CN103374060A - 棉花Trihelix转录因子GhGT23及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉花Trihelix转录因子GhGT23及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，为棉花转录因子Trihelix类蛋白，名称为GhGT23，来源于棉花(Gossypium)，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对提高农作物产量具有重要意义。

Description

棉花Trihelix转录因子GhGT23及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种棉花Trihelix转录因子GhGT23及其编码基因与应用。

背景技术

环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB等等。Trihelix转录因子因其蛋白质结构中的DNA结合域有3个α-螺旋(helix-loop-helix-loop-helix)而得名。该蛋白家族的成员根据其DNA结合元件的特异性而划分为3个蛋白亚家族，即GT-1，GT-2和GT-3(Ayadi et al.，2004，Analysis of GT-3a identifies a distinct subgroupof trihelix DNA-binding transcription factors in Arabidopsis，FEBS Letters 562，147-154.2004)。就蛋白质结构中DNA结合域数目而言，GT-1类和GT-3类仅在其N端有一个trihelix域，而GT-2类蛋白则具有两个trihelix域，分别位于C端和N端。其与GT元件结合，行使功能。

Trihelix转录因子调控光应答基因的表达。最近有报道，拟南芥中的PETAL LOSS是一个GT-2类的蛋白，它参与叶与花器官的正常发育(Brewer et al.，2004，PETALLOSS，a trihelix ranscription factor gene，regulates perianth architecture inthe Arabidopsis flower.Development 131，4035-4046)。

目前，在大豆中鉴定了2个Trihelix转录因子，GmGT2A和GmGT2B，它们调控植物对非生物胁迫的应答反应(专利：大豆Trihelix转录因子(GmGT2A)及其编码基因与应用，专利号：ZL 200610089212.7，一种大豆Trihelix转录因子(GmGT2B)及其编码基因与应用，专利号：ZL 200610089211.2)。但是棉花中Trihelix类转录因子与非生物胁迫的应答尚未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种棉花Trihelix转录因子GhGT23及其编码基因。

本发明提供蛋白，为棉花转录因子Trihelix类蛋白，名称为GhGT23，来源于棉花(Gossypium)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由371个氨基酸残基组成，属于棉花转录因子Trihelix家族。其编码基因的读码框包含1116个核苷酸。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述棉花转录因子GhGT23的编码基因GhGT23也属于本发明的保护范围。

上述基因为如下1)-4)中任一一种的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’端第1-1113位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列1由1116个脱氧核苷酸组成，本序列为GhGT23基因的读码框，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为具体为将上述基因插入表达载体pBin438的BamHI和KpnI酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述调节植物耐逆性为提高植物耐逆性；所述耐逆具体为耐盐；

所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。

本发明的第二个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将上述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。

上述方法中，所述耐逆为耐盐；

所述将上述蛋白的编码基因通过上述的重组载体导入目的植物；

所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。

上述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的耐逆性性状得到改良。

上述基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。

携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明的实验证明，本发明发现了一个基因GhGT23，其表达明显受高盐和干旱诱导，推测GhGT23与植物对非生物逆境应答的调控相关。将GhGT23基因经农杆菌的介导，导入拟南芥Col-0中，获得了过量表达GhGT23的纯系株系，上述转基因株系与野生型拟南芥相比，其耐盐性有显著提高，说明GhGT23基因能够显著提高植物的耐盐性。GhGT23参与植物对非生物胁迫应答的调控。

本发明对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对提高农作物产量具有重要意义。之前曾证明了大豆Trihelix家族的一些成员参与植物对逆境应答的调控。本专利表明棉花Trihelix家族中的一些成员也参与了植物对非生物胁迫应答的调控，其表达与植物的耐非生物胁迫呈正相关。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GhGT23基因在不同处理时的转录特征

A、C分别为RT-PCR和Real time PCR测定的GhGT23在150mM NaCl处理不同时间的转录水平B、D分别为RT-PCR和Real time PCR测定的GhGT23在干旱处理不同时间的转录水平

图2为GhGT23在不同组织中的表达特征

图3为植物表达载体pBin438-GhGT23的示意图

图4为GhGT23过表达株系的分子鉴定

图5为GhGT23过表达株系与对照的耐盐性鉴定

A，测试株系排列示意图；B，GhGT23过表达株系和对照萌发后12天苗移栽至含经75mM NaCl的蛭石中，生长4天，加NaCl水溶液，至终浓度为200mM，3天，再加NaCl水溶液至300mM后的表型，C，经上述处理12天后的存活率统计

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

所有植物材料均生长于22。℃每天的光照为16h/8h(光照/黑暗)。

pBin438载体(双元表达载体)记载在(李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究，中国科学(B辑)，1994，24(3)：276-282.)，由方荣祥院士惠赐。经方荣祥先生同意，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

农杆菌GV3101菌株记载在Clough-SJ，Bent-AF.Floral dip：a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant Journal.1998，16：6，735-743中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)：种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)。

实施例1、棉花GhGT23基因的获得

1、棉花GhGT23基因cDNA克隆

前期的研究表明转录因子Trihelix家族参与植物对非生物胁迫的应答反应，并与植物耐逆性相关。陆地棉(Gossypium hirsutumL.)的耐盐性相对较高。参考拟南芥和大豆等物种Trihelix家族成员的保守氨基酸序列，及棉花Trihelix家族网页中的Trihelix家族成员的序列，克隆了12个Trihelix类基因，转基因实验表明，其中GhGT23与耐逆性相关。

克隆GhGT23所用引物为：

GhGT23BamHIF：5’-AGCGGATCCATGGACAAAGAAACTAATAACC-3’(序列3)

GhGT23SalIKpnIR：5’-AGCGTCGACGGTACCACTTCTTCCTATCCTCAACG-3’(序列4)

陆地棉(Gossypium hirsutumL.新陆早，相吉山，谢宗铭，田琴，董永梅，李有忠，司爱君.新北疆棉花“新陆早”系列品种主要性状分析。新疆农业科学，2010，47(8)：1535-1540。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)发芽，生长12天后，取苗，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒描述的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20μl PCR反应体系为：1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(20μM)、2μl 10×PCR缓冲液、0.4μl dNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20μl，液面覆盖液体石蜡油。反应在PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃变性5min；再94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30-32个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经回收后序列分析。所克隆的序列包括起始密码子ATG和终止密码子TGA。该基因的读码框架包括1116bp，具有序列表中序列1自5’末端第1-1113位的核苷酸序列，为GhGT23的cDNA，氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由371个氨基酸残基组成，即序列表中序列2的氨基酸残基。该PCR产物然后克隆于pMD18-T质粒的多克隆位点，得到重组载体pMDGhGT23。

2、GhGT23基因在非生物胁迫下的表达特征

对陆地棉进行空气干燥和NaCl处理，用于分析陆地棉的GhGT23在高盐和干旱处理下的转录特征。陆地棉发芽，生长7天后，对幼苗分别进行下述胁迫处理：

生长条件除指明外均为22-23℃，光照16h/天

干旱处理：将生长7天的幼苗取出，用滤纸将根系中的水分吸干，置于空气中，0小时、1小时、3小时、6小时和12小时取样。

盐处理：将生长7天的幼苗的根系置于150mM NaCl水溶液中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时取样。

应用RT-PCR和Real Time PCR分析GhGT23基因在上述处理时的转录特征，总RNA的提取同前面的1。所用引物如下：

以Actin作为内对照，引物为：

QRT-GhactinF1：GTAATTCCAGCTCCAATAGCG

QRT-GhactihR1：CCCGAAGGCCAACACAATAG

结果如图1所示，其中，A和C为150mM NaCl水溶液诱导处理的基因表达量，B和D为干旱处理的基因表达量；可以看出，两种方法均显示GhGT23基因的转录在高盐和干旱诱导处理前期均有所下降，但是分别在胁迫6小时和3小时明显受诱导，之后在有回落。根据上述结果推测GhGT23可能参与植物对非生物胁迫的应答。

对陆地棉的各个器官进行GhGT23基因表达量检测，方法同上，结果如图2，由图可见，GhGT23在茎中表达量最高，根中次之，在子叶和叶中较少。

实施例2、GhGT23的功能鉴定

1、重组表达载体pBin438-GhGT23的构建

以实施例1获得的陆地棉幼苗的cDNA为模板，由GhGT23BamHIF和GhGT23KpnIR作为引物，获得的PCR产物，经测序后确认其中包含的GhGT23 cDNA是完整无误的，序列表中的序列1自5’端第1-1113位核苷酸。

GhGT23BamHIF：5’-AGCGGATCCATGGACAAAGAAACTAATAACC-3’(序列3)

GhGT23KpnIR：5’-AGCGTCGACGGTACCACTTCTTCCTATCCTCAACG-3’(序列4)

用限制性内切酶BamHI和Kpn I双酶切上述PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pBin438得到的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，测序，该质粒为将序列表中的序列1自5’端第1-1113位核苷酸插入pBin438的BamHI和Kpn I酶切位点之间得到的载体，将该载体命名为pBin438-GhGT23，且序列表中的序列1位于CaMV 35S启动子之后。重组表达载体pBin438-GhGT23结构示意图如图3所示。

2、转GhGT23拟南芥株系的获得

将重组载体pBin438-GhGT23用电击转化法导入农杆菌GV3101中，得到重组菌，提取重组菌的质粒，测序，验证该质粒中的插入片段为GhGT23，其读码框架无误。将含有该质粒的重组菌命名为GV3101/pBin438-GhGT23。

挑取GV3101/pBin438-GhGT23的单菌落在5mlLB中，于28℃培养8小时，再转接到200mlLB中继续培养3小时，收菌后重悬于LB培养基中得到转化液。将野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0的花浸泡于转化液中10秒，取出后放入MS培养基中避光培养8小时，获得T₀代转化种子，将其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培养基上，获得24株T₀代转GhGT23拟南芥。

提取上述28株T₀代转GhGT23拟南芥植株叶的RNA，并反转录获得cDNA，进行RT-PCR鉴定，探针为序列1，引物为GhGT23BamHIF和GhGT23KpnIR。

其中13个株系的分子鉴定见图4，横坐标为T₀代转GhGT23拟南芥的不同株系，纵坐标为GhGT23的相对表达量，可以看出，5个转基因株系23-1、23-8、23-24、23-29和23-36的表达量高，筛选这5个转基因株系作进一步研究，其中在23-1和23-24中GhGT23有较高的转录水平。

将T₁单株收获种子，此为T₂代种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T₂代的分离情况，如此重复筛选，直至T₃代获得遗传稳定的转基因株系，选择上述5个株系进一步鉴定功能。

采用同样的方法，将空载体pBin438转入野生型拟南芥中，得到T₀代转空载体拟南芥，用上述引物GhGT23BamHIF和GhGT23KpnIR进行RT-PCR，未得到目的基因表达。因此说明T₀代转空载体拟南芥为阳性，同样筛选得到T₃代转空载体拟南芥。

4、GhGT23基因过量表达株系的耐盐性鉴定

实验样本为野生型拟南芥Col-0、T₃代转GhGT23拟南芥株系23-1、23-8、23-24、23-29和23-36、T₃代转空载体拟南芥。每个株系36粒种子。

将各个株系植株的种子同时播种在MS平板上，萌发后12天苗移栽至含75mM NaCl的蛭石中，生长4天，加NaCl水溶液，至终浓度为200mM，3天，再加NaCl水溶液至300mM，12天后统计存活率。上述实验重复两次。以不加入NaCl水溶液处理作为对照。

拍照12天后的结果如图5A所示，对照为不加入NaCl水溶液处理，可以看出，各株系无显著差异；而处理12天后，T₃代转GhGT23拟南芥的存活比野生型多。

具体统计加入NaCl水溶液处理12天后存活率，结果如图5B所示，可以看出，对照的存活率约为12％，而23-1、23-24、23-29和23-36株系的存活率分别为37％、34％、28％、45％，与对照相比达到极显著差异，23-8的存活率为25％，与野生型拟南芥Col-0呈显著差异。

而T₃代转空载体拟南芥和野生型拟南芥Col-0的结果无显著差异。

上述结果表明，陆地棉GhGT23参与了植物在高盐胁迫下的调控。其编码基因GhGT23的过量表达，提高了转基因植株的耐盐性。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)-4)中任一一种的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’端第1-1113位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述重组载体具体为将权利要求2或3所述基因插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。

5.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。

6.根据权利要求5所示的引物对，其特征在于：所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4。

7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述调节植物耐逆性为提高植物耐逆性；所述耐逆具体为耐盐；

所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。

9.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述耐逆为耐盐；

所述将权利要求1所述蛋白的编码基因通过权利要求4所述的重组载体导入目的植物；

所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。

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