CN103353487A

CN103353487A - 一种测定本芴醇含量的高效液相色谱方法

Info

Publication number: CN103353487A
Application number: CN2013102381732A
Authority: CN
Inventors: 彭学东; 张梅; 赵金召; 杨艳丽
Original assignee: ZHANGJIAGANG WEISHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: ZHANGJIAGANG WEISHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2013-10-16

Abstract

本发明公开了一种本芴醇含量的高效液相色谱测定方法，色谱柱：Thermo BDS-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶20∶1(体积比)(pH＝4)；检测温度：30℃；进样量5μl；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：264nm。本芴醇在0.5μg/ml～50μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好线性关系，线性相关系数r＝0.9998。高效液相色谱法检测本芴醇含量的方法，具有灵敏度高，准确可靠，分离效果好，分析简便快捷等技术特点。

Description

一种测定本芴醇含量的高效液相色谱方法

技术领域

本发明涉及一种测定本芴醇含量的高效液相色谱方法。

背景技术

疟疾是一种由疟原虫引起的，通过虐蚊传播，是当今世界发病率最高、危害最重的蚊媒传染病，主要发生在非洲中部、南亚、东南亚及南美北部的热带地区。

自20世纪60年代发现恶性疟原虫对抗疟药氯喹产生抗药性以来，迄今，抗药性恶性疟原虫已经遍布全球所有的恶性疟流行区，且抗性强度不断增强。疟原虫产生抗性的速度远比新药研究的速度更快，使得原有传统的抗疟药在临床应用上受到很大的限制，给疟疾防治工作带来新的困难。为了保护新药，延长新药的使用寿命，将新药组成复方是延缓抗药性产生的有效办法之一，本芴醇是增效、延缓抗药性的复方制剂中的重要组成成分。

本芴醇(Lumefantrine)(结构式见附图1)为黄色结晶性粉末；有苦杏仁臭，无味，分子式为C₃₀H₃₂Cl₃NO，化学名为a-(二正丁氨基甲基)-2，7-二氯-9-(对氯苯亚甲基)-4-芴甲醇，临床上主要用于恶性疟疾，尤其适用于抗氯喹恶性疟疾治疗的药物。其标准收藏与中国药典2010版二部，其含量测定方法为滴定法，不足以满足样品分析和质量控制的要求，而高效液相色谱法测定本芴醇含量的方法鲜有报道。本试验采用反向高效液相色谱法对本芴醇含量测定方法进行研究，方法中本芴醇浓度与峰面积线性关系中，本芴醇的浓度范围最小可至0.5μg/ml，最大可至50μg/ml，线性关系中浓度范围较大；该方法还具有灵敏度高，准确可靠，分离效果好，分析简便快捷等技术特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便快捷、分离效果好、灵敏度高、精密度和准确性更高的本芴醇含量检测方法。为达上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明选用流动相中甲醇的体积百分比由90％递减至65％，优选甲醇体积分数为80％；超纯水的体积百分比由10％递增至35％，优选超纯水的体积分数为20％；冰醋酸的体积分数百分比由0.2％递增至1％，优选体积分数为1％；最后用盐酸盐调节流动相的pH至4。

本发明HPLC方法中，其特点在于选用上述的流动相，按上述流动相所得本芴醇样品图谱有较好的峰形(图谱见附图2)和分离效果。

本发明HPLC分析方法进样量为5μl，利用标准品溶液多次进样来进行进样精密度试验，进样次数为6次，RSD值为0.01％，进样精密度非常好。

附图说明

图1为本芴醇结构式。

图2为本发明本芴醇HPLC检测图谱。

图3为本芴醇标样浓度与峰面积线性关系。

图4为本芴醇室内放置不同时间吸光度的变化。

图5为本芴醇检测波长扫描图谱。

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明本发明的详细分析方法，但本发明并不局限于下述详细分析方法。

实施例1

本芴醇含量测定的高效液相色谱方法-1

色谱条件：采用美国Agilent-1260高效液相色谱仪，Chemstation Edition色谱工作站

色谱柱：Thermo BDS-C18(150mm×4.6mm，5μm)

流动相：甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶20∶1(体积比)(pH＝4)

检测温度：30℃

检测器：紫外检测器

检测波长：264nm

真空泵：SHB-III循环水式真空泵

电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司提供，规格为十万分之一

流动相的制备：流动相按照甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶20∶1(体积比)(pH＝4)混合，0.2μm孔径过滤器过滤，SCQ-250W超声波超声脱气。

采用外标法，需要分别对标准品和待测样品溶液进行测定。

标准品溶液制备：精密称取25mg本芴醇标准品，置于50ml容量瓶中，加少量流动相超声30min使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线，作为储备液，再精密量取储备液1ml，置于10ml的容量瓶中，加流动相稀释定容至刻度。

待测样品制备：精密称取与标准品同等重量的待测样品，置于50ml容量瓶中，加少量流动相超声30min使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线。再精密量取1ml溶液，置于10ml的容量瓶中，加流动相稀释定容至刻度。

根据含量计算公式：

带入数据即可得到本芴醇含量。

以上标准品与待测样品均配制6份，绝对误差不超过0.1％。

实施例2

本芴醇含量测定的高效液相色谱方法-2

色谱条件：采用美国LabAlliance高效液相色谱仪，EZChrom Elite Client色谱工作站

色谱柱：SMT-SAM-C18(250mm×4.6mm，5μm)

流动相：甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶20∶1(体积比)(pH＝4)

检测温度：30℃

检测器：SPECTRA STSTEM，UV6000LP紫外检测器

检测波长：264nm

真空泵：SHB-III循环水式真空泵

采用外标法，需要分别对标准品和待测样品溶液进行测定。

标准品溶液制备：精密称取25mg标准品，置于50ml容量瓶中，加少量乙酸乙酯超声10min使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线，作为储备液，再精密量取储备液1ml，置于10ml的容量瓶中，加流动相定容至刻度。

待测样品制备：精密称取与标准品同等重量的待测样品，置于50ml容量瓶中，加少量乙酸乙酯超声10min使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线。再精密量取1ml溶液，置于10ml的容量瓶中，加流动相定容至刻度。

根据含量计算公式：

带入数据即可得到本芴醇含量。

以上标准品与待测样品均配制6份，绝对误差不超过0.1％。

实施例3

本芴醇含量测定的高效液相色谱方法-3

色谱柱：Thermo BDS-C18(250mm×4.6mm，5μm)

流动相：甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶20∶1(体积比)(pH＝4)

检测温度：30℃

检测器：紫外检测器

检测波长：264nm

真空泵：SHB-III循环水式真空泵

流动相的制备：流动相按照甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶20∶1(体积比)(pH＝4))混合，0.2μm孔径过滤器过滤，SCQ-250W超声波超声脱气。

采用外标法，需要分别对标准品和待测样品溶液进行测定。

标准品溶液制备：精密称取25mg标准品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量二氯甲烷超声1min使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线，作为储备液，再精密量取储备液1ml，置于10ml棕色的容量瓶中，加流动相定容至刻度。

待测样品制备：精密称取与标准品同等重量的待测样品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量二氯甲烷超声1min使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线。再精密量取1ml溶液，置于10ml棕色的容量瓶中，加流动相定容至刻度。

根据含量计算公式：

带入数据即可得到本芴醇含量。

以上标准品与待测样品均配制6份，绝对误差不超过0.1％。

实施例4

本芴醇含量测定的高效液相色谱方法-4

色谱柱：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)

流动相：甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶20∶1(体积比)(pH＝4)

检测温度：30℃

检测器：二极管阵列检测器

检测波长：264nm

真空泵：SHB-III循环水式真空泵

采用外标法，需要分别对标准品和待测样品溶液进行测定。

标准品溶液制备：精密称取25mg本芴醇标准品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量流动相超声30min使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线，作为储备液，再精密量取储备液1ml，置于10ml棕色的容量瓶中，加流动相定容至刻度。

待测样品制备：精密称取与标准品同等重量的待测样品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量流动相超声30min使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线。再精密量取1ml溶液，置于10ml棕色的容量瓶中，加流动相定容至刻度。

根据含量计算公式：

带入数据即可得到本芴醇含量。

以上标准品与待测样品均配制6份，绝对误差不超过0.1％。

本发明的方法学考察：

(1)线性关系考察

在选定的最佳测定条件下，按照上述所述的方法配制本芴醇标准曲线，本芴醇标准品溶液制备完成后，经0.2μm微孔滤膜过滤后注入液相色谱仪，在如下所述条件下分别进样0.2μl、0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，数据回归分析，对进样量和峰面积进行回归方程处理，结果r＝1。结果表明本芴醇在0.2～5μl范围内有良好的线性关系。其中，色谱柱：Thermo-BDS C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶20∶1(体积比)(pH＝4)；检测温度：30℃；进样量：5μl；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：264nm。

(2)线性范围考察

精密称取本芴醇标准品25mg，用流动相溶解稀释定容制成浓度为1mg/ml的储备液。加流动相分别稀释成0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、40μg/ml和50μg/ml的标准溶液，按照本发明分析方法，对样品浓度和峰面积进行数据回归分析，回归方程为：Y(本芴醇标准品峰面积)＝773.62X+0.4465，r＝0.9998(n＝10)(X表示标准品浓度)(详见附图3)。结果表明，本芴醇在0.5μg/ml～50μg/ml浓度范围内，峰面积和本芴醇浓度呈良好的线性关系，本芴醇最低进样量经计算可达0.005μg。

其中，色谱柱：Thermo-BDS C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇∶水∶冰醋酸＝80∶20∶1(体积比)(pH＝4)；检测温度：30℃；进样量5μl；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：264nm。

(3)精密度考察

精密度指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，用以说明测量值的重现性，精密度用相对标准偏差(RSD)来表示。本发明经过6次重复试验，所得峰面积值见下表1，峰面积RSD值为0.01％。

表1本芴醇标样多次进样峰面积值

序号	1	2	3	4	5	6
							峰面积	8102.76662	8101.58239	8100.89985	8100.75628	8101.23518	8102.96957

结果表明，本HPLC法检测本芴醇含量精密度高，重现性好。

(4)本芴醇稳定性实验

本芴醇室内不同放置时间条件下的稳定性：取本芴醇对照品适量，放在10ml的容量瓶中，加流动相超声溶解并稀释制成每1ml中含有本芴醇0.5mg的溶液，在常温下分别放置0、2、3、6、8、10和12h后，利用紫外检测器测定264nm处吸光值的大小。结果(见图4)表明在无直射光照的室内，常温放置12h，对本芴醇的含量影响不大，本芴醇在流动相中的稳定性良好，能够满足含量测定条件。

(5)本芴醇检测波长的确定

精密称取本芴醇标样适量，加流动相超声使溶解制成一定浓度的标准溶液，利用DAD检测器进行190nm--400nm全波长扫描(图谱见图5)，结果本芴醇的最大吸收波长236nm、264nm，同时利用本方法的条件检测本芴醇相关物质在264nm处有最大吸收值，因此选择264nm作为本芴醇含量测定的检测波长。

Claims

1.一种本芴醇含量测定的高效液相色谱(HPLC)方法，其特征在于流动相为甲醇和水及冰醋酸的混合溶液，加入少量的盐酸盐调节流动相的pH值；其中选择甲醇的体积分数为90％～65％，水的体积分数为10％～35％，冰醋酸的体积分数为0.2％～1％，最后优选出峰时间和峰型最好的甲醇体积分数80％，水体积分数20％，冰醋酸的体积分数1％作为系统检测的流动相。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反相色谱柱。

3.如权利要求1所述的方法，使用紫外检测器，检测波长为264nm，柱温30℃，流速为1.0ml/min，进样体积为5μl。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于配制的样品溶液浓度为0.5mg/ml。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于本HPLC法采用外标法进行本芴醇的含量测定，浓度与峰面积线性关系中浓度范围为0.5μg～50μg/ml。