CN103339100A - 同位素碳胆碱类似物 - Google Patents

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Abstract

具有同位素碳的新的胆碱来源的放射性示踪剂，其用于与胆碱代谢改变相关病症状态的正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像(例如前列腺癌、乳腺癌、脑癌、食道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和前列腺癌—原发性肿瘤、结节病或转移的肿瘤成像)。

Description

同位素碳胆碱类似物
发明领域
本发明描述了用于胆碱代谢改变相关病症状态的正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像(例如前列腺癌、乳腺癌、脑癌、食道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和前列腺癌—原发性肿瘤、结节病(nodal disease)或转移的肿瘤成像)的新的放射性示踪剂。本发明还描述了该新的放射性示踪剂的中间体、前体、药物组合物、制备方法和使用方法。
相关领域描述
胆碱激酶(EC 2.7.1.32)活性的生物合成产物，磷酸胆碱，在一些癌症中升高，并且为膜磷脂酰胆碱的前体(Aboagye, E.O., 等, Cancer Res 1999; 59:80-4; Exton, J.H., Biochim Biophys Acta 1994; 1212:26-42; George, T.P., 等, Biochim Biophys Acta 1989; 104:283-91; 和Teegarden, D., 等, J Biol Chem  1990; 265(11):6042-7)。胆碱激酶的过表达和酶活性的提高已经在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌中有报道(Aoyama, C., 等, Prog Lipid Res 2004; 43(3):266-81; Glunde, K., 等, Cancer Res 2004; 64(12):4270-6; Glunde, K., 等, Cancer Res 2005; 65(23): 11034-43; Iorio, E., 等, Cancer Res 2005; 65(20): 9369-76; Ramirez de Molina, A., 等, Biochem Biophys Res Commun 2002; 296(3): 580-3和Ramirez de Molina, A., 等, Lancet Oncol 2007; 8(10): 889-97)，并且很大程度上造成磷酸胆碱水平随着恶性转化和进展而升高；癌细胞中磷酸胆碱水平的升高还由通过磷脂酶C的分解增加所致(Glunde, K., 等, Cancer Res 2004; 64(12):4270-6)。
由于这一表型，以及尿排泄减少，[11C]胆碱已成为对前列腺癌进行正电子发射断层扫描(PET)和PET-计算机断层扫描(PET-CT)成像，以及较小程度上对脑癌、食管癌和肺癌成像的突出的放射性示踪剂(Hara, T., 等, J Nucl Med 2000; 41:1507–13; Hara, T., 等, J Nucl Med 1998; 39:990–5; Hara, T., 等, J Nucl Med 1997; 38:842–7; Kobori, O., 等, Cancer Cell 1999; 86:1638–48; Pieterman, R.M., 等, J Nucl Med 2002; 43(2):167-72和Reske, S.N. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2008; 35:1741)。特定的PET信号由放射性示踪剂的转运和其被胆碱激酶磷酸化为[11C]磷酸胆碱所致。
然而，感兴趣的是[11C]胆碱(以及氟代类似物)主要在肾和肝组织中被胆碱氧化酶氧化成[11C]甜菜碱(见下图1) (EC 1.1.3.17)，且注射放射性示踪剂后不久即可在血浆中检测到代谢物(Roivainen, A., 等, European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32)。这使得使用后期成像(late imaging)方案时母体放射性示踪剂和分解代谢物的相对贡献难以区分。
Figure 253611DEST_PATH_IMAGE001
图1. 主要胆碱代谢物的化学结构及其途径
开发[18F]氟甲基胆碱([18F]FCH)：
Figure 640730DEST_PATH_IMAGE002
以克服碳-11的短物理半衰期(20.4分钟) (DeGrado, T.R., 等, Cancer Res 2001; 61(1):110-7)，已经发表多个使用该相对新的放射性示踪剂的PET和PET-CT研究(Beheshti, M.,等, Eur J Nucl Med Mol Imaging 2008;35(10):1766-74; Cimitan, M.,等, Eur J Nucl Med Mol Imaging 2006; 33(12):1387-98; de Jong, I.J.,等, Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002; 29:1283–8和Price, D.T.,等, J Urol 2002; 168(1):273-80)。认为氟-18的较长半衰期(109.8分钟)潜在地有利于允许当体循环中的母体示踪剂发生充分清除时的后期肿瘤成像(DeGrado, T.R., 等, J Nucl Med 2002; 43(1):92-6).
WO2001/82864描述了18F标记的胆碱类似物，包括[18F]氟甲基胆碱([18F]-FCH)及其作为成像剂(例如PET)的用途，所述成像剂用于影响体内胆碱加工的赘生物和病理生理的非侵入性检测和定位(摘要)。WO2001/82864还描述了18F-标记的二氘化胆碱类似物例如[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱([18F]FDC)(下文中被称为“[18F]D2-FCH”)：
Figure 72848DEST_PATH_IMAGE003
已经研究了胆碱在不同条件下的氧化，包括胆碱和[1,2-2H4]胆碱的相对氧化稳定性 (Fan, F., 等, Biochemistry 2007, 46, 6402-6408; Fan, F.,等, Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 2067-2074; Fan, F.,等, Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 17954-17961; Gadda, G. Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1646, 112-118; Gadda, G., Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1650, 4-9)。理论上，发现在一级同位素效应为8-10的情况下额外的氘取代的作用是微不足道的，这是因为β-二级同位素效应为约1.05 (Fan, F.,等, Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 17954-17961)。
[18F]氟甲基胆碱目前在临床上广泛用于肿瘤状态成像(Beheshti, M., 等, Radiology 2008, 249, 389-90; Beheshti, M.,等, Eur J Nucl Med Mol Imaging 2008, 35, 1766-74)。
如下所述，本发明提供新的11C放射性标记的放射性示踪剂，其可用于胆碱代谢的PET成像并且显示代谢稳定性提高和有利的尿排泄概况。
附图简述
图1描述主要胆碱代谢物的化学结构及其途径。
图3显示四氘化胆碱前体的NMR分析。上部，1H NMR波谱；下部，13C NMR波谱。两波谱均在CDCl3中获得。
图4描述[18F]氟甲基甲苯磺酸盐(9)和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH)合成的HPLC概况，显示了(A) 15分钟后(9)合成的放射性HPLC概况；(B) 15分钟后(9)合成的UV (254 nm)概况；(C) 10分钟后(9)合成的放射性HPLC概况；(D) 粗制(9)的放射性HPLC概况；(E) 配制的注射用(9)的放射性HPLC概况；(F) 配制后的折射率分布(阳离子检测模式)。
图5a为用于经由未保护前体生产[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH)的本发明完全组装的盒(cassette)的图。
图5b为用于经由PMB保护前体生产[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH)的本发明完全组装的盒的图。
图6描述高锰酸钾氧化研究的代表性放射性HPLC分析。上排为[18F]氟甲基胆碱([18F]FCH)和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱([18F]D4-FCH)的对照样品，在时间零点(0分钟)来自反应混合物的提取物。下排为处理20分钟后的提取物。左侧为[18F]氟甲基胆碱([18F]FCH)，右侧为[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱([18F]D4-FCH)。
图7显示[18F]氟甲基胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱在高锰酸钾存在时的化学氧化电位。
图8显示[18F]氟甲基胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱在胆碱氧化酶存在时的时程稳定性测定，证明母体化合物转化为其各自的甜菜碱类似物。
图9显示胆碱氧化酶研究的代表性放射性HPLC分析。上排为[18F]氟甲基胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱的对照样品，在时间零点(0分钟)来自反应混合物的提取物。下排为处理40分钟后的提取物。左侧为[18F]氟甲基胆碱，右侧为[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱。
图10上方：通过放射性HPLC对静脉内注射示踪剂到小鼠内15分钟后获得的小鼠血浆样品中[18F]氟甲基胆碱(FCH)至[18F]FCH-甜菜碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH)至[18F]D4-FCH-甜菜碱的代谢分析。下部：血浆中母体示踪剂，[18F]氟甲基胆碱(FCH)和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH)转化为代谢物[18F]FCH-甜菜碱(FCHB)和[18F]D4-FCH甜菜碱(D4-FCHB)的总结。
图11 [18F]氟甲基胆碱(FCH)、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱(D2-FCH)和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH)在荷HCT-116肿瘤小鼠中的生物分布时程。插图(Inset)：选择的评估时间点。A) [18F]氟甲基胆碱的生物分布；B) [18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱的生物分布；C) [18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱的生物分布；D) 图表A-C中[18F]氟甲基胆碱(FCH)、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱(D2-FCH)和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH)的肿瘤摄取时程。将约3.7 MBq的[18F]氟甲基胆碱(FCH)、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱(D2-FCH)和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH)注射入清醒的雄性C3H-Hej小鼠中，这些小鼠在标明的时间点在异氟烷麻醉下处死。
图12示出放射性HPLC色谱图以显示胆碱放射性示踪剂代谢物在p.i. 30分钟从正常白鼠获得的组织中的分布。上排，放射性示踪剂标准品；中排，肾提取物；下排，肝提取物。左侧为[18F]FCH，右侧为[18F]D4-FCH。
图13示出放射性-HPLC色谱图以显示注射30分钟后HCT116肿瘤中的胆碱放射性示踪剂代谢物的分布。上排，纯放射性示踪剂标准品；下排，30分钟的肿瘤提取物。左侧，[18F]FCH；中，[18F]D4-FCH；右，[11C]胆碱。
图14显示使用HCT116细胞进行磷酸胆碱HPLC验证的放射性HPLC色谱图。左，纯[18F]FCH标准品；中，磷酸酶孵育；右，对照孵育。
图15显示[18F]氟甲基胆碱类似物：[18F]氟甲基胆碱、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱在所选时间点的放射性代谢物分布。
图16显示[18F]FCH和[18F]D4-FCH的组织概况。(a) 由PET数据得到的肝、肾、尿(膀胱)和肌肉中[18F]FCH摄取的时间相对于放射性的曲线，和(b) [18F]D4-FCH的相应数据。结果为均值 ± SE；n = 4只小鼠。为清楚起见，使用了较高和较低的误差条(SE)。(Leyton, 等, Cancer Res 2009: 69:(19), 第7721-7727页)。
图17显示[18F]FCH和[18F]D4-FCH在SKMEL28肿瘤异种移植物中的肿瘤概况。(a) 显示通过肿瘤的0.5 mm横切面和通过膀胱的冠状面的荷SKMEL28肿瘤小鼠的典型[18F]FCH-PET和[18F]D4-FCH-PET图像。为了可视化，显示30-60分钟总的图像数据。箭头指向肿瘤(T)、肝(L)和膀胱(B)。(b) 肿瘤中[18F]FCH和[18F]D4-FCH的时间与放射性比较的曲线。对于各肿瘤，测定了19个时间范围中每一个的放射性。数据为均值%ID/vox60均值 ± SE (n = 4只小鼠/组)。(c) 成像变量的总结。数据为均值± SE，n = 4；*P = 0.04。为清楚起见，使用了较高和较低的误差条(SE)。
图18显示PD0325901(一种促有丝分裂胞外激酶抑制剂)对HCT116肿瘤和细胞摄取[18F]D4-FCH的作用。(a) 用溶媒或25mg/kg PD0325901进行每日处理达10天后HCT116肿瘤中标准化的时间相对于放射性的曲线。数据为均值 ± SE；n = 3只小鼠。(b)成像变量%ID/vox60、%ID/vox60max和AUC的总结。数据为均值 ± SE；* P = 0.05。(c) 在培养物中用[18F]D4-FCH处理HCT116细胞1小时后，PD0325901 (1μM)对[18F]D4-FCH磷酸胆碱代谢的内在细胞作用。数据为均值 ± SE; n=3 ; * P = 0.03。
图19显示HCT116肿瘤中胆碱激酶A的表达。(a) 证明PD0325901对肿瘤胆碱激酶A (CHKA)蛋白表达的作用的典型蛋白质印迹。通过蛋白质印迹分析来自注射PD0325901 (每日25mg/kg，达10天，口服)或溶媒的小鼠的HCT116肿瘤的CHKA表达。使用β-肌动蛋白作为加样对照。(b) CHKA表达的光密度测量总结，表示为相对于β-肌动蛋白的比率。结果为平均比率 ± SE；n = 3，* P = 0.05。
图20显示BALB/c裸鼠中11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱的生物分布时程。将约18.5 MBq 11C标记的示踪剂或3.7 MBq 18F i.v.给予麻醉动物，然后在规定时间点处死。切除组织、称重和计算，将其计数标准化至注射剂量/g湿重组织。显示了平均值(n = 3)和SEM。
图21显示BALB/c裸鼠肝(A)和肾(B)中11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱的代谢概况。在i.v.注射母体放射性示踪剂2、15、30和60分钟后，采用放射性HPLC，评价放射性同位素标记的代谢物概况。显示了平均值(n = 3)和SEM。缩略语：Bet-ald，甜菜醛；p-胆碱，磷酸胆碱。
图22显示HCT116肿瘤中11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱的代谢概况。在i.v.注射母体放射性示踪剂后15分钟和60分钟，采用放射性HPLC，评价HCT116肿瘤异种移植物中放射性同位素标记的代谢物概况。显示了平均值(n = 3)和SEM。* P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001。
图23描述11C-胆碱(○)、11C-D4-胆碱(▲)和18F-D4-胆碱(■) PET图像分析。在动态PET成像60分钟后，检查HCT116肿瘤摄取概况。A，针对11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱的荷HCT116肿瘤小鼠(30 - 60分钟总计活性)的代表性轴PET-CT图像。CT图像标出的肿瘤边缘用红色画出轮廓。B，肿瘤时间相对于放射性的曲线(TAC)。均值± SEM (n = 4只小鼠/组)。
图24显示HCT116肿瘤中11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱的药代动力学。A，改良的区室建模分析(考虑了血浆代谢物及其流入肿瘤的可交换间隙)，被用来推导K i，一种肿瘤内不可逆保留的度量。B，如前所述(29，30)，采用两部位区室模型，计算动力学参数k 3，一种胆碱激酶活性的间接度量。C，肿瘤中甜菜碱与磷酸胆碱之比。在示踪剂注射后15和60分钟，通过放射性HPLC定量测定代谢物。显示了平均值(n = 4)和SEM。* P < 0.05；*** P < 0.001。缩略语：p-胆碱，磷酸胆碱。
图25显示不同组织学来源的肿瘤中18F-D4-胆碱的动态摄取和代谢稳定性。A，获自60分钟动态PET成像的肿瘤时间相对于放射性的曲线(TAC)。均值± SEM (n = 3-5只小鼠/组)。B，肿瘤中18F-D4-胆碱的代谢概况。PET成像后，采用放射性HPLC，评价HCT116肿瘤异种移植物中放射性同位素标记的代谢物概况。显示了平均值(n = 3)和SEM。C，恶性黑素瘤、前列腺腺癌和结肠癌肿瘤中的胆碱激酶表达。肿瘤裂解物的代表性蛋白质印迹(n = 3个异种移植物/肿瘤细胞系)。肌动蛋白用作加样对照。缩略语：CKα，胆碱激酶α。
图26显示肿瘤大小对18F-D4-胆碱摄取和保留的作用。100 mm3 (●)和200 mm3(○)的PC3-M肿瘤中60分钟动态PET成像后检查示踪剂摄取概况。A，使用平均衰变校正计数(average decay-corrected count)的肿瘤时间相对于放射性的曲线。均值± SEM (n = 3-5只小鼠/组)。B，使用最大体素衰变校正计数(maximum voxel decay-corrected count)的肿瘤时间相对于放射性的曲线。均值± SEM (n = 3-5)。
图27显示放射性色谱图中的分析物鉴定。18F-D4-胆碱处理的HCT116细胞裂解物的代表性放射性色谱图。A，1小时18F-D4-胆碱摄取进入HCT116细胞接着细胞裂解，并与溶媒于37℃孵育1小时。B，1小时18F-D4-胆碱摄取进入HCT116细胞接着细胞裂解，并与溶于溶媒的碱性磷酸酶孵育1小时。标示的峰为：1，18F-D4-胆碱；2，18F-D4-磷酸胆碱。
图28显示18F-D4-胆碱的胆碱氧化酶处理。A，18F-D4-胆碱的代表性放射性色谱图。B，用胆碱氧化酶处理20分钟后的18F-D4-胆碱色谱图。C，40分钟处理后的18F-D4-胆碱色谱图。标示的峰为：1，18F-D4-甜菜醛；2，18F-D4-甜菜碱；3，18F-D4-胆碱。
图29显示总的肾活性与作为磷酸胆碱保留的%放射性之间的相关性。在示踪剂注射后2、15、30和60分钟，自11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱摄取值和代谢得出数据。
图30显示HCT116肿瘤中的11C-胆碱(○)、11C-D4-胆碱(▲)和18F-D4-胆碱(■) PET成像分析。在动态PET扫描最初14分钟内的肿瘤时间相对于放射性的曲线(TAC)说明示踪剂动力学细微变化。均值± SEM (n = 4只小鼠/组)。
图31显示人黑素瘤(●)、前列腺(▲)和结肠(■)癌细胞系中体外18F-D4-胆碱摄取的时程。在溶媒处理(实心符号)和半胆碱-3处理的细胞(5 mM；空心符号)中测量摄取。显示了平均值+ SEM (n = 3)。插图：3个细胞系中胆碱激酶-α表达的代表性蛋白质印迹。肌动蛋白用作加样对照。缩略语：CKα，胆碱激酶α。
图32显示分别在100 mm3和200 mm3时荷PC3-M肿瘤小鼠(总计活性30 - 60分钟)的代表性轴PET-CT图像。CT图像标出的肿瘤边缘用红色画出轮廓。
发明概述
本发明提供下式(III)的化合物：
Figure 25761DEST_PATH_IMAGE004
(III)
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢或氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；
m为1-4的整数；
C*为碳的放射性同位素；
X、Y和Z各自独立地为氢、氘(D)、选自F、Cl、Br和I的卤素、烷基、烯基、炔基(alkynl)、芳基、杂芳基、杂环基；和
Q为阴离子反荷离子；条件是式(III)化合物不是11C-胆碱。
发明详述
本发明提供式(I)化合物的新的放射性标记的胆碱类似物：
Figure 947449DEST_PATH_IMAGE005
(I)
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢或氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；
m为1-4的整数；
X和Y各自独立地为氢、氘(D)或F；
Z为选自F、Cl、Br和I的卤素或放射性同位素；和
Q为阴离子反荷离子；
条件是所述式(I)化合物不是氟甲基胆碱、氟甲基-乙基-胆碱、氟甲基-丙基-胆碱、氟甲基-丁基-胆碱、氟甲基-戊基-胆碱、氟甲基-异丙基-胆碱、氟甲基-异丁基-胆碱、氟甲基-仲丁基-胆碱、氟甲基-二乙基-胆碱、氟甲基-二乙醇-胆碱、氟甲基-苄基-胆碱、氟甲基-三乙醇-胆碱、1,1-二氘氟甲基胆碱、1,1-二氘氟甲基-乙基-胆碱、1,1-二氘氟甲基-丙基-胆碱或其[18F]类似物。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(I)化合物，其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；
m为1-4的整数；
X和Y各自独立地为氢、氘(D)或F；
Z为选自F、Cl、Br和I的卤素或放射性同位素；
Q为阴离子反荷离子；
条件是所述式(I)化合物不是氟甲基胆碱、氟甲基-乙基-胆碱、氟甲基-丙基-胆碱、氟甲基-丁基-胆碱、氟甲基-戊基-胆碱、氟甲基-异丙基-胆碱、氟甲基-异丁基-胆碱、氟甲基-仲丁基-胆碱、氟甲基-二乙基-胆碱、氟甲基-二乙醇-胆碱、氟甲基-苄基-胆碱、氟甲基-三乙醇-胆碱或其[18F]类似物。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(I)化合物，其中：
R1和R2各自为氢；
R3和R4各自为氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；
m为1-4的整数；
X和Y各自独立地为氢、氘(D)或F；
Z为选自F、Cl、Br和I的卤素或放射性同位素；
Q为阴离子反荷离子；
条件是所述式(I)化合物不是1,1-二氘氟甲基胆碱、1,1-二氘氟甲基-乙基-胆碱、1,1-二氘氟甲基-丙基-胆碱或其[18F]类似物。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(I)化合物，其中：
R1、R2、R3和R4各自为氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；
m为1-4的整数；
X和Y各自独立地为氢、氘(D)或F；
Z为选自F、Cl、Br和I的卤素或放射性同位素；
Q为阴离子反荷离子。
按照本发明，当本文所述式(I)化合物的Z为卤素时，它可以是选自F、Cl、Br和I的卤素；优选为F。
按照本发明，当本文所述式(I)化合物的Z为放射性同位素(下文亦称“放射性标记的式(I)化合物”)时，它可以是本领域已知的任何放射性同位素。优选Z为适于成像(例如PET、SPECT)的放射性同位素。更优选Z为适于PET成像的放射性同位素。甚至更优选Z为18F、76Br、123I、124I或125I。甚至更优选Z为18F。
按照本发明，本文所述式(I)化合物的Q可以是本领域已知的适于阳离子铵化合物的任何阴离子反荷离子。Q的合适实例包括以下阴离子：溴离子(Br-)、氯离子(Cl-)、乙酸根(CH3CH2C(O)O-)或甲苯磺酸根(-OTos)。在本发明的一个优选实施方案中，Q为溴离子(Br-)或甲苯磺酸根(-OTos)。在本发明的一个优选实施方案中，Q为氯离子(Cl-)或乙酸根(CH3CH2C(O)O-)。在本发明的一个优选实施方案中，Q为氯离子(Cl-)。
按照本发明，式(I)化合物的优选实施方案为以下式(Ia)化合物：
Figure 556285DEST_PATH_IMAGE005
(Ia)
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氘(D)；
R5、R6和R7各自为氢；
X和Y各自独立地为氢；
Z为18F；
Q为Cl-。
按照本发明，优选的式(Ia)化合物为[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱([18F]-D4-FCH)。[18F]-D4-FCH是在代谢上更稳定的氟胆碱(FCH)类似物。相对于相应的18F-未氘化和/或18F-二氘化类似物，[18F]-D4-FCH提供许多优势。例如，相对于[18F]氟甲基胆碱，[18F]-D4-FCH显示化学和酶促氧化稳定性提高。相对于二氘氟胆碱、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱，[18F]-D4-FCH具有改进的体内分布(即对于体内成像显示更好的可用性)，这超过了先前文献所能预测的，因此为意料之外的。[18F]-D4-FCH显示稳定性改进，因此将在放射性示踪剂从体循环充分清除后能够更好地进行肿瘤后期成像。[18F]-D4-FCH还通过提高底物的可用性来提高肿瘤成像的灵敏度。下面将更详细地论述这些优势。
本发明还提供式(II)的前体化合物：
Figure 792094DEST_PATH_IMAGE006
(II)
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢或氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；和
m为1-4的整数。
本发明还提供制备式(II)的前体化合物的方法。
本发明提供下式(III)的化合物：
(III)
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢或氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；
m为1-4的整数；
C*为碳的放射性同位素；
X、Y和Z各自独立地为氢、氘(D)、选自F、Cl、Br和I的卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基；和
Q为阴离子反荷离子；条件是式(III)化合物不是11C-胆碱。
按照本发明，式(III)化合物的C*可以是碳的任何放射性同位素。C*的合适实例包括但不限于11C、13C和14C。Q为对于式(I)化合物所描述的。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(III)化合物，其中C*为11C；X和Y各自为氢；Z为F。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(III)化合物，其中C*为11C；X、Y和Z各自为氢H；R1、R2、R3和R4各自为氘(D)；R5、R6和R7各自为氢(11C-[1,2-2H4]胆碱或“11C-D4-胆碱”。
药物组合物或放射性药物组合物
本发明提供包含式(I)化合物(包括式(Ia)化合物，各自如本文所定义)与药学上可接受的载体、赋形剂或生物相容性载体的药物组合物或放射性药物组合物。根据本发明，当式(I)或(Ia)化合物的Z为放射性同位素时，药物组合物为放射性药物组合物。
本发明进一步提供适合给予哺乳动物的包含式(I)化合物(包括式(Ia)化合物，各自如本文所定义)与药学上可接受的载体、赋形剂或生物相容性载体的药物组合物或放射性药物组合物。
本发明提供包含如本文所定义的式(III)化合物与药学上可接受的载体、赋形剂或生物相容性载体的药物组合物或放射性药物组合物。
本发明进一步提供适合给予哺乳动物的包含如本文所定义的式(III)化合物与药学上可接受的载体、赋形剂或生物相容性载体的药物组合物或放射性药物组合物。
本领域技术人员将理解的是，药学上可接受的载体或赋形剂可为本领域已知的任何药学上可接受的载体或赋形剂。
“生物相容性载体”可为任何流体，特别是液体，可将式(I)、(Ia)或(III)化合物悬浮或溶解在其中，使得药物组合物为生理上耐受的，例如，可给予哺乳动物而无毒性或过度不适。生物相容性载体可合适地为可注射载液例如无菌无热原注射用水、水溶液例如盐水(其可有利地进行平衡使得注射用终产物为等渗的或非低渗的)、一种或多种张度调节物质(例如等离子体阳离子与生物相容性反荷离子的盐)的水溶液、糖(例如，葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如，山梨醇或甘露醇)、二醇(例如，甘油)或其它非离子多元醇物质(例如，聚乙二醇、丙二醇等)。生物相容性载体还可包括生物相容性有机溶剂例如乙醇。这些有机溶剂可用于溶解更亲脂的化合物或制剂。生物相容性载体优选为无热原注射用水、等渗盐水或乙醇水溶液。静脉内注射用生物相容性载体的pH合适地在4.0-10.5的范围内。
药物组合物或放射性药物组合物可胃肠外即通过注射给予，且最优选为水溶液。这样的组合物可任选包含另外的成分，例如缓冲液、药学上可接受的增溶剂(例如环糊精或表面活性剂例如普卢兰尼克(Pluronic)、吐温(Tween)或磷脂)、药学上可接受的稳定剂或抗氧化剂(例如抗坏血酸、龙胆酸或对氨基苯甲酸)。当式(I)、(Ia)或(III)化合物作为放射性药物组合物提供时，用于制备所述化合物的方法可进一步包括获得放射性药物组合物所需的步骤，例如，除去有机溶剂、加入生物相容性缓冲液和任何任选的另外成分。对于胃肠外给予，还需要采取确保放射性药物组合物为无菌和无热原的步骤。这些步骤是本领域技术人员所熟知的。
本发明化合物的制备
本发明提供制备式(I)化合物(包括式(Ia)化合物)的方法，其中所述方法包括使式(II)前体化合物与式(IIIa)化合物反应以形成式(I)化合物(流程A)：
Figure 895365DEST_PATH_IMAGE007
流程A
其中式(I)和(II)化合物各自如本文所描述，式(IIIa)化合物如下：
Figure 53814DEST_PATH_IMAGE008
其中X、Y和Z各自如本文针对式(I)化合物所定义，且“Lg”为离去基团。合适的“Lg”的实例包括，但不限于，溴(Br)和甲苯磺酸根(OTos)。式(IIIa)化合物可通过本领域已知的任何方法(包括本文所述方法)制备。
式(IIIa)化合物(其中Z为F；X和Y均为H且Lg为OTos(即，氟甲基甲苯磺酸根))的合成可如以下流程3所示实现：
Figure 827735DEST_PATH_IMAGE009
其中：i：对甲苯磺酸银、MeCN，回流，20小时；
ii：KF、MeCN，回流，1小时。
根据以上流程3：
(a)合成亚甲基二甲苯磺酸盐
使用Emmons和Ferris的方法，将可市售获得的二碘甲烷与甲苯磺酸银反应，以产生亚甲基二甲苯磺酸盐(Emmons, W.D., 等，"Metathetical Reactions of Silver Salts in Solution. II. The Synthesis of Alkyl Sulfonates (银盐在溶液中的复分解反应. II.  烷基磺酸盐的合成)", Journal of the American Chemical Society, 1953; 75:225)。
(b) 合成无放射性的氟甲基甲苯磺酸盐
氟甲基甲苯磺酸盐可通过使用乙腈中的氟化钾/Kryptofix K222于80℃在标准条件下亲核取代步骤(a)的亚甲基二甲苯磺酸盐而制备。
当Z为放射性同位素时，该放射性同位素可通过本领域技术人员已知的任何方法引入。例如，放射性同位素[18F]-氟离子(18F?)通常作为水溶液从核反应18O(p,n)18F获得，并通过加入阳离子反荷离子以及随后除去水使其成为反应性的。合适的阳离子反荷离子在无水反应溶剂中应具有足够的溶解度以维持18F?的溶解度。因此，已经使用的反荷离子包括大而软的金属离子例如铷或铯、与穴状配体例如KryptofixTM络合的钾或四烷基铵盐。优选的反荷离子为与穴状配体例如KryptofixTM络合的钾，这是由于其在无水溶剂中的良好溶解度和增强的18F?反应性。18F还可通过合适的离去基团例如卤素或甲苯磺酸根基团的亲核置换引入。有关熟知的18F标记技术的更详细讨论可参见“Handbook of Radiopharmaceuticals (放射性药物手册)” (2003; John Wiley和Sons: M.J. Welch和C.S. Redvanly编辑)的第6章。例如，[18F]氟甲基甲苯磺酸盐可通过在包含2-10%水的乙腈中用[18F]-氟离子亲核取代亚甲基二甲苯磺酸盐制备(见Neal, T.R., 等, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 2005; 48:557-68)。
自动化合成
在优选实施方案中，制备式I化合物(包括式(Ia)化合物)的方法为自动化的。例如，[18F]-放射性示踪剂可借助自动化放射性合成设备以自动化方式方便地制备。存在若干种可市售获得的这样的平台设备的实例，包括TRACERlabTM (例如，TRACERlabTMMX)和FASTlabTM (均来自GE Healthcare Ltd.)。这些设备通常包含“盒”(常常为一次性的，在其中实施放射化学)，将其安装在所述设备中以便实施放射性合成。盒通常包括流体通路、反应容器、用于接纳试剂小瓶的端口以及任何用于放射性合成后清洗步骤的固相提取柱。任选地，在本发明进一步的实施方案中，可将自动化的放射性合成设备连接到高效液相色谱仪(HPLC)。
本发明因此提供用于自动化合成式(I)化合物(包括式(Ia)化合物，各自如本文所定义)的盒，其包括：
(i) 包含如本文所定义的式(II)前体化合物的容器；和
(ii) 用本文所定义的式(IIIa)化合物洗脱步骤(i)容器中的内含物的装置(means)。
对于本发明的盒，式(II)和(IIIa)前体化合物的合适和优选的实施方案各自如本文所定义。
在本发明的一个实施方案中，提供无需HPLC纯化步骤的从受保护乙醇胺前体制备式(I)化合物(包括式(Ia)化合物，各自如本文所定义)的方法，其与FASTlabTM相容。
[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(18F-D4-FCH)的放射性合成可根据本文所述方法和实例实施。18F-D4-FCH的放射性合成也可使用可市售获得的合成平台(包括但不限于GE FASTlabTM，可自GE Healthcare Inc.市售获得)实施。
从受保护的前体制备[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱的FASTlabTM放射性合成过程的实例在流程5中示出：
Figure 755240DEST_PATH_IMAGE010
其中：
a. [18F]KF/K222/K2CO3络合物的制备如下文中更详细的描述；
b. [18F]FCH2OTs的制备如下文中更详细的描述；
c. [18F]FCH2OTs的SPE纯化如下文中更详细的描述；
d. O-PMB-[18F]-D4-胆碱(O-PMB-[18F]-D4-FCH)的放射性合成如下文中更详细的描述；和
e. [18F]-D4-胆碱(18F-D4-FCH)作为盐酸盐的纯化&配制如下文中更详细的描述。
[18F]氟代-[1,2-2H4]胆碱或[18F]氟代胆碱(来自受保护的前体)的自动化涉及相同的自动化过程(并且分别从O-PMB-N,N-二甲基-[1,2-2H4]乙醇胺和O-PMB-N,N-二甲基乙醇胺的氟甲基化制备)。
根据本发明的一个实施方案，[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱或[18F]氟甲基胆碱的FASTlabTM合成包括下列连续步骤：
(i) 将[18F]氟化物截留到QMA上；
(ii)从QMA洗脱[18F]氟化物；
(iii) [18F]FCH2OTs的放射性合成；
(iv) [18F]FCH2OTs的SPE清洗；
(v) 反应容器的清洗；
(vi) 同时干燥反应容器和保留在SPE t-C18 plus上的[18F]氟甲基甲苯磺酸盐；
(vii) 烷基化反应；
(viii) 除去未反应的O-PMB-前体；和
(ix) 脱保护&配制。
步骤(i)-(ix)各自在下文中更详细地描述。
在本发明的一个实施方案中，上述步骤(i)-(ix)在本文所述盒上实施。本发明的一个实施方案为用于自动化合成平台的能够实施步骤(i)-(ix)的盒。本发明的一个实施方案为用于从受保护的前体放射性合成[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱([18F]-D4-FCH)或[18F]氟甲基胆碱的盒。本发明盒的实例在图5b中示出。
(i) 将[18F]氟化物截留到QMA上
使[18F]氟化物(典型地在0.5 - 5mL H2 18O中)通过预处理的Waters QMA柱。
(ii) 从QMA洗脱[18F]氟化物
洗脱液(如表1所述)从洗脱液小瓶提取至注射器中，并通过Waters QMA进入反应容器。该程序将[18F]氟化物洗脱入反应容器中。使用设计良好的“氮/真空/加热/冷却”干燥循环除去水和乙腈。
(iii) [18F]FCH2OTs的放射性合成
一旦(ii)的K[18F]氟化物/K222/K2CO3络合物已干燥，则将包含乙腈和水的溶液中的CH2(OTs)2亚甲基二甲苯磺酸盐加入到包含K[18F]氟化物/K222/K2CO3络合物的反应容器中。所得反应混合物将被加热(典型地至110℃，10分钟)，然后冷却(典型地至70℃)。
(iv) [18F]FCH2OTs的SPE清洗
一旦[18F]FCH2OTs的放射性合成完成并且反应容器冷却，将水加入反应容器中以将反应容器中的有机溶剂含量降低至约25%。将该稀释溶液从反应容器转移并通过t-C18-light和t-C18 plus柱—这些柱子随后用12-15 mL 25%乙腈/75%水溶液清洗。在该过程的最后：
—亚甲基二甲苯磺酸盐仍截留在t-C18-light上和
—[18F]FCH2OTs、甲苯磺酰基-[18F]氟化物仍截留在t-C18 plus上。
(v) 反应容器的清洗
清洗反应容器(使用乙醇)，然后进行[18F]氟乙基甲苯磺酸盐和O-PMB-DMEA前体的烷基化。
(vi) 同时干燥反应容器和保留在SPE t-C18 plus上的[18F]氟甲基甲苯磺酸盐
一旦完成清洗(v)，同时干燥反应容器和保留在SPE t-C18 plus上的[18F]氟甲基甲苯磺酸盐。
(vii) 烷基化反应
步骤(vi)之后，使用O-PMB-N,N-二甲基-[1,2-2H4]乙醇胺(或O-PMB-N,N-二甲基乙醇胺)/乙腈混合物将保留在t-C18 plus上的[18F]FCH2OTs(与甲苯磺酰基-[18F]氟化物一起)洗脱至反应容器中。
通过加热反应容器(典型地110℃，15分钟)实现用O-PMB-前体的[18F]FCH2OTs烷基化，以得到[18F]氟代-[1,2-2H4]胆碱(或O-PMB-[18F]氟代胆碱)。
(viii) 除去未反应的O-PMB-前体
将水(3 - 4 mL)加入到反应中，接着使该溶液通过预处理的CM柱，随后用乙醇洗涤—典型地2 x 5mL (其除去未反应的O-PMB-DMEA)，使“纯化的”[18F]氟代-[1,2-2H4]胆碱(或O-PMB-[18F]氟代胆碱)截留在CM柱上。
(ix) 脱保护&配制
使盐酸通过CM柱进入注射器中：这导致O-PMB-[18F]氟代胆碱的脱保护(该注射器包含[18F]氟代胆碱/HCl溶液)。接着将乙酸钠加入该注射器中以将pH缓冲至5 - 8，得到[18F]-D4-胆碱(或[18F]胆碱)/乙酸盐缓冲液。接着将该缓冲溶液转移至包含合适缓冲液的产物小瓶中。
表1提供制备本发明的[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH) (或[18F]氟甲基胆碱)放射盒的所需试剂和其它组件列表：
表1
Figure 18731DEST_PATH_IMAGE011
根据本发明的一个实施方案，[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱经由未保护前体的FASTlabTMTM合成包括如以下流程6所描绘的下列连续步骤：
Figure 664476DEST_PATH_IMAGE012
1.从QMA回收[18F]氟化物；
2. K[18F]F/K222/K2CO3络合物的制备；
3. 18FCH2OTs的放射性合成；
4. 18FCH2OTs的SPE清洗；
5. 反应容器、盒和注射器的清洗；
6.反应容器和C18 SepPak的干燥；
7. 18FCH2OTs与D4-DMEA的洗脱和偶联；
8. 将反应混合物转移至CM柱上；
9. 盒和注射器的清洗；
10. 用稀氨水溶液、乙醇和水洗涤CM柱；
11. 用0.09%氯化钠(5 mL)，随后用水(5 mL)从CM柱洗脱[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱。
在本发明的一个实施方案中，上述步骤(1)-(11)在本文所述盒上实施。本发明的一个实施方案为用于自动化合成平台的能够实施步骤(1)-(11)的盒。本发明的一个实施方案为用于从未保护的前体放射性合成[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱([18F]-D4-FCH)的盒。本发明盒的实例在图5a中示出。
表2提供通过本发明的未保护前体放射性盒制备[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(D4-FCH) (或[18F]氟甲基胆碱)所需的试剂和其它组件的列表：
表2
Figure 994087DEST_PATH_IMAGE013
成像方法
本发明放射性标记的化合物，如本文所述，将经由细胞转运蛋白或通过扩散被摄入细胞。在胆碱激酶过表达或被激活的细胞中，本发明放射性标记的化合物，如本文所述，将被磷酸化并截留在细胞中。这将形成检测赘生性组织的主要机制。
本发明进一步提供成像方法，包括给予受试者本发明放射性标记的化合物或包含本发明放射性标记化合物的药物组合物(各自如本文所述)并检测所述受试者中所述本发明放射性标记化合物的步骤。本发明进一步提供使用本发明放射性标记的化合物或包含本发明放射性标记化合物的药物组合物(各自如本文所述)体内检测赘生性组织的方法。因此本发明提供用于早期检测和诊断，以及改善预后策略的更好的工具，和容易地辨别将响应或不响应可用的治疗性治疗的患者。由于本发明化合物检测赘生性组织的能力，本发明进一步提供监测对赘生性组织相关疾病状态的治疗的治疗性响应的方法。
在本发明的优选实施方案中，用于本发明成像方法的本发明放射性标记的化合物，如本文所描述，为放射性标记的式(I)化合物。
在本发明的优选实施方案中，用于本发明成像方法的本发明放射性标记的化合物，如本文所描述，为放射性标记的式(III)化合物。
本领域技术人员将理解的是，成像类型(例如，PET、SPECT)将由放射性同位素的性质决定。例如，如果放射性标记的式(I)化合物包含18F，则其将适于PET成像。
因此，本发明提供体内检测赘生性组织的方法，其包括下列步骤：
i) 给予受试者本发明放射性标记的化合物或包含本发明放射性标记化合物的药物组合物，各自如本文所定义；
ii) 让所述本发明放射性标记的化合物与所述受试者内的赘生性组织结合；
iii) 检测所述结合的本发明放射性标记化合物中的所述放射性同位素发射的信号；
iv) 生成代表所述信号的位置和/或量的图像；和
v) 测定所述受试者内所述赘生性组织的分布和范围。
“给予”本发明放射性标记的化合物的步骤优选胃肠外实施，并且最优选静脉内。静脉内途径是将化合物递送至受试者身体各处的最有效方式。静脉内给予既无显著身体干预，也对受试者无显著健康风险。本发明放射性标记的化合物优选作为如本文所定义的本发明放射性药物组合物给予。本发明成像方法的完全定义不需要给予步骤。由此，本发明成像方法也可理解为包括在已经预先给予本发明放射性标记化合物的受试者中所实施的上述定义的步骤(ii)-(v)。
给予步骤之后和检测步骤之前，让本发明放射性标记的化合物与赘生性组织结合。例如，当受试者为完整的哺乳动物时，本发明放射性标记的化合物将在整个哺乳动物身体中动态移动，与其中的多种组织接触。一旦本发明放射性标记的化合物与赘生性组织接触，则其将与赘生性组织结合。
本发明方法的“检测”步骤涉及借助对本发明放射性标记化合物所包含的放射性同位素发射的信号敏感的检测器(例如PET摄像机)检测所述信号。该检测步骤还可理解为获取信号数据。
本发明方法的“生成”步骤通过计算机实施，计算机将重构算法应用于获取的信号数据，以产生数据集。接着处理该数据集以生成显示放射性同位素所发射信号的位置和/或量的图像。所发射信号与酶或赘生性组织的量直接相关，使得“测定”步骤可通过评估生成的图像进行。
本发明“受试者”可为任何人或动物受试者。本发明受试者优选为哺乳动物。所述受试者最优选为完整的哺乳动物身体体内。在特别优选的实施方案中，本发明受试者为人。
“赘生性组织相关疾病状态”可为赘生性组织存在所造成的任何疾病状态。该疾病状态的实例包括，但不限于，肿瘤、癌症(例如，前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌和结肠癌)。在本发明优选的实施方案中，赘生性组织相关疾病状态为脑癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、前列腺癌或胰腺癌。
本领域技术人员将理解的是，“治疗”将取决于赘生性组织相关疾病状态。例如，当赘生性组织相关疾病状态为癌症时，治疗可包括，但不限于，手术、化学治疗和放射治疗。因此本发明方法可用于监测针对赘生性组织相关疾病状态的治疗的有效性。
除了赘生物，本发明放射性标记化合物还可用于肝疾病、脑病症、肾疾病和正常细胞增殖相关的多种疾病。本发明放射性标记的化合物还可用于炎症成像、炎症过程(包括类风湿性关节炎和膝滑膜炎)成像和心血管疾病(包括动脉粥样硬化斑块)成像。
前体化合物
本发明提供式(II)的前体化合物：
Figure 979360DEST_PATH_IMAGE006
(II)
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢或氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；和
m为1-4的整数。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(II)的化合物，其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8或-CD(R8)2；
R8为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；和
m为1-4的整数。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(II)的化合物，其中：
R1和R2各自为氢；
R3和R4各自为氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8或-CD(R8)2；
R8为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；和
m为1-4的整数。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(II)的化合物，其中：
R1、R2、R3和R4各自为氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8或-CD(R8)2；
R8为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；和
m为1-4的整数。
按照本发明，式(II)化合物是式(IIa)化合物：
Figure 351436DEST_PATH_IMAGE014
(IIa)。
在本发明的一个实施方案中，提供式(IIb)的化合物：
Figure 484477DEST_PATH_IMAGE015
(IIb)
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢或氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；和
m为1-4的整数；和
Pg是羟基保护基。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(IIb)化合物，其中Pg为对甲氧苄基(PMB)、三甲基硅烷基(TMS)或二甲氧三苯甲基(DMTr)基团。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(IIb)化合物，其中Pg为对甲氧苄基(PMB)基团。
在本发明的一个实施方案中，提供式(IIc)化合物：
Figure 600200DEST_PATH_IMAGE006
(IIc)
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢或氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；和
m为1-4的整数；
条件是如果R1、R2、R3和R4各自为氢，则R5、R6和R7各自不为氢；且条件是如果R1、R2、R3和R4各自为氘，则R5、R6和R7各自不为氢。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(IIc)化合物，其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8或-CD(R8)2；
R8为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；和
m为1-4的整数；条件是R5、R6和R7各自不为氢。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(IIc)化合物，其中：
R1、R2、R3和R4各自为氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8或-CD(R8)2；
R8为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；和
m为1-4的整数；条件是R5、R6和R7各自不为氢。
在本发明的一个优选实施方案中，提供式(IIc)化合物，其中：
R1和R2各自为氢；和
R3和R4各自为氘(D)。
式(II)前体化合物，包括式(IIa)、(IIb)和(IIc)化合物，可通过本领域已知的任何方法(包括本文所述方法)制备。例如，式(IIa)化合物可通过二甲胺/THF与2-溴乙醇-1,1,2,2-d4在碳酸钾存在下的烷基化合成，如以下流程1所示：
Figure 502297DEST_PATH_IMAGE016
其中i = K2CO3、THF，50℃，19 h。所需四氘化产物可通过蒸馏纯化。氘氯仿中式(IIa)化合物的1H NMR波谱(图3)只显示N,N-二甲基和醇的羟基相关的峰；未观察到乙醇链的亚甲基的氢相关的峰。与此相一致，13C NMR波谱(图3)显示N,N-二甲基碳相关的大的单峰；然而，60.4 ppm和62.5 ppm处乙醇亚甲基碳的峰在强度上显著降低，提示与共价碳-氢键的存在情况有关的信号增强的缺失。此外，亚甲基峰均分裂成多重峰，表明自旋-自旋耦合。由于13C NMR典型地用1H解耦运行，观察到的多重态必定为碳-氘键合的结果。基于上述观察，认为所需产物的同位素纯度> 98% (2H同位素占优势，相对于1H同位素)。
式(II)前体化合物的二氘化类似物可通过氢化铝锂还原自N,N-二甲基甘氨酸合成，如下列流程2所示：
Figure 45274DEST_PATH_IMAGE017
其中i = LiAlD4、THF，65℃，24 h。13C NMR分析表明可达到同位素纯度大于95% (2H异构体(isomer)占优势，相对于1H同位素)。
根据本发明，式(II)化合物(包括式(IIa)化合物)的羟基可进一步用保护基保护，得到式(IIb)化合物：
Figure 400032DEST_PATH_IMAGE015
(IIb)
其中Pg为本领域已知的任何羟基保护基。优选Pg为任何酸不稳定性羟基保护基，包括，例如，"Protective Groups in Organic Synthesis (有机合成中的保护基)"，第三版，A Wiley Interscience Publication, John Wiley & Sons Inc., Theodora W. Greene和Peter G. M. Wuts, 第17-200页中所述的羟基保护基。优选Pg为对甲氧苄基(PMB)、三甲基硅烷基(TMS)或二甲氧三苯甲基(DMTr)。更优选Pg为对甲氧苄基(PMB)。
[ 18 F]氟甲基-[1,2- 2 H 4 ]胆碱(D4-FCH)的验证
使用[18F]氟甲基胆碱作为标准品在体外化学和酶促模型中评估对同位素取代导致的氧化的稳定性。然后在体内模型中评估[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱并与[11C]胆碱、[18F]氟甲基胆碱和[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱比较：
高锰酸钾氧化研究
氘取代对键强度的作用最初通过使用高锰酸钾评估[18F]氟甲基胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱的化学氧化模式进行测试。以下流程6详述了室温下碱催化的[18F]氟甲基胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱的高锰酸钾氧化，在预先选择的时间点取出等分试样并通过放射性HPLC分析：
Figure 13733DEST_PATH_IMAGE019
试剂和条件： i) KMnO4，Na2CO3，H2O，室温。
结果在图6和7中概述。放射性HPLC色谱图(图6)显示对于[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱在20分钟时保留较大比例的母体化合物。图7中的图示进一步显示氘化类似物[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱的显著同位素效应，且用高锰酸钾处理1小时后接近80%的母体化合物仍然存在，与此相比，在相同的时间点少于40%的母体化合物[18F]氟甲基胆碱仍然存在。
胆碱氧化酶模型
在胆碱氧化酶模型中评估了[18F]氟甲基胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(Roivainen, A., 等, European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32)。图8中的图示清楚地显示，在酶促氧化模型中，氘化化合物明显比相应的非氘化化合物更稳定。在60分钟时间点，胆碱物类的放射性HPLC分布显示，对于[18F]氟甲基胆碱，母体放射性示踪剂以11±8%的水平存在；60分钟时存在的相应母体氘化放射性示踪剂[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱为29±4%。相关的放射性HPLC色谱图在图9中示出，并进一步例示了[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱相对于[18F]氟甲基胆碱增加的氧化稳定性。这些放射性HPLC色谱图包含第三个峰，标记为“未知”，推测其为中间氧化产物，甜菜醛。
体内稳定性分析
[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱在体内更抗氧化。静脉内(i.v.)给予放射性示踪剂后通过高效液相色谱(HPLC)评估小鼠血浆中两种同位素放射性标记的胆碱物类，[18F]氟甲基胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱与其各自的代谢物，[18F]氟甲基胆碱-甜菜碱([18F]-FCH-甜菜碱)和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱-甜菜碱([18F]-D4-FCH-甜菜碱)的相对氧化比率。发现[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱显著比[18F]氟甲基胆碱对氧化更稳定。如图10所示，[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱显著比[18F]氟甲基胆碱更稳定—静脉内注射入小鼠后15分钟时[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱至[18F]-D4-FCH-甜菜碱40%的转化率，相对于[18F]氟甲基胆碱至[18F]-FCH-甜菜碱80%的转化率。体内氧化的时程在图10中示出，显示[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱相对于[18F]氟甲基胆碱整体提高的稳定性。
生物分布
时程生物分布
时程生物分布针对[18F]氟甲基胆碱、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱在荷HCT116人结肠异种移植物的裸鼠中实施。注射后2、30和60分钟收集组织，数据在图11 A-C中概述。[18F]氟甲基胆碱的摄取值与较早研究(DeGrado, T.R., 等, "Synthesis and Evaluation of 18F-labeled Choline as an Oncologic Tracer for Positron Emisson Tomography: Initial Findings in Prostate Cancer (作为正电子发射断层扫描的肿瘤学示踪剂的18F标记胆碱的合成和评估：在前列腺癌中的初期发现)", Cancer Research 2000; 61:110-7)大体一致。摄取概况的比较显示对于氘化化合物[18F]氟甲基-[1-2H2]-胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱，心脏、肺和肝中放射性示踪剂摄取减少。三种放射性示踪剂的肿瘤摄取概况在图11D中示出，显示在所有时间点氘化化合物相对于[18F]氟甲基胆碱的放射性示踪剂的定位增加。在稍后的时间点肿瘤摄取[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱的显著增加是显然的。
胆碱代谢物的分布
通过HPLC还实现了组织(包括肝、肾和肿瘤)的代谢物分析。[18F]FCH和[18F]D4-FCH及其各自的代谢物在组织中的典型HPLC色谱图在图12中示出。代谢物的肿瘤分布以相似的方式分析(图13)。胆碱及其代谢物缺乏允许不带放射性的未标记化合物的色谱图与放射性色谱图同时呈现的任何UV发色团。因此，代谢物的存在情况通过其它化学或生物方法验证。值得注意的是，对于代谢物的表征使用相同的色谱条件，并且保留时间相似。磷酸胆碱峰的识别(identity)通过用碱性磷酸酶孵育未处理HCT116肿瘤细胞中形成的推定的磷酸胆碱以生物化学方式确认(图14)。
对于[18F]FCH和[18F]D4-FCH二者，注射后30分钟时高比例的肝放射性作为磷酸胆碱存在(图12)。在[18F]D4-FCH处理小鼠的肝(7.4 ± 2.3%)和肾(8.8 ± 0.2%)样品中均观察到未知的代谢物(可能是醛中间体)。相比之下，该未知代谢物未在[18F]FCH处理小鼠的肝样品中发现，并且在肾样品中仅较小程度(3.3 ± 0.6%)地存在。值得注意的是，与[18F]FCH的31.8 ± 9.8%相比，60.6 ± 3.7%的[18F]D4-FCH来源的肾放射性为磷酸胆碱(P = 0.03)。相反地，肾中大部分的[18F]FCH-来源的放射性为[18F]FCH-甜菜碱形式；与[18F]D4-FCH的20.6 ± 6.2%相比，为53.5 ± 5.3% (图12)。可论证的是，血浆中的甜菜碱水平反映组织例如肝和肾中的水平。与肝和肾相比，肿瘤显示不同的HPLC概况；分析肿瘤样品获得的典型放射性HPLC色谱图(静脉内注射[18F]FCH、[18F]D4-FCH和[11C]胆碱后30分钟)在图12中示出。在肿瘤中，就[18F]D4-FCH而言放射性主要为磷酸胆碱形式(图13)。相比之下，[18F]FCH显示显著水平的[18F]FCH-甜菜碱。在后期成像的情况下，这些结果表明[18F]D4-FCH将是用于PET成像的优良的放射性示踪剂，且其摄取概况较易阐明。
本发明多个方面中存在的任何特征的合适和优选方面如本文对其进行描述的第一方面中对所述特征所定义。本发明现在通过一系列非限制性实施例说明。
同位素碳胆碱类似物
本发明提供如本文所描述的式(III)化合物。如本文所描述的，这样的化合物可用作肿瘤成像的PET成像剂。特别地，本文所述式(III)化合物可不以尿排泄，因此提供骨盆恶性肿瘤(pelvic malignancies)例如前列腺癌的更特异性成像。
本发明提供制备式(III)化合物的方法，其中所述方法包括使式(II)前体化合物与式(IV)化合物反应以形成式(III)化合物(流程A)：
Figure 727611DEST_PATH_IMAGE020
其中式(II)和(III)化合物各自如本文所描述，式(IV)化合物如下：
Figure 835244DEST_PATH_IMAGE021
其中C*、X、Y和Z各自如本文中对于式(III)化合物所定义，且“Lg”为离去基团。“Lg”的合适实例包括，但不限于，溴(Br)和甲苯磺酸根(OTos)。式(IV)化合物可通过包括本文所述方法在内的本领域已知的任何方法制备(例如，类似于实施例5和7)。
实施例
试剂和溶剂购自Sigma-Aldrich (Gillingham, UK)，并且不经进一步纯化使用。氟甲基胆碱氯化物(参照标准)购自ABCR Gmbh & Co. (Karlsruhe, Germany)。等渗盐水(0.9 % w/v)购自Hameln Pharmaceuticals (Gloucester, UK)。NMR谱使用在400 MHz (1H NMR)和100 MHz (13C NMR)或600 MHz (1H NMR)和150 MHz (13C NMR)运行的Bruker Avance NMR机器获得。精确的质谱分析在Waters Micromass LCT Premier机器上以正电子电离(EI)或化学电离(CI)模式实施。蒸馏使用Büchi B-585玻璃烘箱(glass oven)(Büchi, Switzerland)进行。
实施例1：N,N-二甲基-[1,2-2H4]-乙醇胺(3)的制备
Figure 230454DEST_PATH_IMAGE022
向K2CO3 (10.50 g，76 mmol)的干THF(10 mL)混悬液中加入二甲胺(2.0 M，在THF中) (38 mL，76 mmol)，接着加入2-溴乙醇-1,1,2,2-d4 (4.90 g, 38 mmol)，将此混悬液在氩气下加热至50℃。19 h后，薄层色谱(TLC)(乙酸乙酯/氧化铝/I2)表明(2)完全转化，让反应混合物冷却至环境温度并过滤。然后减压除去大部分溶剂。蒸馏得到作为无色液体的所需产物(3)，b.p. 78°C/88毫巴 (1.93 g, 55%).1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.40 (s, 1H, OH), 2.24 (s, 6H, N(CH 3)2).13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 62.6 (NCD2 CD2OH), 60.4 (NCD2CD2OH), 47.7 (N(CH3)2)。HRMS (EI) = 93.1093 (M+).C4H7 2H4NO需要93.1092。
实施例2：N,N-二甲基-[1-2H2]-乙醇胺(5)的制备
Figure 841564DEST_PATH_IMAGE023
向N,N-二甲基甘氨酸(0.52 g，5 mmol)的干THF(10 mL)混悬液中加入氘化锂铝(0.53 g，12.5 mmol)，所得混悬液在氩气下回流。24 h后让该混悬液冷却至环境温度并倒在sat. aq. Na2SO4 (15 mL)上，用1 M Na2CO3调节至pH 8，然后用乙醚(3 × 10 mL)洗涤并干燥(Na2SO4)。蒸馏得到作为无色液体的所需产物(5)，b.p. 65°C/26毫巴 (0.06 g, 13%). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.43 (s, 2H, NCH 2CD2), 2.25 (s, 6H, N(CH 3)2), 1.43 (s, 1H, OH). 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 63.7 (NCH2CD2OH), 57.8 (NCH2 CD2OH), 45.7 (N(CH3)2).
实施例3：氟甲基甲苯磺酸盐(8)的制备
Figure 991922DEST_PATH_IMAGE024
根据已建立的文献程序制备亚甲基二甲苯磺酸盐(7)，且分析数据与所报道值一致(Emmons, W.D., 等, Journal of the American Chemical Society, 1953; 75:2257;和Neal, T.R., 等, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 2005; 48:557-68)。
向亚甲基二甲苯磺酸盐(7) (0.67 g, 1.89 mmol)的干乙腈(10 mL)溶液中加入Kryptofix K222 [4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六烷] (1.00 g，2.65 mmol)，接着加入氟化钾(0.16 g，2.83 mmol)。然后将混悬液在氮气下加热至110℃。1 h后TLC (7:3 己烷/乙酸乙酯/二氧化硅/UV254)表明(7)完全转化。反应混合物用乙酸乙酯(25 mL)稀释，用水(2 × 15 mL)洗涤并经MgSO4干燥。色谱法(5 → 10%乙酸乙酯/己烷)得到作为无色油的所需产物(8) (40 mg, 11%)。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.86 (d, 2H, J = 8 Hz, 芳基CH), 7.39 (d, 2 H, J = 8 Hz, 芳基CH), 5.77 (d, 1 H, J = 52 Hz, CH2F), 2.49 (s, 3H, 甲苯基CH3). 13C NMR (CDCl3) δ 145.6 (芳基), 133.8 (芳基), 129.9 (芳基), 127.9 (芳基), 98.1 (d, J = 229 Hz, CH2F), 21.7 (甲苯基CH3). HRMS (CI) = 222.0604 (M + NH4)+. 对于C8H13FNO3S计算值为222.0600.
实施例4：N,N-二甲基乙醇胺(O-4-甲氧苄基)醚(O-PMB-DMEA)的制备
Figure 321272DEST_PATH_IMAGE025
向干燥烧瓶中加入二甲基乙醇胺(4.46 g，50 mmol)和干DMF (50 mL)。在氩气下搅拌该溶液并冰浴冷却。然后在10分钟内分批加入氢化钠(2.0 g，50 mmol)，然后让反应混合物温热至室温。30分钟后在10分钟内逐滴加入4-甲氧苄基氯(3.92 g, 25 mmol)，并将所得混合物在氩气下搅拌。60 h后GC-MS表明反应完全(4-甲氧苄基氯消失)，将反应混合物倒在1 M氢氧化钠(100 mL)上，并用二氯甲烷(DCM)(3 x 30 mL)萃取，然后干燥(Na2SO4)。柱色谱法(0→10%甲醇/DCM；中性二氧化硅)得到作为黄色油的所需产物(O-PMB-DMEA) (1.46 g, 28 %)。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.28 (d, 2H, J = 8.6 Hz, 芳基CH), 6.89 (d, 2H, J = 8.6 Hz, 芳基CH), 4.49 (s, 2H, -CH2-), 3.81 (s, 3H, OCH3), 3.54 (t, 2H, J = 5.8, NCH2CH 2O), 2.54 (t, 2H, J = 5.8, NCH 2CH2O), 2.28 (s, 6H, N(CH3)2). HRMS (ES) = 210.1497 (M+H+). C12H20NO2需要210.1494.
实施例4a：N,N-二甲基乙醇胺(O-4-甲氧苄基)醚(O-PMB-DMEA)的氘化类似物的制备
N,N-二甲基乙醇胺(O-4-甲氧苄基)醚的二-和四-氘化类似物可根据实施例4从适当的二-或四-氘化二甲基乙醇胺制备。
实施例5：[18F]氟甲基甲苯磺酸盐(9)合成的制备
向含有K2CO3 (0.5 mg，3.6 μmol，溶解在100 μL水中)、18-冠醚-6 (10.3 mg，39 μmol)和乙腈(500 μL)混合物的Wheaton小瓶中加入[18F]氟化物(约20 mCi/100 μL水)。然后在氮气流(100 mL/min)下于110℃除去溶剂。然后，加入乙腈(500 μL)并继续蒸馏至干燥。重复该程序两次。然后在环境温度下加入包含3%水的乙腈(250 μL)中的亚甲基二甲苯磺酸盐(7) (6.4 mg, 18 μmol)溶液，接着100℃加热10-15分钟，并通过分析型放射性HPLC监测。通过加入1:1 乙腈/水(1.3 mL)淬灭反应，并通过半制备型放射性HPLC纯化。收集包含[18F]氟甲基甲苯磺酸盐(9)的洗脱液级分并用水稀释至终体积20 mL，然后固定化在Sep Pak C18 light 柱 (Waters, Milford, MA, USA) (用DMF (5 mL)和水(10 mL)预处理)上。进一步用水(5 mL)洗涤柱，然后将保留[18F]氟甲基甲苯磺酸盐(9)的柱在氮气流中干燥20分钟。[18F](13)合成的典型HPLC反应概况在下图4A/4B中示出。
实施例6：通过与[18F]氟溴甲烷反应放射性合成[18F]氟甲基胆碱衍生物
Figure 985789DEST_PATH_IMAGE027
将[18F]氟溴甲烷(根据Bergman等(Appl Radiat Isot 2001;54(6):927-33)制备)加入包含胺前体N,N-二甲基乙醇胺(150 μL)或N,N-二甲基-[1,2-2H4]乙醇胺(3) (150 μL)/干乙腈 (1 mL) (预冷至0℃)的Wheaton小瓶中。将该小瓶封口然后加热至100℃ 10分钟。然后在氮气流下除去大部分溶剂，接着将剩余样品重新溶解在5%乙醇/水(10 mL)中，并固定化在Sep-Pak CM light柱(Waters, Milford, MA, USA) (用2 M HCl (5 mL)和水(10 mL)预处理)上，以实现氯阴离子交换。然后用乙醇(10 mL)和水(10 mL)洗涤柱子，接着使用盐水(0.5-2.0 mL)洗脱放射性示踪剂(11a)或(11c)并通过无菌滤器(0.2 μm) (Sartorius, Goettingen, Germany)。
实施例7：通过与[18F]氟甲基甲基甲苯磺酸盐反应放射性合成[18F]氟甲基胆碱、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱
Figure 244732DEST_PATH_IMAGE028
将(根据实施例5制备)并使用干DMF(300 μL)从Sep-Pak柱洗脱的[18F]氟甲基甲苯磺酸盐(9)加入到包含一种下列前体的Wheaton小瓶中：N,N-二甲基乙醇胺(150 μL)、N,N-二甲基-[1,2-2H4]乙醇胺(3) (150 μL) (根据实施例1制备)或N,N-二甲基-[1-2H2]乙醇胺(5)(150 μL) (根据实施例2制备)，并边搅拌边加热至100℃。20分钟后用水(10 mL)淬灭反应并固定化在Sep Pak CM light 柱 (Waters) (用2 M HCl (5 mL)和水(10 mL)预处理)上，以便实现氯阴离子交换，然后用乙醇(5 mL)和水(10 mL)洗涤，接着用等渗盐水(0.5-1.0 mL)洗脱放射性示踪剂[18F]氟甲基胆碱(12a)、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱(12b)或[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱[18F] (12c)。
实施例8：无放射性的氟甲基甲苯磺酸盐(15)的合成
Figure 999061DEST_PATH_IMAGE029
I：对甲苯磺酸银、MeCN，回流，20 h；
Ii：KF、MeCN，回流，1 h。
根据以上流程3：
(a)亚甲基二甲苯磺酸盐(14)的合成
使用Emmons和Ferris的方法，将可市售获得的二碘甲烷(13) (2.67 g，10 mmol)与甲苯磺酸银(6.14 g，22 mmol)反应，产生亚甲基二甲苯磺酸盐(10)，得率28% (Emmons, W.D., 等, "Metathetical Reactions of Silver Salts in Solution. II. The Synthesis of Alkyl Sulfonates (溶液中银盐的复分解反应。II. 烷基磺酸盐的合成)", Journal of the American Chemical Society, 1953; 75:225)。
(b)无放射性的氟甲基甲苯磺酸盐(15)的合成
氟甲基甲苯磺酸盐(11) (0.04g)如下制备：使用乙腈 (10 mL)中的氟化钾(0.16 g, 2.83 mmol)/Kryptofix K222 (1.0 g, 2.65 mmol)在80℃亲核取代实施例3(a)的亚甲基二甲苯磺酸盐(10) (0.67 g, 1.89 mmol)，以11%的得率产生所需产物。
实施例9：[18F]氟溴甲烷(17)的合成
Figure 798390DEST_PATH_IMAGE030
改编Bergman等(Appl Radiat Isot 2001;54(6):927-33)的方法，将可市售获得的二溴甲烷(16)与乙腈中的[18F]氟化钾/Kryptofix K222在110℃反应，以产生所需的[18F]氟溴甲烷(17)，[18F]氟溴甲烷(17)通过气相色谱法纯化并通过洗脱到包含乙腈和相关胆碱前体的预冷小瓶中截留。
实施例10：放射化学纯度分析
[18F]氟甲基胆碱、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱[18F]的放射化学纯度通过与可市售获得的氟氯化胆碱标准品共洗脱确认。使用装备有Agilent G1362A折射率检测器(RID)和Bioscan Flowcount FC-3400 PIN二极管检测器的Agilent 1100 series HPLC系统。色谱分离在反相柱(150 mm × 4.6 mm)和包含5 mM庚烷磺酸与乙腈(90:10 v/v)的以流速1.0 mL/min递送的流动相上实施。
实施例11：使用胆碱氧化酶的酶促氧化研究
本方法改编自Roivannen等的方法(Roivainen, A., 等, European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32)。将[18F]氟甲基胆碱或[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱[18F]的等分试样(100 μL，约3.7 MBq)加入包含水(1.9 mL)的小瓶中，以得到原液。将包含胆碱氧化酶(0.05个单位/uL)的磷酸钠缓冲液(0.1 M，pH 7) (10 uL)加入至原液的等分试样(190 uL)中，然后使小瓶处于室温，并不时搅动。在选择的时间点(5、20、40和60分钟)用HPLC流动相(缓冲液A，1.1 mL)稀释样品，过滤(0.22 μm滤器)，然后将约1 mL经由1 mL样品环路注射入HPLC用于分析。色谱分离在Waters C18 Bondapak (7.8 × 300 mm)柱(Waters, Milford, Massachusetts, USA)上以3 mL/分钟实施，且流动相具有缓冲液A (包含乙腈、乙醇、乙酸、1.0 mol/L乙酸铵、水和0.1 mol/L磷酸钠(800:68:2:3:127:10 [v/v]))和缓冲液B(包含相同的组分，但比例不同(400:68:44:88:400:10 [v/v]))。梯度程序包括：100%缓冲液A 6分钟，0-100%缓冲液B 10分钟，100-0% B 2分钟，接着0% B 2分钟。
实施例12：生物分布
人结肠(HCT116)肿瘤如先前所报道(Leyton, J., 等, Cancer Research 2005; 65(10):4202-10)在雄性C3H-Hej小鼠(Harlan, Bicester, United Kingdom)中生长。肿瘤尺寸使用测径器连续测量，肿瘤体积通过如下公式计算：体积= (π/6) × a × b × c，其中a、b和c代表肿瘤的三个相互垂直的轴。小鼠在其肿瘤达到约100 mm3时使用。[18F]氟甲基胆碱、[18F]氟甲基-[1-2H2]胆碱和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱(约3.7 MBq)各自经由尾静脉注射入清醒的未处理荷瘤小鼠中。注射放射性示踪剂后在预定的时间点(2, 30和60分钟)在终端麻醉下处死小鼠以获得血液、血浆、肿瘤、心脏、肺、肝、肾和肌肉。组织放射性在γ计数器(Cobra II Auto-Gamma counter, Packard Biosciences Co, Pangbourne, UK)上测定并进行衰变校正。数据作为注射剂量百分数/克组织表述。
实施例13：[18F]氟甲基胆碱([18F]FCH)和[18F]氟甲基-[1,2-2H4]胆碱([18F]D4-FCH)在体内的氧化电位
[18F]FCH或[18F](D4-FCH) (80-100 μCi)经由尾静脉注射入麻醉的非荷瘤C3H-Hej小鼠中；使用异氟烷/O2/N2O麻醉。注射后2、15、30和60分钟获得的血浆样品在液氮中速冻并-80℃保存。对于分析，将样品融化并保持在4℃。向约0.2 mL血浆中加入冰冷乙腈(1.5 mL)。然后将混合物离心(3分钟，15,493 × g；4℃)。上清液使用旋转蒸发仪(Heidoloph instruments GMBH & C0, Schwabach, Germany)在45℃浴温度下蒸发至干燥。将残留物悬浮在流动相(1.1 mL)中，使其澄清(0.2 μm滤器)并通过HPLC分析。肝样品在冰冷乙腈(1.5 mL)中匀浆化，随后按照血浆样品处理。所有样品在装备有γ-RAM Model 3放射检测器(IN/US Systems inc., FL, USA)的Agilent 1100 series HPLC系统上分析。分析基于Roivannen (Roivainen, A., 等, European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32)的方法，使用Phenomenex Luna SCX柱(10μ，250 × 4.6 mm)和包含0.25 M磷酸二氢钠(pH 4.8)和乙腈(90:10 v/v)的流动相，以流速2 ml/分钟递送。
实施例14：胆碱代谢物的分布
肝、肾和肿瘤样品在30分钟时获得。所有样品在液氮中速冻。对于分析，样品在临用前融化并保持在4℃。向约0.2 mL血浆中加入冰冷甲醇(1.5 mL)。然后将混合物离心(3分钟，15,493 x g，4℃)。上清液使用旋转蒸发仪(Heidoloph Instruments)在40℃浴温度下蒸发至干燥。残留物悬浮在流动相(1.1 mL)中，使其澄清(0.2 Am滤器)并通过HPLC分析。肝、肾和肿瘤样品使用IKA Ultra-Turrax T-25匀浆器在冰冷甲醇(1.5 mL)中匀浆化，随后按照血浆样品(上文)处理。所有样品通过放射性HPLC在装备有γ-RAM Model 3 γ-检测器(IN/US系统)和Laura 3软件(Lablogic)的Agilent 1100 series HPLC系统(Agilent Technologies)上分析。固定相包括Waters μBondapak C18反相柱(300 × 7.8 mm)(Waters, Milford, MA, USA)。样品使用包含溶剂A(乙腈/水/乙醇/乙酸/1.0 mol/L乙酸铵/0.1mol/L磷酸钠；800/127/68/2/3/10)和溶剂B(乙腈/水/乙醇/乙酸/1.0 mol/L乙酸铵/0.1 mol/L磷酸钠；400/400/68/44/88/10)的流动相以如下梯度分析：0% B 6分钟，然后0 → 100% B 10分钟，100% B 0.5分钟，100→0% B 1.5分钟，然后0% B 2分钟，以流速3 mL/分钟递送。
实施例15：HCT116肿瘤细胞对[18F]D4-FCH和[18F]FCH的代谢
HCT116细胞在T150烧瓶中生长，一式三份，直至其70%汇合，然后用溶媒(生长培养基中的1% DMSO)或溶媒中的1 μmol/L PD0325901处理24 h。细胞用1.1 MBq的[18F]D4-FCH或[18F]FCH脉冲1 h。细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次，刮入5 mL PBS中，并500 × g离心3分钟，然后在2 mL冰冷的甲醇中重悬用于HPLC分析，如上文针对组织样品所述。为了提供5’-磷酸盐为HPLC色谱图上鉴别的峰的生物化学证据，如先前所述(Barthel, H., 等, Cancer Res 2003; 63(13):3791-8)用碱性磷酸酶处理培养的细胞。简言之，HCT116细胞在100 mm皿中一式三份生长，用5.0 MBq [18F]FCH 37℃孵育60分钟以形成推定的[18F]FCH-磷酸盐。细胞用5 mL冰冷PBS洗涤两次，然后刮下，在750 × g(4℃，3分钟) (在5 mL PBS中)离心。将细胞在1 mL包含50% (v/v)甘油、0.5mmol/L MgCl2和0.5mmol/L ZnCl2的5 mmol/L Tris- HCl (pH 7.4)中匀浆化，并用10单位细菌(III型)碱性磷酸酶(Sigma)在振摇的水浴中37℃孵育30分钟，以使[18F]FCH-磷酸盐去磷酸化。反应通过加入冰冷甲醇终止。样品按照上述血浆处理并通过放射性HPLC分析。
对照实验不使用碱性磷酸酶进行。
实施例16：小动物PET成像
PET成像研究。动态[18F]FCH和[18F]D4-FCH成像扫描在专用的小动物PET扫描仪，quad-HIDAC (Oxford正电子系统)上实施。该仪器的特征先前已描述(Barthel, H., 等, Cancer Res 2003; 63(13):3791-8)。对于尾静脉扫描，诱导麻醉(异氟烷/O2/N2O)后将导管插入溶媒-或药物-处理的小鼠中。将动物放置在恒温控制的夹具(校准以提供约37℃的直肠温度)中，俯卧放置在扫描仪中。经由尾静脉插管注射[18F]FCH或[18F]D4-FCH (2.96-3.7 MBq)并开始扫描。动态扫描以列表模式形式在60分钟期间内如先前所报道(Leyton, J., 等, Cancer Research 2006; 66(15):7621-9)获得。获得的数据被分成0.5 mm弦图箱(sinogram bins)和19 时帧(0.5 × 0.5 × 0.5 mm 体素；4 × 15，4 × 60和11 × 300 s)用于图像重建，这通过使用二维Hamming滤波器(截断值(cutoff) 0.6)滤过反向投影进行。图像数据集使用Analyze软件(版本6.0；Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic)可视化。30-60分钟动态数据的累积图像用于使放射性示踪剂摄取可视化并绘出目标区域。目标区域在五个临近肿瘤区域(每个0.5 mm厚)手动定义。将这些切片的动态数据对于各组织(肝、肾、肌肉、尿和肿瘤)和在各19个时间点平均化，以获得时间相对于放射性的曲线。代表注射放射性的相应全身时间相对于放射性的曲线通过将所有200 × 160 × 160重建体素中的放射性加在一起获得。肿瘤放射性标准化为全身放射性，并作为百分比注射剂量/体素(%ID/vox)表述。60分钟时的标准化放射性示踪剂摄取(%ID/vox60)用于后来的比较。五个肿瘤切片中的标准化最大体素强度%IDvox60max的平均值也用于比较以说明肿瘤异质性和肿瘤坏死区域的存在。曲线下面积计算为%ID/vox从0-60分钟的积分。
实施例17：小鼠中PD0325901处理的作用
大小匹配的荷HCT116肿瘤的小鼠通过口服强饲溶媒(0.5%羟丙基甲基纤维素 + 0.2%吐温80)或25 mg/kg (0.005 mL/g小鼠)制备于溶媒中的促有丝分裂胞外激酶抑制剂PD0325901，随机接受每日处理。[18F]D4-FCH-PET扫描在10个每日处理后进行，扫描前1 h给予最后剂量。成像后，将肿瘤在液氮中速冻，并保存在约80℃用于分析胆碱激酶A表达。结果在图18和19中说明。
其例示了[18F]D4-FCH-PET作为药物反应早期生物标志的应用。大部分当前开发的用于癌症的药物靶向细胞增殖或存活涉及的关键激酶。本实施例显示在肿瘤萎缩不显著的异种移植物模型中，MEK抑制剂PD0325901对生长因子受体-Ras-MAP激酶通路的抑制导致预示通路抑制的肿瘤[18F]D4-FCH摄取的显著降低。该图还显示[18F]D4-FCH摄取的抑制至少部分由胆碱激酶活性的抑制所致。
实施例18：[18F]FCH和[18F]D4-FCH用于成像的比较
如图16中所说明，[18F]FCH和[18F]D4-FCH均迅速摄入组织并保留。组织放射性以下列顺序增加：肌肉 < 尿 <肾< 肝。鉴于在肝中磷酸化相对氧化的优势(图12)，总体肝放射性水平在两种放射性示踪剂之间仅发现很小差异。注射[18F]D4-FCH或[18F]FCH后60分钟的肝放射水平，%ID/vox60，分别为20.92 ± 4.24和18.75 ± 4.28 (图16)。这也与注射[18F]D4-FCH的甜菜碱比注射[18F]FCH的甜菜碱水平低(图12)一致。因此，通过PET (缺乏化学拆分)测定的肝中两种放射性示踪剂的药代动力学相似。与[18F]FCH相比的[18F]D4-FCH的肾放射水平较低(图16)，另一方面，反映[18F]D4-FCH在肾中的氧化电位较低。[18F]FCH和[18F]D4-FCH的%ID/vox60在肾中分别为15.97 ± 4.65和 7.59 ± 3.91 (图16)。放射性示踪剂之间的尿排泄相似。在膀胱上描绘的目标区域(ROI)显示[18F]D4-FCH和[18F]FCH的%ID/vox60值分别为5.20 ± 1.71和6.70 ± 0.71。尿代谢物主要包含未代谢的放射性示踪剂。肌肉显示在任何组织中最低的放射性示踪剂水平。
尽管相对高的[18F]D4-FCH全身稳定性和高比例的磷酸胆碱代谢物，通过PET观察到注射[18F]D4-FCH的小鼠中肿瘤放射性示踪剂的摄取比[18F]FCH组高。图17显示典型的(0.5 mm)横向PET图像切片，证明[18F]FCH和[18F]D4-FCH在人黑素瘤SKMEL-28 异种移植物中累积。在该小鼠模型中，与[18F]FCH图像相比，[18F]D4-FCH PET图像的信号与背景对比在定性上优良。两种放射性示踪剂具有通过PET检测到的相似的肿瘤动力学概况(图17)。动力学通过快速肿瘤流入表征，且峰放射性在约1分钟时(图17)。然后肿瘤水平保持平衡，直至约5分钟，随后为平稳时期。[18F]D4-FCH的递送和保留在数量上高于FCH的递送和保留(图17)。[18F]D4-FCH和[18F]FCH的%ID/vox60分别为7.43 ± 0.47和5.50 ± 0.49 (P=0.04)。由于肿瘤常常与异质的细胞群体一起存在，利用另一种可能对实验干扰(experimental noise)较不敏感的成像变量—5个切片的最大像素%ID/vox60 (%IDvox60max)的平均值。对于[18F]D4-FCH该变量也显著较高(P=0.05；图17)。此外，对于D4-FCH小鼠，时间相对于放射性的曲线下方的肿瘤面积(AUC)比FCH高(P =0.02)。尽管选择30分钟时间点用于更详细地分析组织样品，但与[18F]FCH相比，对于[18F]D4-FCH，血浆中母体化合物的百分比在较早的时间点始终较高。关于成像，两种放射性示踪剂的肿瘤摄取在早期(15分钟)和晚期(60分钟)时间点相似(补充表1)。较早的时间点可适合骨盆成像。
实施例19：对治疗反应的成像
已经证实对于体内研究[18F]D4-FCH是更稳定的氟化胆碱类似物，研究了该放射性示踪剂测量治疗反应的用途。这些研究在可再现的肿瘤模型系统(其中治疗结果已预先表征)，即，用PD0325901每日处理(达10天)的人结肠癌异种移植物HCT116中实施(Leyton, J., 等, "Noninvasive imaging of cell proliferation following mitogenic extracellular kinase inhibition by PD0325901 (PD0325901抑制促有丝分裂胞外激酶后细胞增殖的非侵袭性成像)", Mol Cancer Ther 2008; 7(9):3112-21)。药物处理导致肿瘤停滞(与预处理组相比在第10天肿瘤大小仅减少12.2%)；溶媒处理小鼠的肿瘤增加375%。PD0325901处理的小鼠中的肿瘤[18F]D4-FCH水平约在与溶媒处理小鼠相同的时间出现峰值；然而，经处理肿瘤中的放射性示踪剂保留显著降低(图18)。药物处理10天后所有成像变量减小(P=0.05，图18)。这表明[18F]D4-FCH可用于在甚至未发现肿瘤大小减少有大的改变的情况下检测治疗反应(Leyton, J., 等, "Noninvasive imaging of cell proliferation following mitogenic extracellular kinase inhibition by PD0325901 (PD0325901抑制促有丝分裂胞外激酶后细胞增殖的非侵袭性成像)", Mol Cancer Ther 2008; 7(9):3112-21)。为了解生物标志的变化，PD0325901对D4-FCH-磷酸胆碱形成的内在细胞作用通过用PD0325901处理指数生长的培养中的HCT116细胞24 h并测量60分钟的体外[18F]D4-FCH摄取来检查。如图18所示，在药物处理的细胞中PD0325901显著抑制[18F]D4-FCH磷酸胆碱形成，证明药物在肿瘤中的作用可能是由于对胆碱代谢的细胞作用而非血液动力学作用。
为进一步了解调控用药物处理的[18F]D4-FCH摄取的机制，评估PET扫描后切除的PD0325901和溶媒处理的肿瘤中CHKA表达的变化。PD0325901处理后的第10天看到体内CHKA蛋白表达显著降低(P=0.03) (图19)，表明药物处理的肿瘤中CHKA表达降低导致较低的D[18F]4-FCH摄取。药物诱导的CHKA表达降低还发生在体外PD0325901处理的指数生长的细胞中。
实施例20：统计
统计学分析使用软件GraphPad Prism第4版(GraphPad)进行。组间的比较使用非参数Mann-Whitney检验进行。认为双尾P ≤ 0.05是显著的。
实施例21
材料与方法
细胞系
使HCT116 (LGC Standards，Teddington，Middlesex，UK)和PC3-M细胞(Dr Matthew Caley捐赠，胰腺癌转移团队(Prostate Cancer Metastasis Team)，Imperial College London，UK)在补充10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U.mL?1青霉素和100 μg.mL?1链霉素(Invitrogen，Paisley，Refrewshire，UK)的RPMI 1640培养基中生长。使A375细胞(Eyal Gottlieb教授捐赠，Beatson Institute for Cancer Research，Glasgow，UK)在补充10%胎牛血清、2 mm l-谷氨酰胺、100 U.mL?1青霉素和100 μg.mL?1链霉素(Invitrogen，Paisley，Refrewshire，UK)的高葡萄糖(4.5 g/L) DMEM培养基中生长。将所有细胞保持在37℃、含有5% CO2的潮湿气氛下。
蛋白质印迹
采用标准技术进行蛋白质印迹法。收获细胞，在RIPA缓冲液(Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL，USA)中裂解。膜使用兔抗人胆碱激酶α多克隆抗体(Sigma-Aldrich Co. Ltd，Poole，Dorset，UK；1:500)探测。兔抗肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich Co. Ltd，Poole，Dorset，UK；1:5000)用作加样对照，而过氧化物酶缀合的驴抗兔IgG抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA，USA；1:2500)用作第二抗体。使用Amersham ECL试剂盒(GE Healthcare，Chalfont St Giles，Bucks，UK)使蛋白质显现。对印迹进行扫描(Bio-Rad GS-800标准化光密度计；Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，使用扫描分析软件(Quantity One；Bio-Rad)，通过光密度测定法进行信号量化。
对于肿瘤胆碱激酶表达的分析，切割约100 mm3的肿瘤，置于Precellys 24裂解试剂盒2 mL管(Bertin Technoologies，Montigny-le-Bretonneux，France)中，管中装有1.4 mm陶瓷珠，并在液氮中速冻。对于匀浆化，将1 mL RIPA缓冲液加入裂解试剂盒管中，将其在Precellys 24匀浆器中匀浆化(6500 RPM；2 x 17 s，以20 s间隔)。通过离心除去细胞碎片后，如上所述进行蛋白质印迹法。
体外18F-D4-胆碱摄取
分析前夜，将细胞(5 x 105)铺板在6孔板中。实验当天，将含有40 μCi 18F-D4-胆碱的新鲜生长培养基加入各孔中。在5% CO2的潮湿气氛中于37℃孵育60分钟后，测量细胞摄取。随后将板置于冰上，用冰冷的PBS洗涤3次，并在RIPA缓冲液(Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL，USA；1 mL，10分钟)裂解。将细胞裂解物转移到计数管中，在γ计数器(Cobra II Auto-Gamma计数器，Packard Biosciences Co，Pangbourne，UK)中测定衰变校正的放射性。将等分试样速冻，用于在放射性衰变后，使用BCA 96孔板测定法(Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL，USA)测定蛋白质。数据表示为每mg蛋白质总放射性的百分比。对于半胆碱-3处理(5 mM；Sigma-Aldrich)，将细胞与该化合物一起孵育30分钟后，加入放射性，并持续摄取时程期间。
体内肿瘤模型
根据英国内政部动物操作指南(科学程序)法(United Kingdom Home Office Guidance on the Operation of the Animal (Scientific Procedures) Act) 1986和在最新公布的癌症研究中动物福利与使用准则(Workman P, Aboagye EO, Balkwill F,等. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br J Cancer.2010;102:1555-1577)范围内，由获许可的研究人员进行全部动物实验。使用雄性BALB/c裸鼠(6-8周龄；Charles River，Wilmington，MA，USA)。给小鼠背部皮下注射肿瘤细胞(2 x 106)，当异种移植物达到100 mm3左右时使用动物。使用测径器连续测量肿瘤尺寸，通过以下公式计算肿瘤体积：体积= (π/6) × a × b × c，其中a、b和c表示肿瘤的3个相互垂直的轴。
体内示踪剂代谢
采用自Smith G，Zhao Y，Leyton J等，Radiosynthesis and pre-clinical evaluation of [(18)F]fluoro-[1,2-(2)H(4)]choline ([(18)F]氟-[1,2-(2)H(4)]胆碱的放射合成和临床前评价). Nucl Med Biol.2011;38:39-51改编的方法，定量测定来自血浆和组织的放射性标记的代谢物。简单地说，给终端麻醉下的荷瘤小鼠i.v.推注以下放射性示踪剂之一：11C-胆碱、11C-D4-胆碱(约18.5 MBq)或18F-D4-胆碱(约3.7 MBq)，在放射性示踪剂注射后2、15、30或60分钟，通过心脏穿刺放血处死。对于自动放射合成方法，参见实施例22。立即将肿瘤、肾和肝样品在液氮中速冻。将等分试样的肝素化血液快速离心(14000 g，5分钟，4℃)，以获得血浆。随后将血浆样品在液氮中速冻，分析前保持在干冰上。
对于分析，临用前使样品融化，并保持在4℃下。向冰冷的血浆(200 μl)中加入冰冷的甲醇(1.5 mL)，将所得混悬液离心(14000 g；4℃；3分钟)。然后倾析上清液，在旋转蒸发器(浴温，40℃)上蒸发至干，然后重新悬浮于HPLC流动相(溶剂A：乙腈/水/乙醇/乙酸/1.0 M乙酸铵/0.1 M磷酸钠[800/127/68/2/3/10]；1.1 mL)。将样品通过亲水注射器过滤器(0.2 μm过滤器；Millex PTFE过滤器，Millipore，MA.，USA)过滤，然后样品(约1 mL)通过1 mL样品环注射至HPLC用于分析。使用Ultra-Turrax T-25匀浆器(IKA Werke GmbH and Co. KG, Staufen, Germany)，将组织在冰冷的甲醇(1.5 mL)中匀浆化，随后按照血浆样品一样处理。
采用Leyton J, Smith G, Zhao Y,等, [18F]fluoromethyl-[1,2-2H4]-choline: a novel radiotracer for imaging choline metabolism in tumors by positron emission tomography ([18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱：通过正电子发射断层扫描用于肿瘤的胆碱代谢成像的新的放射性示踪剂). Cancer Res.2009;69:7721-7728的方法，在如上配置的Agilent 1100系列HPLC系统(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)中对样品进行分析。采用μBondapak C18 HPLC柱(Waters，Milford，MA，USA；7.8×3000 mm)、固定相和以3 mL/分钟的流速递送的由溶剂A (见上)和溶剂B (乙腈/水/乙醇/乙酸/1.0 M乙酸铵/0.1 M磷酸钠(400/400/68/44/88/10))组成的流动相用于分析物分离。梯度设置如下：0% B达5分钟；10分钟内0%-100% B；100% B达0.5分钟；2分钟内100%-0% B；0% B达2.5分钟。
PET成像研究
在给荷瘤小鼠i.v.推注约3.7 MBq用于18F研究或约18.5 MBq用于11C后，在专用小动物PET扫描仪(Siemens Inveon PET模块，Siemens Medical Solutions USA, Inc., Malvern, PA, USA)上进行动态11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱成像扫描。在60分钟内以列表模式形式获取动态扫描。然后将所获取的数据分成0.5 mm正弦箱和19时帧用于图像重建(4 × 15 s、4 × 60 s和11 × 300 s)，这通过滤过反向投影进行。对于输入函数分析，将数据分成25时帧用于图像重建(8 x 5 s、1 x 20 s、4 x 40 s、1 x 80 s和11 x 300 s)。采用Siemens Inveon Research Workplace软件以使肿瘤中的放射性示踪剂摄取显现；利用动态数据的30-60分钟累积图像以界定三维(3D)目标区域(ROI)。如下估算动脉输入函数(Arterial input function)：使用2-5分钟累积图像在心腔中心手工画出单个体素3D ROI。小心地使ROI与心肌的重叠减到最低。对于在各个时间点的所有ROI，对计数密度取平均。以获得时间相对于放射性的曲线(TAC)。使肿瘤TAC标准化至通过VDC-304剂量校正器(Veenstra Instruments，Joure，Netherlands)测量的注射剂量，并表示为每mL组织注射剂量百分比。还利用计算为0 - 60分钟的%ID/mL积分的TAC下面积和60分钟时放射性示踪剂的标准化摄取(%ID/mL60)用于比较。
生物分布研究
通过经麻醉的BALB/c裸鼠尾静脉各注射11C-胆碱、11C-D4-胆碱(约18.5 MBq)和18F-D4-胆碱(约3.7 MBq)。使小鼠保持在麻醉下，并在放射性示踪剂注射后2、15、30或60分钟通过心脏穿刺放血处死，以获得血液、血浆、心脏、肺、肝、肾和肌肉。在γ计数器(Cobra II Auto-Gamma计数器，Packard Biosciences Co，Pangbourne，UK)上测定组织放射性，并经衰变校正。数据表示为每克组织注射剂量百分比。
统计
数据表示为均值±均值的标准误差(SEM)，除非另有说明。采用斯图登t检验，确定两个数据集间比较的显著性。将ANOVA用于多参数分析(windows用Prism v5.0软件，GraphPad Software，San Diego，CA，USA)。如果P ≤ 0.05，则组间差异视为显著。
结果
氘化导致肾放射性示踪剂摄取提高
用11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱示踪剂在未荷瘤雄性裸鼠中进行时程生物分布。图20显示2、15、30和60分钟时的组织分布。在60分钟内组织摄取中3种示踪剂间存在最小差异，其摄取值与之前发表的18F-胆碱和18F-D4-胆碱的数据大体一致(DeGrado TR，Baldwin SW，Wang S等，Synthesis and evaluation of (18)F-labeled choline analogs as oncologic PET tracers (作为肿瘤PET示踪剂的(18)F标记的胆碱类似物的合成与评价). J Nucl Med.2001;42:s1805-1814；Smith G，Zhao Y，Leyton J等, Radiosynthesis and pre-clinical evaluation of [(18)F]fluoro-[1,2-(2)H(4)]choline ([(18)F]氟-[1,2-(2)H(4)]胆碱的放射合成与临床前评价). Nucl Med Biol.2011;38:39-51。在所有示踪剂中，存在从血液中快速提取(extraction)，其大部分放射性保留在肾内，早在注射后2分钟内就明显可见。11C-胆碱的氘化导致在60分钟内肾保留显著增加1.8倍(P < 0.05；图20A)，当与此时间点的11C-胆碱相比时，观察到18F-D4-胆碱的肾保留增加3.3倍(P < 0.01)。与相同的天然示踪剂11C-胆碱相比时，11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱的尿排泄有增加的趋势，但这种增加未达到统计显著性。
11C-胆碱的氘化导致体内适度耐氧化
通过放射性HPLC进行组织和血浆中的示踪剂代谢(图21)。利用酶促(碱性磷酸酶和胆碱氧化酶)方法，将峰指定为胆碱、甜菜碱、甜菜醛和磷酸胆碱以确定其身份(分别为图27和图28) (Leyton J, Smith G, Zhao Y,等，[18F]fluoromethyl-[1,2-2H4]-choline: a novel radiotracer for imaging choline metabolism in tumors by positron emission tomography (18F]氟甲基-[1,2-2H4]-胆碱：通过正电子发射断层扫描用于肿瘤中的胆碱代谢成像的新的放射性示踪剂). Cancer Res.2009;69:7721-7728)。
在肝中，11C-胆碱和11C-D4-胆碱两者快速氧化成甜菜碱(图21A)，到2分钟时其49.2 ± 7.7%的11C-胆碱放射性已氧化成甜菜碱。注射后2分钟，11C-胆碱的氘化在肝中提供免于氧化的显著防护，其24.5 ± 2.1% 放射性为甜菜碱(甜菜碱水平降低51.2%；P = 0.037)，但这种防护到15分钟时丧失。值得注意的是，对于18F-D4-胆碱，到15分钟时高比例的肝放射性(约80%)作为磷酸胆碱存在。这相当于当与两种碳-11示踪剂相比时，肝特异性氧化大大下降(60分钟时15.0 ± 3.6%的放射性为甜菜碱；P = 0.002)。
与肝形成对比，11C-胆碱的氘化导致在整个60分钟时程内在肾中防止氧化(图21B)。对于11C-D4-胆碱，当与11C-胆碱比较时，在60分钟内甜菜碱水平降低20 - 40% (P < 0.05)，这相当于磷酸胆碱成比例地增加(P < 0.05)。18F-D4-胆碱在肾中比两种碳-11标记的胆碱示踪剂更耐氧化。当对全部3种示踪剂的数据进行比较时，在放射性标记的磷酸胆碱和肾保留的水平之间存在关系(R2 = 0.504；图29)。在血浆中，对于11C-胆碱和11C-D4-胆碱两者，甜菜碱的短暂水平几乎相同；应注意，对于所有放射性示踪剂，总放射性水平低。对于11C-胆碱和11C-D4-胆碱，2分钟时，12.1 ± 2.6%和8.8 ± 3.8%的放射性分别呈甜菜碱的形式，在15分钟时，升至78.6 ± 4.4%和79.5 ± 2.9%。对于18F-D4-胆碱，甜菜碱水平显著降低，15分钟时，其43.7 ± 12.4%的活性作为甜菜碱存在。在该时程的其余时间，对于18F-D4-胆碱未观察到血浆甜菜碱进一步增加。
氟化防止肿瘤中的胆碱氧化
测量了HCT116肿瘤中的11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱代谢(图22)。对于所有示踪剂，与肾和肝中的水平相比，肿瘤中的胆碱氧化大大降低。15分钟时，与11C-胆碱相比，11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱具有更显著多的相当于磷酸胆碱的放射性；较之于11C-胆碱的30.5 ± 4.0%，11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱分别为43.8 ± 1.5%和45.1 ± 3.2% (分别为P = 0.035和P = 0.046)。到60分钟时，对于所有3种示踪剂，大部分放射性为磷酸胆碱，磷酸胆碱水平按照以下顺序增加：11C-胆碱< 11C-D4-胆碱< 18F-D4-胆碱。60分钟时，11C-胆碱和11C-D4-胆碱的肿瘤代谢概况无差异，但是观察到18F-D4-胆碱的胆碱氧化降低；与11C-胆碱的28.1 ± 2.9%相比，18F-D4-胆碱的甜菜碱放射性为14.0 ± 3.0% (P = 0.026)。
对于通过PET使肿瘤成像而言胆碱示踪剂具有类似的灵敏度
尽管18F-D4-胆碱的高的全身稳定性，但是通过PET，小鼠的肿瘤放射性示踪剂摄取不高于11C-胆碱或11C-D4-胆碱的摄取(图23)。图23表示典型的(0.5 mm)横向PET图像切片，显示了HCT116肿瘤中所有3种示踪剂的蓄积。对于所有3种示踪剂都存在异质肿瘤摄取，但是肿瘤信号-背景水平相同；通过60分钟时的标准化摄取值和时间相对于放射性的曲线下肿瘤面积的值来证实(数据未显示)。应注意，PET数据表示总的放射性。在11C-胆碱或11C-D4-胆碱的情况下，大部分的这类放射性为甜菜碱(图22)。
肿瘤示踪剂动力学
尽管通过PET检测，肿瘤中总体示踪剂保留没有差异，但是示踪剂摄取的动力学概况在3种胆碱示踪剂间不同(图23B)。3种示踪剂的动力学通过在最初5分钟内的快速肿瘤流入，接着通过肿瘤保留的稳定来表征。成像的最初14分钟内18F-D4-胆碱的初始递送高于11C-胆碱和11C-D4-胆碱的递送(最初14分钟的放大TAC见图30)。与用11C-胆碱检测的逐渐蓄积相比，用18F-D4-胆碱和11C-D4-胆碱在30和60分钟之间观察到活性的慢冲洗(wash-out)。使用来自心腔的代谢物校正的TAC作为输入函数，从两组织不可逆模型计算肿瘤中放射性不可逆截留的参数K i和k 3 (图24A和B)。说明代谢物对组织TAC的影响的双重输入(DI)模型被用于动力学分析，以补充数据予以描述。在氘化和未氘化11C-胆碱之间流量常数测量(flux constant measurement)没有显著差异。然而，加入甲基氟导致K i和k 3分别降低49.2% (n = 3；P = 0.022)和75.2% (n = 3；P = 0.005；即当将18F-D4-胆碱与11C-D4-胆碱比较时)。在全部3种示踪剂中K 1 ’值相似：11C-胆碱、11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱分别为0.106 ± 0.026；0.114 ± 0.019；0.142 ± 0.027。可能胞内甜菜碱形成(胞外间隙中不仅存在甜菜碱)导致高于预期的不可逆摄取；与18F-D4-胆碱相比，用11C-胆碱在15和60分钟时，甜菜碱:磷酸胆碱之比分别有显著的388%和230%的增加(P = 0.045和0.036) (图5C)。
18F-D4-胆碱对前列腺腺癌和恶性黑素瘤的PET成像显示良好的灵敏度
已证实对于体内研究18F-D4-胆碱是更稳定的胆碱类似物，对于结肠腺癌成像有良好的灵敏度，期需评价其在人类癌症其它模型(包括恶性黑素瘤A375和前列腺腺癌PC3-M)中用于癌症检测的适合性。30分钟内，3个细胞系中18F-D4-胆碱的体外摄取相似(图31)，与几乎相同的胆碱激酶表达水平有关(图31插图)。放射性的保留显示是胆碱激酶依赖性的，因为用胆碱转运和胆碱激酶抑制剂半胆碱-3处理细胞，导致在全部3个细胞系中胞内示踪剂放射性降低> 90%。这些癌症模型中，类似的胞内截留的18F-D4-胆碱转化成其体内摄取(图25A))，显示流量常数测量和PET成像变量的类似值(补充表1)。存在18F-D4-胆碱的肿瘤保留按照以下顺序增加的趋势：A375 < HCT116 < PC3-M；反映在这些细胞系中胆碱激酶的表达中(图25C)。在15或60分钟注射后，3个细胞癌症模型间的肿瘤代谢物概况无可辨别差异(图25B)。
肿瘤大小影响18F-D4-胆碱摄取和保留但不影响肿瘤药代动力学
对于PET成像，在成像前使肿瘤生长至100 mm3。然而，当肿瘤大小达到200 mm3时，给一小群移植了PC3-M异种移植物的动物成像(有关典型的横向PET图像参见图32)。这些肿瘤在肿瘤边缘显示截然不同的18F-D4-胆碱摄取模式，对应于当与较小的PC3-M肿瘤相比时，肿瘤放射性显著降低(图26)。如同HCT116肿瘤一样，在两个PC3-M组群内，示踪剂注射5分钟内，达到最大肿瘤比放射性，接着为平稳期。60分钟时放射性示踪剂保留的量值显著高于较小的肿瘤，其中相对于较大肿瘤的0.82 ± 0.12% ID/mL，标准化摄取值为1.97 ± 0.07% ID/mL (2.4倍增加；P = 0.0002；n = 3-5)。从肿瘤ROI获取最大体素放射性值，对肿瘤摄取进行分析，导致在60分钟时示踪剂摄取的较小差异，与约200 mm3肿瘤中测量的3.34 ± 0.08%ID/mLmax相比，在约100 mm3肿瘤中测量的%ID/mLmax为4.75 ± 0.38 (1.4倍增加；P = 0.019；n = 3-5)。引人关注的是，两个肿瘤组群之间测量不可逆截留的放射性的动力学参数K i和k 3没有显著改变。
在60分钟时程内，肾保留按11C-胆碱< 11C-D4-胆碱< 18F-D4-胆碱的顺序增加(图20)，其总的肾放射性显示与作为磷酸胆碱而保留的放射性%成比例(图29；R2 = 0.504)。通过11C-胆碱的氘化防止胆碱氧化显示有组织特异性，且当与11C-胆碱相比时，恰在注射后2分钟在肝中测出的甜菜碱放射性降低(图21)。
尽管用18F-D4-胆碱系统性防止胆碱氧化，但是在移植的HCT116肿瘤中，胆碱氧化速率的降低不明显得多(图22)。注射后15分钟时，与11C-胆碱相比，当分别注射11C-D4-胆碱和18F-D4-胆碱时，有较高的放射性标记的磷酸胆碱水平，为43.6%和47.9%。到60分钟时，3种示踪剂间的磷酸胆碱水平没有差异，但是用18F-D4-胆碱的甜菜碱比放射性显著降低。磷酸胆碱比活的该平衡可通过饱和效应来解释，到60分钟时，母体示踪剂水平降至最低，严重限制了胆碱激酶活性可用的底物水平。当与肝和肾相比时，在整个时程内，对于全部3种示踪剂，在肿瘤中观察到较低的甜菜碱水平，可能因胆碱氧化较低能力或甜菜碱的冲洗降低所致。
通过PET对3种胆碱放射性示踪剂的比较表明，总体肿瘤放射性示踪剂摄取没有显著差异，因此灵敏度也没有显著差异(图23)，但在其它器官中观察到大的改变。然而，示踪剂间初期肿瘤动力学(在代谢较低的时间点上)不同，其中18F-D4-胆碱的特征在于在约5分钟内快速递送，接着活性从肿瘤中慢冲洗。这与11C-胆碱较慢的摄取但持续肿瘤保留形成对比。与11C-胆碱和11C-D4-胆碱相比，60分钟时，对于18F-D4-胆碱在肿瘤中观察到分别为2.7倍和4.0倍的未代谢母体示踪剂(图22)。然而，氘化不改变总体肿瘤放射性水平，且所用建模方法在不同的胞内物类无区别。虽然全部示踪剂胞内转化成磷酸胆碱，但与18F-D4-胆碱相比，较高的11C-胆碱和11C-D4-胆碱的胞内保留速率常数(K i 和k 3 ；图24A和B)通过HCT116肿瘤内非氟化示踪剂快速转化为甜菜碱来解释，表明18F-D4-胆碱有较大的特异性。与18F-D4-胆碱相比，11C-胆碱和11C-D4-胆碱的肿瘤甜菜碱/磷酸胆碱代谢物之比分别提高达388% (P = 0.045)和259% (P = 0.061，不显著) (图24C)。
实施例22
概述
使用采购的材料而不进一步纯化。1,2-2H4-二甲基乙醇胺(DMEA)由Target Molecules Ltd (Southampton，UK)定制合成。冲洗用水来自Baxter (Deerfield，IL，USA)，碱石灰购自VWR (Lutterworth，Leicestershire，UK)。注射用0.9%氯化钠来自Hameln pharmaceuticals Ltd (Gloucester，UK)，0.045% NaCl溶液由该原液和冲洗用水制备。氢化铝锂(0.1 M，在THF中)和氢碘酸(57%)来自ABX (Radeburg，Germany)。亚甲基二甲苯磺酸盐获自Huayi Isotope Company (Toronto，Canada)。所有其它化学品均来自Sigma-Aldrich Co. Ltd (Poole，Dorset，UK)。对于iPhase 11C-PRO的11C-甲基化，iPhase一次性合成试剂盒获自iPhase Technologies Pty Ltd (Melbourne，Australia)。对于GE FASTlab (GE Healthcare，Chalfont St. Giles，UK)上的18F-氟甲基化，不完全装配的GE FASTlab盒装有FASTlab水袋、N2过滤器、预处理的QMA柱和反应容器。Waters Sep-Pak Accell CM light、tC18 light和tC18 Plus柱获自Waters Corporation (Milford, Ma., USA)。
11 C-胆碱和 11 C-[1,2- 2 H 4 ]-胆碱的合成
11C-甲基碘采用标准湿化学方法制备。简单地说，将11C-二氧化碳通过订制附带的致冷收集器(cryogenic trap)转移至iPhase平台，使用氢化铝锂(0.1 M，在THF中) (200 uL)在室温下1分钟内还原成11C-甲烷。然后，将浓氢碘酸(200 μL)加到反应器容器中，将混合物加热至140℃达1分钟。然后使11C-甲基碘通过含有碱石灰和五氧化二磷干燥剂的短柱蒸馏至含有前体二甲基乙醇胺或1,2-2H4-二甲基乙醇胺(20 μl)的2 mL不锈钢环路。让甲基化反应在室温下进行2.5分钟。粗产物然后使用乙醇(20 mL)以5 mL/分钟的流速冲洗至CM柱。CM柱之前已依次用0.045%氯化钠(5 mL)和水(5 mL)预处理。CM柱然后依次用氨水溶液(0.08%，15 mL)和水(10 mL)洗涤。然后使用氯化钠溶液(0.045%，10 mL)将胆碱产物从柱中洗脱。
18 F-氟甲基-[1,2- 2 H 4 ]-胆碱的合成
给系统配置洗脱液小瓶，小瓶中装有1:4 K2CO3水溶液:Kryptofix K222的乙腈(1.0 mL)溶液、180 mg K2CO3的水(10.0 mL)溶液和120 mg Kryptofix K222的乙腈(10.0 mL)溶液、亚甲基二甲苯磺酸盐(4.2-4.4 mg)的乙腈(2%水；1.25 mL)溶液、前体1,2-2H4-二甲基乙醇胺(150 μl)的无水乙腈(1.4 mL)溶液。
将氟-18吸入系统，并固定在Waters QMA light柱上，然后用1 mL碳酸盐和kryptofix的混合物洗脱至反应容器中。在K[18F]F/K222/K2CO3干燥循环完成后，加入亚甲基二甲苯磺酸盐的乙腈(2%水；1.25 mL)溶液，使反应容器加热至110℃达10分钟。反应物用水(3 mL)猝灭，使所得混合物通过t-C18 light和t-C18 plus柱(用乙腈和水各2 mL预处理)两者；然后使15%乙腈的水溶液通过各柱。在完成清洗循环后，将亚甲基二甲苯磺酸盐截留至t-C18 light柱中，而18F-氟甲基甲苯磺酸盐(与18F-甲苯磺酰基氟化物一起)保留在t-C18 plus中，且其它反应物进入废物区(waste)。在该放射合成第一期后，采用洗涤循环乙醇→真空→氮气清洗反应容器。然后将具有固定18F-氟甲基甲苯磺酸盐的反应容器和t-C18 plus柱同时在氮气流下干燥。然后用150 μl 1,2-2H4-二甲基乙醇胺的1.4 mL乙腈溶液，将18F-氟甲基甲苯磺酸盐从t-C18 plus柱洗脱至反应容器中。然后将反应器容器加热至110℃达15分钟后冷却，反应容器内容物用水洗涤至CM柱(用2 mL水处理)。柱通过从散装乙醇小瓶中抽取乙醇并且使之通过CM柱来洗涤；重复洗涤循环一次，接着用0.08%氨水溶液(4.5 mL)洗涤。CM柱然后依次用乙醇和水进行最后洗涤。用0.09%氯化钠溶液(4.5 mL)将产物18F-氟-[1,2-2H2]胆碱从CM柱中洗出，得到含18F-氟-[1,2-2H2]胆碱的氯化钠缓冲液，为最终配制品。
化学/放射化学纯度的评价
用附带Metrosep C4阳离子柱(250 × 4.0 mm)的Metrohm离子色谱系统(Runcorn，UK)，针对化学/放射化学纯度对11C-胆碱、11C-[1,2-2H4]-胆碱和18F-氟-[1,2-2H2]胆碱进行分析。流动相为3 mM硝酸:乙腈(75:25 v/v)，以1.5 mL/分钟的等度模式运行。在配制后，所有放射性示踪剂的放射化学纯度均>95%。
HCT116肿瘤中的动力学分析
利用二组织不可逆区室模型以拟合TAC，如之前对于11C-胆碱已建立的一样(Kenny LM，Contractor KB，Hinz R等, Reproducibility of [11C]choline-positron emission tomography and effect of trastuzumab ([11C]胆碱-正电子发射断层扫描的再现性和曲妥珠单抗的作用). Clin Cancer Res. 2010年8月15日;16(16):4236-4245；以及Sutinen E，Nurmi M，Roivainen A等, Kinetics of [(11)C]choline uptake in prostate cancer: a PET study (前列腺癌中[(11)C]胆碱摄取的动力学：PET研究). Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2004年3月;31(3):317-324。如上所述，全血TAC (wbTAC(t))的估算自PET成像本身推导。由于wbTAC仅获自一个体素，因此它相对有干扰。因此用从峰值开始的三个指数之和来拟合，拟合函数在动力学建模中用作输入函数(在代谢物校正后，参见下文)。自血浆代谢物分析计算母体分数值pf (parent fraction value)：在2、15、30和60分钟时，分别地，对于18F-D4-胆碱为[0.96,0.55,0.47,0.26]，对于11C-胆碱为[0.92,0.25,0.20,0.12]，对于11C-D4-胆碱为[0.91,0.18,0.08,0.03]。将pf值拟合至其约束(constraint) pf(t=0)=1的二个指数之和，得到函数pf(t)。然后，通过乘以wbTAC(t)和pf(t)计算母体全血TAC wbTACPAR(t)，并用作输入函数以估算参数K 1 (mL/cm3/分钟)、k 2 (1/分钟)、k 3 (1/分钟)和Vb (无单位)。由估算的微观参数(microparameter)计算稳态净不可逆摄取速率常数K i (mL/cm3/分钟)为K 1 k 3/(k 2 + k 3)。因为使用wbTACPAR(t)作为模型唯一的输入函数所得到的拟合质量差，并且因为18F-D4-胆碱、11C-胆碱和11C-D4-胆碱在小鼠体内快速代谢，因此还考虑了说明代谢物对组织TAC的影响的双重输入(DI)模型(Huang SC，Yu DC，Barrio JR等, Kinetics and modeling of L-6-[18F]fluoro-dopa in human positron emission tomographic studies (人正电子放射X线体层摄影研究中L-6-[18F]氟-多巴的动力学和建模). J Cereb Blood Flow Metab. 1991年11月;11(6):898-913)。在DI模型中，使用计算为wbTAC(t)x[1-pf(t)]的代谢物全血TAC wbTACMET(t)与wbTACPAR(t)一起作为输入函数；用2-组织不可逆模型对母体示踪剂建模，而使用简单的2-组织可逆模型来描述代谢物动力学，因此除估算的母体参数外，还计算代谢物流入和流出K 1’和k 2’。使用标准加权非线性最小平方(WNLLS)作为估算程序。WNLLS使加权残差平方和(WRSS)函数最小化
Figure 321775DEST_PATH_IMAGE031
其中
Figure 813937DEST_PATH_IMAGE032
和分别表明自PET图像计算的衰变校正浓度和第i帧的中间时间(mid-time)，n表示帧数。在Eq.1中，权wi设置为
其中
Figure 42333DEST_PATH_IMAGE035
和λ表示第i帧的持续时间和18F (对于18F-D4-胆碱)或11C (对于11C-胆碱和11C-D4-胆碱)的半衰期(Tomasi G，Bertoldo A，Bishu S，Unterman A，Smith CB，Schmidt KC, Voxel-based estimation of kinetic model parameters of the L-[1-(11)C]leucine PET method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis: validation and comparison with region-of-interest-based methods (基于体素的估算用于测定脑蛋白质合成的区域率的L-[1-(11)C]亮氨酸PET方法的动力学模型参数：验证并与基于目标区域的方法进行比较). J Cereb lood Flow Metab. 2009年7月;29(7):1317-1331)。用Matlab函数lsqnonlin进行WNLLS估算；将参数约束为正，但不使用上限。
补充表1. 肿瘤中动态18F-D4-胆碱PET的动力学参数。60分钟时的衰变校正摄取值(NUV60)和曲线下面积(AUC)获自肿瘤TAC。通过拟合肿瘤TAC和推导的输入函数得到流量常数测量K 1 ’、K i和k 3，校正18F-D4-胆碱的放射性血浆代谢物至示踪剂递送和保留的2-组织不可逆模型。显示了平均值(n = 3) ± SEM。
上文讨论和/或引用的所有专利、期刊文章、出版物和其它文献通过引用结合到本文中。

Claims (8)

1. 一种式(III)化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
(III)
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地为氢或氘(D)；
R5、R6和R7各自独立地为氢、R8、-(CH2)mR8、-(CD2)mR8、-(CF2)mR8、-CH(R8)2或-CD(R8)2；
R8独立地为氢、-OH、-CH3、-CF3、-CH2OH、-CH2F、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CD3、-CD2OH、-CD2F、CD2Cl、CD2Br、CD2I或-C6H5；
m为1-4的整数；
C*为碳的放射性同位素；
X、Y和Z各自独立地为氢、氘(D)、选自F、Cl、Br和I的卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基；和
Q为阴离子反荷离子；条件是所述式(III)化合物不是11C-胆碱。
2. 权利要求1的化合物，其中C*为11C、13C或14C。
3. 权利要求1的化合物，其中C*为11C；X和Y各自为氢；Z为F。
4. 权利要求1的化合物，其中C*为11C；X、Y和Z各自为氢H；R1、R2、R3和R4各自为氘(D)；R5、R6和R7各自为氢。
5. 一种药物组合物，其包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
6. 一种药物组合物，其包含权利要求2的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
7. 一种药物组合物，其包含权利要求3的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
8. 一种药物组合物，其包含权利要求4的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
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