的实例包括但不限于氢同位素，例如2H和3H；碳同位素，例如13C和14C；氮同位素，例如15N；氧同位素，例如17O和18O；磷同位素，例如31P和32P；硫同位素，例如35S；氟同位素，例如18F；和氯同位素，例如36Cl。使用同位素变体(例如，氘，2H)可获得由代谢稳定性更强带来的某些治疗优势，例如，体内半衰期增加或剂量需求减少。另外，公开化合物的某些同位素变体可并入在药物和/或底物组织分布研究中可能有用的放射活性同位素(例如，氚3H或14C)。
本发明的实施方案
以下段落呈现了本发明的许多实施方案。在每种情况下，实施方案包括叙述的化合物及其单一立体异构体或立体异构体混合物，及其药学上可接受的盐。
在式I化合物的一个实施方案中，R3为H或卤代。
在另一实施方案中，式I-1的化合物为式Ia的化合物，其中R4为H或F。
Figure BDA00003557632000211
在另一实施方案中，式Ia的化合物为式Ib的化合物。
Figure BDA00003557632000221
在另一实施方案中，所述化合物为式Ic-1或I-c2的化合物。
Figure BDA00003557632000222
在另一实施方案中，式Ic-2的化合物呈互变异构式Ic-3。
Figure BDA00003557632000223
在另一实施方案中，所述化合物为式Id的化合物，其中R4为H或F。
Figure BDA00003557632000231
在另一实施方案中，所述化合物为式Ie的化合物。
Figure BDA00003557632000232
在式I化合物的这些和其它实施方案中，
Figure BDA00003557632000233
为
Figure BDA00003557632000234
在另一实施方案中，
Figure BDA00003557632000235
Figure BDA00003557632000251
Figure BDA00003557632000261
Figure BDA00003557632000271
Figure BDA00003557632000281
在另一实施方案中，为
Figure BDA00003557632000283
Figure BDA00003557632000291
Figure BDA00003557632000301
在另一实施方案中，
Figure BDA00003557632000302
为
Figure BDA00003557632000303
Figure BDA00003557632000304
其中R6a和R6b各自独立地为H、(C1-C6)烷基或卤代(C1-C6)烷基。
另一实施方案中，在本文所述化合物公式中的R1为H、(C1-C6)烷基或NH2、NHCO(C1-C6)烷基。
另一实施方案中，本文所述式中的化合物为：
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-[2-(甲氧基)乙基]嘧啶-2-基}甲胺；
1-{4，5-二甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺；
N-乙基-N-({4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}甲基)乙胺；
{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}乙酸甲酯；
{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}甲醇；
{2-[(二甲基氨基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-5-基}乙酸甲酯；
1-(6，6-二甲基-4-{7-[4-(甲氧基)-3-{[2-(甲氧基)乙基]氧基}苯基]-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基}-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺；
1-{4-[7-{3-[(二氟甲基)氧基]-4-(甲氧基)苯基}-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺；1-(6，6-二甲基-4-{7-[4-(甲氧基)-3-(甲磺酰基)苯基]-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基}-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺；
N-[5-(4-{2-[(二甲基氨基)甲基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)-2-(甲氧基)苯基]甲磺酰胺；
N′-{5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基乙烷-1，2-二胺；
N-乙基-5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺；
N′-{5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基丙烷-1，3-二胺；
N-氮杂环丁-3-基-5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺；
N-氮杂环丁-3-基-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
N-[5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-2-(甲氧基)苯基]甲磺酰胺；
(5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸甲酯；
1-[5-(4-{2-[(二甲基氨基)甲基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)-2-(甲氧基)苯基]乙酮；
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-N-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-4-[6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(吡咯烷-1-基甲基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓；
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-苯基嘧啶-2-基}甲胺；
1-{5-(3-氟丙基)-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(2-甲基丙基)嘧啶-2-基}甲胺；
1-{6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}乙胺；
4-[2-(氟甲基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-基]-7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓；
N-({6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}甲基)乙酰胺；
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺；
6-氨基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]吡啶-3-腈；
6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺；
1-{5-溴-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺；
1-{5-氯-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺；
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-丙基嘧啶-2-基}甲胺；
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-丙-2-烯-1-基嘧啶-2-基}甲胺；
2-氟-N-({4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}甲基)乙胺；
4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-丙-2-烯-1-基嘧啶-2-胺；
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-[(4-氟苯基)甲基]-6-甲基嘧啶-2-胺；
1-{4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-7-(甲氧基)喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺；
N，N-二甲基-1-{4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-7-(甲氧基)喹唑啉-2-基}甲胺；
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺；
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-N-乙基-1H-苯并咪唑-2-胺；
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基嘧啶-2-胺；
4-[9-氟-7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺；
4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺；
6-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-胺
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基嘧啶-2-胺
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺
1-{4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-7-(甲氧基)喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺
4-甲基-5-(1-甲基乙基)-6-[7-(2-甲基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺；
4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
任选为其药学上可接受的盐。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含1)选自表1的呈其单一立体异构体或异构体混合物的式I(除非另外说明，此处和下文包括I-1、I-2、Ia、Ib、Ic、Id和Ie)化合物，任选为其药学上可接受的盐，和2)其药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
另一方面，本发明提供了一种治疗疾病、病症或综合征的方法，其中所述疾病与PI3K/mTOR直接或间接导致的不受控制、异常和/或有害的细胞活性相关，所述方法包括向有需要的人施用治疗有效量的式I、Ia、Ib、Ic、Id和Ie的化合物，任选为其药学上可接受的盐或药物组合物。在另一实施方案中所述疾病为癌症。
在这一方面的一个实施方案中，所述癌症为乳癌、套细胞淋巴瘤、肾细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、NPM/ALK转化的间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、间变性大细胞淋巴瘤、血管瘤、成胶质细胞瘤或头颈癌。
另一方面，本发明涉及一种治疗疾病、病症或综合征的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的式I化合物，任选为其药学上可接受的盐，或包含治疗有效量的式I化合物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。在另一实施方案中所述疾病为癌症。
在这一方面的一个实施方案中，所述癌症为乳癌、套细胞淋巴瘤、肾细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、NPM/ALK转化的间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、间变性大细胞淋巴瘤、血管瘤、成胶质细胞瘤或头颈癌。
在另一实施方案中，为式I化合物的本发明化合物作为体内PI3Kα、PI3Kβ和/或mTOR的抑制剂，研究PI3Kα和/或mTOR在生物学过程，包括本文所述疾病中的体内作用也有用。相应地，本发明还包括一种抑制体内PI3Kα和/或mTOR的方法，包括向哺乳动物施用本发明的化合物或组合物。
在以上提供的任何实施方案的另一实施方案中，所述癌症为乳癌、套细胞淋巴瘤、肾细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、NPM/ALK转化的间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、间变性大细胞淋巴瘤、血管瘤、成胶质细胞瘤或头颈癌。
另一实施方案涉及一种鉴定PI3K同工酶的选择性抑制剂的方法，所述方法包括：(a)使在PI3K-α中携带第一突变的第一细胞与候选抑制剂接触；(b)使在所述PI3K-α中携带野生型PI3K-α、PTEN无效突变或第二突变的第二细胞与候选抑制剂接触；和(c)测量所述第一和第二细胞中的AKT磷酸化，其中与所述第二细胞相比，所述第一细胞中的AKT磷酸化降低鉴定所述候选试剂为选择性PI3K-α抑制剂。在这个和以下提供的其它实施方案中，候选抑制剂为式I和表1的化合物。
可制备或从许多公司购买可使用本发明的方法筛选的候选抑制剂化合物库。例如，可从Comgenex(Princeton，N.J.)、BrandonAssociates(Merrimack，N.H.)、Microsource(New Milford，Conn.)和Aldrich(Milwaukee，Wis.)购买获得合成化合物库。大型化学公司也已经研发了候选抑制剂化合物库并且可从其购买获得。另外，通过常规化学、物理和生物方式易于修饰天然收集物、合成生成库和化合物。
在本文所述筛选方法的实践中使用的细胞可为初生细胞、次生细胞或永生化细胞(例如，确立细胞系)。它们可通过本领域众所周知的技术制备(例如，可通过来自患者或健康供体的细针活检获得细胞)或由免疫和微生物学商业资源购买(例如，从American Type CultureCollection(ATCC)，Manassas，Va.)。可选地或另外，可通过基因工程使细胞含有(例如)目标基因。在第一类细胞中，细胞在PI3K-α激酶结构域中具有基因突变，例如H1047R。在筛选测定中使用的第二类细胞中，第二类细胞在不同激酶催化亚单位中具有基因突变(例如，螺旋结构域中的突变(例如E545K)或不同调节蛋白中的突变(例如磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)))。当与在不同激酶催化亚单位中具有基因突变(例如，螺旋结构域中的突变(例如E545K)或不同调节蛋白中的突变)的细胞相比，在具有PI3K-α激酶结构域基因突变的细胞中候选抑制剂抑制磷酸化(例如AKT磷酸化)的程度更高时，则候选抑制剂是在PI3K-α中具有活化突变的癌症或肿瘤的选择性抑制剂。相反，与PTEN阴性、PI3K-α野生型和PI3K-α-E545K背景相比，在具有PI3K-α-H1047R突变的肿瘤细胞中PI3K-α选择性化合物以更强效力抑制AKT磷酸化、PI3K途径活化和细胞增殖。PTEN失活和KRAS活化均使细胞对PI3K-α选择性化合物的生长抑制效应不敏感。SEQID NO：1中说明性地提供了野生型PI3K-α并且由SEQ ID NO：2的mRNA编码。
在一些实施方案中，筛选测定中使用的第一和第二细胞的遗传背景不同。在一个实施方案中，第一细胞组在PI3K-α激酶结构域中有基因突变。在说明性实施方案中，第一细胞组中的基因突变包括mRNA的突变(GenBank登录号NM006218，版本NM006218.2GI：54792081，本文公开为SEQ ID NO：2，其编码在激酶结构域中有突变的全长PI3K-α)。在一个实施方案中，示例性突变在SEQ ID NO：2激酶结构域中的密码子(3296、3297和3298)处，其中密码子突变在SEQ ID NO：1中提供的PI3K-α的位置1047处提供了除组氨酸外的氨基酸。在一个示例性突变中，1047处的组氨酸突变为精氨酸(H1047R)。先前已经报道这种突变是PI3K/AKT信号转导途径中的显著致癌突变。第二细胞组缺乏第一试验细胞组的突变。在一个实施方案中，示例性突变在SEQ ID NO：2螺旋结构域中的密码子(1790、1791和1792)处，其中密码子突变在SEQ ID NO：1中提供的PI3K-α的位置542或545处提供了除谷氨酸外的氨基酸。在一个示例性突变中，545处的谷氨酸突变为赖氨酸(例如，E542K或E545K)。先前已经报道这种突变是PI3K/AKT信号转导途径中的显著致癌突变。
在一些实施方案中，第二细胞组可在PTEN中具有突变。
在一些实施方案中，第一细胞组可包括各种细胞系，包括癌细胞系，例如可由美国模式培养物保藏所((ATCC)American Type CultureCollection，Manassas，VA.)购买获得的携带PI3K-α的H1047R het基因突变的乳癌细胞系。在一些实施方案中，第一细胞可包括HCT-116、T-47D、MDA-MB-453、SIGOV-3、BT-20或LS H74T细胞系。在一些实施方案中，第二细胞可包括MCF-7、PC3MCI-H460、SK-BR-3、PC-3、MDA-MB-468、SK-BR-3、MDA-MB-231T或A549。购买后可根据提供的说明保存每种特定细胞系并且通常可通过ATCC获得。
在一些实施方案中，第一细胞组和第二细胞组还可包括已经用突变PI3K-α催化亚单位，例如H1047R het或E545K PI3K-α催化亚单位转化的非肿瘤细胞系。将核酸和载体引入分离细胞中，体外培养并选择转化宿主细胞的方法在本领域中已知并且包括使用氯化钙介导的转化、转导、接合、三亲交配、DEAE、葡聚糖介导的转染、感染、膜与脂质体融合、用涂有DNA的微粒高速轰击、直接显微注射至单个细胞中和电穿孔(见，例如，Sambrook等，见上文；Davis等，BasicMethods in Molecular Biology，第2版，McGraw-Hill Professional，1995；和Neumann等，EMBO J.，1：841(1982))。有几种瞬时或稳定地使用多种表达载体进行真核细胞转染的方法。使细胞系例如NIH3T3突变的方法，例如通过扩增编码目标突变PI3K-α催化亚单位的DNA序列。可将扩增的PCR突变PI3K-α构建体克隆至病毒表达载体中，例如pSX2neo，一种通过将猴病毒40早期启动子-新霉素磷酸转移酶基因插入pSX2中制备，设计为表达高水平10A1MLV Env的莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)长末端重复序列驱动的表达载体。NIH3T3细胞的转化可通过用不同CaPO4共沉淀技术转染进行。达到融合后，可将细胞转移至含有5％FBS、无地塞米松(dexamethasone)的培养基中。可通过用小孔吸管(从火焰上抽出产生细小尖端的巴斯德吸管(Pasteur pipette))从细胞层切除转化灶并且使用与移液管连接的橡胶球抽吸所述灶，从转化和未转化Env-质粒-转染细胞的混合物中分开且分离出形态学转化细胞。
在一些实施方案中，本文所述的方法需要在候选抑制剂存在下测试细胞，其中向单独的示例性测定孔中添加候选抑制剂，每个孔含有第一或第二细胞。候选抑制剂的量可不同，以致可测定抑制活性的范围，以测定候选抑制剂的IC50。这可通过将化合物连续稀释于适当溶剂(例如，DMSO)，然后稀释于孵育第一和第二细胞的培养基中容易地实现。在一些实施方案中，候选抑制剂的浓度范围可从约1pM至约1mM浓度。在一些实施方案中，可添加范围从约0.5nM至约10μM的量的候选抑制剂。候选抑制剂与第一和第二细胞组一起孵育可不同，通常范围从约30min至约60h。
在一些实施方案中，尤其是PI3K-α介导的活性，用生长因子刺激细胞。由细胞系的需求介导对生长因子的选择，例如，说明性生长因子可包括VEGF、IGF、胰岛素和调蛋白(heregulin)。
在一些实施方案中，可使用多种细胞活性测量候选化合物的抑制活性。当使用癌细胞系时，对细胞中PI3K介导的活性，例如AKT磷酸化(残基S473和T308处)、AKT活化、细胞增殖和凋亡抗性的抑制全部可测量。在一些实施方案中，可使用可从AbCam，Cambridge，MA购买获得的磷酸-特异性抗体(例如AKT1(phospho S473)，产品目录号ab8932；AKT1(phospho T308)产品目录号ab66134)测量第一和第二细胞组中AKT磷酸化的量。在通过引用整体并入本文的Donahue，A.C.等，Measuring phosphorylated Akt and other phosphoinositide3-kinase-regulated phosphoproteins in primary lymphocytes.MethodsEnzymol.2007(434)：131-154中描述了测量对第一和第二细胞组中PI3K-α活性的抑制的其它方法。
在另一实施方案中，本发明提供了一种为具有包含PI3K-α的肿瘤的癌症患者确定治疗方案的方法，所述方法包括：
确定所述PI3K-α的氨基酸1047和/或545中存在或不存在突变；
其中如果所述PI3K-α在位置1047处有突变，所述方法包括向癌症患者施用治疗有效量的PI3K-α选择性抑制剂化合物；或
其中如果所述PI3K-α在位置545处有突变，所述方法包括向癌症患者施用治疗有效量的PI3K-α选择性抑制剂和PI3K-β选择性抑制剂的组合、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合。
在另一实施方案中，本发明提供了一种为具有包含PI3K-α的肿瘤的癌症患者确定治疗方案的方法，所述方法包括：
确定所述PI3K-α的氨基酸1047和/或545中存在或不存在突变；
其中如果所述PI3K-α在位置1047处有突变，所述方法包括向癌症患者(受试者)施用治疗有效量的PI3K-α选择性抑制剂化合物、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂、PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合；或
其中如果所述PI3K-α在位置545处有突变，所述方法包括向癌症患者施用治疗有效量的PI3K-α选择性抑制剂和PI3K-β选择性抑制剂的组合、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合。
本发明的方法可用于鉴定更有可能受益于用PI3Kα选择性抑制剂治疗的癌症患者群体以及不大可能受益的患者群体。
本发明可用于进一步定义通过长期体外细胞系剖析和体内药效和功效研究鉴定PI3Kα抑制剂敏感肿瘤亚型的遗传标志或基因表达标记。
在一些实施方案中，根据在具有本文所述PI3K-α突变背景的癌症中PI3K-α选择性抑制剂的活性差异，可容易地进行为具有本文举例说明的癌症的癌症患者确定治疗方案的方法。在已经分析并测定了肿瘤细胞以确定肿瘤是否在激酶结构域中具有PI3Kα突变，例如产生H1047R的突变的患者中，可通过定制包含PI3K-α选择性抑制剂的治疗实现更高功效和治疗改进。对于具有在PI3Kα激酶结构域中不具有突变的肿瘤的患者而言，治疗可能需要采用不同治疗方案，例如，通过集中递送PI3K-α选择性抑制剂和PI3K-β选择性抑制剂的组合、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合。如上所示，在表1和本文的详细描述中举例说明了PI3K-α选择性抑制剂、mTOR选择性抑制剂和双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂。
在一些实施方案中，确定治疗方案的方法包括确定受试者肿瘤中PI3K-α的氨基酸1047和/或545中突变的存在。可使用突变特异性抗体，以多种方式，使用核酸方法、蛋白质分离方法或直接免疫方法完成这个步骤。在一些实施方案中，可使用氨基酸序列分析的任何适合方法确定受试者肿瘤中PI3K-α的氨基酸1047和/或545中突变的存在。适合技术的实例包括但不限于western印迹分析、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。
在本发明中，提到PI3Kα氨基酸序列中的位置是参考SEQ ID NO：1。提到PI3Kα核苷酸序列中的位置是参考SEQ ID NO：2。使用单字母氨基酸名称，后面是在蛋白质序列中的位置，描述野生型蛋白质序列中的特定氨基酸，例如E545指位置545为谷氨酸。为表示特殊位置的取代，取代氨基酸在位置后面，例如E545K指位置545处的谷氨酸被赖氨酸置换。
通常使用体外法确定PI3K-α肽序列中存在或不存在突变，其中使用已经从患者身体取出的肿瘤样品。
可使用任何适合方法确定PI3Kα的氨基酸序列或其一部分中存在或不存在突变。例如，可确定PI3Kα的核苷酸序列或其一部分并且可直接查询由核苷酸序列或PI3K-α蛋白推断的氨基酸序列。
可使用核酸序列分析的任何方法确定PI3K-α的核苷酸序列或其一部分。鉴定基因中序列突变的方法在本领域中众所周知并且可通过任何适合方法鉴定PI3Kα中的突变。这些方法包括但不限于动态等位基因特异性杂交；使用分子信标；基于酶的方法，例如使用DNA连接酶、DNA聚合酶或核酸酶；基于PCR的方法、全基因组测序；部分基因组测序；外显子组测序；核酸探针杂交；和限制性酶消化分析。
直接DNA测序方法在本领域中众所周知，(见例如：CurrentProtocols in Molecular Biology，由Fred M.Ausubel，Roger Brent，RobertE.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，KevinStruhl编辑，和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Joe Sambrook，David W Russel，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。这些测序法包括(例如)使用放射性标记的核苷酸和经荧光染料标记的核苷酸。
例如，Barbi，S.等使用下列方法为PI3K-α的螺旋结构域(外显子9)和激酶结构域(外显子20)测序。从石蜡包埋组织中提取出正常和肿瘤DNA，并使用荧光染料标记的引物，下列引物对扩增。需要挑选引物序列以独特地选择DNA区域，避免与附近的相似序列错误杂交的可能性。常用方法为BLAST检索，由此引物可与之结合的所有可能区域均可见。可通过BLAST检索核苷酸序列及引物本身。NCBI免费工具Primer-BLAST将引物设计工具和BLAST检索融入一个应用程序中，商业软件产品例如Beacon Designer(Premier BiosoftInternational，Palo Alto California)也是如此。应避免单核苷酸重复序列，因为可发生环形成并且有助于错误杂交。另外，计算机程序易于获得以帮助设计适合的引物。在某些实施方案中，标记核酸探针以用于Southern杂交测定中。核酸探针可经放射性标记、荧光标记或在免疫学上可检测，尤其是经地高辛标记(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)。
在一些实施方案中，确定外显子9中螺旋结构域突变的存在可包括分别使用正向引物和反向引物：GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC(SEQ ID NO：3)和CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT(SEQ ID NO：4)并且测序引物可包括TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA(SEQ ID NO：5)。
为确定外显子20中激酶结构域的突变，一类示例性引物可分别包括：正向和反向引物CTCAATGATGCTTGGCTCTG(SEQ ID NO：6)和TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC(SEQ ID NO：7)并且测序引物可包括TTGATGACATTGCATACATTCG(SEQ ID NO：8)。然后可为扩增产物测序。(Barbi，S.等，J.Experimental and Clinical Cancer Research2010，29：32)。然后比较序列并确定野生型PI3K-α序列和肿瘤PI3K-α序列之间的差异。也可仅通过扩增肿瘤DNA并且把肿瘤中的PI3K-α序列与SEQ ID NO：1的序列作比较进行所述测定。
在一些实施方案中，本发明提供了多核苷酸序列，包括全部或部分来自SEQ ID NO：2，在高度严格条件下能够与PI3K-α的螺旋区域或激酶结构域杂交的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸可包括与编码全部或部分PI3K-α或具有本文所述特定突变的PI3K-α的核酸序列互补的序列。术语“互补”和“互补性”指按碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，对于序列“A-G-T”而言，与序列“T-C-A”互补。互补性可为“部分”，其中根据碱基配对规则，仅一些核酸的碱基匹配。或者，在核酸之间存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
在一些实施方案中，本发明提供了多核苷酸序列，包括全部或部分来自SEQ ID NO：2，在高度严格条件下能够与oPI3K-α的螺旋区域或激酶结构域杂交的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明包括在测定中使用从受试者肿瘤分离的RNA确定在SEQ ID NO：1的位置1047、542或545的氨基酸处是否存在突变，所述测定可进一步包括：(a)使所述RNA样品逆转录为等效cDNA；(b)使用一对指向PI3K-α基因的预定区域的核酸探针扩增cDNA的预定区域；(c)为所述扩增cDNA区域测序以获得所述扩增cDNA区域的多核苷酸序列；和(d)确定所述扩增cDNA区域在编码SEQ ID NO：1的位置1047、542或545的氨基酸的密码子中是否含有基因突变。
在一些实施方案中，本方法可采用通过使用一对核酸引物扩增cDNA而扩增cDNA的预定区域，第一引物能够与编码SEQ ID NO：1的氨基酸1047或542或545处的氨基酸的DNA密码子上游的cDNA严格杂交，而第二核酸引物可操作以与编码SEQ ID NO：1的氨基酸1047或542或545处的氨基酸的DNA密码子下游的cDNA严格杂交。
在一些实施方案中，多核苷酸可包括与编码全部或部分PI3K-α或具有本文所述特定突变的PI3K-α的核酸序列互补的序列。术语“互补”和“互补性”指按碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，对于序列“A-G-T”而言，与序列“T-C-A”互补。互补性可为“部分”，其中根据碱基配对规则，仅一些核酸的碱基匹配。或者，在核酸之间存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
当提到核酸杂交使用时，“高度严格条件”包括当采用长度为约500个核苷酸的探针时，在42C°下于5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/lNaH2PO4.H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节为7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑鱼精子DNA组成的溶液中结合或杂交，接着在42C°下于包含0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤等效的条件。
当涉及核酸使用时，术语“同源性”指互补性的程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。“序列同一性”指对两个或更多个核酸或蛋白质之间关系的量度，以对于总比较长度的百分比给出。同一性计算考虑了在各自较大序列中相同和处于相同相对位置的核苷酸或氨基酸残基。可用计算机程序中所含的算法，例如“GAP”(Genetics Computer Group，Madison，Wis.)和“ALIGN”(DNAStar，Madison，Wis.)进行同一性的计算。部分互补序列是至少部分抑制完全互补序列(或与完全互补序列竞争)与靶核酸杂交，用功能术语“大体同源”所指的序列。可在低严格条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、液态杂交等)检查对完全互补序列与靶序列杂交的抑制。在低严格条件下，大体同源序列或探针将竞争并抑制完全同源的序列与靶标的结合(即，杂交)。这并不是说，低严格条件允许非特异性结合；低严格条件要求两个序列相互之间的结合为特异性(即，选择性)相互作用。可通过使用甚至缺乏部分程度的互补性(即，同一性小于约30％)的第二靶标测试不存在非特异性结合；在不存在非特异性结合时，探针不会与第二非互补靶标杂交。
在优选的实施方案中，杂交条件基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)并且赋予限定的“严格性”。术语“杂交”指互补核酸配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受例如核酸之间的互补程度、所涉条件的严格性、形成的杂交物的Tm和核酸内G∶C比例等因素影响。在其结构中含有互补核酸配对的单个分子称为“自交”。
术语“Tm”指核酸的“解链温度”。解链温度是一群双链核酸分子半数解离为单链时的温度。计算核酸Tm的方程式在本领域众所周知。如标准参考所示，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，可用方程式：Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算Tm简单估计值。术语“严格性”指进行核酸杂交的温度、离子强度和存在其它化合物(例如有机溶剂)的条件。以“高度严格”条件，仅在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间发生核酸碱基配对。
另外，可使用允许检测单核苷酸变异的任何序列特异性核酸检测方法，尤其是牵涉互补碱基配对的任何此类方法确定PI3Kα中的序列突变。例如，为确定PI3K-α是否包含E545突变，在聚合酶链式反应(PCR)中使用PI3K-α肽序列或其包含SEQ ID NO：2的核苷酸1790、1791和1792的部分(与氨基酸序列中的位置545相对应的密码子)，其中只有在位置1790的核苷酸为G时，寡核苷酸引物允许扩增PI3Kα。如果未形成反应产物，则位置545的氨基酸突变。在另一实例中，将寡核苷酸引物设计为如果位置3297的核苷酸为A则允许扩增(包含核苷酸3296、3297和3298的密码子与氨基酸序列的位置1047相对应)。如果使用那些引物未形成反应产物，则位置545的氨基酸突变。进行PCR的方法在本领域中已知(见Current Protocols inMolecular Biology，由Fred M.Ausubel，Roger Brent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl编辑，和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Joe Sambrook，David WRussel，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
动态等位基因特异性杂交(DASH)基因型分型利用由错配碱基对的不稳定性引起的DNA解链温度的差异。这种技术很适合自动操作。第一步，用生物素化引物，通过PCR反应扩增DNA片段并与珠粒连接。第二步，使扩增产物与链霉亲和素柱连接并用NaOH洗涤以去除未生物素化的链。然后当与双链DNA结合时，在发荧光的分子存在下添加序列特异性寡核苷酸。然后当温度升高至可确定Tm时，测量强度。单个核苷酸变化将导致比预期Tm低(Howell W.，Jobs M.，Gyllensten U.，Brookes A.(1999)Dynamic allele-specific hybridization.A new method for scoring single nucleotide polymorphisms.NatBiotechnol.17(1)：87-8)。因为DASH基因型分型是测量Tm的可量化变化，所以能够测量所有类型的突变，而不仅仅是SNP。DASH的其它好处包括能够用无标记探针工作并且其设计和执行条件简单。
分子信标也可用于检测DNA序列中的突变。分子信标利用特异性工程化的单链寡核苷酸探针。将寡核苷酸设计为在每个末端和位于之间的探针序列处有互补区域。这种设计使探针在其天然、分离状态下呈发夹或茎环结构。探针的一端连接荧光团而另一端连接荧光猝灭剂。由于探针的茎环结构，荧光团与猝灭剂靠得很近，从而防止分子发出任何荧光。还将分子工程化，使得仅探针序列与将在所述测定中使用的基因组DNA互补(Abravaya K.，Huff J.，Marshall R.，MerchantB.，Mullen C.，Schneider G.和Robinson J.(2003)Molecular beacons asdiagnostic tools：technology and applications.Clin Chem Lab Med.41：468-474)。如果在测定期间分子信标的探针序列遇到其靶基因组DNA，分子信标的探针序列将退火并杂交。由于探针序列的长度，探针的发夹片段将变性，有利于形成更长、更稳定的探针-靶标杂交物。由于发夹缔合，这种构象变化允许荧光团与猝灭剂摆脱其紧密靠近，使分子发荧光。另一方面，如果探针序列遇到仅仅具有一个非互补核苷酸的靶序列，分子信表将优先呈其天然发夹状态并且将观察不到荧光，因为荧光团保持猝灭。这些分子信标的独特设计允许简单诊断测定以鉴定指定位置的SNP。如果将分子信标设计为匹配野生型等位基因而另一个匹配等位基因的突变体，二者可用于鉴定个体的基因型。如果在所述测定期间仅检测到第一探针的荧光团波长，则个体为野生型纯合子。如果仅检测到第二探针的波长，则个体为突变等位基因纯合子。最后，如果检测到两个波长，则两个分子信标必须与其补体杂交，从而个体必须含两个等位基因并且为杂合子。
基于酶的核酸方法也适合并且预期用于确定PI3K-α核苷酸序列中的突变。例如，限制性片段长度多态性(RFLP)(以下更加详细地讨论)可用于检测单核苷酸差异。SNP-RFLP利用许多不同限制性内切核酸酶及其对独特的特异性限制位点的高亲和力。通过在基因组样品上进行消化并通过凝胶测定确定片段长度，可能断定酶是否切割预期限制位点。不能切割基因组样品导致片段比预期长很多，暗示在限制性位点处存在致使其免受核酸酶活性影响的突变。
本文使用术语“功能等效的密码子”指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸的6个密码子。
在本发明的一个实施方案中，所述方法包括用于确定编码氨基酸1047的密码子的序列的至少一个核酸探针或寡核苷酸。在另一实施方案中，所述方法包括用于确定编码氨基酸545的密码子的序列的至少一个核酸探针或寡核苷酸。寡核苷酸为PCR引物，优选只有在编码氨基酸1047的密码子编码组氨酸时允许扩增PI3Kα核酸序列片段的一系列PCR引物。在另一种方法中，只有在编码氨基酸545的密码子编码谷氨酸时，PCR引物或一系列PCR引物允许扩增核酸序列片段。适合PCR引物的确定在本领域中很常规，(Current Protocols inMolecular Biology，由Fred M.Ausubel，Roger Brent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl编辑；Looseleaf：0-471-650338-X；CD-ROM：0-471-30661-4)。另外，计算机程序易于获得以帮助设计适合的引物。在某些实施方案中，标记核酸探针以用于Southern杂交测定中。核酸探针可经放射性标记、荧光标记或在免疫学上可检测，尤其是经地高辛标记(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim)。
美国专利公布20010016323公开了使用荧光标记的寡核苷酸探针和荧光共振能量转移检测点突变的方法。导致探针和靶DNA链之间碱基错配的点突变引起复合物的解链温度低于如果探针和靶标完美匹配时探针和靶标的解链温度。
检测单点突变的其它适合方法包括(例如)美国专利公布2002010665中公开的方法，其牵涉使用阵列格式的寡核苷酸探针。此类阵列可包括SEQ ID NO：3-8中的一个或多个。美国专利公布20020177157公开了另外的检测点突变的方法。
可使用许多可用技术中的一种或多种鉴定携带导致PI3K-α激酶结构域突变的点突变，例如为本发明主题的H1047R的多核苷酸。然而，检测不限于本文所述技术并且本发明的方法和组合物不限于这些仅为了示例性目的提供的方法。本文还公开了多核苷酸和寡核苷酸探针并且在本发明的范围内，并且这些探针适于以下描述的一种或多种技术。这些包括等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)，在一个实施方案中，这是诊断突变检测方法，其中与相应于已知突变的等位基因的一对寡核苷酸杂交用于检测突变。另一种适合方法为变性高效液相色谱法(DHPLC)，这是设计用于基于对错配核苷酸之间异源双链体形成的检测鉴定突变和多态性的液相色谱法。在指定条件下，由于解链温度降低，所以异源双链体比同源双链体更早从柱上洗脱。然后可对个体样品进行分析。
可通过DHPLC分析含突变或野生型序列的DNA扩增区域。在美国专利No.5,795,976和6,453,244中描述了DHPLC的用途，二者通过引用并入本文。适合方法是由Transgenomic，Inc.(Omaha，Nebr.)，使用Transgenomic
Figure BDA00003557632000501
系统提供的方法。
对于ASO，通过PCR扩增含PI3K-α突变(H1047R和/或E545K)的基因组DNA或cDNA区域并转移至复制膜上。这可通过斑点/狭线印迹法、手动定点或消化和Southern印迹法完成。使膜预先杂交，然后与放射性标记或deoxygenin(DIG)标记的寡核苷酸杂交成突变或野生型序列。对于DIG标记而言，使用化学发光或比色法进行检测。然后更严格地洗涤膜直至从非特异性序列中洗掉ASO。放射自显影曝光后，为产物与每个寡核苷酸杂交的水平评分。最佳的是，对于正常和突变序列而言，在每个过滤器上包括对照，以确认恰当的严格性，并且使用阴性PCR对照检查PCR中的污染。
除本领域的技术参数外，ASO探针的尺寸不受限制。通常，过短的探针不是所述位置所独有的，而过长的探针可导致失去敏感性。寡核苷酸的长度优选为15-21个核苷酸，对寡核苷酸中心有错配。
优选使用正向引物进行PCR扩增样品DNA上进行ASO杂交以检测本发明突变的区域。对于外显子9而言，正向引物和反向引物分别为GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC(SEQ ID NO：3)和CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT(SEQ ID NO：4)并且测序引物为TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA(SEQ ID NO：5)，对于外显子20而言，正向引物和反向引物分别为CTCAATGATGCTTGGCTCTG(SEQ ID NO：6)和TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC(SEQ ID NO：7)。在这种情况下，不一定通过PCR或同等方法扩增，但是可任选进行。
任选地，可通过测序分析以上所述的一个或一个以上的扩增区域(包括使用SEQ ID NO：3-8的引物生成的306核苷酸区域)或这些区域中任一个的较短部分，以便检测突变。可如本领域中常规的那样进行测序。为了鉴定突变的存在，对测序区域选择的唯一限制是，选择用于测序的区域必须包括为突变对象的核苷酸。正如本领域中所知，除技术参数外，选择用于测序的区域的尺寸不受限制，并且可为包含使用本文公开的引物SEQ ID NOs：3&4和6&7扩增的所选区域之间的部分或所有DNA或RNA的较长区域测序。
以上公开的方法的变型也适于检测突变。例如，在ASO的变型中，ASO是具有末端脱氧核苷酸转移酶的均聚尾，沾到尼龙膜上，并通过紫外照射共价结合。用生物素化引物扩增靶DNA并与含有固定寡核苷酸的膜杂交，接着进行检测。这种反向斑点印记技术的实例为来自Innogenetics(Belgium)的INNO-LIPA试剂盒。
经鉴定并测序突变基因和基因产物，即在E545K和H1047R处有突变的SEQ ID NO：1，探针和对基因产物产生的抗体可用于各种杂交和免疫学测定中，以筛选并检测正常或突变基因或基因产物的存在。
突变基因在异源细胞系统中的表达可用于证明结构功能关系。将DNA序列连接至质粒表达载体中转染细胞是测试突变对各种细胞生物学参数的影响的有用方法。含有人或小鼠正常或突变序列或其一部分的质粒表达载体可用于鉴定对调节功能至关重要的蛋白质部分的体外诱变实验中。
在研究中可利用DNA序列来了解基因的表达及其产物，并实现大量蛋白质的生产以进行功能分析、抗体产生和患者治疗。序列的变化可能或可能不在相对量、组织特异性和功能性质方面改变表达模式。
有许多方法可用于分析变异(例如，突变或多态)核酸序列。检测多态性或突变的测定法分为几类，包括但不限于直接测序测定法、片段多态性测定法、杂交测定法和基于计算机的数据分析。进行这些测定法的多种变型的方法和可购买获得的试剂盒或服务可购买获得并且为本领域的技术人员已知。在一些实施方案中，联合或组合进行测定(例如，合并来自几种测定法的不同试剂或技术以产生一种测定法)。下列说明性测定法可用于筛选并鉴定含有目标PI3K-α突变的突变的核酸分子。
片段长度多态性测定法
在本发明的一些实施方案中，使用片段长度多态性测定法检测变异序列。在片段长度多态性测定法中，使用酶(例如，限制酶或CLEAVASE I[Third Wave Technologies，Madison，Wis.]酶)生成基于在一系列位置裂解DNA的独特DNA带型。来自含有SNP或突变的样品的DNA片段将具有不同于野生型的带型。
PCR测定法
在本发明的一些实施方案中，使用基于PCR的测定法检测变异序列。在一些实施方案中，PCR测定法包括使用仅与PI3Kα的变异或野生型等位基因(例如，与具有突变或多个突变的区域)杂交的寡核苷酸核酸引物。两类引物均用于扩增DNA样品。如果仅突变引物产生PCR产物，则受试者的肿瘤或癌症在PI3K-α突变等位基因中表达体细胞突变。为所用特异性寡核苷酸引物或寡核苷酸探针，筛选的DNA或RNA的质量和类型及可使用本领域普通技术人员已知的恰当试剂和/或PCR循环条件控制的其它众所周知的变量定制PCR扩增条件。
RFLP测定法
在本发明的一些实施方案中，使用限制性片段长度多态性测定法(RFLP)检测变异序列。首先使用PCR分离目标区域。然后用已知为指定多态性产生独特片段长度的限制酶消化的PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳分离限制酶切PCR产物并通过溴化乙锭染色可视化。将片段的长度与分子量标记和由野生型和突变体对照生成的片段作比较。
直接测序测定法
在本发明的一些实施方案中，使用直接测序技术检测变异序列。在这些测定法中，首先使用任何适合方法从受试者中分离出DNA样品。在一些实施方案中，将目标区域克隆至适合载体中并通过在宿主细胞(例如，细菌)中生长而扩增。在其它施方案中，使用PCR扩增目标区域中的DNA。
扩增后，使用任何适合方法为目标区域(例如，含目标SNP或突变的区域)中的DNA测序，包括但不限于使用放射性标记核苷酸手动测序或自动测序。使用任何适合方法展示测序结果。检查序列并确定存在或不存在指定SNP或突变。
CFLP测定法
在其它实施方案中，使用CLEAVASE片段长度多态性测定法检测变异序列(CFLP；Third Wave Technologies，Madison，Wis.；见例如，美国专利No.5,843,654、5,843,669、5,719,208和5,888,780；各自通过引用并入本文)。这种测定法基于观察到，当DNA的单链本身折叠时，它们呈现对于DNA分子的精确序列而言非常独特的高级结构。这些二级结构牵涉DNA的部分双链化区域，以致单链区域与双链DNA发夹并列。CLEAVASE I酶是一种结构特异性、耐热核酸酶，其识别并裂解这些单链和双链区域之间的接点。例如，首先使用PCR分离出目标区域。然后，通过加热使DNA链分开。接着，反应冷却以使得链内二级结构形成。用CLEAVASE I酶处理PCR产物以生成一系列对于指定SNP或突变而言独特的片段。分离并检测(例如，通过琼脂糖凝胶电泳)CLEAVASE酶处理的PCR产物并可视化(例如，通过溴化乙锭染色)。将片段的长度与分子量标记和由野生型和突变体对照生成的片段作比较。
杂交测定法
在本发明的一些实施方案中，在杂交测定法中通过杂交分析检测变异序列。在杂交测定法中，基于来自样品的DNA与互补DNA分子(例如，寡核苷酸探针或本文举例说明的探针)杂交的能力确定存在或不存在指定突变。使用各种技术进行杂交和检测的各种杂交测定法可用。以下提供了实践本发明方法的有关有用杂交测定法。
直接检测杂交
在一些实施方案中，通过可视化结合探针(例如，Northern或Southern测定；见例如，Ausabel等(编辑)(1991)Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，NY)直接检测探针与目标序列(例如，SNP或突变)的杂交。在这些测定法中，从受试者分离基因组DNA(Southern)或RNA(Northern)。然后用在基因组中很少裂解而在测定的任何标记附近不裂解的一系列限制酶裂解DNA或RNA。然后分离DNA或RNA(例如，在琼脂糖凝胶上)并转移到膜上。使标记(例如，通过并入放射性核苷酸)探针或对检测的SNP或突变有特异性的探针在一定条件或低培养基或高度严格条件下与膜接触。去除未结合的探针并通过可视化标记探针检测结合的存在。
使用“DNA芯片”测定法检测杂交
在本发明的一些实施方案中，使用DNA芯片杂交测定法检测变异序列。在这种测定法中，使一系列寡核苷酸探针附于固体支撑物上。将寡核苷酸探针设计成对于SNP或突变而言是独特的。使目标DNA样品与DNA“芯片”接触并检测杂交。
在一些实施方案中，举例说明的可购买获得的DNA芯片测定法可包括
Figure BDA00003557632000541
(由Affymetrix，Santa Clara，CA，USA购买获得)；见例如，美国专利No.6,045,996、5,925,525和5,858,659；各自通过引用并入本文)测定法。技术使用附于“芯片”的微型化、高密度寡核苷酸探针阵列。通过Affymetrix的结合了固相化学合成与半导体行业中采用的光刻制造技术的光引导化学合成工艺生产探针阵列。使用一系列光刻掩膜限定芯片暴露位点，接着进行特定化学合成步骤，所述工艺构建高密度寡核苷酸阵列，每个探针均在阵列中的预定位置。在大玻璃晶片上同时合成多个探针阵列。然后切割晶片，并将单个探针阵列包装在注塑成型的塑料盒中，保护探针阵列免受环境影响并用作杂交腔室。
分离待分析的核酸，通过PCR扩增，并用荧光报告基团标记。然后使用流体站，与阵列一起孵育标记DNA。然后将阵列插入扫描仪中，检测杂交模式。当从已经并入与探针阵列结合的靶标的荧光报告基团发光时，收集杂交数据。完美匹配靶标的探针通常产生比有错配的探针更强的信号。因为已知阵列上每个探针的序列和位置，按照互补性，可检测涂在探针阵列上的靶核酸的同一性。
酶检测杂交
在本发明的一些实施方案中，通过酶裂解特定结构检测杂交(INVADER测定法，Third Wave Technologies；见例如，美国专利No.5,846,717、6,090,543、6,001,567、5,985,557和5,994,069；各自通过引用并入本文)。INVADER测定法通过使用结构特异性酶裂解通过重叠寡核苷酸探针杂交形成的复合物检测特定DNA和RNA序列。对于无温度循环时存在的每个靶序列而言，温度升高和其中一种探针过量使得多个探针能够被裂解。然后这些裂解探针指导第二标记探针的裂解。可用经内部染料猝灭的荧光素标记二级探针寡核苷酸的5′-末端。裂解后，可使用标准荧光酶标仪检测去猝灭荧光素标记的产物。INVADER测定法检测未扩增基因组DNA中的特定突变。使分离的DNA样品与对本发明的突变或野生型PI3K-α序列有特异性的第一探针接触并使其杂交。然后使对第一探针有特异性并且含有荧光素标记的第二探针杂交并添加酶。通过使用荧光酶标仪并且将试样的信号与已知阳性和阴性对照作比较检测结合。
在一些实施方案中，使用TaqMan测定法检测结合探针的杂交(PEBiosystems，Foster City，Calif.；见例如，美国专利No.5,962,233和5,538,848，各自通过引用并入本文)。在PCR反应期间进行测定。TaqMan测定法利用AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。在PCR反应中包括对指定等位基因或突变有特异性的探针。探针由具有5′-报告染料(例如，荧光染料)和3′-猝灭染料的寡核苷酸组成。PCR期间，如果探针与它的靶标结合，AMPLITAQ GOLD聚合酶的5′-3′溶核活性在报告和猝灭染料之间裂解探针。将报告染料与猝灭染料分开导致荧光增强。信号随每个PCR循环积累并且可用荧光计监测。
根据本发明，还提供了将包括对上述诊断筛选而言所必需的试剂的诊断试剂盒。例如，可提供包括为检测和/或扩增突变PI3K-α和同等野生型PI3K-α相关的核苷酸序列而存在的寡核苷酸探针或PCR引物的试剂盒。同样，可标记此类探针，以更易于检测特异性杂交。正如对上述各种诊断实施方案恰当的是，可将此类试剂盒中的寡核苷酸探针固定至底物上并且可提供恰当对照。此类寡核苷酸探针的实例包括包含SEQ ID NO：3&4和6&7的至少一个或由SEQ ID NO：3&4和6&7的至少一个组成的寡核苷酸。
可使用氨基酸序列分析的任何方法确定PI3Kα的氨基酸序列中存在或不存在突变。非限制性实例包括：western印迹分析或ELISA测定，或受试者肿瘤中PI3Kα的直接蛋白质测序。在一些实施方案中，与突变PI3Kα相比，特别有用的抗体对野生型PI3K-α有特异性，例如，在测定中有用的抗体将与野生型PI3K-α或部分野生型PI3Kα结合，但是不与在目标氨基酸处有突变的PI3Kα结合。特别有用的抗体可包括结合在位置1047处具有组氨酸的野生型PI3Kα，但是不结合具有除组氨酸外的氨基酸(例如精氨酸)的突变PI3Kα的抗体，换言之，抗体与在位置1047处包含组氨酸的表位特异性结合。同样，结合在位置545处具有谷氨酸的野生型PI3Kα，但是不结合在位置545处具有除谷氨酸外的氨基酸(例如在所述位置的赖氨酸)的突变PI3Kα的抗体特别有用。
本发明的另一实施方案提供了一种包括与突变形式的PI3Kα的结合相比，使用与野生型PI3Kα蛋白选择性结合的至少一种抗体的方法。可选地，和与野生型PI3Kα蛋白的结合相比，抗体与突变形式的PI3Kα选择性结合并且可区分野生型PI3Kα和PI3Kα-H1047R或野生型PI3Kα和PI3Kα-E545K。本领域的技术人员通常已知从相对少量(少于1mg)的复合物混合物中分离出适量靶蛋白的方法。在一个说明性实施方案中，使用通常可用的溶解试剂，在蛋白酶抑制剂的存在下溶解来自受试者肿瘤或癌的一种肿瘤细胞或多种肿瘤细胞。使溶解产物澄清并且使上清液发生电泳并使用突变特异性抗体进行Western印迹法，或可选地，选择性免疫沉淀突变的PI3Kα-H1047R或PI3Kα-E545K并进一步与捕捉抗体解离并进行Western印迹法或直接为蛋白质测序。
“抗体”包括通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标，例如蛋白质、多肽、肽、碳水化物、多核苷酸、脂质等的任何免疫球蛋白分子。如本文所使用，在广义上使用术语并且包括完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(例如由至少两个完整抗体生成的双特异性抗体)、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其它修饰免疫球蛋白分子，只要抗体表现出所需生物学活性。分别基于其称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的同一性，抗体可为任何5大类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有众所周知的不同亚单位结构和三维构型。抗体可裸露或与其它分子偶联，例如毒素、放射性同位素等。
“抗体片段”可指完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于线性抗体；单链抗体分子；Fc或Fc′肽、Fab和Fab片段和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“嵌合抗体”指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链的可变区与源自一个物种的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)，具有所需特异性、亲和力和能力的抗体的可变区相对应，而恒定区与源自另一物种(通常为人)的抗体中的序列同源以避免在该物种中引起免疫反应。
“人源化”形式的非人(例如，兔)抗体包括含有源自非人免疫球蛋白的最小序列或不含序列的嵌合抗体。就绝大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)，例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物，具有所需特异性、亲和力和能力的高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。很多时候，人源化抗体可大体上包含至少一个，通常两个可变结构域的全部，其中全部或大体上全部的超变环与非人免疫球蛋白的高变环相对应并且全部或大体上全部的FR残基为人免疫球蛋白序列的FR残基。人源化抗体也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。在免疫学和分子生物学领域中，用于生成人源化抗体的方法众所周知。
“杂交抗体”可包括其中来自具有不同抗原决定区的抗体的重链和轻链对组装在一起，以致所得四聚体可识别并结合两个不同表位或两种不同抗原的免疫球蛋白分子。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可交换使用并且指能够被特殊抗体识别并特异性结合的抗原部分。当抗原为多肽时，可由通过蛋白质的三级折叠并列的连续氨基酸和非连续氨基酸形成表位。在蛋白质变性后，通常保留了由连续氨基酸形成的表位，而在蛋白质变性后，通常失去了通过三级折叠形成的表位。表位通常包括呈独特空间构象的至少3-5个，更通常地，至少5或8-10个氨基酸。
与表位“特异性结合”或表现出对表位的“特异性结合”指抗体与表位的反应或缔合比替代物质更频繁，和/或更迅速，和/或持续时间更长，和/或亲和力更强。
抗体的制备
多克隆抗体
优选通过多次皮下(sc)或腹腔(ip)注射相关抗原和佐剂，在动物体内产生多克隆抗体。可选地，可将抗原直接注射至哺乳动物的淋巴结内(见Kilpatrick等，Hybridoma，16：381-389，1997)。可通过使用双功能或衍生试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酰酐或本领域已知的其它试剂，使相关抗原与在待免疫物种中产生免疫的蛋白质，例如钥孔傶血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联获得更强的抗体反应。
通过合并(例如)100μg的蛋白质或偶联物(对于小鼠而言)与3个体积的弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)并在多个部位皮内注射所述溶液使动物对抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫。1个月之后，通过在多个部位皮下注射为动物加强原有量1/5至1/10于弗氏完全佐剂中的肽或偶联物。在加强注射7-14天后，为动物放血并测定血清的抗体滴度。为动物加强直至滴度稳定水平。优选地，用相同抗原的偶联物为动物加强，但是通过不同交联剂偶联。也可在重组细胞培养物中产生作为蛋白质融合的偶联物。同样，凝聚剂(例如明矾)适合用于增强免疫反应。
单克隆抗体
可使用Kohler等，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，使小鼠或其它恰当宿主动物，例如大鼠、仓鼠或猕猴免疫以得到产生或能够产生将与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。可选地，可在体外免疫淋巴细胞。然后使用适合融合剂(例如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。在优选含有抑制未融合、亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质的适合培养基中接种并培育这样制备的杂交瘤细胞。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是有效融合，支持所选抗体生成细胞高水平生成抗体并且对培养基敏感的骨髓瘤细胞。还描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。示例性鼠骨髓瘤系包括源自可从Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA获得的MOP-21和M.C.-11小鼠肿瘤和可从American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞的骨髓瘤系。测定杂交瘤细胞生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的生成。优选地，通过免疫沉淀法或体外结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。例如，可通过BIAcore或Scatchard分析测定单克隆抗体的结合亲和力(Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980))。
鉴定杂交瘤细胞生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体后，通过限制稀释过程亚克隆克隆系并通过标准方法培育(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(AcademicPress，1986))。为此，适合培养基包括(例如)D-MEMO或RPMI1640培养基。另外，和腹水瘤一样，在动物体内培育杂交瘤细胞。适当地通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法，从培养基、腹水液或血清中分离出亚克隆分泌的单克隆抗体。
抗体的重组生成
可通过直接蛋白质测序确定目标免疫球蛋白的氨基酸序列，并且可根据通用密码子表设计适合的编码核苷酸序列。
可选地，可使用常规程序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)从杂交瘤细胞中分离出编码单克隆抗体的DNA并测序。序列测定通常将需要分离至少一部分的目标基因或cDNA。通常这需要克隆编码单克隆抗体的DNA或mRNA。使用标准技术进行克隆(见，例如，Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Guide，第1-3卷，Cold Spring HarborPress，其通过引用并入本文)。例如，可通过逆转录聚腺苷酸+mRNA，优选膜相关mRNA构建cDNA库，使用对人免疫球蛋白多肽基因序列有特异性的探针筛选所述库。在一个优选实施方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码目标免疫球蛋白基因片段(例如，轻链可变片段)的cDNA(或全长cDNA的一部分)。可容易地将扩增序列克隆至任何适合载体中，例如表达载体、微基因载体或噬菌体展示载体。应了解，使用的特殊克隆方法不是关键，只要可能测定目标免疫球蛋白多肽的某个部分的序列。
一个用于克隆并测序的RNA源是通过从转基因小鼠获得B细胞并使B细胞与永生细胞融合生成的杂交瘤。使用杂交瘤的优势在于，可容易地筛选杂交瘤，并且杂交瘤生成所选目标人单克隆抗体。可选地，可从免疫动物的B细胞(或整个脾脏)分离RNA。当使用除杂交瘤外的来源时，可能期望筛选编码具有特定结合特征的免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽的序列。一种这样筛选的方法是使用噬菌体展示技术。例如，Dower等，WO91/17271；McCafferty等，WO92/01047；和Caton和Koprowski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6450-6454(1990)中描述了噬菌体展示，其各自通过引用并入本文。在一个使用噬菌体展示技术的实施方案中，分离来自免疫转基因小鼠的cDNA(例如，全脾脏cDNA)，使用PCR扩增编码免疫球蛋白多肽的一部分，例如CDR区域的cDNA序列，并将扩增序列插入噬菌体载体中。通过标准技术例如淘选，鉴定编码目标肽，例如具有所需结合特征的可变区肽的cDNA。然后测定扩增或克隆核酸的序列。通常，测定编码免疫球蛋白多肽的整个可变区的序列，然而，有时候仅仅需要为可变区的一部分测序，例如CDR编码部分。通常测序部分的长度将为至少30个碱基，且更经常地，将为编码至少1/3或至少约一半长度的可变区的碱基测序。可对从cDNA库分离的克隆进行测序，或当使用PCR时，在亚克隆扩增序列后或通过扩增片段的直接PCR测序进行测序。使用标准技术进行测序(见，例如，Sambrook等(1989)MolecularCloning：A Laboratory Guide，第1-3卷，Cold Spring Harbor Press，和Sanger，F.等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463-5467，其通过引用并入本文)。通过将克隆核酸的序列与公布的人免疫球蛋白基因和cDNA的序列作比较，技术人员可根据测序区域容易地确定(i)杂交瘤免疫球蛋白多肽(包括重链的同种型)的种系片段用途和(ii)重链和轻链可变区的序列，包括由添加N-区域和体细胞突变过程产生的序列。免疫球蛋白基因序列信息的一个来源是国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)、国家医学图书馆(National Library of Medicine)、美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院(National Institutes of Health，Bethesda，Md)。
一旦分离，DNA就可与表达控制序列可操作地连接或置于表达载体中，然后转染至不会另外生成免疫球蛋白的宿主细胞中，例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以指导重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。
表达控制序列指可操作连接的编码序列在特殊宿主生物中表达所必需的DNA序列。适合原核生物的控制序列(例如)包括启动子，任选操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
当和另一核酸序列处于功能关系时，核酸可操作地连接。例如，如果表达为参与多肽分泌的前体蛋白，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的NDA可操作地连接；如果影响序列的转录，启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果定位便于促进翻译，核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接指连接的DNA序列连续，并且在为分泌前导序列的情况下，连接的DNA序列连续并处于阅读阶段。然而，增强子不一定连续。可通过在方便的限制位点连接实现连接。如果不存在此类位点，根据常规实践可使用合成寡核苷酸衔接子或连接子。
细胞、细胞系和细胞培养物常常可交换使用并且所有此类名称包括子代。转化体和转化细胞包括初生受试细胞和由此得到的的培养物，不考虑转移次数。还应理解，由于故意或无意突变，所有子代在DNA含量上可能不精确相同。包括筛选用于原转化细胞，具有相同功能或生物学活性的突变子代。
提供了编码特异性抗体，任选与宿主细胞识别的控制序列可操作地连接的分离核酸，载体和包含核酸的宿主细胞，和生成抗体的重组技术，所述技术包括培养宿主细胞，以致核酸表达，并且任选地，从宿主细胞培养物或培养基中回收抗体。
在本领域中已知各种载体。载体组分可包括以下的一种或多种：信号序列(例如，可指导抗体分泌的信号序列)、复制起点、一个或多个选择性标记基因(例如，可赋予抗体或其它药物抗性，补充营养缺陷或供给培养基中没有的关键养分的选择性标记基因)、增强子元件、启动子和转录终止序列，其全部在本领域中众所周知。
适合的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。适合的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterohacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏杆菌属(Salmonella)(例如，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏杆菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷菌(Serratia marcescans))和志贺杆菌菌属(Shigella)，以及杆菌属(Bacilli)(例如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)。除原核生物外，真核微生物，例如丝状真菌或酵母，是适合抗体编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和菌株通常可用，例如毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)；假丝酵母(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉(Aspergillus)宿主(例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。
表达糖基化抗体的适合宿主细胞源自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒菌株和变体和来自宿主例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的相应许可的昆虫宿主细胞。用于转染此类细胞的各种病毒菌株公开可用，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-I变体和家蚕NPV的Bm-5菌株。
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最强，并且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例为中国仓鼠卵巢细胞，包括CHOKI细胞(ATCC CCL61)和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(DXB-11，DG-44；Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(亚克隆以便在悬浮培养中生长的293或293细胞，[Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977)]；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；小鼠滋养细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(WI38，ATCC CCL75)；人肝细胞瘤细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞和FS4细胞。
可在各种培养基中培养宿主细胞。可购买获得的培养基，例如Ham的F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔伯科改良伊格尔培养基((DMEM)，Sigma)适合培养宿主细胞。另外，Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469；WO90103430、WO87/00195或美国专利参考No.30,985中描述的任何培养基均可用作宿主细胞的培养基。必要时，可为这些培养基中的任一种补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素.TM.药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需补充物。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对于技术人员而言显而易见。
例如，可使用羟磷灰石色谱法、阳离子或阴离子交换色谱法，或优选亲和色谱法，使用目标抗原或蛋白质A或蛋白质G作为亲和配体纯化抗体组合物。蛋白质A可用于纯化基于人.γ.1、.γ.2或.γ.4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。对所有小鼠同种型和人.γ.3推荐蛋白质G(Guss等，20EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体附着的基质很多时候是琼脂糖，但是其它基质也可用。机械稳定的基质，例如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯允许比用琼脂糖可达到的流量更快且加工时间更短。抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABX.TM.树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，25NJ.)对纯化有用。根据特异性结合试剂或待回收的抗体，蛋白质纯化的其它技术，例如醇沉、反相HPLC、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也可能。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可交换使用并且指能够被特殊抗体识别并特异性结合的抗原部分。当抗原为多肽时，可由通过蛋白质的三级折叠并列的连续氨基酸和非连续氨基酸形成表位。在蛋白质变性后，通常保留了由连续氨基酸形成的表位，而在蛋白质变性后，通常失去了通过三级折叠形成的表位。表位通常包括呈独特空间构象的至少3-5个，更通常地，至少5或8-10个氨基酸。
与表位“特异性结合”或表现出对表位的“特异性结合”指抗体与表位的反应或缔合比替代物质更频繁，和/或更迅速，和/或持续时间更长，和/或亲和力更强。
在一些实施方案中，一旦使用上述一种或多种测定和方法分析受试者的肿瘤确定肿瘤是具有野生型PI3K-α还是突变PI3K-α，例如PI3K-αE545K或PI3K-αH1047R，可为受试者准备治疗方案。如果受试者的肿瘤具有在位置1047处具有突变(例如，H1047R)的PI3K-α，治疗方案包括向受试者施用治疗有效量的PI3K-α选择性抑制剂化合物或双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂，或PI3K-α选择性抑制剂或mTOR选择性抑制剂的组合。如果受试者的肿瘤具有在位置545处具有突变(例如，E545K)的PI3K-α，治疗方案包括向受试者施用治疗有效量的PI3K-α选择性抑制剂和PI3K-β选择性抑制剂的组合、双重PI3K-α/mTOR选择性抑制剂，或PI3K-α选择性抑制剂和mTOR选择性抑制剂的组合。
在另一实施方案中，本发明提供了包含用于进行本发明方法的物质的试剂盒。可由诊断室、实验室或医师进行本文所述的诊断/筛选程序。本发明提供了可用于这些不同环境的试剂盒。
可在试剂盒中将根据本发明的方法鉴定受试者肿瘤或癌症中的PI3K-α突变所需的基本材料和试剂组装在一起。在某些实施方案中，试剂盒包含特异性检测从本文公开的受试者肿瘤获得的核酸或蛋白质中的突变的至少一种PI3K-α氨基酸测序试剂，和根据本发明的一种或多种方法使用试剂盒的说明书。每个试剂盒必须包含赋予所述程序特异性的试剂。因此，为检测具有PI3K-αH1047R或E545K突变的mRNA，所述试剂将包含与mRNA互补的核酸探针，例如cDNA或寡核苷酸。核酸探针可能或可能不固定在基质表面(例如，微阵列)。为检测至少一个PI3K-α突变基因编码的多肽产物，所述试剂将包含与突变PI3K-α或野生型PI3K-α特异性结合的抗体。
根据所述程序，试剂盒可进一步包含以下的一种或多种：提取缓冲液和/或试剂、扩增缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、免疫检测缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂和检测工具。在试剂盒中还可能包括使用这些缓冲液和试剂进行所述程序的不同步骤的方法。
可提供呈固体(例如，冻干)或液体形式的试剂。本发明的试剂盒可任选包含为每种单独缓冲液和/或试剂混合样品和/或试剂的一个或多个容器(例如，小瓶、安瓿、试管、ELISA板、培养板、烧瓶或玻璃瓶)。通常每种组分适合在其各自的容器中等分或以浓缩形式提供。也可提供适合进行公开方法的某些步骤的其它容器。优选保持试剂盒的单独容器的商业销售受严格限制。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒进一步包含对照样品。例如，试剂盒可包括源自各种物理状态的组织的总mRNA样品，例如，用作对照的野生型PI3K-α、PI3K-αH1047R mRNA或PI3K-αE545KmRNA。在其它实施方案中，本发明试剂盒包含如本文所述，用作比较模板的至少一个前列腺疾病表达图谱。优选地，表达图谱是计算机可读介质中存储的数字信息。
根据本发明的一种或多种方法使用试剂盒的说明书可包括加工前列腺组织样品和/或进行试验的说明书，解释结果的说明书以及政府机关(例如，FDA)规定形式的控制医药品或生物制品的生产、使用或销售的通知。
代表性化合物
表1中描绘了本发明化合物的结构和名称。表中每一项旨在包括所示化合物及其单一立体异构体或立体异构体的混合物和药学上可接受的盐。根据经国际纯粹与应用化学联合会(International Union ofPure and Applied Chemistry)(IUPAC)、国际生物化学和分子生物学联合会(International Union of Biochemistry and MolecularBiology)(IUBMB)和化学文摘服务社(Chemical Abstracts Service)(CAS)协定的命名规则的系统应用为本发明的化合物命名。特别地，使用ACD/Lab命名软件8.00版本，产品版本8.08或更新，生成表1中的名称。
表1
Figure BDA00003557632000691
Figure BDA00003557632000701
Figure BDA00003557632000711
Figure BDA00003557632000721
Figure BDA00003557632000731
Figure BDA00003557632000741
Figure BDA00003557632000761
一般性施用
一方面，本发明提供了包含根据本发明的PI3K/mTOR抑制剂和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。在某些其它特定实施方案中，通过口服途径施用。可通过任何接受的施用模式或试剂进行呈纯净形式或适当药物组合物的本发明化合物或其药学上可接受的盐的施用为类似实用性服务。因此，例如可通过口服、鼻、肠胃外(静脉、肌内或皮下)、局部、经皮、阴道内、膀胱内、脑池内或直肠，呈固体、半固体、冻干粉形式或液体剂型，例如片剂、栓剂、丸剂、软弹性胶囊和硬明胶胶囊、粉末、溶液、悬浮液或气溶胶等，特别地呈适合单次施用精确剂量的单位剂型施用。
组合物将包括常规药物载体或赋形剂和作为活性剂的本发明化合物，并且，另外，可包括载体和佐剂等。
佐剂包括防腐剂、湿润剂、助悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、乳化剂和分散剂。可用各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止微生物的作用。也可能希望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶致使可注射药物形式的吸收延长。
若需要，本发明的药物组合物也可含有少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如柠檬酸、单月桂酸山梨醇酐酯、油酸三乙醇胺、丁基化羟基甲苯等。
制剂的选择取决于各种因素，例如药物施用模式(例如，对于口服施用，制剂呈片剂、丸剂或胶囊形式)和原料药的生物利用率。最近，特别是对于显示出弱生物利用率的药物，已经基于可通过增加表面积，即减少粒度可增大生物利用率的原理研发了药物制剂。例如，美国专利No.4,107,288描述了颗粒的尺寸范围从10至1,000nm的药物制剂，其中活性物质支持在大分子交联基质上。美国专利No.5,145,684描述了药物制剂的生产，其中在表面改性剂的存在下将原料药粉碎成纳米颗粒(平均粒度为400nm)，然后分散于液体基质中以产生展现出非常高的生物利用率的药物制剂。
适合肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌水或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液，和用于复水为无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。适合的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、丙三醇等)、其适合混合物、植物油(例如橄榄油)和注射有机酯(例如油酸乙酯)。例如，可通过使用包衣(例如卵磷脂)，在为分散体的情况下通过维持所需粒度并且通过使用表面活性剂维持适当流动性。
一个优选施用途径为口服，使用可根据待治疗疾病状态的严重程度调节的方便的每日给药方案。
供口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在此类固体剂型中，活性化合物混有至少一种常用惰性赋形剂(或载体)，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，或(a)填料或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，(b)粘合剂，例如纤维素衍生物、淀粉、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶，(c)保湿剂，例如丙三醇，(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、交联羧甲基纤维素钠、复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液缓凝剂，例如石蜡，(f)吸收加速剂，例如季铵化合物，(g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯、硬脂酸镁等，(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土，和(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、硫酸月桂酯钠或其混合物。在为胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可包含缓冲剂。
可用包衣和壳，例如本领域众所周知的肠溶衣和其它包衣制备上述固体剂型。上述固体剂型可含有安慰剂，并且还可具有以延迟方式在肠道的某一部分释放活性化合物的组合物。可用的嵌入组合物的实例为聚合物和蜡。活性化合物也可呈微胶囊化形式，如果适当，可具有一种或多种以上提到的赋形剂。
供口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。例如，可通过将本发明的化合物或其药学上可接受的盐和任选药物佐剂溶解、分散(等)于载体，例如水、盐水、含水右旋糖、丙三醇、乙醇等；增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺；油，尤其是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、丙三醇、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯；或这些物质的混合物等制备此类剂型，从而形成溶液或悬浮液。
除活性化合物外，悬浮液可含有助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧代乙烯山梨醇和山梨糖醇酐酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、膨润土、琼脂和黄芪胶或这些物质的混合物等。
供直肠施用的组合物是(例如)可通过使本发明化合物与(例如)在常温下为固体，但是在体温下为液体并且因此，在适合体腔内时融化并在其中释放活性组分的适合非刺激性赋形剂或载体(例如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡)混合制备的栓剂。
供局部施用本发明化合物的剂型包括软膏、粉末、喷雾和吸入剂。在无菌条件下使活性化合物与可能需要的生理上可接受的载体和任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。还将眼科制剂、眼膏、粉末和溶液考虑在本发明的范围内。
可使用压缩气体使本发明的化合物呈气溶胶形式分散。适合这一用途的惰性气体为氮气、二氧化碳等。
通常，根据预期施用模式，药学上可接受的组合物将含有约1重量％至约99重量％的本发明化合物或其药学上可接受的盐和99重量％至1重量％的适合药物赋形剂。在一个实例中，所述组合物将介于约5重量％至约75重量％的本发明化合物或其药学上可接受的盐，其余部分为适合药物赋形剂。
制备此类剂型的实际方法已知，或将对于本领域的技术人员显而易见；例如，见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(MackPublishing Company，Easton，Pa.，1990)。无论如何，待施用的组合物将含有治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，用于根据本发明的教导治疗疾病状态。
本发明的化合物或其药学上的盐或溶剂化物按将根据多种因素变化的治疗有效量施用，包括采用的特定化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用长度、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、施用模式和时间、排泄率、药物组合、特殊疾病状态的严重程度和主体接受的疗法。可按约0.1至约1,000mg/天范围内的剂量水平向患者施用本发明的化合物。对于体重为约70kg的正常成人而言，实例为在约0.01至约1,00mg/kg体重/天范围内的剂量。然而，所用具体剂量可不同。例如，剂量可取决于许多因素，包括患者的要求、治疗病状的严重程度和所用化合物的药物活性。特殊患者的最佳剂量的确定为本领域的普通技术人员众所周知。
如果配制成固定剂量，此类组合产品采用在上述剂量范围内的本发明化合物和在其批准剂量范围内的其它药物活性试剂。当组合制剂不适用时，可选地，本发明的化合物可与已知的药学上可接受的试剂一起依次使用。
一般合成
可通过以下描述的合成程序制备本发明的化合物。制备这些化合物使用的原材料和试剂可从商业供应商例如Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，Wis.)或Bachem(Torrance，Calif.)获得，或通过本领域技术人员已知的方法，按照参考中提出的程序制备，例如Fieser andFieser’s Reagents for Organic Synthesis，第1-17卷(John Wiley and Sons，1991)；Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds，第1-5卷和Supplementals(Elsevier Science Publishers，1989)；Organic Reactions，第1-40卷(John Wiley and Sons，1991)，March’s Advanced OrganicChemistry，(John Wiley and Sons，第4版)和Larock’s ComprehensiveOrganic Transformations(VCH Publishers Inc.，1989)。这些实施例仅仅为了说明可合成本发明化合物的一些方法，并且可对这些实施例进行各种修改并向查阅了本公开的本领域技术人员建议。若需要，可使用常规技术，包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱法等，分离并纯化反应的原材料和中间产物。可使用常规方式，包括物理常数和光谱数据，表征此类材料。
除非指出相反，本文所述的反应在大气压力和约-78℃至约150℃，更特别地约0℃至约125℃的温度范围内且更特别地在大约室温(或环境温度)下，例如约20℃下发生。除非另有说明(如在氢化的情况下)，所有反应在氮气氛围下进行。
可通过本领域技术人员已知的技术制备前药。这些技术通常修饰指定化合物中的恰当官能团。这些经修饰官能团通过常规操作或在体内再生原官能团。可根据常规方法制备本发明化合物的酰胺和酯。在T.Higuchi和V.Stella，“Pro-drugs as Novel Delivery Systems，”A.C.S.Symposium Series的第14卷，和Bioreversible Carriers in Drug Design，Edward B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association andPergamon Press，1987中提供了对前药的全面讨论，二者通过引用并入本文用于所有目的。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐在其结构中可具有不对称碳原子或季铵化氮原子。可通过本文所述合成制备的本发明化合物呈单一立体异构体、外消旋物和对映异构体和非对映异构体的混合物存在。化合物也可呈几何异构体存在。将所有此类单一立体异构体、外消旋物及其混合物和几何异构体规定为在本发明的范围之内。
本发明的一些化合物可含有活性酮-C(O)CF3并且可部分或全部呈-C(OH2)CF3形式存在。不管将化合物画成-C(O)CF3还是-C(OH2)CF3形式，二者均包括在本发明的范围之内。虽然可将单体化合物画成-C(O)CF3形式，但是本领域的普通技术人员将理解，化合物可部分或全部呈-C(OH2)CF3形式存在并且两种形式的比例可根据化合物及其存在的条件变化。
本发明的一些化合物可呈互变异构体存在。例如，当存在酮或醛时，分子以烯醇形式存在；当存在酰胺时，分子呈亚胺酸存在；并且当存在烯胺时，分子呈亚胺存在。所有此类互变异构体均在本发明的范围之内。
本发明还包括本发明化合物的N-氧化物衍生物和受保护衍生物。例如，当本发明的化合物含有可氧化氮原子时，可通过本领域众所周知的方法将氮原子转化为N-氧化物。当本发明的化合物含有例如羟基、羧基、硫醇等基团或含氮原子的任何基团时，可用适合的“保护基团”或“保护基”保护这些基团。在T.W.Greene，Protective Groupsin Organic Synthesis，John Wiley&Sons，Inc.1991中可找到适合保护基的综合列表，其公开内容通过引用整体并入本文。可通过本领域众所周知的方法制备本发明化合物的受保护衍生物。
本领域众所周知由立体异构体的外消旋混合物或非外消旋混合物制备和/或分开和分离单一立体异构体的方法。例如，可使用手性合成子或手性试剂制备旋光性(R)-和(S)-异构体，或使用常规技术分解。可通过本领域中普通技术人员已知的方法分解对映异构体(R-和S-异构体)，例如通过：形成(例如)可通过结晶分开的非对映异构体盐或复合物；通过形成(例如)可通过结晶分开的非对映异构体衍生物，一种对映异构体与对映异构体专用试剂的选择性反应，例如酶促氧化或还原，接着分开经修饰和未经修饰的对映异构体；或在手性环境中，例如在手性支撑物，例如具有结合的手性配体的硅胶上或在手性溶剂的存在下进行气-液或液体色谱法。应了解，通过上述其中一个分离程序将需要的对映异构体转化为另一化学实体时，可能需要另一步骤以释放所需对映异构体形式。可选地，可使用旋光性试剂、底物、催化剂或溶剂通过不对称合成或通过不对称转化将一种对映异构体转化为另一种对映异构体合成特定对映异构体。对于富含特殊对映异构体的对映异构体混合物，可通过再结晶进一步富集(伴随产量损伤)主要组分对映异构体。
另外，本发明的化合物可与药学上可接受的溶剂，例如水、乙醇等一起以未溶剂化以及溶剂化形式存在。一般而言，对于本发明的目的，认为溶剂化形式与未溶剂化形式等效。
制备本发明化合物的化学反应为本领域的技术人员已知。事实上，可能存在一种以上的工艺制备本发明的化合物。下列实施例说明但不限制本发明。本文引用的所有参考通过引用整体并入。
合成实施例
4-氯-5-异丙基-6-甲基嘧啶-2-胺
步骤1：
30min内在0℃下经滴液漏斗向2-异丙基乙酰酸乙酯(22.0g，0.18mol)和盐酸胍(18.0g，0.19mol)于甲醇(100mL)中的溶液添加甲醇钠(0.38mol，86.4mL，25％甲醇溶液)。使反应混合物升至室温，然后加热至50℃持续18h。浓缩混合物，用乙酸乙酯(20mL)稀释并用6N含水盐酸调节至pH6-7。过滤所得固体并用水洗涤。浓缩滤液并重复过滤获得第二批固体。在真空下干燥合并的固体以产生呈浅黄色固体的2-氨基-5-异丙基-6-甲基嘧啶-4(1H)-酮(16.8g，56％)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.5(s，1H)，6.17(s，2H)，2.85(m，1H)，2.03(s，3H)，1.15(d，6H)；C8H13N3O的MS(EI)：168.2(MH+)。
步骤2：
使2-氨基-5-异丙基-6-甲基嘧啶-4(1H)-酮(4.93g，29.5mmol)于磷酰氯(50mL)中的溶液回流18h。浓缩反应混合物并且如果是乙酸乙酯和水(各10mL)，用混合物分隔残渣。经添加固体碳酸氢钠直至水相pH为6-7，猝灭两相混合物。用乙酸乙酯(3×100mL)萃取水层并且在硫酸镁上干燥合并的有机溶液，过滤并浓缩以获得呈浅褐色固体的4-氯-5-异丙基-6-甲基嘧啶-2-胺(4.92g，90％)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ6.71(s，2H)，3.26(m，1H)，3.25(s，3H)，1.21(d，6H)；C8H12ClN3的MS(EI)：186.1(MH+)。
1-(4-氯-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺
步骤1：
向5，5-二甲基-2-氧代环己烷羧酸甲酯(6.0g，33mmol)和2-氯乙脒盐酸盐(4.6g，36mmol)于甲醇(30mL)中的溶液添加甲氧基钠(4.4M于MeOH中，9.0mL，40mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物3h，然后浓缩。使所得残渣分隔在乙酸乙酯和碳酸氢钠水溶液之间。用盐水洗涤有机层，在硫酸镁上干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化提供呈白色固体的2-(氯甲基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-醇(4.2g，57％产量)。C11H15ClN2O的MS(ES)：227(MH+)。
步骤2：
向2-(氯甲基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-醇(2.5g，11mmol)于THF(10mL)中的溶液添加二甲胺(2M于THF中，16.5mL，33mmol)。加热(60℃)反应混合物2h，然后分隔在乙酸乙酯和碳酸氢钠之间。用盐水洗涤有机层，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩以提供用于步骤3中，无需进一步纯化的2-((二甲基氨基)甲基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-醇。C13H21N3O的MS(ES)：236(MH+)。
步骤3：
向来自步骤2的最终残渣于CHCl3(10mL)中的溶液添加POCl3(10mL)。加热(90℃)反应混合物2h并浓缩。这种残渣分隔在二氯甲烷和碳酸氢钠水溶液之间并且用盐水洗涤所得有机层，在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩。于氯仿中，通过硅胶柱色谱法(5-10％于甲醇中的浓氨水)纯化提供1-(4-氯-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺(1.3g，48％产量)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ4.52(s，2H)，3.02(s，6H)，2.98(t，2H)，2.61(s，2H)，1.71(t，2H)，1.06(s，6H)；C13H20ClN3的MS(ES)：254(MH+)。
使用类似合成技术并且用醋酸铯代替步骤2中的二甲胺，制备(4-氯-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)乙酸甲酯：
7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸1，1-二甲基乙酯
Figure BDA00003557632000841
步骤1：
将可购买获得的5-溴-2-羟基苯甲醛(4.0g，10mmol)和2-氨基乙醇合并于THF/MeOH(100mL，10∶1)中并且边搅拌边添加硼氢化钠(0.76g，2.0mmol)。在40℃下搅拌所得反应混合物4h，在旋转蒸发器上浓缩，然后用EtOAc(50mL)和饱和NaHCO3(30mL)稀释。向该悬浮液中添加二碳酸二叔丁酯(2.83g，13mmol)。在室温下搅拌混合物过夜。用水洗涤有机层，在无水硫酸镁上干燥，过滤并在旋转蒸发器上浓缩。随后向粗反应产物中添加己烷，导致形成白色固体。过滤这种浆料以获得呈白色固体的5-溴2-羟基苄基(2-羟乙基)氨基甲酸叔丁酯(6.8g，98％)。C14H20BrNO4的MS(EI)，真实值：346(MH+)。
步骤2：
将5-溴-2-羟基苄基(2-羟乙基)氨基甲酸叔丁酯(3.46g，10mmol)和三苯基膦(3.96g，15mmol)合并于DCM(100mL)中并添加偶氮二甲酸二异丙酯(3.03g，15mmol)。在室温下搅拌所得反应混合物12h。用水洗涤反应混合物，干燥、过滤并在旋转蒸发器上浓缩。经硅胶色谱法，用8∶2己烷/乙酸乙酯洗脱纯化所得粗产物以产生呈白色固体的所需产物(1.74g，53％)。C14H18BrNO3的MS(EI)，真实值：328(MH+)。
(4-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)硼酸
Figure BDA00003557632000851
步骤1：
使7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸1，1-二甲基乙酯(30.0g，91.4mmol)和硼酸三异丙酯(22.4g，119mmol)于THF(300mL)中的溶液冷却至-78℃，并且在40min内在该温度下滴加2.5M正丁基锂于己烷(47.6mL，119mmol)中的溶液。在-78℃再搅拌反应混合物30min，然后通过滴加2N盐酸(80ml)猝灭，并使其升温至室温。添加乙酸乙酯(100mL)和水(100mL)，分离有机层，并用乙酸乙酯(100mL)萃取水层。用水洗涤合并的有机层，在硫酸钠上干燥，并浓缩。向残渣中添加己烷(200mL)并搅拌混合物过夜。过滤沉淀物，用己烷洗涤几次，并干燥以产生呈无色固体的(4-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)硼酸(23.4g，87％)。C14H20BNO5的MS(EI)：294(MH+)。
7-溴-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓盐酸盐
步骤1：
将7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸1，1-二甲基乙酯(10g，30.5mmol)倒入热乙醇(10mL)中，接着添加4M于二噁烷溶液中的氯化氢(2.1个当量，16mL)，并且使所得溶液在1h内缓慢冷却至环境温度。然后添加过量乙醚并过滤所得浆料。用乙醚洗涤滤饼并干燥以产生呈无色结晶固体的7-溴-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓盐酸盐(7.9g，98％产量)。C9H10NOBr的MS(EI)：229(MH+)。
实施例1
4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺
Figure BDA00003557632000861
步骤1：
向5-溴-2-甲基苯并咪唑(38g，180mmol)于THF(400mL)中的溶液添加二碳酸二叔丁酯(39g，189mmol)。在室温下搅拌反应混合物24h，然后浓缩。向残渣中添加乙酸乙酯(400mL)，并且用10％柠檬酸水溶液(2×100mL)、水(100mL)和盐水(100mL)洗涤溶液，在硫酸钠上干燥并浓缩。在硅胶上进行柱色谱法(于己烷中20-30％乙酸乙酯梯度)提供呈米色固体的6-溴-2-甲基-1H-苯并咪唑-1-羧酸1，1-二甲基乙酯(27g，48％产量)。C13H15BrN2O2的MS(EI)：312(MH+)。
步骤2：
用氮气为6-溴-2-甲基-1H-苯并咪唑-1-羧酸1，1-二甲基乙酯(11.3g，36mmol)、(4-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)硼酸(11.7g，40mmol)、[1，1-二(二苯基膦)]二茂铁二氯化钯(II)二氯甲烷加成物(3.0g，10mol％)于二噁烷(115mL)和水(28.5mL)中的悬浮液排气，然后添加二异丙基乙胺(18.6g，144mmol)。在90℃下搅拌反应混合物220min，使其冷却至室温并浓缩。在硅胶上对残渣进行柱色谱法(于己烷中25-30％乙酸乙酯梯度)获得呈非晶形固体7-(1-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸1，1-二甲基乙酯(13.2g，76％产量)。C27H33N3O5的MS(EI)：480(MH+)。
步骤3：
使7-(1-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸1，1-二甲基乙酯(13.1g，27mmol)于甲醇(20mL)和4N氯化氢于二噁烷(30mL)中的混合物中的溶液回流15min。冷却至室温后，添加乙醚(100mL)，并浓缩反应混合物。再添加一份乙醚(100mL)，过滤掉沉淀，用乙醚洗涤几次，并干燥以产生呈浅米色固体的7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓二盐酸盐(8.9g，93％产量)。1HNMR(400MHz，CD3OD)：
Figure BDA00003557632000871
7.93(s，1H)，7.86-7.67(m，4H)，7.28(s，1H)，4.54(s，2H)，4.33-4.23(m，2H)，3.65-3.54(m，2H)，2.91(s，3H)；C17H17N3O的MS(EI)：280(MH+)。
步骤4
在室温下向7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓二盐酸盐(137mg，0.39mmol)和4-氯-5-异丙基-6-甲基嘧啶-2-胺(72.5mg，0.39mmol)于NMP(2mL)中的溶液添加二异丙基乙胺(0.56mL，0.28mmol)。加热反应混合物至100℃持续5h。使反应冷却至室温并用水稀释，然后用乙酸乙酯(20mL×3)萃取。在硫酸镁上干燥合并的萃取物，过滤并减压浓缩。使用含水乙酸铵缓冲水/乙腈流动相，通过制备反相HPLC纯化所得残渣并冻干合并的纯净成分以产生4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺(62.3mg，37％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.63(s，1H)，7.51(d，3H)，7.36(d，1H)，7.05(dd，1H)，6.02(s，2H)，4.25(s，4H)，3.54(s，2H)，3.24(m，1H)，2.28(d，3H)，1.27(d，6H)；C25H28N6O的MS(EI)：429.3(MH+)。
根据实施例1的方法进行并且在步骤4中用替代性试剂代替4-氯-5-异丙基-6-甲基嘧啶-2-胺，制备本发明的下列化合物：
1-{6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}乙胺
1H NMR(400MHz，MeOH-d4)：7.98(s，1H)，7.86(d，1H)，7.84(s，1H)，7.81(s，1H)，7.79(s，1H)，7.62(dd，1H)，7.10(d，1H)，5.23(br s，2H)，4.60(m，1H)，4.57(m，2H)，4.35(m，2H)，3.34(s，2H)，2.91(m，2H)，2.87(s，3H)，2.60(br s，2H)，1.69(m，2H)，1.66(d，3H)，0.89(s，6H)；C29H34N6O的MS(EI)：483(MH+)。
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-[2-(甲氧基)乙基]嘧啶-2-基}甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.25(s，1H)，7.67(m，2H)，7.47(dd，，2H)，7.39(d，1H)，7.01(d，1H)，4.60(s，2H)，4.29(m，2H)，3.79(m，2H)，3.53(t，2H)，3.18(m，4H)，2.92(t，2H)，2.36(s，3H)，2.13(s，6H)；C28H34N6O2的MS(EI)：487.3(MH+)。
1-{4，5-二甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.61(m，2H)，7.45(dd，2H)，7.37(d，1H)，7.00(d，1H)，4.61(s，2H)，4.29(m，2H)，3.82(m，2H)，3.39(s，2H)，2.31(s，3H)，2.19(s，3H)，2.17(s，6H)，1.91(s，3H-OAc峰值)；C26H30N6O的MS(EI)：443.3(MH+)。
N-乙基-N-({4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}甲基)乙胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.53(m，4H)，7.35(d，1H)，7.03(d，1H)，4.43(s，2H)，4.30(m，2H)，3.68(m，2H)，3.59(s，2H)，2.51(m部分掩埋，5H)，2.48(s，3H)，1.91(s，3H)，1.32(d，6H)，0.94(t，6H)；C30H38N6O的MS(EI)：499.3(MH+)。
{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}乙酸甲酯
1H NMR(400MHz，DMSO-d6+D2O)：δ7.70(s，1H)，7.56(m，3H)，7.37(m，1H)，7.05(d，1H)，4.95(s，2H)，4.42(s，2H)，4.28(m，2H)，3.68(m，2H)，3.32-3.24(m，1H)，2.49(s，3H)，2.05(s，3H)，1.31(d，6H)；C28H31N5O3的MS(EI)：486.3(MH+)。
{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}甲醇
1H NMR(400MHz，DMSO-d6+D2O)：δ7.55-7.42(m，4H)，7.36(d，1H)，7.01(d，1H)，4.80(br t，0.5H-OH峰值)，4.43(s，2H)，4.32(s，2H)，4.26(m，2H)，3.72(m，2H)，3.25(q，1H)，2.47(s部分掩埋，3H)，2.44(s，3H)，1.29(d，6H)；C26H29N5O2的MS(EI)：444.3(MH+)。
{2-[(二甲基氨基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-5-基}乙酸甲酯
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.67-7.41(m，3H)，7.38-7.27(m，3H)，6.97(d，1H)，4.48(d，2H)，4.27(m，2H)，3.74(m，2H)，3.68(s，2H)，3.63(s，2H)，3.40(s掩埋，6H)，2.21(s，3H)，2.11(s，6H)，1.89(s，3H-OAc峰值)；C28H32N6O3的MS(EI)：501.3(MH+)。
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-苯基嘧啶-2-基}甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.50(ddd，4H)，7.43-7.29(m，5H)，7.23(d，1H)，6.92(dd，1H)，4.51(d，2H)，4.10-3.96(m，2H)，3.53(d，2H)，3.38(d，2H)，2.50(s，3H)，2.16(d，6H)，2.02(d，3H)；C31H32N6O的MS(EI)：505.0(MH+)。
7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-4-[6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(吡咯烷-1-基甲基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.60(s，1H)，7.53-7.39(m，3H)，7.33(dd，1H)，7.00(d，1H)，4.40(s，2H)，4.27(d，2H)，3.65(s，2H)，3.47(s，2H)，3.33-3.22(m，1H)，2.47(s，3H)，2.44(d，3H)，2.41(s，4H)，1.85(s，6H，OAc)，1.56(dt，4H)，1.30(d，6H)；C30H36N6O的MS(EI)：497.2(MH+)。
1-{5-(3-氟丙基)-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.75(d，2H)，7.63(d，1H)，7.53(dd，2H)，7.01(d，1H)，4.80(s，2H)，4.40(s，2H)，4.34(t，1H)，4.29(s，2H)，4.22(t，1H)，3.87(s，2H)，2.79(d，2H)，2.77(s，6H)，2.62(s，3H)，2.42(s，3H)，1.81(m，1H)，1.79(m，1H)；C28H33FN6O的MS(EI)：489.3(MH+)。
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(2-甲基丙基)嘧啶-2-基}甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：12.22(s，1H)，7.62(m，2H)，7.54(s，1H)，7.42(dd，1H)，7.34(d，1H)，6.96(d，1H)，4.56(s，2H)，4.29(s，2H)，3.73(s，2H)，3.30(s，2H，重叠)，2.57(d，2H)，2.46(s，3H，重叠)，2.32(s，3H)，2.10(s，6H)，1.88(s，2H，OAc)，1.75-1.56(m，1H)，0.52(d，7H)；C29H36N6O的MS(EI)：485(MH+)。
6-氨基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]吡啶-3-腈
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.37(d，1H)，7.87(d，2H)，7.84(s，1H)，7.65(s，1H)，7.55(dd，1H)，7.06(d，1H)，5.90(bs，2H)，4.50(m，2H)，4.30(s，2H)，3.76(m，2H)，2.55(s，2H)，1.91(d，3H)，1.90(m，1H)，1.23(d，2H)，0.93(s，6H)；C23H20N6O的MS(ES)：397(MH+)。
6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.91(s，1H)，7.81(d，1H)，7.76(d，1H)，7.72(d，1H)，7.56(dd，1H)，7.07(d，1H)，5.02(s，2H)，4.42(m，2H)，4.19(m，2H)，2.86(s，3H)，2.67(t，2H)，2.41(s，2H)，1.61(t，2H)，0.89(s，6H)；C27H30N6O的MS(ES)：455(MH+)。
1-{5-溴-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)：7.63(m，2H)，7.52(d，1H)，7.43(m，2H)，7.00(d，1H)，5.06(s，2H)，4.35(m，2H)，4.18(m，2H)，3.79(s，2H)，2.58(s，3H)，2.56(s，3H)，2.47(s，6H)，1.93(s，6H)；C25H27BrN6O的MS(EI)：507/509(MH+)。
1-{5-氯-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)：7.62(m，2H)，7.52(d，1H)，7.43(m，2H)，7.02(d，1H)，5.08(s，2H)，4.34(m，2H)，4.23(m，2H)，3.84(s，2H)，2.58(s，3H)，2.52(s，6H)，2.50(s，3H)，1.94(s，3H)；C25H27ClN6O的MS(EI)：463(MH+)。
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-丙基嘧啶-2-基}甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.61(m，2H)，7.46(m，2H)，7.36(d，1H)，6.99(d，1H)，4.61(s，2H)，4.32(s，2H)，3.78(s，2H)，3.34(br s，2H)，2.61-2.52(m，2H)，2.51(s，3H)，2.35(s，3H)，2.10(s，6H)，1.45(m，2H)，0.75(t，3H)；C28H34N6O的MS(EI)：471(MH+)。
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-丙-2-烯-1-基嘧啶-2-基}甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.63(s，1H)，7.56-7.43(m，3H)，7.36(d，1H)，7.00(d，1H)，6.13(m，1H)，5.27(d，1H)，4.95(d，1H)，4.61(s，2H)，4.27(br s，2H)，3.82(s，2H)，3.37(s，2H)，3.32(s，2H)，2.50(s，3H)，2.27(s，3H)，2.18(s，6H)；C28H32N6O的MS(EI)：469(MH+)。
2-氟-N-({4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}甲基)乙胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.63(s，1H)，7.55(s，1H)，7.50(d，2H)，7.37(d，1H)，7.02(d，1H)，4.45(m，3H)，4.35-4.20(m，3H)，3.71(s，2H)，3.63(s，2H)，3.34-3.21(m，1H)，2.76(t，1H)，2.69(t，1H)，2.47(s，3H)，1.87(s，3H)，1.33(d，6H)；C28H33FN6O的MS(EI)：489(MH+)。
4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-丙-2-烯-1-基嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：12.23(s，1H)，7.67-7.49(m，4H)，7.35(s，1H)，7.03(d，1H)，6.11(m，1H)，6.00(s，2H)，5.26(m，1H)，5.00(d，1H)，4.44(s，2H)，4.26(s，2H)，3.68(s，2H)，3.18(s，2H)，2.49(s，3H)，2.11(s，3H)；C25H26N6O的MS(EI)：427(MH+)。
N，N-二甲基-1-{4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-7-(甲氧基)喹唑啉-2-基}甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.94(t，1H)，7.68(s，2H)，7.42(dd，3H)，7.16(s，1H)，7.08(d，1H)，6.95(t，1H)，5.03(d，2H)，4.43(d，2H)，4.17(d，2H)，3.89(s，3H)，3.44(s，2H)，2.50(s，3H)，2.14(s，6H)；C29H30N6O2的MS(EI)：495.2(MH+)。
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.62-7.38(m，3H)，7.26-7.06(m，6H)，7.00(d，1H)，6.84(s，1H)，6.45(s，2H)，4.40(s，2H)，4.22(s，2H)，3.85(s，2H)，3.71(s，2H)，2.52(d，3H)，2.01(s，3H)；C29H27FN6O的MS(EI)：495.3(MH+)。
根据实施例1的方法进行并且在步骤1中用5-溴苯并咪唑代替5-溴-2-甲基苯并咪唑并且在步骤4中用替代性试剂代替4-氯-5-异丙基-6-甲基嘧啶-2-胺，制备本发明的下列化合物：
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.19(s，1H)，7.80(d，1H)，7.65(d，1H)，7.59(d，1H)，7.53(dd，1H)，7.50(m，1H)，7.05(d，1H)，4.79(s，2H)，4.35(m，2H)，4.01(m，2H)，2.63(t，2H)，2.41(s，2H)，1.61(t，2H)，0.90(s，6H)；C26H28N6O的MS(ES)：441(MH+)。
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-[(4-氟苯基)甲基]-6-甲基嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.24(d，1H)，7.92-7.50(m，1H)，7.47(d，1H)，7.20(d，1H)，7.12(dq，5H)，7.02(d，1H)，6.75(d，1H)，6.11(d，2H)，4.31(s，2H)，4.20(d，2H)，3.82(d，2H)，3.65(s，2H)，1.98(s，3H)；C28H25FN6O的MS(EI)：481.0(MH+)。
1-{4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-7-(甲氧基)喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.25(s，1H)，7.95(d，1H)，7.81(s，1H)，7.74-7.62(m，2H)，7.49(d，2H)，7.16(s，1H)，7.10-7.03(m，1H)，6.98(d，1H)，5.05(s，2H)，4.45(s，2H)，4.20(s，2H)，3.87(d，3H)，3.47(s，2H)，2.13(d，6H)；C28H28N6O2的MS(EI)：481.3(MH+)。
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.20(d，1H)，7.82-7.70(m，2H)，7.61(d，1H)，7.57-7.48(m，2H)，7.45(d，1H)，7.06(t，1H)，6.02(s，2H)，4.23(d，4H)，3.51(d，2H)，3.22(d，1H)，2.30(s，3H)，1.26(t，6H)；C24H26N6O的MS(EI)：415.3(MH+)。
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.22(s，1H)，7.81(s，2H)，7.62(s，1H)，7.45(dd，2H)，7.00(d，1H)，6.09(s，1H)，5.94(s，2H)，4.73(s，2H)，4.03(dd，4H)，2.03(d，3H)，1.88(s，6H)；C21H20N6O的MS(EI)：373.2(MH+)。
根据实施例1的方法进行并且在步骤4中用N-乙基-5-(2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)-1H-苯并咪唑-2-胺代替7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓二盐酸盐，制备本发明的下列化合物：
5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-N-乙基-1H-苯并咪唑-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.44(d，3H)，7.32(s，1H)，7.29-7.02(m，2H)，7.04(d，1H)，6.60(s，1H)，6.02(s，2H)，6.02(s，27H)，4.23(s，4H)，3.54(s，2H)，3.50(d，2H)，3.23(d，1H)，2.51(s，3H)，2.28(d，2H)，1.27(d，6H)，1.18(t，3H)；C26H31N7O的MS(EI)：458.3(MH+)。
实施例2
1-{4-[7-{3-[(二氟甲基)氧基]-4-(甲氧基)苯基}-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺
Figure BDA00003557632000951
步骤1：
为(4-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)硼酸(123mg，0.42mmol)、4-溴-2-[(二氟甲基)氧基]-1-(甲氧基)苯(106mg，0.42mmol)、碳酸钾(116mg，0.84mmol)、1，1′-二(二苯基膦)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷复合物(17mg，0.021mmol)于二噁烷(800uL)和水(200uL)中的混合物喷洒氮气2min。然后于微波反应器中，在110℃下加热混合物15min。然后用水稀释混合物并且用乙酸乙酯萃取3次。合并有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶梯度色谱法(100％己烷至50％于己烷中的乙酸乙酯)纯化残渣以提供呈无色糖浆的7-{3-[(二氟甲基)氧基]-4-(甲氧基)苯基}-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸1，1-二甲基乙酯(102.4mg，0.243mmol，58％产量)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.50-7.30(m，3H)，7.12-6.97(m，2H)，6.59(t，1H)，4.59-4.43(m，2H)，4.09-4.05(m，2H)，3.92(s，3H)，3.85-3.75(m，2H)，1.46-1.37(m，9H)；C22H25F2NO5的MS(EI)：322(MH+-Boc)。
步骤2：
向7-{3-[(二氟甲基)氧基]-4-(甲氧基)苯基}-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸1，1-二甲基乙酯(102mg，0.24mmol)于甲醇(2mL)中的溶液添加于二噁烷(4M，600uL，2.4mmol)中的无水氯化氢，加热所得溶液至60℃持续40min。冷却至室温后，浓缩混合物并在真空中干燥残渣以提供定量产量的7-{3-[(二氟甲基)氧基]-4-(甲氧基)苯基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓盐酸盐。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.32(s，2H)，7.79(d，1H)，7.64(dd，1H)，7.55(dd，1H)，7.46(d，1H)，7.36-6.95(m，3H)，4.40(s，2H)，4.21(s，2H)，3.87(s，3H)，3.50(s，2H)；C17H17F2NO3的MS(EI)：322(MH+)。
步骤3：
加热7-{3-[(二氟甲基)氧基]-4-(甲氧基)苯基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓盐酸盐(86mg，0.24mmol)、1-(4-氯-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺(61mg，0.24mmol)和二异丙基乙胺(209uL，1.2mmol)于NMP(500μL)中的溶液至120℃持续23h，然后冷却至室温。然后加水并用乙酸乙酯萃取所得含水混合物2次。在硫酸钠上干燥合并的有机萃取物，过滤并在真空中浓缩。通过制备反相HPLC纯化残渣以提供呈白色固体的1-{4-[7-{3-[(二氟甲基)氧基]-4-(甲氧基)苯基}-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺(15.1mg，0.028mmol，12％产量)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.67(d，1H)，7.54(dd，1H)，7.50-7.43(m，2H)，7.24(d，1H)，7.13(t，1H)，7.00(d，1H)，4.71(s，2H)，4.37-4.29(m，2H)，3.94-3.88(m，2H)，3.87(s，3H)，2.72(s，2H)，2.58(brs，6H)，2.47(s，2H)，1.61(t，2H)，0.85(s，6H)；C30H36F2N4O3的MS(EI)：539(MH+)。
根据实施例2的方法进行并且用替代性试剂代替步骤1中的4-溴-2-[(二氟甲基)氧基]-1-(甲氧基)苯和/或步骤3中的1-(4-氯-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺，制备本发明的下列化合物：
1-(6，6-二甲基-4-{7-[4-(甲氧基)-3-{[2-(甲氧基)乙基]氧基}苯基]-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基}-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.61(d，1H)，7.44(dd，1H)，7.20-7.14(m，2H)，7.02(d，1H)，6.97(d，1H)，4.60(s，2H)，4.31-4.24(m，2H)，4.18-4.13(m，2H)，3.87-3.82(m，2H)，3.79(s，3H)，3.70-3.66(m，2H)，3.33(s，3H)，2.69(t，2H)，2.45(s，2H)，2.14(s，6H)，1.59(t，2H)，0.86(s，6H)；C32H42N4O4的MS(EI)：547(MH+)。
1-(6，6-二甲基-4-{7-[4-(甲氧基)-3-(甲磺酰基)苯基]-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基}-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.00(d，1H)，7.96(dd，1H)，7.63(d，1H)，7.45(dd，1H)，7.40(d，1H)，7.01(d，1H)，4.66(s，2H)，4.36-4.25(m，2H)，4.00(s，3H)，3.91-3.78(m，2H)，3.41(s，2H)，3.28(s，3H)，2.68(t，2H)，2.43(s，2H)，2.12(br s，6H)，1.59(t，2H)，0.85(s，6H)；C30H38N4O4S的MS(EI)：551(MH+)。
N-[5-(4-{2-[(二甲基氨基)甲基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)-2-(甲氧基)苯基]甲磺酰胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.03(s，1H)，7.51(d，1H)，7.49-7.39(m，3H)，7.17(d，1H)，7.02(d，1H)，4.45(s，2H)，4.33-4.26(m，2H)，3.87(s，3H)，3.74-3.66(m，2H)，3.32(s，2H)，3.30-3.21(m，1H)，2.98(s，3H)，2.48(s，3H)，2.30(br s，6H)，1.32(d，6H)；C28H37N5O4S的MS(EI)：540(MH+)。
N-[5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-2-(甲氧基)苯基]甲磺酰胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.41(d，1H)，7.36-7.29(m，2H)，7.01(d，1H)，6.71(d，1H)，6.65(d，1H)，5.99(s，2H)，4.20(M，4H)，3.66(s，3H)，3.57-3.49(m，2H)，3.28-3.18(m，1H)，2.55(s，3H)，2.30(s，3H)，1.27(d，6H)；C25H31N5O4S的MS(EI)：498(MH+)。
1-[5-(4-{2-[(二甲基氨基)甲基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)-2-(甲氧基)苯基]乙酮
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.85-7.78(m，2H)，7.62(d，1H)，7.44(dd，1H)，7.26(d，1H)，6.99(d，1H)，4.62(s，2H)，4.33-4.25(m，2H)，3.93(s，3H)，3.89-3.80(m，2H)，3.39(s，2H)，2.69(t，2H)，2.56(s，2H)，2.44(s，3H)，2.15(s，6H)，1.59(t，2H)，0.86(s，6H)；C31H38N4O3的MS(EI)：515(MH+)。
实施例3
N-氮杂环丁-3-基-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺
步骤1：
将金属钠(167mg，7mmol)溶于乙醇(20mL)中形成乙醇乙氧基钠。向该溶液中添加硫脲(265mg，3.5mmol)和2-乙酰基-3-甲基丁酸乙酯(540uL，2.9mmol)。回流时搅拌2h后，使反应混合物冷却至室温，然后在真空中浓缩。用水稀释残渣，然后用乙酸酸化为pH7。通过过滤收集形成的白色沉淀并且在真空中干燥以提供呈白色结晶固体的6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-硫代-2，3-二氢嘧啶-4(1H)-酮(354mg，1.92mmol，66％产量)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.20(br s，1H)，11.97(br s，1H)，2.88-2.78(m，1H)，2.13(s，3H)，1.16(d，6H)；C8H12N2OS的MS(EI)：185(MH+)。
步骤2：
在室温下用碘甲烷(80uL，1.28mmol)处理6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-硫代-2，3-二氢嘧啶-4(1H)-酮(120mg，0.64mmol)于DMF(1mL)中的溶液2h。然后用10％氯化锂水溶液稀释混合物并且用乙酸乙酯萃取2次。用10％氯化锂水溶液洗涤合并的有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤并且在真空中浓缩以提供呈乳白色固体的6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(甲基硫代)嘧啶-4(3H)-酮(126.8mg，0.64mmol，100％产量)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ12.19(br s，1H)，3.07-2.97(m，1H)，2.56(s，3H)，2.32(s，3H)，1.31(d，6H)；C9H14N2OS的MS(EI)：199(MH+)。
步骤3：
向6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(甲基硫代)嘧啶-4(3H)-酮(127mg，0.64mmol)于氯仿(1mL)中的溶液添加磷酰氯(1mL)，并且在70℃下搅拌所得混合物1h。冷却至室温后，在真空中去除挥发性物质。然后用二氯甲烷稀释残渣。用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机溶液，并且用二氯甲烷反萃取水相。在硫酸钠上干燥合并的有机萃取物，过滤并在真空中浓缩以提供呈黄色油的4-氯-6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(甲基硫代)嘧啶(121.3mmol，0.56mmol，87％产量)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.51-3.39(m，1H)，2.55(s，3H)，2.54(s，3H)，1.36(d，6H)；C9H13ClN2S的MS(EI)：217，219(Cl同位素，MH+)。
步骤4：
加热7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓盐酸盐(177mg，0.56mmol)、4-氯-6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(甲基硫代)嘧啶(121mg，0.56mmol)和二异丙基乙胺(490uL，2.8mmol)于DMA(800uL)中的溶液至110℃持续21h，然后冷却至室温。然后添加10％氯化锂水溶液，并且用乙酸乙酯萃取所得含水混合物2次。在硫酸钠上干燥合并的有机萃取物，过滤并在真空中浓缩。然后通过梯度硅胶色谱法(100％二氯甲烷至10％于二氯甲烷中的甲醇)纯化残渣以提供呈黄色糖浆的7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-4-[6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(甲基硫代)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓(145mg，0.315mmol，56％产量)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.58(br m，1H)，7.45(dd，1H)，7.43(d，1H)，7.40(dd，1H)，7.08(d，1H)，4.42(s，2H)，4.34-4.28(m，2H)，3.81-3.76(m，2H)，3.37-3.27(m，1H)，2.65(s，3H)，2.48(s，3H)，2.41(s，3H)，1.34(d，6H)；C26H29N5OS的MS(EI)：460(MH+)。
步骤5：
用3-氯过氧苯甲酸(136mg，0.788mmol)处理7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-4-[6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(甲基硫代)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓(145mg，0.315mmol)于二氯甲烷(2.5mL)中的溶液。搅拌50min后，用二氯甲烷稀释混合物并且用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。用二氯甲烷反萃取水相。用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤合并的有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤并在真空中浓缩以提供定量产量的呈黄色/橙色固体的7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-4-[6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(甲磺酰基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.71(s，1H)，7.58(d，1H)，7.51(d，1H)，7.48-7.37(m，2H)，7.05(d，1H)，4.60(s，2H)，4.39-4.24(m，2H)，3.95-3.85(m，2H)，3.41-3.26(m，1H)，3.03(s，3H)，2.66(s，3H)，2.64(s，3H)，1.40(d，6H)；C26H29N5O3S的MS(EI)：492(MH+)。
步骤6：
向7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-4-[6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(甲磺酰基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓(70.3mg，0.143mmol)于NMP(250uL)中的溶液添加3-氨基氮杂环丁烷-1-羧酸1，1-二甲基乙酯(123mg，0.715mmol)，在145℃下搅拌混合物20h。冷却至室温后，添加10％氯化锂水溶液。用乙酸乙酯萃取所得水溶液2次。用10％氯化锂水溶液洗涤合并的有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤并在真空中浓缩。通过制备反相HPLC纯化残渣以提供呈橙色薄膜的3-({4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}氨基)氮杂环丁烷-1-羧酸1，1-二甲基乙酯(17.4mg，0.030mmol，21％产量)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.67(s，1H)，7.57-7.42(m，4H)，7.01(d，1H)，4.50(s，2H)，4.45-4.36(m，1H)，4.31-4.26(m，2H)，3.98(t，2H)，3.76-3.71(m，2H)，3.68(dd，2H)，3.29-3.23(m，1H)，2.57(s，3H)，2.36(s，3H)，1.38-1.31(m，15H)；C33H41N7O3的MS(EI)：584(MH+)。
步骤7：
向3-({4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}氨基)氮杂环丁烷-1-羧酸1，1-二甲基乙酯(17.4mg，0.030mmol)于甲醇200uL)中的溶液添加于二噁烷(4N，75uL，0.3mmol)中的无水氯化氢，并且加热所得混合物至60℃持续25min。冷却至室温后，在真空中去除挥发性物质以提供呈米色固体的N-氮杂环丁-3-基-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺二盐酸盐(16.2mg)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.93(s，1H)，7.86-7.78(m，2H)，7.68(d，1H)，7.59(dd，1H)，7.08(d，1H)，4.97-4.89(m，3H)，4.57-4.52(m，2H)，4.31-4.24(m，2H)，4.18-4.11(m，2H)，4.09-4.03(m，2H)，3.09-2.99(m，1H)，2.88(s，3H)，2.50(s，3H)，1.34(d，6H)；C28H33N7O的MS(EI)：484(MH+)。
根据实施例3的方法进行并且在步骤1中用2-(4-氟苄基)-3-氧代丁酸乙酯代替2-乙酰基-3-甲基丁酸乙酯和/或在步骤6中用替代性胺代替3-氨基氮杂环丁烷-1-羧酸1，1-二甲基乙酯，制备本发明的下列化合物：
N′-{5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基乙烷-1，2-二胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.22(d，1H)，7.62-7.49(m，1H)，7.47-7.39(m，2H)，7.21-7.06(m，5H)，6.98(dd，1H)，6.92-6.80(m，1H)，6.38-6.25(m，1H)，4.40(br s，2H)，4.26-4.18(m，2H)，3.86(s，2H)，3.72-3.63(m，2H)，3.29-3.19(m，2H)，2.51(s，3H)，2.36-2.24(m，2H)，2.12(br s，6H)，1.99(s，3H)；C33H36FN7O的MS(EI)：566(MH+)。
N-乙基-5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.59-7.46(m，2H)，7.41(dd，1H)，7.26(d，1H)，7.17-7.08(m，2H)，7.01-6.93(m，3H)，6.90(s，1H)，4.50(s，2H)，4.27-4.20(m，2H)，3.90(s，2H)，3.85-3.75(m，2H)，3.31-3.23(m，2H)，2.60(s，3H)，2.04(s，3H)，1.05(t，3H)；C31H31FN6O的MS(EI)：523(MH+)。
N′-{5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基丙烷-1，3-二胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.22(d，1H)，7.66-7.48(m，1H)，7.48-7.36(m，2H)，7.23-7.05(m，5H)，7.02-6.87(m，2H)，6.64-6.51(m，1H)，4.42(br s，2H)，4.26-4.16(m，2H)，3.86(s，2H)，3.68(br s，2H)，3.14(br s，2H)，2.17-2.08(m，2H)，2.04(s，6H)，1.98(s，3H)，1.52(br s，2H)；C34H38FN7O的MS(EI)：580(MH+)。
N-氮杂环丁-3-基-5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.57-7.48(m，2H)，7.42(dd，1H)，7.24(d，1H)，7.13-7.06(m，2H)，7.01-6.89(m，3H)，6.75(s，1H)，4.85-4.75(m，1H)，4.45(s，2H)，4.32-4.24(m，2H)，4.07-3.98(m，2H)，3.93-3.75(m，6H)，2.60(s，3H)，2.07(s，3H)；C32H32FN7O的MS(EI)：550(MH+)。
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-N-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.60-7.45(m，2H)，7.42(dd，1H)，7.22-7.08(m，5H)，7.02-6.90(m，2H)，6.37(d，1H)，4.43(br s，2H)，4.23-4.16(m，2H)，3.92-3.78(m，3H)，3.70-3.62(m，2H)，3.32-3.22(m，4H)，1.97(s，3H)，0.99(br s，6H)；C32H33FN6O的MS(EI)：537(MH+)。
实施例4
(5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸甲酯
Figure BDA00003557632001031
步骤1：
在90℃下加热(4-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)硼酸(1.58g，5.4mmol)、4-溴-2-硝基苯胺(1.17g，5.4mmol)、碳酸铯(3.52mg，10.8mmol)、1，1′-二(二苯基膦)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷复合物(395mg，0.54mmol)于二噁烷(20mL)和水(4mL)中的混合物3.5h，然后冷却至室温。然后用水和乙酸乙酯稀释混合物。通过硅藻土过滤混合物，然后将所得滤液分隔开。用乙酸乙酯萃取水相2次。合并有机萃取物，在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩。通过梯度硅胶色谱法(80％己烷∶20％乙酸乙酯至50％乙酸乙酯∶50％己烷)纯化残渣以提供呈嫩黄色-橙色固体的7-(4-氨基-3-硝基苯基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸1，1-二甲基乙酯(1.59g，4.44mmol，82％产量)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.16(d，1H)，7.73(d，1H)，7.52(s，2H)，7.49-7.39(m，2H)，7.09(d，1H)，7.06-6.91(m，1H)，4.56-4.37(m，2H)，4.11-3.95(m，2H)，3.78-3.60(m，2H)，1.40-1.22(m，9H)；C20H23N3O5的MS(EI)：330(MH+-叔丁基)。
步骤2：
向7-(4-氨基-3-硝基苯基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸1，1-二甲基乙酯(10g，26mmol)于二噁烷(50mL)中的溶液添加于二噁烷(4M，50mL，200mmol)中的氯化氢，并且在室温下搅拌混合物16h。然后去除挥发性物质以提供定量产量的2-硝基-4-(2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)苯胺二盐酸盐。C15H15N3O3的MS(EI)：286(MH+)。
步骤3：
加热2-硝基-4-(2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)苯胺盐酸盐(285mg，1mmol)、4-氯-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺(186mg，1mmol)和二异丙基乙胺(348uL，2mmol)于NMP(2mL)中的溶液至120℃持续22h，然后冷却至室温。然后添加水和乙酸乙酯并通过过滤去除不溶性橙色固体。将所得滤液分隔开并且用乙酸乙酯萃取水相。在硫酸钠上干燥合并的有机萃取物，过滤并在真空中浓缩。通过硅胶梯度色谱法(100％二氯甲烷至5％甲醇∶95％二氯甲烷)纯化残渣以提供呈黄色/橙色油的4-[7-(4-氨基-3-硝基苯基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺(161mg，0.37mmol，37％产量)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.33(d，1H)，7.60(dd，1H)，7.43-7.36(m，2H)，7.10(d，1H)，6.88(d，1H)，6.12(br s，3H)，4.58(s，2H)，4.33(s，2H)，4.28-4.23(m，2H)，3.69-3.63(m，2H)，3.34-3.24(m，1H)，2.42(s，3H)，1.33(d，6H)；C23H26N6O3的MS(EI)：435(MH+)。
步骤4：
向4-[7-(4-氨基-3-硝基苯基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺(161mg，0.37mmol)于甲醇(3mL)中的溶液添加10％钯碳(湿润，50mg)。使所得悬浮液受氢气氛围1h。然后再添加100mg的10％钯碳，再使悬浮液受氢气氛围2.5h。然后过滤去除催化剂，在真空中浓缩滤液以提供呈深褐色薄膜的4-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}苯-1，2-二胺(122.2mg，0.302mmol，75％产量)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.38-7.32(m，2H)，7.05(d，1H)，6.93-6.88(m，2H)，6.79-6.73(m，1H)，4.56(s，2H)，4.29(s，2H)，4.27-4.22(m，2H)，3.68-3.62(m，2H)，3.49-3.42(m，4H)，3.36-3.27(m，1H)，2.41(s，3H)，1.32(d，6H)；C23H28N6O的MS(EI)：405(MH+)。
步骤5：
加热4-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}苯-1，2-二胺(122mg，0.30mmol)和1，3-二(甲氧基羰基)-2-甲基-异硫脲(62mg，0.3mmol)于乙酸(1.5mL)中的溶液至80℃持续20min，然后冷却至室温。在真空中去除乙酸。通过制备反相HPLC纯化残渣以提供呈米色固体的(5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸甲酯(103.4mg，0.212mmol，71％产量)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.51(br s，1H)，7.49-7.42(m，2H)，7.39-7.30(m，1H)，7.27-7.19(m，1H)，7.06(d，1H)，6.02(br s，2H)，4.28-4.17(m，4H)，3.68(br s，3H)，3.58-3.50(m，2H)，3.29-3.19(m，1H)，2.31(s，3H)，1.28(d，6H)；C26H29N7O3的MS(EI)：488(MH+)。
实施例5
N-({6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}甲基)乙酰胺
Figure BDA00003557632001061
步骤1：
在90℃下搅拌7-溴-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓盐酸盐(3.06g，12.90mmol)、(4-氯-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)乙酸甲酯(3.40g，11.40mmol)和N，N-二异丙基乙胺(7.0mL，40.0mmol)于1-甲基-2-吡咯烷酮(20.0mL)中的混合物4h。冷却至室温后，反应混合物分隔在水和二氯甲烷之间。分离有机层，用饱和碳酸氢钠水溶液(25mL)洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩以产生无需进一步纯化转移的[4-(7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基]乙酸甲酯。C22H26BrN3O3的MS(EI)：461(MH+)。
步骤2：
向步骤1中获得的[4-(7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基]乙酸甲酯于甲醇(50mL)和水(10mL)的混合物中的溶液添加氢氧化锂(0.40g，13.40mmol)并且在室温下搅拌反应混合物30min。浓缩反应混合物并分隔在饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯之间。分离有机层，用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。梯度硅胶色谱法(己烷∶乙酸乙酯4∶1至1∶1)提供[4-(7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基]甲醇(3.7g，77％)。1H NMR(400MHz，CHCl3-d3)：7.37(d，1H)，7.29(dd，1H)，6.89(d，1H)，4.56(s，2H)，4.52(s，2H)，4.23(t，2H)，3.91(t，2H)，3.70(t，1H)，2.81(t，2H)，2.38(s，2H)，1.65(t，2H)，0.96(s，6H)；C20H24BrN3O2的MS(EI)：419(MH+)。
步骤3：
加热[4-(7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基]甲醇(2.20g，5.30mmol)和磷酰氯(5.0mL，53.65mmol)于氯仿(5.0mL)中的合并溶液至75℃持续150min。使其冷却至室温后，浓缩反应混合物并将所得残渣分隔在饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷之间。分离有机层，用1M氢氧化钠水溶液洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。梯度硅胶色谱法(己烷∶乙酸乙酯9∶1至1∶1)提供7-溴-4-[2-(氯甲基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓(1.9g，83％)。C20H23BrClN3O的MS(EI)：437(MH+)。
步骤4：
向乙酰胺(37mg，0.63mmol)和六甲基二硅基胺基锂(1M于己烷中，1.50mL，1.50mmol)于N，N-二甲基甲酰胺(4.0mL)中的合并溶液添加7-溴-4-[2-(氯甲基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓(91mg，0.21mmol)于N，N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中的溶液，并且在100℃下搅拌反应混合物16h。冷却至室温后，反应混合物分隔在饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷之间。分离有机层并用二氯甲烷(2×)萃取水层。用水洗涤合并的有机层，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩以产生N-{[4-(7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基]甲基}乙酰胺(50mg，52％)，并且使用无需进一步纯化。C22H27BrN4O2的MS(EI)：460(MH+)。
步骤5：
使于1，4-二噁烷(1.8mL)和水(0.2mL)的混合物中的N-{[4-(7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基]甲基}乙酰胺(50mg，0.11mmol)、2-甲基-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2-基)-1H-苯并咪唑-1-羧酸1，1-二甲基乙酯(42mg，0.16mmol)、二(二苯基膦)二茂铁]-二氯化钯(II)(7mg，0.011mmol)、碳酸铯(0.18g，0.55mmol)的混合物于微波仪器中在110℃下反应30min。使反应混合物冷却至室温并分隔在饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷之间。分离有机层，用水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。向所得残渣于甲醇中的溶液，添加4M无水氯化氢于1，4-二噁烷(2.0mL)中的溶液并且加热反应混合物回流30min。使其冷却至室温后，浓缩反应混合物，溶于甲醇(2mL)中并通过制备反相HPLC(0.1％含水乙酸铵缓冲的含水乙腈流动相)纯化以产生N-({6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}甲基)乙酰胺(8mg，14％)。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.05(t，1H)，7.64(d，1H)，7.63(s，1H)，7.48(dd，1H)，7.37(dd，1H)，7.03(d，1H)，4.66(s，2H)，4.31(m，2H)，4.17(d，2H)，3.88(m，2H)，2.70(t，2H)，2.47(s，3H)，1.84(s，2H)，1.84(s，3H)，1.60(t，2H)，0.87(s，6H)；C30H34N6O2的MS(ES)：511(MH+)。
根据实施例5的方法进行并且在步骤3中使[4-(7-溴-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基]甲醇与DAST反应，然后进行步骤5，制备本发明的下列化合物：
4-[2-(氟甲基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-基]-7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ7.69(s，1H)，7.67(d，1H)，7.54(d，1H)，7.50(dd，1H)，7.44(dd，1H)，7.03(d，1H)，5.23(d，2H)，4.66(s，2H)，4.30(m，2H)，3.89(s，1H)，2.73(t，2H)，2.54(s，3H)，1.91(s，2H)，1.61(t，2H)，0.86(s，6H)；C28H30FN5O的MS(ES)：472(MH+)。
实施例6
6-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-胺
Figure BDA00003557632001091
步骤1：
用氮气为5-溴-3-硝基吡啶-2-胺(4.84g，22.2mmol)、(4-{[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)硼酸(6.51g，22.2mmol)、[1，1-二(二苯基)膦]二茂铁二氯化钯(II)二氯甲烷加成物(1.60g，10mol％)于二噁烷(75mL)和水(15mL)中的悬浮液排气，然后添加碳酸铯(14.46g，44.4mmol)。在90℃下搅拌反应混合物过夜。使混合物冷却至室温，加水(150ml)并搅拌30min产生沉淀。通过过滤收集产物1，1-二甲基乙基-7-(6-氨基-5-硝基吡啶-3-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸酯(8.1g，94％产量)，在真空下干燥。C19H22N4O5的MS(EI)：387.1(MH+)。
步骤2：
用氮气为1，1-二甲基乙基-7-(6-氨基-5-硝基吡啶-3-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸酯(6.12g，15.84mmol)、钯碳(0.6g)于乙酸(100mL)中的悬浮液排气10min。在parr振荡器上使反应混合物氢化(45psi)60min。氢化完成后，通过
Figure BDA00003557632001092
垫过滤反应混合物。浓缩滤液并用乙酸乙酯(200ml)稀释残渣，用水、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，然后在硫酸钠上干燥并过滤。蒸发乙酸乙酯获得1，1-二甲基乙基-7-(5，6-二氨基吡啶-3-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸酯(5.6g，99％产量)。1H NMR(400MHz，CD3OD)：7.56-7.27(m，4H)，7.08-7.02(m，1H)，4.51(s，2H)，4.07-4.03(m，2H)，3.86-3.74(m，2H)，1.3(s，9H)。
步骤3：
加热1，1-二甲基乙基-7-(5，6-二氨基吡啶-3-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸酯(5.64g，15.84mmol)和1，3-二(苄氧基羰基)-2-甲基-2-异硫脲(11.8g，32.92mmol)于乙酸(30mL)中的溶液至86℃持续3h。冷却至室温后，添加乙酸乙酯(100mL)并通过过滤收集沉淀，用乙酸乙酯洗涤几次，并干燥以产生1，1-二甲基乙基-7-[2-({[(苯基甲基)氧基]羰基}氨基)-1H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基]-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸酯(4.50g，55％产量)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：11.9(s，br，2H)，8.42(s，1H)，7.90(s，1H)，7.52-7.36(m，7H)，5.28(s，2H)，4.60-4.34(m，2H)，4.18-4.02(m，2H)，3.79-3.67(m，2H)，1.38(s，9H)。
步骤4：
在室温下向1，1-二甲基乙基-7-[2-({[(苯基甲基)氧基]羰基}氨基)-1H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基]-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-羧酸酯(4.5g，8.73mmol)于甲醇(20ml)中的溶液添加4N于二噁烷中的HCl。然后加热反应混合物至55℃持续3h。冷却至室温后，通过过滤收集沉淀，用最小量的甲醇洗涤并干燥以产生[6-(2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)-1H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基]氨基甲酸苯甲酯盐酸盐(3.0g，76％产量)。1HNMR(400MHz，CD3OD)：8.59(m，1H)，8.51(s，1H)，7.85(m，1H)，7.79-7.75(m，1H)，5.37(s，2H)，4.53(s，2H)，4.37-4.32(m，2H)，3.67-3.64(m，2H)。
步骤5：
在室温下向[6-(2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)-1H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基]氨基甲酸苯甲酯盐酸盐(265mg，0.58mmol)和4-氯-5-异丙基-6-甲基嘧啶-2-胺(108mg，0.58mmol)于NMP(2mL)中的搅拌溶液添加二异丙基乙胺(0.42mL，2.34mmol)。加热反应混合物至120℃并搅拌过夜。使反应冷却至室温并用水稀释，然后用乙酸乙酯(20mL×3)萃取。在硫酸镁上干燥萃取物，过滤并减压浓缩。使用乙酸铵缓冲的含水乙腈梯度流动相，通过制备反相HPLC纯化所得残渣并且冻干合并的纯净成分以获得6-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.12(s，1H)，7.50(d，3H)，7.31(s，1H)，7.07(d，1H)，6.67(s，2H)，6.02(s，2H)，4.25(s，4H)，3.51(d，2H)，3.31(m，1H)，2.30(s，3H)，1.26(d，6H)；C23H26N8O的MS(EI)：431.3(MH+)。
按实施例1中那样进行并且在步骤3中用原甲酸三乙酯代替1，3-二(苄氧基羰基)-2-甲基-2-异硫脲而在步骤5中用替代性起始试剂代替4-氯-5-异丙基-6-甲基嘧啶-2-胺，制备本发明的下列化合物。
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.47(dd，2H)，8.12(s，1H)，7.95(s，1H)，7.53(s，1H)，7.12(t，2H)，7.05(t，3H)，6.88(d，1H)，6.13(s，2H)，4.34(s，2H)，4.22(s，2H)，3.83(s，2H)，3.65(s，2H)，1.97(s，3H)；C27H24FN7O的MS(EI)：482.2(MH+)。
1-{4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-7-(甲氧基)喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.62(t，1H)，8.45(d，1H)，8.17(d，1H)，7.90(t，1H)，7.74(t，1H)，7.52(dt，1H)，7.12(t，1H)，7.05(dd，1H)，6.98(d，1H)，5.04(s，2H)，4.44(d，2H)，4.18(s，2H)，3.86(s，3H)，3.41(s，2H)，2.08(d，6H)；C27H27N7O2的MS(EI)：482.3(MH+)。
4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.60(s，1H)，8.45(s，1H)，8.17(s，1H)，7.62-7.52(m，2H)，7.09(d，1H)，6.00(s，2H)，4.26(d，4H)，3.52(s，2H)，3.18(dt，1H)，2.28(s，3H)，1.22(t，6H)；C23H25N7O的MS(EI)：416.0(MH+)。
4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺
1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)：8.65(br s，1H)，8.43(s，1H)，8.21(br s，1H)，7.63(d，1H)，7.53(dd，1H)，7.11(dd，1H)，4.73(s，2H)，4.35(tr，2H)，3.95(tr，2H)，2.62(tr，2H)，2.39(s，2H)，1.61(tr，2H)，0.90(s，6H)。C25H27N7O的MS EI：443(MH+)。
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.29(s，1H)，7.94(s，1H)，7.50(d，1H)，7.11(t，2H)，7.05(t，4H)，6.86(s，1H)，6.12(s，2H)，4.33(s，2H)，4.22(s，2H)，3.83(s，2H)，3.65(s，2H)，2.54(s，3H)，1.97(s，3H)；C28H26FN7O的MS(EI)：496.2(MH+)。
4-甲基-5-(1-甲基乙基)-6-[7-(2-甲基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.47(d，1H)，7.98(d，1H)，7.65-7.48(m，2H)，7.08(t，1H)，6.03(s，2H)，4.27(d，4H)，3.54(s，2H)，3.21(m，1H)，2.54(s，3H)，2.30(s，3H)，1.25(d，6H)；C24H27N7O的MS(EI)：430.3(MH+)。
6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：8.51(s，1H)，8.03(s，1H)，7.66(d，1H)，7.53(dd，1H)，7.17(d，1H)，5.87(s，2H)，4.50(s，2H)，4.29(m，2H)，3.73(m，2H)，2.55(s，3H)，2.33(s，2H)，1.86(s，2H)，1.52(t，2H)，0.92(s，6H)；C26H29N7O的MS(EI)：456(MH+)。
4-[9-氟-7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺
使用4-氯-5-异丙基-6-甲基嘧啶-2-胺和7-溴-9-氟-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓盐酸盐制备标题化合物。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ7.67(s，1H)，7.51(d，1H)，7.48(d，1H)，7.39(dd，1H)，7.34(s，1H)，6.04(s，2H)，4.31(m，4H)，3.57(m，2H)，3.20(m，1H)，2.49(s，3H)，2.30(s，3H)，1.26(d，6H)；C25H27FN6O的MS(ES)：447(MH+)。
生物学实施例
本发明的化合物对PI3K-α、mTOR或二者有活性。已经使用试验生物学实施例1和3中描述的测定法测试本发明的化合物并且已经确定是PI3K-α、mTOR或二者的抑制剂。
本领域中已知测量PI3K、mTORc1和mTORc2活性和化合物对其的抑制的适合体外测定法。生物学实施例，实施例1、2和3描述了测量PI3K和mTOR活性的体外测定法。测量在癌症治疗中的体外效率的基于细胞的测定法在本领域中已知。生物学实施例，实施例5和6描述了测量体外细胞活性的测定法。本领域的普通技术人员已知适合的体内癌症模型。生物学实施例7、8、9、10、11、12和13描述了前列腺癌、成胶质细胞瘤、肺癌和黑素瘤的体内模型。按照本文公开的实施例，以及本领域公开的实施例，本领域的普通技术人员可测定本发明化合物的PI3K抑制活性和/或mTOR抑制活性。
因此，式I的化合物对治疗疾病，尤其是癌症有用，其中对PI3K-α、mTOR或二者的活性有助于所述疾病的病理学和/或症候学。例如，对PI3K-α、mTOR或二者的活性有助于其病理学和/或症候学的癌症包括乳癌、套细胞淋巴瘤、肾细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、NPM/ALK转化的间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、间变性大细胞淋巴瘤、血管瘤、成胶质细胞瘤或头颈癌。
生物学实施例1
mTOR/GbL/Raptor(mTORC1)ELISA测定
在4E-BP1蛋白磷酸化后，以ELISA测定形式进行mTORC1酶活性的测量。所有实验均以384孔形式进行。通常，0.5μL含不同浓度的试验化合物的DMSO与15μL酶溶液混合。添加15μL含底物的溶液引发激酶反应。测定条件如下：0.2nM mTORC1、10μM ATP和50nM NHis标记的4E-BP1于20mM Hepes中，pH7.2，1mM DTT、50mM NaCl、10mM MnCl2、0.02mg/mL BSA、0.01％CHAPS、50mMβ-甘油磷酸酯。在环境温度下孵育120min后，将20μL反应体积转移至涂有Ni-螯合物的384孔板上。4E-BP1蛋白的结合步骤进行60min，接着用各50μL的Tris缓冲盐水溶液(TBS)洗涤4次。添加于5％BSA-TBST(0.2％于TBS中的吐温-20(Tween-20))中的抗-磷酸-4E-BP1兔-IgG(20μL，1∶5000)并且再孵育60min。在洗掉一次抗体后(50μL洗涤4次)，类似地用HRP标记的第二抗-IgG进行孵育。用TBST最后一步洗涤后，添加20μL的SuperSignal ELISA Femto(PierceBiotechnology)并使用EnVision酶标仪测量发光。
使用这种测定，本发明的化合物优选具有介于约0.0001nM至500nM(IC50)之间的mTOR抑制活性。在另一实施方案中，本发明的化合物具有介于约0.001nM至250nM之间的mTOR抑制活性。在另一实施方案中，本发明的化合物具有介于约0.001nM至250nM之间的mTOR抑制活性。在另一实施方案中，本发明的化合物具有0.01nM至100nM的mTOR抑制活性。在另一实施方案中，本发明的化合物具有0.1nM至50nM的mTOR抑制活性。
编号与表1中的一样，在该测定中化合物4-5、11-17、24-29、33-36、39-42、44-48和50-52的IC50小于或等于100nM。
编号与表1中的一样，在该测定中化合物3、7-8、10、18-21和23的IC50大于100nM但是小于或等于500nM。
编号与表1中的一样，在该测定中化合物1-2、6、9、22、30-32、37-38、43和49的IC50大于500nM但是小于或等于2500nM。
生物学实施例2
免疫复合物mTORC2激酶(mTORC2IP-激酶)测定
在悬浮培养基上培育HeLa(ATCC)细胞并溶解于含有40mMHEPES pH7.5、120mM NaCl、1mM EDTA、10mM焦磷酸钠、10mMβ-甘油磷酸酯、10mM NaF、10mM NaN3、一片蛋白酶抑制剂(Complete-Mini，EDTA-free，Roche)、0.3％胆酰胺丙基二甲氨基丙磺酸内盐(CHAPS)、1mM AEBSF、0.5mM苯甲脒HCl、20μg/mL肝素和1.5mM Na3VO4的冰冷溶解缓冲液中。用抗RICTOR抗体使mTORC2复合物免疫沉淀2h。使免疫复合物固定在蛋白质A琼脂糖(GEHealthcare，17-5280-01)上，依次用洗涤缓冲液(40mM HEPES pH7.5、120mM NaCl、10mMβ-甘油磷酸酯、0.3％CHAPS、1mM AEBSF、20μg/mL肝素、1.5mM Na3VO4和Complete-Mini，EDTA-free)洗涤3次并再次悬浮于激酶缓冲液(40mM HEPES pH7.5、120mM NaCl、0.3％CHAPS、20μg/mL肝素、4mM MgCl2、4mM MnCl2、10％甘油和10mM DTT)中。在37℃下用试验化合物或0.6％DMSO预孵育免疫复合物(相当于1×107个细胞)5min，然后在33μL含激酶缓冲液、50μM ATP和0.75μg全长去磷酸化AKT1的最终体积(包括5μL床体积)中进行激酶反应8min。添加11μL含20％β-巯基乙醇的4×SDS样品缓冲液终止激酶反应并溶解于10％Tris甘氨酸凝胶中。在4C、50V下将凝胶转移至PVDF膜上20h。将膜封闭于5％于TBST中的脱脂奶中1h并且在4℃下用1/1000稀释于3％BSA/TBST中的兔抗-pAKT(S473)(Cell Signaling Technology，4060)孵育过夜。于TBST中洗涤膜3次并且用1/10000稀释于5％脱脂奶/TBST中的第二山羊抗兔HRP抗体(Cell Signaling Technology，2125)孵育1h。使用AmershamECL-plus检测信号。使用ImageQuant软件分析扫描数据。使用XLfit4软件测定试验化合物相对应于DMSO处理样品的IC50。
生物学实施例3
pS6(S240/244)ELISA测定
按24000个细胞/孔，将MCF-7细胞(ATCC)接种于96孔板(Corning，3904)中，含10％FBS(Cellgro)、1％NEAA(Cellgro)和1％青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)(Cellgro)的DMEM(Cellgro)中。在37℃、5％CO2下孵育细胞48h，并且用无血清DMEM或含有0.4％BSA的培养基替换生长培养基。向细胞中添加连续稀释于0.3％DMSO(媒介物)中的试验化合物并孵育3h。为固定细胞，去除培养基并且在室温下向每个孔添加100μL/孔于TBS(20mM Tris、500mMNaCl)中的4％甲醛(Sigma Aldrich，F8775)30min。用200μL含0.1％Triton X-100(Sigma，产品目录号#T9284)的TBS洗涤细胞4次。在室温下用100μL Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor Biosciences，927-40000)封闭板1h。按1∶400将抗-pS6(S240/244)抗体(Cell SignalingTechnology，2215)和抗-总S6抗体(R&D systems，MAB5436)稀释于Odyssey封闭缓冲液中，并向一块板添加50μL含两种抗体的抗体溶液以检测pS6和总S6。在4℃下孵育过夜后，用200μL含0.1％吐温20(Bio-Rad，产品目录号#170-6351)(TBST)的TBS洗涤板4次。按1∶400将与IRDye偶联的山羊抗兔和山羊抗小鼠第二抗体(Li-CorBiosciences，产品目录号#926-32221和926-32210)稀释于含0.1％吐温20的Odyssey封闭缓冲液中。向每个孔添加50μL含两种抗体的抗体溶液并且在室温下孵育1h。用200μL TBST洗涤板3次并用200μLTBS洗涤2次。在Odyssey酶标仪上读取荧光性。基于pS6与总S6信号的比例测定化合物处理孔的IC50值，标准化为DMSO处理的对照孔。
在一个实施方案中，在该测定中于MCF-7细胞中试验的本发明化合物的抑制活性为1.5μM或更低。在另一实施方案中，在该测定中于MCF-7细胞中试验的本发明化合物的抑制活性为1.0μM或更低。在另一实施方案中，在该测定中于MCF-7细胞中试验的本发明化合物的抑制活性为0.5μM或更低。在一个实施方案中，在该测定中于MCF-7细胞中试验的本发明化合物的抑制活性为0.25μM或更低。在一个实施方案中，在该测定中于MCF-7细胞中试验的本发明化合物的抑制活性为0.2μM或更低。在一个实施方案中，在该测定中于MCF-7细胞中试验的本发明化合物的抑制活性为0.1μM或更低。
生物学实施例4
PI3K生物化学测定
使用荧光素酶-萤光素耦合化学发光，按激酶反应后消耗的ATP百分比测量PI3Kα活性。在白色384孔、培养基结合微量滴定板(Greiner)上进行反应。通过合并20μL体积的试验化合物、ATP、底物(PIP2)和激酶于缓冲液中引发激酶反应。标准PI3Kα测定缓冲液由50mM Tris pH7.5、1mM EGTA、10mM MgCl2、1mM DTT和0.03％CHAPS构成。酶、ATP和底物的标准测定浓度分别为3nM、1μM和10μM。在环境温度下孵育反应混合物约2h。激酶反应后，添加10μL等分试样的荧光素酶-萤光素混合物(Promega Kinase-Glo)并且使用Victor2或EnVision(Perkin Elmer)测量化学发光信号。总ATP消耗量限于40-60％并且对照化合物的IC50值与文献参考相当一致。用PI3Kβ、PI3Kγ或PI3Kδ代替PI3Kα，测量化合物对PI3K其它同种型的抑制活性。对于PI3Kβ和PI3Kδ测定，酶浓度分别为10nM和4nM。对于PI3Kγ测定，酶浓度为40nM，孵育时间为1h，并且测定缓冲液中MgCl2的浓度为5mM。
编号与表1中的一样，在PI3K-α测定中化合物1-11、14-15、17、20、22、24-30、32-42和44-52的IC50小于或等于100nM。
编号与表1中的一样，在PI3K-α测定中化合物12-13、16、18、21、23和31的IC50大于100nM但是小于或等于500nM。
编号与表1中的一样，在PI3K-α测定中化合物19和43的IC50大于500nM但是小于或等于2500nM。
替代实施方案：在一个实施方案中，本发明包括具有约0.5μM或更低的PI3K-α抑制活性的本发明化合物并且对mTOR无活性(当在2.0μM或更高浓度下试验时)或对PI3K-α的选择性高于mTOR约5倍或更高，约7倍或更高，或约10倍或更高。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.35μM或更低的PI3K-α抑制活性的本发明化合物并且对mTOR无活性(当在2.0μM或更高浓度下试验时)或对PI3K-α的选择性高于mTOR约5倍或更高，约7倍或更高，或约10倍或更高。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.25μM或更低的PI3K-α抑制活性的本发明化合物并且对mTOR无活性(当在2.0μM或更高浓度下试验时)或对PI3K-α的选择性高于mTOR约5倍或更高，约7倍或更高，或约10倍或更高。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.1μM或更低的PI3K-α抑制活性的本发明化合物并且对mTOR无活性(当在2.0μM或更高浓度下试验时)或对PI3K-α的选择性高于mTOR约5倍或更高，约7倍或更高，或约10倍或更高。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.05μM或更低的PI3K-α抑制活性的本发明化合物并且对PI3K-α的选择性高于mTOR约5倍或更高，约7倍或更高，或约10倍或更高。
替代实施方案：在一个实施方案中，本发明包括具有约2.0μM或更低的PI3K-α抑制活性和约2.0μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物并且对其中一个靶标的选择性不超过另一个的3倍。在另一实施方案中，本发明包括具有约1.0μM或更低的PI3K-α抑制活性和约1.0μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物并且对其中一个靶标的选择性不超过另一个的3倍。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.5μM或更低的PI3K-α抑制活性和约0.5μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物并且对其中一个靶标的选择性不超过另一个的3倍。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.3μM或更低的PI3K-α抑制活性和约0.3μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物并且对其中一个靶标的选择性不超过另一个的3倍。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.2μM或更低的PI3K-α抑制活性和约0.2μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物并且对其中一个靶标的选择性不超过另一个的2倍。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.15μM或更低的PI3K-α抑制活性和约0.15μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物并且对其中一个靶标的选择性不超过另一个的2倍。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.1μM或更低的PI3K-α抑制活性和约0.1μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.05μM或更低的PI3K-α抑制活性和约0.05μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.02μM或更低的PI3K-α抑制活性和约0.02μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物。在另一实施方案中，本发明包括具有约0.01μM或更低的PI3K-α抑制活性和约0.01μM或更低的mTOR抑制活性的本发明化合物。
生物学实施例5-11
异种移植肿瘤药效模型
在下列模型中使用5-8周龄，重约20-25g的雌性和雄性无胸腺裸鼠(NCr)。开始研究之前，使动物适应最少48h。这些研究期间，随意为动物提供食物和水并关在条件为70-75°F和60％相对湿度的房间内。用自动定时器维持12h光和12h暗循环。每天检查所有动物由化合物诱导的或与肿瘤相关的死亡。
MCF-7乳腺癌模型
在体外在37℃下于5％CO2潮湿环境中，于补充了10％胎牛血清(Cellgro)、青霉素-链霉素和非必需氨基酸的DMEM(Cellgro)中培养MCF7人乳腺癌细胞。在第0天，通过胰蛋白酶处理收获细胞，并且向雌性裸鼠的后胁皮下植入5×106个于100μL由50％冷Hank平衡盐溶液与50％低生长因子基底膜(Becton Dickinson)制成的溶液中的细胞。将应答器植入每只小鼠体内，以便鉴定和数据跟踪，并且每天监测动物的临床症状和存活率。
在雌性无胸腺裸鼠中建立肿瘤并且当肿瘤重量达到100-200mg时分期。按10、25、50和100mg/kg每日一次(qd)或每日两次(bid)口服施用于水中呈溶液/细微悬浮液(1∶1摩尔比的1N HCL)的本发明化合物14天。14-19天服药期间，一周测定肿瘤重量两次并每天记录体重。
Colo-205结肠模型
在体外在37℃下于5％CO2潮湿环境中，于补充了10％胎牛血清(Hyclone)、青霉素-链霉素和非必需氨基酸的DMEM(Mediatech)中培养Colo-205人结直肠癌细胞。在第0天，通过胰蛋白酶处理收获细胞，并且向5-8周龄的雌性裸鼠的后胁皮下植入3×106个于0.1mL冰冷Hank平衡盐溶液中的细胞(10-15代，活力＞95％)。将应答器植入每只小鼠体内以便鉴定，并且每天监测动物的临床症状和存活率。
在雌性无胸腺裸鼠中建立肿瘤并且当平均肿瘤重量达到100-200mg时分期。按10、25、50和100mg/kg每日一次(qd)或每日两次(bid)口服施用于水中呈溶液/细微悬浮液(1∶1摩尔比的1N HCL)的本发明化合物14天。14天服药期间，一周测定肿瘤重量两次并每天记录体重。
PC-3前列腺癌模型
在体外在37℃下于5％CO2潮湿环境中，于补充了20％胎牛血清(Hyclone)、青霉素-链霉素和非必需氨基酸的DMEM(Mediatech)中培养PC-3人前列腺癌细胞。在第0天，通过胰蛋白酶处理收获细胞，并且向5-8周龄的雄性裸鼠的后胁皮下植入3×106个于0.1mL冰冷Hank平衡盐溶液中的细胞(10-14代，活力＞95％)。将应答器植入每只小鼠体内以便鉴定，并且每天监测动物的临床症状和存活率。
在雄性无胸腺裸鼠中建立肿瘤并且当平均肿瘤重量达到100-200mg时分期。按10、25、50或100mg/kg每日一次(qd)或每日两次(bid)口服施用于水中呈溶液/细微悬浮液(1∶1摩尔比的1N HCL)的本发明化合物19天。14-19天服药期间，一周测定肿瘤重量两次并每天记录体重。
U-87MG人成胶质细胞瘤模型
在体外在37℃下于5％CO2潮湿环境中，于补充了10％胎牛血清(Hyclone)、青霉素-链霉素和非必需氨基酸的DMEM(Mediatech)中培养U-87MG人成胶质细胞瘤细胞。在第0天，通过胰蛋白酶处理收获细胞，并且向5-8周龄的雌性裸鼠的后胁皮内植入2×106个于0.1mL冰冷Hank平衡盐溶液中的细胞(第5代，活力96％)。将应答器植入每只小鼠体内以便鉴定，并且每天监测动物的临床症状和存活率。每天记录体重。
A549人肺癌模型
在体外在37℃下于5％CO2潮湿环境中，于补充了10％胎牛血清(Hyclone)、青霉素-链霉素和非必需氨基酸的DMEM(Mediatech)中培养A549人肺癌细胞。在第0天，通过胰蛋白酶处理收获细胞，并且向5-8周龄的雌性裸鼠的后胁皮内植入10×106个于0.1mL冰冷Hank平衡盐溶液中的细胞(第12代，活力99％)。将应答器植入每只小鼠体内以便鉴定，并且每天监测动物的临床症状和存活率。每天记录体重。
A2058人黑素瘤模型
在体外在37℃下于5％CO2潮湿环境中，于补充了10％胎牛血清(Hyclone)、青霉素-链霉素和非必需氨基酸的DMEM(Mediatech)中培养A2058人黑素瘤细胞。在第0天，通过胰蛋白酶处理收获细胞，并且向5-8周龄的雌性无胸腺裸鼠的后胁皮内植入3×106个于0.1mL冰冷Hank平衡盐溶液中的细胞(第3代，活力95％)。将应答器植入每只小鼠体内以便鉴定，并且每天监测动物的临床症状和存活率。每天记录体重。
WM-266-4人黑素瘤模型
在体外在37℃下于5％CO2潮湿环境中，于补充了10％胎牛血清(Hyclone)、青霉素-链霉素和非必需氨基酸的DMEM(Mediatech)中培养WM-266-4人黑素瘤细胞。在第0天，通过胰蛋白酶处理收获细胞，并且向5-8周龄的雌性无胸腺裸鼠的后胁皮内植入3×106个于0.1mL冰冷Hank平衡盐溶液中的细胞(第5代，活力99％)。将应答器植入每只小鼠体内以便鉴定，并且每天监测动物的临床症状和存活率。每天记录体重。
通过用卡尺测量垂直直径，使用下列公式确定以上模型中的肿瘤重量(TW)：
肿瘤重量(mg)＝[肿瘤体积＝长度(mm)×宽度2(mm2)]/2
记录这些数据并绘制于肿瘤重量比对植入后天数的线形图上并且在图上作为肿瘤生长率的指示呈现。用下列公式确定肿瘤生长抑制(TGI)百分比：
[ 1 - ( ( X f - X 0 ) ( Y f - X 0 ) ) ] * 100
其中X0＝分组当天所有肿瘤的平均TW
Xf＝第f天处理组的TW
Yf＝第f天媒介物对照组的TW
如果肿瘤消退到原始尺寸以下，则用下列公式确定肿瘤消退百分比：
( X 0 - X f X 0 ) * 100
单独计算每只小鼠的肿瘤尺寸以获得每个实验组的平均值±SEM值。使用双尾学生t检验确定统计显著性(显著定义为P＜0.05)。
为了清楚和理解，已经通过举例说明和实施例的方式相当详细地描述了前述发明。已经参考各个特定实施方案和技术描述了本发明。然而，应理解，保持在本发明的精神和范围内的同时，可进行许多改变和修改。对于本领域的技术人员显而易见的是，在所附权利要求的范围内可实践变化和修改。因此，应理解，以上描述旨在说明而非限制。因此，不得依据以上描述确定本发明的范围，而应依据以下所附权利要求，连同为此权利要求授权的全部等效方案范围确定。本申请中引用的所有专利、专利申请和出版物均如同单独地指出将每个单独的专利或专利申请通过引用并入的相同程度据此通过引用整体并入。
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Figure IDA00003557632300121
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Claims (17)

1.一种式I的化合物
或其单一异构体或立体异构体混合物，任选为其药学上可接受的盐，其中
RW为其中：
Ra和Rb各自独立地为-CO(C1-C6)烷基、-CO2(C1-C6)烷基、-SO2-(C1-C6)烷基、-NHSO2-(C1-C6)烷基、O-(C1-C6)烷基、O-(C1-C6)卤代烷基、O-(C1-C6)亚烷基-OR”’，其中R”’为H或(C1-C6)烷基
R1为H、(C1-C6)烷基)、NH2、NH(C1-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C7)-环烷基、NHCO2(C1-C6)烷基或N((C1-C6)烷基)2；
X为N或CH；
R4为H或卤代；
Q为N、C-H或C-(C1-C6)烷基、C-CN或C-CF3；
R6为H、(C1-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-NH2、(C1-C6)亚烷基-NH(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-NH(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)亚烷基-N(C1-C6)烷基)2、NH2、NH(C1-C6)烷基、羟烷基、(C1-C6)亚烷基-O(C1-C6)烷基、NH(C1-C6)亚烷基NH2、NH(C1-C6)亚烷基-环烷基、-NH(C1-C6)亚烷基-杂环烷基、N((C1-C6)烷基)2、(C1-C6)亚烷基-NHSO2-(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-NH(C＝O)-(C1-C6)烷基、-(C＝O)-NH2、-(C＝O)-(C1-C6)烷基、-(C＝O)-NH(C1-C6)烷基、-(C＝O)-N(C1-C6)烷基))2、-NHSO2-(C1-C6)烷基、-S(O)-(C1-C6)烷基、-SO2-(C1-C6)烷基、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C6)烷基、-SO2N((C1-C6)烷基)2、-CN、(C4-C7)杂环烷基、(C1-C6)亚烷基-(C3-C7)杂环烷基、硝基、(C1-C6)亚烷基-CN、NH(C1-C6)亚烷基-NH(C1-C6)烷基、NH(C1-C6)亚烷基-N((C1-C6)烷基)2或(C1-C6)亚烷基-OC(O)-(C1-C6)烷基，其中R6中的任一亚烷基经1、2或3个独立为卤代或羟基的基团任选取代，并且其中当任一亚烷基为-CH2-时，-CH2-的其中一个氢可被CF3、CHF2或CH2F任选置换；
R7为H、卤代、-NH2、硝基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、-CF3、卤代(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、NH(C1-C6)烷基或N((C1-C6)烷基)2；
Y为N或C-R8，其中R8为H、卤代、(C1-C6)烷基、-CF3、NH2、NH(C1-C6)烷基、N((C1-C6)烷基)2、(C2-C6)烯基、(C1-C6)亚烷基-O(C1-C6)烷基、羟烷基、(C1-C6)亚烷基-CO2(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-CO2H、苯基、-CF3、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、(C1-C6)亚烷基-(C3-C7)环烷基、COH、CO2H、-CO2(C1-C6)烷基、CN、(C1-C6)亚烷基-CN、(C1-C6)亚烷基-C≡C-H、(C1-C6)亚烷基-C≡C-(C1-C6)烷基、-C≡C-H、-C≡C-(C1-C6)烷基、(C1-C6)亚烷基-苯基；其中R8中的任一苯基经1、2或3个基团任选取代，所述基团独立为卤代或烷基；或
R7和R8连同与之连接的原子可连在一起形成任选含多达两个选自N-H、N-(C1-C6)烷基、O、SO和SO2的杂原子的5、6或7元饱和、部分不饱和或不饱和环，并且其中由R7和R8形成的环经1或2个独立地为烷基、烷氧基或卤代的基团任选取代；并且
Z为N或C-R9，其中R9为H、卤代或(C1-C6)烷基；并且
其中Q和Z中至少一个为N。
2.根据权利要求1所述的化合物，其为式Ia或I-2的化合物。
Figure FDA00003557631900031
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述化合物为式Ia的化合物。
Figure FDA00003557631900032
4.根据权利要求1-3所述的化合物，其中式Ia的化合物为式Ib的化合物。
Figure FDA00003557631900033
5.根据权利要求1-4所述的化合物，其中所述化合物为式Ic-1或Ic-2的化合物。
Figure FDA00003557631900041
6.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述化合物为式Id的化合物，其中R4为H或F。
Figure FDA00003557631900042
7.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述化合物为式Ie的化合物。
Figure FDA00003557631900043
8.根据权利要求1-7所述的化合物，其中R4为H。
9.根据权利要求1-8所述的化合物，其中
Figure FDA00003557631900051
为
Figure FDA00003557631900052
10.根据权利要求9所述的化合物，其中
Figure FDA00003557631900053
为
Figure FDA00003557631900054
11.根据权利要求1-8所述的化合物，其中为
Figure FDA00003557631900061
Figure FDA00003557631900071
Figure FDA00003557631900081
Figure FDA00003557631900091
Figure FDA00003557631900101
Figure FDA00003557631900111
12.根据权利要求1-11所述的化合物，其中
Figure FDA00003557631900112
Figure FDA00003557631900113
Figure FDA00003557631900121
13.根据权利要求1-12所述的化合物，其为：
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-[2-(甲氧基)乙基]嘧啶-2-基}甲胺；
1-{4，5-二甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺；
N-乙基-N-({4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}甲基)乙胺；
{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}乙酸甲酯；
{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}甲醇；
{2-[(二甲基氨基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-5-基}乙酸甲酯；
1-(6，6-二甲基-4-{7-[4-(甲氧基)-3-{[2-(甲氧基)乙基]氧基}苯基]-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基}-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺；
1-{4-[7-{3-[(二氟甲基)氧基]-4-(甲氧基)苯基}-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺；1-(6，6-二甲基-4-{7-[4-(甲氧基)-3-(甲磺酰基)苯基]-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基}-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基)-N，N-二甲基甲胺；
N-[5-(4-{2-[(二甲基氨基)甲基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)-2-(甲氧基)苯基]甲磺酰胺；
N′-{5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基乙烷-1，2-二胺；
N-乙基-5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺；
N′-{5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基丙烷-1，3-二胺；
N-氮杂环丁-3-基-5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺；
N-氮杂环丁-3-基-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
N-[5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-2-(甲氧基)苯基]甲磺酰胺；
(5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸甲酯；
1-[5-(4-{2-[(二甲基氨基)甲基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-基}-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基)-2-(甲氧基)苯基]乙酮；
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-N-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-4-[6-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-(吡咯烷-1-基甲基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓；
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-苯基嘧啶-2-基}甲胺；
1-{5-(3-氟丙基)-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(2-甲基丙基)嘧啶-2-基}甲胺；
1-{6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}乙胺；
4-[2-(氟甲基)-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-4-基]-7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓；
N-({6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-基}甲基)乙酰胺；
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺；
6-氨基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]吡啶-3-腈；
6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺；
1-{5-溴-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺；
1-{5-氯-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-基}-N，N-二甲基甲胺；
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-丙基嘧啶-2-基}甲胺；
N，N-二甲基-1-{4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-丙-2-烯-1-基嘧啶-2-基}甲胺；
2-氟-N-({4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-基}甲基)乙胺；
4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-丙-2-烯-1-基嘧啶-2-胺；
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-[(4-氟苯基)甲基]-6-甲基嘧啶-2-胺；
1-{4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-7-(甲氧基)喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺；
N，N-二甲基-1-{4-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-7-(甲氧基)喹唑啉-2-基}甲胺；
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺；
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
4-甲基-6-[7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
5-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-N-乙基-1H-苯并咪唑-2-胺；
4-[7-(1H-苯并咪唑-5-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基嘧啶-2-胺；
4-[9-氟-7-(2-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
6，6-二甲基-4-[7-(2-甲基-1H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺；
4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6，6-二甲基-5，6，7，8-四氢喹唑啉-2-胺；
6-{4-[2-氨基-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-4-基]-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-7-基}-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-胺
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基嘧啶-2-胺
5-[(4-氟苯基)甲基]-4-甲基-6-[7-(2-甲基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺
1-{4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-7-(甲氧基)喹唑啉-2-基}-N，N-二甲基甲胺
4-甲基-5-(1-甲基乙基)-6-[7-(2-甲基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]嘧啶-2-胺；
4-[7-(3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-6-基)-2，3-二氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4(5H)-基]-6-甲基-5-(1-甲基乙基)嘧啶-2-胺；
任选为其药学上可接受的盐。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-13所述的化合物，任选为其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
15.一种治疗疾病、病症或综合征的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据权利要求1-13所述的化合物，任选为其药学上可接受的盐，或向患者施用包含治疗有效量的根据权利要求1-13所述的化合物，任选为其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病为癌症。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症为乳癌、套细胞淋巴瘤、肾细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、NPM/ALK转化的间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、间变性大细胞淋巴瘤、血管瘤、成胶质细胞瘤或头颈癌。
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