CN103343167A - 可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法 - Google Patents
可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，包括：应用miRNA微阵列芯片技术获得miRNAs的差异表达谱，并用生物信息学方法和qRT-PCR技术进一步筛选验证，得到可调控ATXN3基因表达的miRNAs；用qRT-PCR技术及Westernblot技术确定miRNAs与ATXN3的靶向作用关系及作用机制；采用双荧光素酶报告基因检测技术确定miR-25与ATXN3基因的靶向作用关系及具体结合位点，为研发SCA3/MJD疾病相关诊断试剂盒提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法。
背景技术
脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia, SCA)是人类主要的神经退行性疾病之一，其中脊髓小脑共济失调3 型(Spinocerebellar
ataxia type 3/Machado-Joseph disease,SCA3/MJD)最为常见，其致病基因ATXN3 （ MJD1 ）编码蛋白ataxin-3蛋白为含有多聚谷氨酰胺(polyglutamine, polyQ)的胞浆蛋白。含异常扩展polyQ肽链的ataxin-3蛋白可选择性在神经系统特定区域（小脑、脑干、脊髓等）积聚形成神经元核内包涵体（neuronal intranuclear
inclusions，NIIs）并引起神经元死亡。目前研究已明确异常扩展polyQ突变蛋白的细胞毒性触发了这类疾病的发生与发展。尽管它们引起神经元损害的确切机制还不清楚，但近年研究发现polyQ疾病中存在转录异常（Shimohata T, Nakajima
T, Yamada M, et al. Exapanded polyglutamine stretches interact with TAFⅡ130,interfering with
CREB-dependent transcription. Nat Genet, 2000,26:29-36.），提示转录调控机制异常可能是polyQ疾病共同的发生机制之一。
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的、大小约21-23个碱基的单链非编码小RNA。它由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的miRNA前体经过Dicer酶加工后生成，其作用机制主要是通过与靶基因信使RNA(manage RNA, mRNA) 的3’端非翻译区 (3’untranslation region, 3’UTR) 种子序列 (seed sequence) 特异性碱基互补配对结合，从而在转录或转录后水平影响靶基因的表达（Carthew
RW, Sontheimer EJ. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell, 2009，136(4):642-655.）。中枢神经系统中有多种特异性表达的miRNAs，其在脑发育过程中表达量的变化与神经发生、神经干细胞分化、可塑性及记忆等多种生理过程密切相关。
Mitchell等应用miRNA微阵列芯片筛选出数种与前列腺癌发生可能相关的候选miRNAs ，进一步经Taqman RT-PCR定量分析验证后，将表达差异最显著的miR-141作为前列腺癌肿瘤可能的分子标志物（Mitchell PS, Parkin RK,
Kroh EM, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer
detection. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105 (30): 10513-10518.）。
Bilen 等在SCA3/MJD细胞模型中发现，RNA干扰介导的Dicer基因沉默能明显增强polyQ扩展突变型ataxin-3蛋白所致的细胞毒性作用，而补给含有细胞所有miRNAs的小RNA片段后，polyQ扩展突变型ataxin-3蛋白诱导的神经退行性变可明显减轻（Bilen J, Liu
N, Burnett BG, et al. MicroRNA pathways modulate
polyglutamine-induced neurodegeneration. Mol Cell, 2006, 24: 157-163.）。这些信息提示机体内存在对SCA3/MJD具有神经保护作用的miRNAs，它们通过在体内一定水平的表达，直接或间接抑制致病蛋白ataxin-3的神经毒性，从而减缓SCA3/MJD的病情。
CN 102899392 A 公开了一种用于肠癌诊断的一组miRNA的检测方法和应用，该组miRNA是一组miR-129-3p,miR-767-3p,miR-877*的生物标志物，其miRNA序列分别如SEQ ID N0.1,N0.2,N0.3所示;其检测方法，包括:1)收集人血清样本;2）提取血清中总RNA ; 3)对生物标志物进行反转录和实时定量PCR反应，以U6 snRNA作为内参，计算每个生物标志物的PCR相对定量值;4)根据每个生物标志物的PCR相对定量值计算P值，当P>0. 6621时，认为是肠癌样本，P<0. 6621时，认为是非肠癌样本。该检测方法单一，判断标准过于简单，可能会影响诊断结果的准确性。
然而，可调控ATXN3基因表达的miRNAs的筛选和鉴定方法的构建、确定具体参与调控ATXN3基因表达的miRNAs及其作用靶点，目前国内外尚无报道，有待进一步研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案为：可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，包括以下步骤：
(1）准备含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血各5~10ml，分离的血清分装后置于-80℃备用；
(2）TRIzol法提取步骤（1）血清中含miRNA的总RNAs；
（3）应用miRNA微阵列芯片技术对步骤（2）中的总RNAs进行miRNAs表达谱检测，初步筛选得到SCA3/MJD分子标志物miRNAs；
(4）对步骤3）初步筛选得到的SCA3/MJD分子标志物miRNAs，应用生物信息学方法和qRT—PCR技术在含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血中进行验证；
（5）上调通过步骤（4）验证的SCA3/MJD分子标志物miRNAs，利用Western blot技术检测转染所述SCA3/MJD分子标志物miRNAs后内源性野生型及外源性突变型ataxin-3蛋白表达水平：
①HEK 293T细胞培养；
②细胞转染：
内源性ataxin-3蛋白检测转染成分：negative mimics
100ng、 miR-29a mimics 100ng、 miR-34b mimics
100ng、miR-125b mimics
100ng、 miR-25 mimics 100ng、 siATXN3
100ng；其转染对象为HEK 293T细胞；
外源性ataxin-3蛋白检测转染成分：negative mimics 100ng 、 siATXN3
100ng 、miR-25 mimics 100ng ；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；
③内源性野生型及外源性突变型ataxin-3蛋白表达水平检测：总蛋白提取，蛋白定量，SDS-PAGE胶的制备，上样及电泳，转膜，封闭，加一抗，洗一抗，加二抗，洗二抗，曝光，显影及定影；
（6）上调及下调步骤（5）明确的SCA3/MJD分子标志物miRNAs表达后，采用qRT-PCR法检测内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平；
①HEK 293T细胞或SCA3/MJD模型细胞培养；
②细胞转染：
内源性ATXN3基因表达测定： siATXN3 50ng、 miR-25 mimics 50ng、negative mimics 50ng、miR-25 inhibitor 100ng、negative inhibitor 100ng、空转染组；其转染对象为HEK 293T细胞；
外源性ATXN3基因表达测定：negative mimics 50ng、siATXN3 50ng、miR-25 mimics 50ng；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；
③内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平检测：
a)总RNAs抽提；
b)总RNAs纯度鉴定；
c)总RNAs完整性鉴定；
d）逆转录合成cDNA；
e）qRT-PCR：以β-actin作为内参照，cDNA序列引物： ATXN3-1F:
GGCTCACTTTGTGCTCAACATTG ；ATXN3-2R: TCTCATCCTCTCCTCCTCATCCAG；β-actin-1F:TGAAGGTGACAGCAGTCGGTTG ；β-ACTIN-2R:
GGCTTTTAGGATGGCAAGGGAC；
f) 通过比较目的基因ATXN3和内参基因β-actin的Ct值，应用2 -△△ Ct法对所得数据进行处理，计算目的基因ATXN3相对内参基因β -actin的mRNA相对表达量；
（7）应用双荧光素酶报告基因检测技术明确SCA3/MJD分子标志物miRNAs调控ATXN3基因的作用靶点；
①生物信息学软件预测调控ATXN3表达的miRNA；
②构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达载体；
③构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达突变体；
④双荧光素酶报告基因活性检测：
a)HEK 293T细胞培养；
b)细胞转染：
pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR转染组： pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR
150ng+miR-25 mimics 25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR 150ng+negative mimics 25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR
150ng；
pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR转染组：pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR
150ng+miR-25 mimics 25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR 150ng+negative mimics 25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR
150ng；
c)双荧光素酶活性分析。
进一步，步骤（3）miRNA微阵列芯片技术的操作条件: 采用miRCURYTM Array Power标记试剂盒得到标记好的探针，探针与miRCURYTM芯片56℃杂交16~20h，再使用Gene Pix4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度。
进一步，步骤（4）的PCR反应程序为95℃，3min；40个PCR循环：95℃，10秒；60℃，20秒；72℃，20秒；78℃，20秒。
进一步，步骤（5）Western blot的蛋白上样量为20µg。
进一步，步骤（6）qRT-PCR循环程序为： 95℃ 15秒；95℃ 5秒；60℃ 30秒，循环40次，在60℃延伸30秒时读取荧光值。
进一步，步骤（7）-①采用Pictar、TargetScan和miRanda三种生物信息学软件。
进一步，步骤（7）-③通过将靶序列259-266位碱基由GTGCAAT突变为CTCGATA，构建ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达突变体。
进一步，所述SCA3/MJD分子标志物miRNAs为序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4所示的miR-29a、 miR-125b、miR-25和miR-34b。
本发明可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法的有益效果：本发明采用miRNA微阵列芯片对含SCA3/MJD的血液进行miRNA表达谱检测分析，高效准确筛选出表达显著下调的miRNAs共26个，表达显著上调的miRNAs共20个；以生物信息学及qRT-PCR技术为平台，证实了miR-29a、miR-125b、miR-25及miR-34b共4种miRNAs在含SCA3/MJD的血液中显著表达，其中表达下调者为miR-29a、miR-125b、miR-25；表达上调者为miR-34b，且miR-29a与miR-34b表达最为显著，miR-29a、miR-125b、miR-25及miR-34b为SCA3/MJD分子标志物，为研发SCA3/MJD疾病相关诊断试剂盒提供依据。
本发明应用qRT-PCR技术及Western blot技术快速准确地确定了miR-25能降低内源性及外源性ataxin-3蛋白表达水平，但不能下调内源性或外源性ATXN3基因mRNA表达水平，miR-25对ATXN3 基因表达的调控水平为转录后水平，为研发SCA3/MJD疾病相关诊断试剂盒提供依据。
本发明应用双荧光素酶报告基因检测技术确定了miR-25能直接靶向调控ATXN3基因的表达，其作用靶点位于ATXN3 基因mRNA 3’UTR的259-266位碱基区域，为研发SCA3/MJD疾病相关诊断试剂盒提供依据。
附图说明
图1为血清miRNA微阵列芯片表达谱；
图2为qRT—PCR定量分析图；
图3为各待测miRNAs mimics干预48小时后，内源性ataxin-3蛋白表达结果图；
1：negative mimics 干预组； 2：miR-29a mimics 干预组；3：miR-34b mimics 干预组；4：miR-125b mimics 干预组；5：miR-25 mimics 干预组；6：siATXN3 干预组；β-actin：内对照
图4为miR-25mimics干预48小时后，外源性ataxin-3蛋白表达结果图；
1：negative mimics 干预组； 2：siATXN3 干预组；3：miR-25 mimics 干预组；β-actin：内参照
图5为miR-25干预24小时后，内源性ATXN3基因mRNA相对表达水平分析图；
图6为miR-25干预48小时后，内源性ATXN3基因mRNA相对表达水平分析图；
图7为miR-25干预48小时后，外源性ATXN3基因mRNA相对表达水平分析图；
图8为miR-25 mimics干预pmirGLO-ATXN3 3’UTR载体48hr后luciferase相对活性水平比较分析图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
参照图1~图8：
（
1
）准备含
SCA3/MJD
的抗凝血和不含
SCA3/MJD
的抗凝血各
5~10ml
，分离的血清分装后置于
-80
℃备用；
（
2
）
TRIzol
法提取步骤（
1
）血清中含
miRNA
的总
RNAs
：
从-80℃冰箱中取出血清，解冻后各取每份血清样品0.25ml及2~8ul聚丙烯载体，再与0.75ml TRI Reagent BD混合，盖紧管盖，用手振荡摇匀，将混合液在室温下孵育5分钟；加0.2ml氯仿入混合液中，盖紧管盖，剧烈摇匀15秒。室温静置5分钟，于4℃，12000g离心15分钟，混合液即分成三层，下层为红色酚氯仿相，上层为无色水相。RNA则全部被融于水相层中，而DNA和蛋白质溶解于中间层和有机层；将水相层转移至新管中，加入0.5ml异丙醇至上述液相层中沉淀RNA，室温下孵育5~10分钟，然后4℃，12000g离心8分钟。RNA在管底呈白色胶状物；移去上清液，每样品加入1ml75%乙醇，振荡，清洗RNA，于4℃，7,500g离心5分钟；去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥；用紫外分光光度仪测定RNA在260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估其纯度。
（ 3 ）应用 miRNA 微阵列芯片技术对步骤（ 2 ）中的总 RNAs 进行 miRNAs 表达谱检测：
采用miRCURYTM Array Power标记试剂盒，用标记酶将Hy3TM荧光基团标记在每份样品中miRNA的3’端，从而得到用于芯片杂交的荧光探针；然后将被标记Hy3TM的样品混合液与25ul杂交缓冲液混合，置于95℃变性2min，冰上孵育2min，然后使用phalanxTM热收缩杂交袋将标记好的探针与miRCURYTM芯片于56℃条件下杂交16~20h；再使用Gene Pix4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，采用计算机软件对采集的杂交图像进行数字化分析，计算出荧光强度信号比值。
血清miRNA微阵列芯片表达谱如图1所示，筛选初步得到含SCA3/MJD的血清中异常表达的miRNAs，其中表达显著下调的miRNAs共26个，具体见表1；表达显著上调的miRNAs共20个，如表2所示；且miR-29a、miR-125b、miR-25及miR-34b等4个miRNAs在含SCA3/MJD的血清存在明显表达异常，其中miR-29a、miR-125b、miR-25表达下调，而miR-34b表达上调。
表1：微阵列芯片结果中表达显著下调的26个miRNA
| miRNA | Ratio(N/A) | P-value | miRNA | Ratio(N/A) | P-value | |
| hsa-miR-29a | 4.7 | 0.0334 | hsa-miR-374a | 2.41 | 0.019 | |
| hsa-let-7f | 3.48 | 0.0412 | hsa-miR-192 | 2.4 | 0.026 | |
| hsa-miR-215 | 2.88 | 0.0129 | hsa-miR-324-3p | 2.26 | 0.0094 | |
| hsa-miR-342-3p | 2.86 | 0.0068 | hsa-miR-19a | 2.23 | 0.0027 | |
| hsa-miR-429 | 2.67 | 0.003 | hsa-miR-205 | 2.22 | 0.0217 | |
| hsa-miR-193a-5p | 2.65 | 0.001 | hsa-miR-200a | 2.21 | 0.0156 | |
| hsa-miR-98 | 2.61 | 0.0134 | hsa-miR-18a | 2.19 | 0.0075 | |
| hsa-miR-223* | 2.55 | 0.0074 | hsa-miR-142-5p | 2.13 | 0.0057 | |
| hsa-miR-375 | 2.56 | 0.001 | hsa-miR-125b | 2.11 | 0.023 | |
| hsa-miR-500a* | 2.49 | 0.0001 | hsa-miR-18a* | 2.10 | 0.0149 | |
| hsa-miRPlus-E1247 | 2.48 | 0.0167 | hsa-miR-27a | 2.10 | 0.0359 | |
| hsa-miR-19b | 2.47 | 0.0003 | hsa-miR-1297 | 2.07 | 0.0113 | |
| hsa-miRPlus-F1074 | 2.47 | 0.0228 | hsa-miR-25 | 2.04 | 0.0233 |
注明：Ratio表示不含SCA3/MJD的血清(N)与含SCA3/MJD的血清(A)荧光信号强度比值；
差异显著表达的miRNA筛选标准：Ratio>2.0，P<0.05。
表2：微阵列芯片结果中表达显著上调的20个miRNA
| miRNA | Ratio(A/N) | P-value | miRNA | Ratio(A/N) | P-value | |
| hsa-miR-34b | 4.79 | 0.0001 | hsa-miR-1258 | 2.38 | 0.0037 | |
| hsa-miR-647 | 3.31 | 0.0007 | hsa-miR-431 | 2.3 | 0.0397 | |
| hsv1-miR-H8 | 3.19 | 0.0063 | hsa-miR-1261 | 2.18 | 0.0138 | |
| hsa-miR-620 | 3.12 | 0.0187 | hsa-miR-574-3p | 2.17 | 0.0013 | |
| hsa-miRPlus-E1097 | 3.12 | 0.0334 | hsa-miR-659 | 2.16 | 0.0379 | |
| hsa-miR-576-5p | 2.91 | 0.0131 | hsa-miR-1264 | 2.15 | 0.0054 | |
| hsa-miRPlus-E1146 | 2.75 | 0.0003 | hsa-miRPlus-E1110 | 2.11 | 0.0272 | |
| hsv1-miR-H6-3p | 2.62 | 0.0014 | hsa-miR-888* | 2.06 | 0.0012 | |
| hsa-miR-138-1* | 2.59 | 0.0176 | hsa-miR-935 | 2.04 | 0.0216 | |
| hsa-miR-1260 | 2.52 | 0.0001 | hsa-miR-625 | 2.02 | 0.0358 |
注明:Ratio表示含SCA3/MJD的血清(A)与不含SCA3/MJD的血清(N)荧光信号强度比值;
差异显著表达的miRNA筛选标准：Ratio>2.0，P<0.05。
（
4
）对步骤（
3
）初步筛选得到的
miRNAs
，应用生物信息学方法和
qRT
—
PCR
技术在含
SCA3/MJD
的抗凝血和不含
SCA3/MJD
的抗凝血中进行验证：
①目标miRNA引物设计如下：
②样品RNA进行cDNA合成：
RT引物设计如下：
然后制备RT混合反应液：dNTP(2.5mM each) 2ul、10X RT Buffer 2ul、RT特异引物(1uM) 0.5ul、Total RNA 250ng、MMLV反转录酶(10U/ul) 2 ul、RNA酶抑制剂(40u/ul) 0.3ul、无RNA酶水 20ul、总体积 20ul；
在PCR扩增仪进行RT反应：分别于16℃反应30min；42℃反应40min；85℃反应5min。反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存；
③qRT-PCR定量分析：
将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系：dNTP（2.5mM each） 1.0µl、10 × PCR缓冲液
1.0µl、MgCl2 溶液 0.6µl、Taq聚合酶 0.5units、Sybergreen I 终浓度0.25×、10uM 的PCR特异引物F
0.4µl、10uM 的PCR特异引物R 0.4µl、2×ROX Reference Dye
0.2µl、加水至总体积为8 µl；
将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中， 再加入对应的2 µl cDNA；将上述384-PCR板置于qPCR仪上进行PCR反应，采用U6做内参，U6及所有的指标均按以下程序进行：95℃，3min；40个PCR循环（95℃，10秒；60℃，20秒；72℃，20秒；78℃，20秒（收集荧光））；采用2 - △△ CT法进行数据分析；
④应用SPSS 18.0对相关数据进行数据处理以及统计分析。
RT—qPCR进行定量分析miRNAs在含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血中的表达结果如图2所示，RT—qPCR实验结果确定了miR-29a、miR-125b、miR-25及miR-34b可以作为SCA3/MJD分子标志物。
（
5
）上调通过步骤（
4
）验证的
miRNAs
，利用
Western blot
技术检测转染上述
miRNAs
后内源性野生型及外源性突变型
ataxin-3
蛋白表达水平
:
①HEK 293T细胞培养：HEK 293T细胞 (人胚肾细胞)和 SCA3/MJD模型细胞由医学遗传学国家重点实验室提供，其细胞培养液为含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素及100 IU/ml链霉素的DMEM培养液，于37℃、5%CO2孵育箱中培养；每隔约2天更换一次新鲜培养液；
②细胞转染：
a)细胞接种：转染前一日取对数生长期的HEK 293T细胞或SCA3/MJD模型细胞，1×PBS洗涤2次，0.25%胰酶-EDTA消化约30秒后，加入10%胎牛血清DMEM培养液吹打混匀细胞，然后进行细胞计数，调整细胞浓度至1×105/ml。以2×105个/孔密度将细胞接种至6孔板中，于37℃、5%CO2孵育箱中继续培养过夜，次日取细胞形态良好、分散均匀，汇合度约80-90%用于转染；
b）细胞瞬时转染：
内源性ataxin-3蛋白检测转染成分：negative mimics
100ng、 miR-29a mimics 100ng、 miR-34b mimics
100ng、miR-125b mimics
100ng、 miR-25 mimics 100ng、 siATXN3
100ng； 其转染对象为HEK 293T细胞；
外源性ataxin-3蛋白检测转染成分：negative mimics 100ng、 siATXN3
100ng、miR-25 mimics 100ng；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；
转染操作步骤：在1.5ml EP管中加入250ul opti-MEM培养基，然后将上述转染成分加入其中混匀；在另一1.5ml EP管中加入250ul opti-MEM培养基，然后再加入5µl Lipofectamine 2000脂质体，室温下孵育5min；将上述两管溶液混合摇匀，室温下孵育20min；此期间吸去6孔板中的培养基，1×PBS洗涤2次，加入1.5ml opti -MEM培养基；将孵育好的500ul混合液轻轻加入6孔板中，边加边晃动培养板，使液体混合均匀；将6孔板放入37℃、5%CO2的孵箱中进行培养；转染4-6小时后，将6孔板中的opti-MEM培养基换成含血清培养基；
③内源性野生型及外源性突变型ataxin-3蛋白表达水平检测：总蛋白提取，蛋白定量，SDS-PAGE胶的制备，上样及电泳，转膜，封闭，加一抗，洗一抗，加二抗，洗二抗，曝光，显影及定影：
a) 总蛋白提取：于转染48小时后用枪头吸尽培养液；每孔细胞加入200ul冰上预冷的1×PBS，反复洗涤细胞3次，每次1分钟，将1×PBS弃净后把培养板置于冰上；按400ul/孔将细胞裂解液加入6孔板中，吹打混匀，于冰上裂解30分钟；裂解完毕，用移液器将细胞碎片及裂解液移至1.5ml EP管中，整个过程在冰上操作；将细胞裂解液于12000 rpm，4℃，离心30 min。取离心后上清液移至新的1.5ml EP管内，-80℃保存备用；
b) BCA法蛋白定量：标准品的制备：将标准品BSA（2mg/ml）用去离子水进行梯度稀释；待测蛋白样品的制备：将待测蛋白样品做适当稀释使其浓度落在0-1.5 mg/ml之间；工作液的制备：根据检测样本的量按50: 1的比例将A液与B液混合制备适量的工作液；检测：将204ul工作液和10ul样品或标准品依次加入96孔板孔内，每孔设一复孔，于37℃，孵育15分钟，在562nm波长下测定样品和标准品的吸光值；计算浓度：根据标准品的吸光值和浓度绘制标准曲线，求出未知样品的浓度；
c）Western blot法检测蛋白水平：
灌胶前准备：将灌胶用玻璃板清洗干净，烘干，小心将两块玻璃板依次插在制胶槽上，固定；
灌注分离胶：根据要检测蛋白的性质及大小不同，选择适当浓度的凝胶，本实验选用12%的分离胶（丙烯酰胺溶液（30.8%） 3.36ml、2M Tris-HCl 2.10ml、ddH2O
2.94ml、10% APS 50 µl、TEMED 10 µl）；将上述液体混匀后迅速加入制胶槽的两玻璃板之间至适当高度，用去离子水覆盖，室温下放置30-45分钟；
灌注堆积胶：待分离胶凝固后，将水倒出并用滤纸吸干，再制备堆积胶（丙烯酰胺溶液（30.8%） 0.5 ml、1M Tris-HCl 0.75 ml、ddH2O
1.75 ml、10% APS 15 µl、TEMED 5 µl），加入两玻璃板间至距最上方0.5cm处，迅速插入齿梳，再将液体加满，室温下放置30分钟；
待堆积胶凝固后，小心拔掉齿梳，用去离子水冲洗掉加样孔中多余的聚合胶，然后将玻璃板移至电泳槽内，在内外电泳槽中加入足量电泳缓冲液，以确保电泳缓冲液的液面盖过凝胶的最上端。取20ug蛋白样品加入等体积5×SDS sample buffer，100℃沸水，变性5分钟，置于冰上骤冷。将样品及蛋白marker加入上样孔内，以80V恒压电泳，待进入分离胶后再转为120V恒压电泳，至溴酚蓝跑至胶底时，停止电泳；
电泳完毕，将玻璃板从电泳槽取出，撬开玻璃板，将凝胶做好标记置于大培养皿中。根据凝胶大小剪一张PVDF 膜和两张滤纸板，将其浸泡在转膜液中5分钟。在转膜夹黑面上方依次将海绵、滤纸板、凝胶、PVDF 膜、滤纸板、海绵置于其上，将转膜夹夹好固定于转膜槽中，并使膜靠近电极阳面，以300mA恒流，转膜45分钟。转膜完毕，将膜由转膜夹中取出，置于封闭液中室温下封闭1小时或4℃过夜；
将封闭好的膜置于大培养皿中，加入按1:10000比例稀释的鼠抗人atxin-3单克隆抗体或鼠抗人GFP单克隆抗体，4℃孵育过夜；
收集一抗后，用1×TBST 10ml洗膜，室温下每次15分钟，漂洗3次，洗时置于摇床上摇动；
将膜置于另一大培养皿中，加入按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗，置于摇床上，室温下摇动1小时；
弃二抗后，用1×TBST 10ml洗膜，室温下每次15分钟，漂洗3次，洗时置于摇床上摇动；
将清洗后的膜置于杂交袋中，从ECL试剂盒取等量A液和B液混匀，反应5分钟，再加入杂交袋中使其与膜均匀接触。打开压片夹，将膜转有蛋白质的一面朝上置于压片夹中，转入暗室显影。在暗室中打开压片夹，剪适当大小X光片，置于装有PVDF 膜的杂交袋上，压片1分钟，然后将X光片置于自动洗片机中显影及定影；
④运用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析，用student’s t检验对western blot结果进行统计学分析。
上调步骤（4）验证得到的miRNAs表达水平48小时后，内源性野生型ataxin-3蛋白表达水平的结果如图3所示：过表达 miR-25细胞的内源性野生型ataxin-3蛋白表达水平相对于阴性对照（negative mimics）显著降低，其结果与阳性对照组（siATXN3）类似；而过表达miR-29a、miR-34b、miR-125 b细胞的内源性野生型ataxin-3蛋白表达水平与阴性对照组（negative mimics）无明显变化；
上调对内源性野生型ataxin-3蛋白有影响的miRNA表达水平48小时后，外源性突变型ataxin-3蛋白表达水平的结果如图4所示：过表达miR-25细胞的外源性突变型ataxin-3蛋白表达水平显著降低，其结果与阳性对照组（siATXN3）类似，显著低于阴性对照。
（
6
）上调及下调步骤（
5
）明确的
miRNAs
表达后，采用
RT-qPCR
法检测内源性野生型及外源性突变型
ATXN3
基因
mRNA
表达水平
:
①HEK 293T细胞或SCA3/MJD模型细胞培养：步骤同（5）-①；
②细胞转染：
a)细胞接种：转染前一日取对数生长期的HEK 293T细胞或SCA3/MJD模型细胞，1×PBS洗涤2次，0.25%胰酶-EDTA消化约30秒后，加入10%胎牛血清DMEM培养液吹打混匀细胞，然后进行细胞计数，调整细胞浓度至2×104/ml。以2×104个/孔密度将细胞接种至12孔板中，于37℃、5%CO2孵育箱中继续培养过夜，次日取细胞形态良好、分散均匀，汇合度约50~60%用于转染；
b）细胞瞬时转染：
内源性ATXN3基因表达测定： siATXN3 50ng、 miR-25 mimics 50ng、negative mimics 50ng 、miR-25 inhibitor 100ng、negative inhibitor 100ng、空转染组；其转染对象为HEK 293T细胞；
外源性ATXN3基因表达测定：negative mimics 50ng、siATXN3 50ng、miR-25 mimics 50ng；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；
转染操作步骤同步骤（5）-②-b)所述；
③内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平检测：
a) 总RNAs抽提：
转染48h后分别收获细胞，弃培养基，1×PBS洗涤2次，每孔细胞加入1 ml TRIZOL试剂，用移液器吹打几次，使得核酸蛋白复合物完全分离，无菌罩内室温放置5分钟；用移液器将核酸蛋白复合物转移至1.5ml EP管中（DEPC水处理过），按每1ml TRIZOL样品中加入0.2 ml新开的氯仿，盖好盖子，剧烈震荡15秒，室温下静置放置2-3min； 12600 rpm，4℃，离心15 min；样品分三层，取上清无色水相（约0.6 ml）到另一1.5ml EP管（DEPC水处理过），加0.5 ml预冷的异丙醇，盖好盖子，混匀，室温放置10min； 12600 rpm，4℃，离心10min；观察总RNA在管底的白色沉淀，弃上清，加入1.0 ml用DEPC水新配制的75% 乙醇洗涤，7500 rpm，4℃，离心5 min；去上清，点离，用小Tip吸干液体。无菌罩内室温晾置10min干燥RNA沉淀；每管加入DEPC处理的去离子水20ul，中枪打匀，4℃冰箱溶解1h，测OD值；
b) 总RNAs纯度鉴定：
用紫外分光光度计检测所抽提RNA在260nm、280nm处的吸光度。根据所抽提RNA在260nm、280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0；
c）总RNAs完整性鉴定：
取5μl抽提总RNA产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物（120v, 40 min）。溴化乙啶（EB）染色10 min后，在分子成像仪上观察电泳结果，如琼脂糖凝胶上可清晰看到28S 和18S条带，且28S 条带的亮度约为18S条带的两倍，说明RNA完整性良好；
d）逆转录合成cDNA：
逆转录反应体系：模板RNA 2ug、oligo(dT)18引物 1μl、5×Buffer 4μl、RNase抑制剂（20u/ul） 1μl、dNTP混合物 （10mM） 2μl、逆转录酶（200u/ul）1μl、加nuclease-free水定容至20μl；
逆转录循环参数设置： 42℃ 60min→70℃ 5 min ，将逆转录的cDNA产物按1：64比例稀释用于qPCR或保存于-70℃备用；
e）qRT-PCR：
检测内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平，以β-actin作为内参照。针对ATXN3基因NM 004993.5的cDNA序列和β-actin基因的cDNA序列设计引物如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| ATXN3-1F: | GGCTCACTTTGTGCTCAACATTG |
| ATXN3-2R: | TCTCATCCTCTCCTCCTCATCCAG |
| β-actin-1F: | TGAAGGTGACAGCAGTCGGTTG |
| β-actin-2R: | GGCTTTTAGGATGGCAAGGGAC |
qPCR反应体系：
| 组分 | 体积 |
| cDNA模板 | 1.0ul |
| SYBR® Premix Ex Taq™ (2×) | 5.0ul |
| ROX Reference Dye（50×） | 0.2ul |
| 引物-1F | 0.2ul |
| 引物-2R | 0.2ul |
| ddH2O | 6.4ul |
| 总体积 | 10.0ul |
qPCR循环参数设置：预变性：95℃ 15秒；变性：95℃ 5秒；延伸：60℃ 30秒，循环次数：40次，在60℃延伸30秒这一步读取荧光值；
f) 通过比较目的基因ATXN3和内参基因β-actin的Ct值，应用2 -△△ Ct法对所得数据进行处理，计算目的基因ATXN3相对内参基因β-actin的mRNA相对表达量；
④运用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析。用student’s t检验对荧光定量PCR结果进行统计学分析，数据显示均为平均值±SE，以单侧P<0.05认为差异有统计学意义。
上调或下调miR-25表达水平24小时和48小时后，内源性ATXN3基因mRNA相对表达水平的qRT-PCR结果分别如图5和图6所示：予 miR-25 mimics 和miR-25 inhibitors上调或下调HEK 293T细胞中miR-25表达水平24或48小时后，内源性ATXN3 基因mRNA表达水平较阴性对照组未发生明显变化，其结果显著高于阳性对照组；
上调或下调miR-25表达水平48小时后，外源性野生型ATXN3基因mRNA相对表达水平的qRT-PCR结果如图7所示：外源性ATXN3 基因mRNA表达水平较阴性对照组未发生明显变化，其结果显著高于阳性对照组。
qRT-PCR的结果说明miR-25对ATXN3 基因表达的调控水平为转录后水平。
（
7
）应用双荧光素酶报告基因检测技术明确调控
ATXN3
基因的
miRNAs
作用靶点：
①生物信息学软件预测调控ATXN3表达的miRNA:
从NCBI基因数据库中查找人类ATXN3基因的ID，根据软件要求说明，应用3种在线预测软(Pictar、TargetScan和miRanda)件预测调控ATXN3表达的miRNA，通过不同软件共同的预测结果分析miR-25能否靶向调控ATXN3；
②构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达载体:
根据GenBank基因数据库中ATXN3基因的NM-004993序列1~ 1531bp信息设计其3’UTR扩增引物，以HEK-293T细胞基因组DNA为模板PCR扩增ATXN3基因的3’UTR部分序列，将其克隆并插入到pmirGLO荧光素酶报告基因编码区下游，构建ATXN3基因的mRNA 3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达载体，所用载体的报告荧光为Luc2，校正荧光为hRluc-neosion；
③构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达突变体：
在构建好的野生型ATXN3基因的mRNA 3'UTR部分序列荧光素酶报告基因载体的基础上，利用PCR突变法，针对软件预测的miR-25与ATXN3基因mRNA 3'UTR的结合靶点设计引物，将靶序列259-266位碱基由GTGCAAT突变为CTCGATA，构建突变型ATXN3基因的mRNA 3'UTR部分序列荧光素酶报告基因载体；
④双荧光素酶报告基因活性检测：
a)HEK 293T细胞培养:操作同步骤（5）-①；
b)细胞转染：
细胞接种：转染前一日取对数生长期的HEK 293T细胞，1×PBS洗涤2次，0.25%胰酶-EDTA消化约30秒后，加入10%胎牛血清DMEM培养液吹打混匀细胞，然后进行细胞计数，调整细胞浓度至1×105/ml。以5×104个/孔密度将细胞接种至24孔板中，于37℃、5%CO2孵育箱中继续培养过夜，次日取细胞形态良好、分散均匀，汇合度约60-70%用于转染；
细胞瞬时共转染：
pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR转染组： pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR
150ng+miR-25 mimics 25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR 150ng+negative mimics 25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR
150ng；
pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR转染组：pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR
150ng+miR-25 mimics 25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR 150ng+negative mimics 25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR
150ng；
共转染操作同步骤（5）-②-b)；
c) 双荧光素酶活性分析：
试剂准备：将5×Passive Lysis Buffe (PLB) 按1:4比例加入去离子水稀释至1×，将1 vial Dual-Glo®
Luciferase Substrate 溶于10ml的Dual-Glo® Luciferase Buffer 中，充分混匀，-70℃避光保存，该溶液命名为Dual-Glo® Luciferase Reagent；检测活性前将 Dual-Glo® Stop & Glo®
Substrate 按1:100比例加入Dual-Glo® Stop & Glo®
Buffer中，命名为Dual-Glo® Stop &
Glo®Reagent；共转染后24、48小时，弃掉24孔板中的培养基，1×PBS 洗涤细胞两次；每孔加入100μl 的1×PLB，充分混合以完全覆盖细胞，于－80℃下放置5min，然后室温下迅速溶解以使细胞充分裂解；用移液器将裂解液及细胞碎片移至EP管中，12000rpm，4℃，离心1min，将上清液移至另一新EP管中；将20ul的Dual-Glo® Luciferase
Reagent加入EP管中，室温下放置10min后将其放入单电子发光管中，检测荧火虫荧光素酶的活性，记录数值；将EP管从仪器中取出，加入20ul的Dual-Glo® Stop &
Glo®Reagent，室温下放置10min后将EP管再次放入单电子发光管中，检测海肾荧光素酶的活性，记录数值；
将3次复孔转染后第一次所测得的萤火虫荧光素酶活性的平均值分别除以第二次所测得的海肾荧光素酶活性的平均值得到校正转染效率后的相对活性，将校正转染效率后的相对活性分别除以空白对照（质粒转染组）的校正转染效率的相对活性即得各样品相对空白对照的归一化活性变化倍数；
d）统计学分析：运用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析。用student’t检验对双荧光素酶报告基因检测活性结果进行统计学分析，数据显示均为平均值±SE，以单侧P<0.05认为差异有统计学意义。
miR-25 mimics干预pmirGLO-ATXN3 3’UTR载体48hr后双荧光素酶报告基因检测活性实验结果如图8所示：予 miR-25 mimics 上调miR-25表达水平后，pmirGLO-ATXN3 3’UTR载体（miR-25+3’UTR WT）荧光素酶相对活性水平下降约40%，其结果与阴性对照组相比具有显著性差异；与阴性对照相比，pmirGLO-ATXN3 3’UTR突变体（miR-25+3’UTR MUT）萤火虫荧光素酶相对活性水平未发生显著性变化。
双荧光素酶报告基因检测活性实验结果说明：miR-25能直接靶向调控ATXN3基因的表达，其作用靶点位于ATXN3 基因mRNA 3’UTR的259-266位碱基区域，对SCA3/MJD具有潜在的神经保护作用。
所述的可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，为研发SCA3/MJD疾病相关诊断试剂盒提供依据。
序列表
<110>
中南大学湘雅医院
<120>可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法
<160>4
<210>1
<211>22
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
UAGCACCAUC
UGAAAUCGGU
UA
22
<210>2
<211>22
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
UCCCUGAGAC
CCUAACUUGU
GA
22
<210>3
<211>22
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
CAUUGCACUU
GUCUCGGUCU
GA
22
<210>4
<211>22
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
CAAUCACUAA
CUCCACUGCC
AU
22
Claims (8)
1.可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）准备含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血各5~10ml，分离的血清分装后置于-80℃备用；
（2）TRIzol法提取步骤（1）血清中含miRNA的总RNAs；
（3）应用miRNA微阵列芯片技术对步骤（2）中的总RNAs进行miRNAs表达谱检测，初步筛选得到SCA3/MJD分子标志物miRNAs；
（4）对步骤（3）初步筛选得到的SCA3/MJD分子标志物miRNAs，应用生物信息学方法和qRT—PCR技术在含SCA3/MJD的抗凝血和不含SCA3/MJD的抗凝血中进行验证；
(5）上调通过步骤（4）验证的SCA3/MJD分子标志物miRNAs，利用Western blot技术检测转染所述SCA3/MJD分子标志物miRNAs后内源性野生型及外源性突变型ataxin-3蛋白表达水平：
①HEK 293T细胞培养；
②细胞转染：
内源性ataxin-3蛋白检测转染成分：negative mimics 100ng、 miR-29a mimics 100ng、 miR-34b mimics 100ng、miR-125b mimics 100ng、 miR-25 mimics 100ng、 siATXN3 100ng；其转染对象为HEK 293T细胞；
外源性ataxin-3蛋白检测转染成分：negative mimics 100ng 、 siATXN3 100ng 、miR-25 mimics 100ng ；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；
③内源性野生型及外源性突变型ataxin-3蛋白表达水平检测：总蛋白提取，蛋白定量，SDS-PAGE胶的制备，上样及电泳，转膜，封闭，加一抗，洗一抗，加二抗，洗二抗，曝光，显影及定影；
（6）上调及下调步骤（5）明确的SCA3/MJD分子标志物miRNAs表达后，采用qRT-PCR法检测内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平；
①HEK 293T细胞或SCA3/MJD模型细胞培养；
②细胞转染：
内源性ATXN3基因表达测定： siATXN3 50ng、 miR-25 mimics 50ng、negative mimics 50ng、miR-25 inhibitor 100ng、negative inhibitor 100ng、空转染组；其转染对象为HEK 293T细胞；
外源性ATXN3基因表达测定：negative mimics 50ng、siATXN3 50ng、miR-25 mimics 50ng；其转染对象为SCA3/MJD模型细胞；
③内源性野生型及外源性突变型ATXN3基因mRNA表达水平检测：
a)总RNAs抽提；
b)总RNAs纯度鉴定；
c)总RNAs完整性鉴定；
d）逆转录合成cDNA；
e）qRT-PCR：以β-actin作为内参照，
cDNA序列引物：
ATXN3-1F: GGCTCACTTTGTGCTCAACATTG ；
ATXN3-2R:
TCTCATCCTCTCCTCCTCATCCAG；β-actin-1F:TGAAGGTGACAGCAGTCGGTTG ；
β-actin-2R:
GGCTTTTAGGATGGCAAGGGAC；
f) 通过比较目的基因ATXN3和内参基因β-actin的Ct值，应用2 -△△ Ct法对所得数据进行处理，计算目的基因ATXN3相对内参基因β -actin的mRNA相对表达量；
（7）应用双荧光素酶报告基因检测技术明确SCA3/MJD分子标志物miRNAs调控ATXN3基因的作用靶点；
①生物信息学软件预测调控ATXN3表达的miRNA；
②构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达载体；
③构建及鉴定ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达突变体；
④双荧光素酶报告基因活性检测：
a)HEK 293T细胞培养；
b)细胞转染：
pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR转染组： pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR
150ng+miR-25 mimics 25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR 150ng+negative mimics 25ng、pmirGLO/WT-ATXN3-3'UTR
150ng；
pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR转染组：pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR
150ng+miR-25 mimics 25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR 150ng+negative mimics 25ng、pmirGLO/M-ATXN3-3'UTR
150ng；
c)双荧光素酶活性分析。
2. 如权利要求1所述可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤3）miRNA微阵列芯片技术的操作条件: 采用miRCURYTM Array Power标记试剂盒得到标记好的探针，探针与miRCURYTM芯片56℃杂交16~20h,再使用Gene Pix4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度。
3.如权利要求1所述可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤4）的PCR反应程序为95℃，3min；40个PCR循环：95℃，10秒；60℃，20秒；72℃，20秒；78℃，20秒。
4.如权利要求1所述可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤5）Western blot的蛋白上样量为20µg。
5.如权利要求1所述可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤6）qRT-PCR循环程序为： 95℃ 15秒；95℃ 5秒；60℃ 30秒，循环40次，在60℃延伸30秒时读取荧光值。
6.如权利要求1所述可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤7）-①采用Pictar、TargetScan和miRanda三种生物信息学软件。
7.如权利要求1所述可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤7）-③通过将靶序列259-266位碱基由GTGCAAT突变为CTCGATA，构建ATXN3基因3’UTR部分序列荧光素酶报告基因表达突变体。
8.如权利要求1~7之一所述可调控ATXN3基因表达的SCA3/MJD分子标志物miRNAs的筛选和鉴定方法，其特征在于，所述SCA3/MJD分子标志物miRNAs为序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4所示的miR-29a、 miR-125b、miR-25和miR-34b。
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