CN103333839A

CN103333839A - 甘露聚糖酶及其基因和应用

Info

Publication number: CN103333839A
Application number: CN2013102831151A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 胡可; 李春秀; 潘江
Original assignee: Shanghai Xinyuan Environmental Engineering Co ltd
Current assignee: Shanghai Xinyuan Environmental Engineering Co ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2013-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2033-07-05
Also published as: CN103333839B

Abstract

本发明公开了一种新的甘露聚糖酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，重组酶的制备方法，以及该重组酶作为生物酶破胶剂在降低以瓜尔胶及其衍生物为基础的水基压裂液黏度中的应用。本发明的甘露聚糖酶可以作为生物破胶剂应用于油井水基压裂液的酶法破胶。与现有的破胶剂相比，本发明制备的生物破胶剂不仅具有破胶彻底，破胶后残渣少，对环境友好等优点，而且非常适合高温油井的压裂和破胶作业，具有高温条件下破胶能力异常突出的优势；同时该酶在低温条件下基础活力极低，可有效避免在压裂液未到达预定位置之前或在压裂作业尚未完成的情况下过早地提前破胶的负面效应。预计在三次采油中应用效益将非常显著。

Description

甘露聚糖酶及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高温甘露聚糖酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该甘露聚糖酶或其重组体作为生物酶破胶剂，在控制油井水基压裂液中瓜尔胶或其衍生物的条件性水解破胶中的应用。

背景技术

一些低渗透油气藏具有渗流阻力大，呈非线性流动等特征，驱替效率低、开采难度高、单井产量低，并且稳产难度大。为了提高低渗透油气藏的油井产量，可以通过往油井中注入高压液体以撑裂岩层，由此水基压裂液应运而生。在石油开采过程中，首先将以瓜尔胶或其衍生物为基础的碱性水基压裂液凝胶打入油井中。压裂液凝胶包裹着支撑剂将其携带送入地层，在外加的强大压力下，地层被压裂产生裂缝，支撑剂进入裂缝将其支撑开来。再关闭油井，在化学破胶剂或生物破胶剂作用下将压裂液凝胶彻底破胶，然后迅速将裂解的压裂液从井中返排出来，使油层形成具有很好导流能力的裂缝，从而使油井出油量增加。

瓜尔胶及其衍生物在石油开采中被广泛用作增稠剂，其本质为半乳甘露聚糖，主链由甘露糖通过β-1,4-糖苷键连接而成，侧链半乳糖通过α-1,6-糖苷键连接在主链上，其分子量在200～300kDa。天然瓜尔胶由于不能快速溶胀和水化、溶解慢、水不溶物含量高、黏度不易控制等缺陷而应用受限。目前工业上通过改性以提高其理化性能，瓜尔胶衍生物可根据衍生基团而大致分为：非离子瓜尔胶、阳离子瓜尔胶、阴离子瓜尔胶、两性离子瓜尔胶等，常见的瓜尔胶衍生物有羟丙基瓜尔胶，羧甲基瓜尔胶，羧甲基羟丙基瓜尔胶等，其中羟丙基瓜尔胶大量应用于油田压裂液。

在上述过程中，破胶步骤非常关键，如果压裂液凝胶破胶不彻底，则粘稠的压裂液凝胶及破胶残渣牢固地包裹在支撑剂周围，会堵塞裂缝，造成裂缝孔隙渗透率降低，引起油田储层暂时性甚至永久性的伤害。对于瓜尔胶及其衍生物，目前使用的破胶方法有两种，一种是化学方法，另一种是生物方法。1981 年Hinkel在U.S.Pat.No.4,250,044中指出，过硫酸铵或者过硫酸钾可以用作破胶剂，在合适的油层条件下发挥其破胶作用。此后，油田开始大量采用过硫酸铵作为破胶剂。目前，我国有许多油田采用过硫酸铵作为破胶剂。尽管化学破胶剂具有一定效果，但也具有化学污染大及破胶度有限等缺陷。另一方面，生物方法利用瓜尔胶水解酶催化降解瓜尔胶及其衍生物从而达到破胶的目的。根据瓜尔胶及其衍生物的分子结构，破胶剂的作用点可以从其主链入手，利用甘露聚糖酶水解其主链上的β-1,4-糖苷键，降低其分子质量，从而降低其溶液的黏度，达到破胶目的。与化学法相比，酶法破胶具有专一性强，可控性好，破胶彻底，破胶后残渣少，油层污染小，压裂后油层物性好等优势，有利于保护油层，更好地提高油井产量。

1991年公开的专利U.S.4,996,153中，Cadmus和Slodki披露了一种针对以木聚糖为基础的水基压裂液的生物酶破胶剂，这种水基压裂液及相应的破胶剂适用于低温油井。1993年Tjon-Joe-Pin在专利U.S.5,201,370中公开了一种针对以瓜尔胶为基础的水基压裂液的生物酶破胶剂，这种破胶剂可以水解α-1,6-D-半乳糖苷键和β-1,4-D-甘露糖苷键，其适用的油井温度是20-80°C。1991年Bergquist从嗜热厌氧菌Caldocellulosiruptor saccharolyticus中发现一种甘露聚糖酶(Appl.Environ.Microbiol.1991，57，694-700);2011年授权的美国专利U.S.8,058,212中，贝克休斯公司将这种甘露聚糖酶作为一种新型的生物酶破胶剂用于水基压裂液的破胶，据称这种破胶剂可以适用于72°C以上的油田。1995年至2002年，Kelly等陆续公开了U.S.5,421,412，U.S.5,869,435，U.S.6,197,730和U.S.6,936,454共4项专利，在此基础上美国哈利伯顿(Halliburton)油气田服务公司于1999年研制出新型耐高温生物酶破胶剂这种破胶剂包含α-1,6-D-半乳糖苷酶和β-1,4-D-甘露聚糖酶，其酶来自于嗜热厌氧菌Thermotoga neapolitana DSM5068(新阿波罗栖热袍菌)和Thermotoga maritime(海栖热胞菌)，所述破胶剂可以短期耐受90°C高温。

目前已在世界范围内推广，2005年起由大连百奥泰科技有限公司在中国地区全面推广。

近几年，我国也开始重视生物酶破胶剂的研发。在2009年的中国专利公开文件CN101608113A中，东营盛世石油科技有限公司将蛋白酶、纤维素酶和木瓜酶按比例混合制成生物酶破胶剂，此种破胶剂需要辅酶和酶激活剂作为辅剂，成本较高，且此种破胶剂适用的油层温度仅为50°C。在2010年的中国专利公开文件CN101781552A中，陕西延长石油(集团)有限责任公司披露了一种复合生物酶破胶剂，其中含有甘露聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、葡聚糖酶、黄原胶酶，适用范围为20～60°C。在2011年的中国专利公开CN102286275A中，西安石油大学王俊奇等同样研制出一种复合型生物酶破胶剂，其中含有一定比例的纤维素糖苷特异性酶、淀粉糖苷特异性酶、胍胶糖苷特异性酶。上述三种生物酶破胶剂成分复杂，而且其中一些酶不能降解瓜尔胶及其衍生物。在2010年的中国专利公开CN101838620A中，大连百奥泰科技有限公司从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis BIT09L1)中获得一种甘露聚糖酶，将其作为生物酶破胶剂，适用的油井温度为15～60°C。在2011年的中国专利公开CN102168049A中，天津工业生物技术研究所从地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis M1-4)中得到破胶酶，适用温度为20～65°C。

油井内的温度随着深度和压力的增加而不断提高，深层油气藏温度通常在70～80°C以上，而我国近期研制的生物酶破胶剂均不适用于高温油井，因此我国不得不使用进口破胶酶制剂。进口酶制剂成本较高，此外进口的破胶酶制剂产品(例如

)都是国外早期开发的，存在不少缺点，例如在中低温(20～50°C)时即开始显现比较显著的破胶活性，这样就不可避免地使与酶一起注入油井的压裂液凝胶在到达预定位置之前即过早地破胶，从而大大降低了压裂的效果。目前，中国石油严重依赖进口，自给率不断下降，能源供应存在潜在隐患，严重威胁国家安全。因此，创新研发中国自主品牌和知识产权的高温型生物破胶酶制剂，克服现有酶制剂的技术缺陷，促进其在高温油气藏三次采油领域的广泛应用，提高我国油气田的采收率，具有重大战略意义和经济价值。

发明内容

发明人通过下述技术方案解决现有生物酶破胶剂所存在的技术缺陷。

本发明提供嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)CGMCC7283，所述嗜热网球菌能分泌甘露聚糖酶，可用于水基压裂液的破胶。

本发明提供一种新的甘露聚糖酶，所述酶是

(a)具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质；或

(b)由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有甘露聚糖酶活性的衍生蛋白质。

在一个具体的实施方式中，所述衍生蛋白质具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

本发明提供可用于水基压裂液破胶降粘目的的高温甘露聚糖酶基因。在一个具体的实施方式中，本发明提供编码上述蛋白质(a)或(b)的基因。在一个更具体的实施方式中，所述基因具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供包含本发明甘露聚糖酶基因核苷酸序列的重组表达载体。本发明还提供包含本发明甘露聚糖酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。

本发明提供一种重组甘露聚糖酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的包含所述甘露聚糖酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体，以获得重组甘露聚糖酶。

本发明还提供将本发明的甘露聚糖酶用作生物酶破胶剂，在以瓜尔胶及其衍生物为基础的水基压裂液中进行高效破胶作用的方法。

本发明还提供含有瓜尔胶及其衍生物作为增稠剂的水基压裂液，其中还含有本发明的甘露聚糖酶或者重组甘露聚糖酶作为高温破胶剂。

在一些实施方式中，所述水基压裂液中的增稠剂是瓜尔胶或其衍生物，例如可含有0.35～0.75%的瓜尔胶或其衍生物。在一些实施方式中，所述水基压裂液中含有交联剂，包括但不限于硼砂、有机硼等，例如可含有0.04～0.06%的硼砂。在一些实施方式中，所述水基压裂液中含有黏土稳定剂，包括但不限于KCl、KBr、CaCl₂、CaBr₂、HCOONa等，所述黏土稳定剂的含量可以是2.5～10%。在一些实施方式中，所述水基压裂液中含有杀菌剂，包括但不限于戊二醛，例如含有0.005%的戊二醛。在一些实施方式中，所述水基压裂液中含有抗氧化剂，包括但不限于Na₂S₃O₃等，例如含有0.1～1%的Na₂S₃O₃。

本发明的甘露聚糖酶可以有效降解瓜尔胶及其衍生物，非常适用于作为以瓜尔胶为基础的水基压裂液的破胶剂。与其他生物破胶剂如商品化的

相比，本发明的甘露聚糖酶的最大优势在于，本发明的甘露聚糖酶在室温条件下基础活力极低，而在高温条件下(≥70°C)却能发挥出强有效的破胶能力。因此，采用本发明的甘露聚糖酶作为破胶剂，不仅能有效地避免水基压裂液被过早地破胶，还能在压裂作业完成后有效地将压裂液深度水解破胶。

通过随后的描述和所附权利要求，本领域技术人员会明白本申请的其他目标、特征、优点和各方面。然而，应当理解，虽然表明了本申请的优选实施方式，但以下描述、所附的权利要求和具体实施例仅是为了说明而给出。本领域技术人员阅读下文后不难明白属于本发明构思和范围内的各种改变和改进。

附图简要说明

图1为DtMan酶基因经PCR扩增后的电泳图谱，其中：泳道1～3为DtMan基因的PCR扩增产物；泳道4为DNA标记物(Marker II，北京天根生化科技有限公司)。

图2为重组表达质粒pET-DtMan的构建示意图。

图3为重组甘露聚糖酶DtMan的聚丙烯凝胶电泳图。其中，1、破碎上清；2、破碎沉淀；3、蛋白质分子量标记物(Takara公司)。

图4为不同野生菌对瓜尔胶和羟丙基瓜尔胶活力测定结果。其中(●)为重组甘露聚糖酶DtMan嗜热网球菌CGMCC7283，(○)为其它野生菌。

图5为分别以DtMan(▲)和

(■)进行80°C静态破胶实验的反应进程曲线。

发明详述

本说明书中，除非另有注明具体条件，实施例中各实验方法按照常规方法和条件，或按照试剂说明书进行。除非另有明确标注，各组分的含量均表示质量/体积(w/v)含量。

活性甘露聚糖酶的筛选

发明人在对实验室保藏野生菌种筛选的基础上，获得本发明的甘露聚糖酶。具体地说，发明人依据生物破胶剂应用所需的高温环境，对本实验室保藏的嗜热微生物菌种资源进行甘露聚糖酶活性检测，从菌种库中挑选出具有甘露聚糖酶活性的候选菌株，并根据菌株所显示的甘露聚糖酶活性的综合性能选出嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)ECU0693(保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)中国科学院微生物研究所内的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2013年3月6日，保藏号为：CGMCC7283)。

该菌株是基于筛选嗜热甘露聚糖酶的目的，从南京汤山温泉水中分离获得。筛选菌种所用方法如下：将所采集的温泉样本以厌氧方式在添加0.5%胰蛋白胨，0.5%乳糖和1%瓜尔胶的人工海水(1L人工海水中含有NaCl27.70g， MgSO₄·7H₂O7.00g，MgCl₂·6H₂O5.50g，KCl0.65g，NaBr0.10g，H₃BO₃30.00mg，SrCl₂·6H₂O15.00mg，柠檬酸10.00mg，KI0.05mg，CaCl₂·2H₂O2.25g)中培养。在厌氧培养瓶中通入100%N₂以控制无氧环境。在65°C条件下培养3天后培养液变浑浊，对培养液进行菌种分离，获得菌株纯培养，显微镜镜检显示该菌体以杆状形式存在。经鉴定为不运动、无芽孢、极端厌氧的浅灰色杆状菌，为革兰氏阳性菌。该菌株通过16S rDNA鉴定为嗜热网球菌，其营养方式为化能异养型。

活性甘露聚糖酶的基因克隆

提取嗜热网球菌CGMCC7283的总DNA，采用Sau3AI(GATC)限制性内切酶对其进行酶切，使其形成特定的粘性末端。通过控制酶用量和反应时间，把总DNA酶切成2～6kb的片段。回收大小为1～5kb的DNA片段，并将这些片段与BamHI（GGATCC）酶切的pET-43.1a载体以相同粘性末端高效连接。用酶连产物转化感受态细胞E.coli DH5α后，涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，倒置平皿，于37°C培养12～16小时后，挑取白色菌落重新点到含有100mg/L氨苄青霉素和24mg/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，150mg/L瓜尔胶的新鲜LB固体培养基平板上，37°C培养24小时后，在光线充足的条件下观察平板，选择有水解圈的克隆，即为含瓜尔胶水解酶基因的阳性克隆子。

由上海英俊生物技术公司对阳性克隆中所插入的外源片段进行测序。外源片段长度为1,560bp，用Omiga软件分析该片段的开放性阅读框(ORF)，其中大于600bp的ORF只有一个。根据这个ORF设计引物，上游引物为：CGCGGATCCATGAAATTTACTCTACCTCTTCTTATCCTT(SEQ ID No.5)；下游引物为：CCGCTCGAGTTATTCTTCAACTTTCAAATTTGGTAGC(SEQ ID No.6)；然后以嗜热网球菌CGMCC7283的基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增基因，获得完整的嗜热网球菌甘露聚糖酶DtMan的全长基因序列。

甘露聚糖酶的重组表达和活性测定

基于克隆所得嗜热网球菌甘露聚糖酶DtMan的全长基因，发明人采用本领域常规技术构建了大肠杆菌重组表达细胞(参见例如，Sambrook等，2001年，《分子克隆：实验手册》第3版，纽约冷泉港实验室出版社)。

活性测定中，选择在水基压裂液中被广泛用作增稠剂的瓜尔胶和羟丙基瓜尔胶作为目标底物，对克隆表达所得的重组甘露聚糖酶用DNS试剂法进行破胶活性测定。

DNS试剂法具体过程如下：将含0.35%瓜尔胶的1mL KPB溶液(50mM，pH7.0)和1mL粗酶液加入20mL带有刻度的密闭试管中，在80°C水浴中孵育15分钟后加DNS试剂3mL，于沸水浴中孵育5分钟，然后迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，于540nm处测定吸光值。将测定的吸光值同标准曲线对比，得到相应的还原糖含量，再计算相应活力。1单位酶活力(U_DNS)定义为每分钟内产生1μmol还原糖所需的酶量。

甘露聚糖酶DtMan基因和同系物

本发明的重组甘露聚糖酶DtMan的基因全长为1410bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1407个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。该序列与美国贝克休斯公司所应用的源自于解糖热解纤维素菌Caldocellulosiruptor saccharolyticus的生物酶破胶剂相似性仅为9.8%，与Kelly所报道的源自于那不勒斯栖热袍菌Thermotoga neapolitana中的甘露聚糖酶相似性仅为14.7%，与源自于海栖热袍菌Thermotoga maritime中的甘露聚糖酶相似性仅为11.5%。可见，本发明所述甘露聚糖酶与现有技术已知的各种生物酶破胶剂之间存在显著差异。DtMan的突变体DtMan^mut的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其编码碱基序列可以如SEQ ID No.3所示，其与现有技术已知的各种生物酶破胶剂之间的相似性均小于15%，差异性亦非常显著。

本领域熟练技术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，编码氨基酸序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No.1或SEQ ID No.3。本发明还考虑到各种可能的核苷酸序列变异，这些变异可通过根据可能密码子选择密码子组合而产生。根据应用于天然产生的氨基酸序列的标准三联遗传密码产生这些组合，所有此类变异都被视作已具体公开。另外，还可以通过适当引入替换、缺失、或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。可以在保持酶活性特征的条件下，通过对SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示碱基序列的一个或多个碱基进行替换、缺失或增加来制得本发明中多聚核苷酸的同系物。

酶的分子结构改造

发明人对所得甘露聚糖酶进行了分子结构改造，发现对SEQ ID No.2所示氨基酸序列的5个氨基酸残基进行突变，如第76位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，第228位异亮氨酸突变为甘氨酸，第315位谷氨酸变为甘氨酸，第318位色氨酸变为半胱氨酸，第410位天冬酰胺变为赖氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的DtMan突变体DtMan^mut。纯化至单一条带后，测得DtMan的活力为213U_DNS/mg，而纯化的DtMan^mut活力为268U_DNS/mg，实验结果证明突变后的重组甘露聚糖酶的活性有所提高。

重组表达系统

为了表达重组甘露聚糖酶，可将编码所述重组甘露聚糖酶或其功能等同物的核苷酸序列插入合适的表达载体，即包含插入序列转录和翻译必需元件的载体。可用本领域熟练技术人员熟知的方法构建包含多肽编码序列以及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。可通过培养本发明的包含所述甘露聚糖酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体，来获得重组甘露聚糖酶。

可通过本领域常规方法，将本发明的甘露聚糖酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上而构建得到所述重组表达载体。所述载体可以是本领域的各种常规质粒载体，例如质粒pET-43.1a(+)。制得本发明所述重组表达载体的示例性方法如下：将通过PCR扩增所得的甘露聚糖酶DtMan及其突变体的基因产物用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切，形成互补的粘性末端，同时将克隆载体和表达载体pET-43.1a(+)同样用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明甘露聚糖酶DtMan及其突变体基因的重组表达质粒pET-DtMan和pET-DtMan^mut。

可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得所述重组表达转化体。所述宿主微生物可以是本领域的各种常规宿主微生物，只要该微生物能稳定地自行复制重组表达载体，且能有效表达所携带的本发明的甘露聚糖酶基因即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α。例如，将前述重组表达质粒pET-DtMan或pET-DtMan^mut转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌株。

培养所述重组表达转化体所用的培养基可以是本领域已知可使所述转化体生长并产生本发明的甘露聚糖酶的任何培养基，对于E.coli菌株，可选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同，按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并产生甘露聚糖酶酶即可。培养转化体的其他具体操作均可按本领域常规操作进行。对于E.coli菌株，示例性方法如下：将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.7(优选0.6)时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1-1.0mmol/L(优选0.5mmol/L)进行诱导，即可高效表达本发明的重组甘露聚糖酶。

甘露聚糖酶活力的测定

为了准确表征本发明的甘露聚糖酶能否用于水基压裂液破胶，本发明建立了一种新颖的甘露聚糖酶活力测定方法。发明人首次提出，可以采用数字粘度计，例如上海方瑞仪器有限公司的LVDV-1型，实时跟踪黏度变化情况，绘制得到黏度变化曲线，用于甘露聚糖酶活力的测定。例如，可以由电脑或其它电子数据记录分析仪接收数字粘度计测得的黏度值并产生黏度变化的时间曲线，通过曲线拟合获得甘露聚糖酶的活力。

示例性的具体测定方法如下：

反应体系：150mL0.75%(w/v)瓜尔胶(或其衍生物)的溶液或水基压裂液的基液，在80°C保温10分钟，加入1mL1mg/mL DtMan粗酶液，迅速混匀后实时监控黏度变化过程。按如下黏度降半时间法进行计算：

1)残余黏度百分数的计算：

残余黏度%=100×η_t/η₀

其中η₀表示酶加入前胶液的黏度，η_t表示加入酶后t秒(酶作用时间t)时测得的溶液黏度。

2)以酶作用的时间为横坐标，残余黏度百分数为纵坐标作图，在图中找出残余黏度下降至50%时所对应的酶作用时间τ_1/2，单位为秒(s)。

3)酶活力(U_VIS)=3600/τ_1/2。

其中，酶表观活力单位的定义为：在酶活力测定条件下，在1小时内使0.75% (w/v)羟丙基瓜尔胶溶液黏度下降50%所需的酶量为1个活力单位(U_VIS)。

甘露聚糖酶的破胶应用

本发明的甘露聚糖酶可在各种需要的条件下用于破胶。例如，可以在下述条件下进行破胶：在pH4.0～10.0，温度为60～90°C的水基压裂液中，加入本发明的甘露聚糖酶，可以有效地使所述水基压裂液破胶。所述水基压裂液可以瓜尔胶或者瓜尔胶的衍生物(羟丙基瓜尔胶、羧甲基瓜尔胶、羧甲基羟丙基瓜尔胶等)为增稠剂，以硼砂或者有机硼为交联剂，并可含有各种必要的添加剂(如粘土稳定剂、防膨剂、助排剂、杀菌剂、温度稳定剂等)。

为了进一步提高水基压裂液的携沙能力，通常需要用交联剂交联瓜尔胶或其衍生物，增加聚合物的分子量，从而进一步增加水基压裂液黏度。最常用的交联剂为硼砂，硼砂在水溶液中水解为硼酸和氢氧化钠，硼酸进一步水解为四羟基合硼酸根离子(B(OH)₄ ^-)。四羟基合硼酸根离子与瓜尔胶分子结构上的cis-OH形成糖苷键，每个硼离子可以与源自于不同分子的连接四个cis-OH，将聚合物偶联，形成一个巨大的网络结构。由于微碱性(pH8.0～10.0)条件有利于硼酸的水解并促使硼离子与瓜尔胶的络合反应向正向进行，从而有利于瓜尔胶的交联形成凝胶，因此目前水基压裂液的pH均控制在微碱性范围。为此，发明人用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液控制基液的pH，采用上述黏度降半时间法考察了本发明的甘露聚糖酶在pH8.0、9.0和10.0条件下的破胶能力。为了确认本发明甘露聚糖酶的较大应用范围，发明人还用磷酸盐缓冲液(PBS)将基液pH控制在酸性及中性条件下，采用上述黏度降半时间法考察了本发明的甘露聚糖酶在酸性及中性条件下的破胶能力。本发明的甘露聚糖酶DtMan在这些条件下都显示了较好的活力，因此，可以作为优良的生物酶破胶剂。

水基压裂液中，除了必要的增稠剂、交联剂、支撑剂、破胶剂以外，还需要其他添加剂。这些添加剂可包括高温稳定剂（防止瓜尔胶自发水解引起的提早破胶）如硫代硫酸钠、甲醇等；杀菌剂（防止微生物掺入压裂液中影响压裂效果）如戊二醛等；黏土稳定剂（防止黏土的迁移堵塞裂缝）如KCl、CaCl₂或甲酸钠等。因此，发明人还考察了重组甘露聚糖酶DtMan与水基压裂液中各种添加剂，包括黏土稳定剂(3%KCl、3%KBr、10%CaCl₂、10%CaBr₂、6%HCOONa)，高温稳定剂(1%Na₂S₂O₃)，杀菌剂(0.005%戊二醛)的配伍性。实验结果证明DtMan与水基压裂液中的各种添加剂有非常良好的配伍性，适合用作生物酶破胶剂。

在实际应用中，水基压裂液是在室温下配制后，在强大的压力下压入油井中，油井内的温度随深度增加而升高，在高温油井中，井底的温度通常达到80°C，甚至更高。理想的破胶是发生在油井底部，且在压裂作业完成之后。这就要求水基压裂液配方中包含的破胶剂在室温条件下对瓜尔胶没有或者仅有很微弱的降解能力，而在高温如80°C时具有很高的活性以及较好的稳定性。因此，本发明考察了甘露聚糖酶DtMan在20、50、80°C三种条件下的破胶能力，并同商品酶

进行了对照试验。结果表明，在保持甘露聚糖酶DtMan与

在80°C活力相同的条件下，相同的酶量在中低温下反应时，DtMan与

的基础破胶活力存在着很大的差异。例如，在20°C和50°C条件下，甘露聚糖酶DtMan的活力仅为80°C活力的3%和18%，如此低的活力可以有效地避免过早地将水基压裂液提前破胶；但是，商品破胶酶

在20°C和50°C下的基础破胶活力却非常显著，分别高达80°C活力的41%和94%，这就不可避免地导致与酶一起注入油井的压裂液在没有到达预定位置之前或者在压裂作业没有完成的情况下过早破胶，显著减弱油气藏岩缝压裂的效果。可见，本发明的甘露聚糖酶DtMan成功地克服了现有破胶剂的技术缺陷，改进和完善了破胶剂的技术效果，除了提高酶在高温下的破胶活力之外，还降低了酶在常温下的基础活力。因此，本发明的酶活力对温度的敏感性和选择性有益于增加压裂与破胶作业的可控性和可行性。

本发明为了进一步研究甘露聚糖酶DtMan作为生物酶破胶剂的应用能力，配制了硼砂交联的水基压裂液（具体组成参考实施例8），并在80°C条件下进行了静态破胶实验。实验结果表明甘露聚糖酶DtMan破胶4小时后能有效地将水基压裂液黏度将为4mPa·s，有效地达到了破胶目的。而相同活力的商品破胶酶

在破胶12小时后，水基压裂液黏度为6mPa·s。此外，本发明从破胶液冷却后黏度回复能力和破胶液中残渣含量两方面分别考察了甘露聚糖酶DtMan和商品破胶酶的破胶程度。实验结果证明以DtMan为破胶剂的破胶液冷却后其黏度明显小于以商品破胶酶

为破胶剂的破胶液冷却后的黏度，同时以DtMan为破胶剂的水基压裂液破胶后所产生的残渣明显小于以商品破胶酶

为破胶剂的水基压裂液破胶后所产生的残渣，说明DtMan对羟丙基瓜尔胶分子的降解作用更为彻底，再次证明了甘露聚糖酶DtMan比商品破胶酶更适合用作高温生物酶破胶剂。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均为市售可得。

具体实施方式

发明人通过对实验室菌种的活性筛选，发现嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)CGMCC7283具有较高的甘露聚糖酶活性，进而对其甘露聚糖酶进行克隆表达，并验证其功能。本发明的甘露聚糖酶能高效降解瓜尔胶和羟丙基瓜尔胶及其类似结构的衍生物，有效降低以瓜尔胶及其衍生物为基础的水基压裂液的黏度，而且该酶在中低温时的基础活性低，与常见于水基压裂液的各种添加剂具有很好的配伍性，显示出优良的破胶性能和广泛的适用范围。

下文所述实施例以示例性而非限制性方式进一步说明本发明。实施例中所用材料的来源为：

嗜热网球菌ECU0693：本实验室筛选获得，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC7283；

表达质粒pET-43.1a：购自上海Novagen公司；

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：购自北京天根生化科技有限公司。

实施例1～2的过程如图2所示。

实施例1甘露聚糖酶基因的克隆

根据鸟枪法所得到的开放性阅读框为依据，设计PCR引物如下：

上游引物为：CGCGGATCCATGAAATTTACTCTACCTCTTCTTATCCTT(SEQ ID NO.5)；

下游引物为：CCGCTCGAGTTATTCTTCAACTTTCAAATTTGGTAGC(SEQ ID NO.6)；

其中，上游引物下划线部分为XhoI酶切位点，下游引物下划线部分为BamHI酶切位点。

以嗜热网球菌CGMCC7283的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix15μl，上游引物和下游引物(0.3μmol/L)各1μl， DNA模板1μl(0.1μg)，DSMO1μl和ddH₂O11μl。PCR扩增步骤为：(1)95°C，预变性5分钟；(2)94°C，变性1分钟；(3)55°C退火30秒；(4)72°C延伸1.5分钟；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72°C继续延伸10分钟，冷却至4°C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1200～2000bp区间的目标条带(图1)，获得一条完整的嗜热网球菌甘露聚糖酶全长基因序列，经DNA测序，全长1410bp，序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

实施例2重组表达质粒和重组表达转化体的制备

将实施例1所得的PCR产物在37°C用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切6小时，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段，其中含有正确的插入片段。将目标片段与同样经XhoI和BamHI酶切后的质粒pET-43.1a(+)混合，在T4DNA连接酶的作用下，4°C连接过夜得到重组表达质粒pET-DtMan。

将上述重组表达质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中。在含有氨苄青霉素的LB培养基抗性平板(培养基成分：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2%(w/v)，抗生素含量100mg/L)上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌株，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。转化液涂布到含有50mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-DtMan。

实施例3重组甘露聚糖酶的表达

将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含氨苄青霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37°C振荡培养过夜，按1%(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置37°C、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG作为诱导剂，37°C诱导5小时后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH6.0的缓冲液中，在冰水浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组甘露聚糖酶的粗酶液，如前文所述采用DNS试剂法测得活力约为84U_DNS/mg。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析，重组蛋白以部分可溶的形式存在。

实施例4重组甘露聚糖酶与商品破胶剂

在不同温度下的破胶能力测试

发明人在本实施例中考察了DtMan和

在20、50、80°C条件下降低羟丙基瓜尔胶溶液黏度的能力，反应体系为：150mL Gly-NaOH溶液(100mM，pH9.0)中加入1.125g羟丙基瓜尔胶，1.5g硫代硫酸钠，3g KCl，和活力为120U_vis的破胶剂(在80°C条件下用黏度降半时间法测得的活力值)。

80°C条件下，在初始阶段，一分钟内，DtMan和

均可快速降低羟丙基瓜尔胶溶液的黏度，此后，DtMan保持其活性，并在350s内将羟丙基瓜尔胶溶液的黏度降至5mPa·s，而

则反应缓慢。但是在50和20°C条件下，

却以相对较快的速度降低羟丙基瓜尔胶溶液的黏度。

发明人计算了DtMan和

在这三种温度条件下的反应初始速率。如表1所示，80°C条件下，两者反应初速率相同。随后，在其他反应条件均不变的情况下，只改变温度，测得

在50°C时活性仍然非常高，在20°C时活性仍然保持了80°C时的41%。而DtMan在50°C条件下，其活性仅仅为80°C时的18.5%，而在20°C时活性仅为3.7%。

为了进一步考察重组甘露聚糖酶DtMan适用的温度范围，发明人还用黏度降半时间法考察了甘露聚糖酶DtMan在60、70、90°C条件下的活力。

表1.温度对甘露聚糖酶DtMan和

活力的影响

实施例5不同pH条件下重组甘露聚糖酶的破胶能力测试

在pH4.0～10.0的条件下，考察重组甘露聚糖酶DtMan催化羟丙基瓜尔胶水解以降低羟丙基瓜尔胶溶液黏度的能力，所用羟丙基瓜尔胶溶液的组成包括：150mL不同pH的缓冲液(pH4.0～7.0时使用100mM PBS缓冲液，pH8.0～10.0时使用100mM Gly-NaOH缓冲液)，0.75%(w/v)的羟丙基瓜尔胶，1%(w/v)的硫代硫酸钠(抗氧化剂，抑制高温造成的HPG自发水解)。评估活力方法参考“发明详述”部分的黏度降半时间法。

表2显示各pH条件下酶促羟丙基瓜尔胶溶液黏度下降的初始速率，可见 DtMan在近中性或酸性条件下均表现出非常优秀的活性，但在碱性条件下酶活随pH的上升而有所下降。用DtMan进行破胶时，在pH8.0的碱性条件下，溶液黏度降至5mPa·s耗时仅9.3分钟；在pH9.0的条件下，溶液黏度降至5mPa·s需要耗时18.9分钟；而在pH10.0条件下，溶液黏度降至5mPa·s需要158.9分钟。表2所示数据证明甘露聚糖酶DtMan可用于碱性条件破胶，而且在水基压裂液用于酸性油井的时候同样具有非常杰出的破胶能力。

表2.pH对甘露聚糖酶DtMan活力的影响

实施例6重组甘露聚糖酶与水基压裂液添加剂的配伍性测试

发明人在本实施例中考察了重组甘露聚糖酶DtMan与水基压裂液中各种添加剂，包括基本盐(3%KCl、3%KBr、10%CaCl₂、10%CaBr₂、6%HCOONa)，高温稳定剂(10%CH₃OH、1%Na₂S₂O₃)，杀菌剂(0.005%戊二醛)的配伍性。配制了8种含有不同添加剂的羟丙基瓜尔胶溶液，各种添加剂的含量分别如下：3%KCl、3%KBr、10%CaCl₂、10%CaBr₂、6%HCOONa、10%CH₃OH、1%Na₂S₂O₃、0.005%戊二醛(C₅H₈O₂)。为了准确考察重组甘露聚糖酶DtMan与添加剂的配伍性，本实验同时采用黏度降半时间法和DNS试剂法两种方法来表征甘露聚糖酶的活性。每个实验条件一式三份地进行三次平行试验。空白试验中不添加任何添加剂，仅为羟丙基瓜尔胶溶液。

测试结果如表3所示，黏度法和DNS试剂法所测得的结果在趋势上保持一致，证明了黏度降半时间法的有效性和可靠性。从表3中可看出，在大多数条件下，重组甘露聚糖酶与添加剂显示出了良好的配伍性，重组甘露聚糖酶DtMan在高浓度钙盐10%(w/v)存在下活性受一定影响，但仍然显示约50%的相对活性。其它黏土稳定剂、杀菌剂或高温稳定剂对酶的活性均没有显著影响。

表3甘露聚糖酶与水基压裂液添加剂配伍性测试结果*

*DNS法和黏度降半时间法所得活性均为相对值，单位为%。

实施例7重组甘露聚糖酶对瓜尔胶及其衍生物溶液的降解性能测试

在本实施例中，发明人考察了重组甘露聚糖酶对瓜尔胶及其衍生物(瓜尔胶，羟丙基瓜尔胶，羧甲基瓜尔胶，羧甲基羟丙基瓜尔胶)溶液的黏度降低能力。

反应体系：150mL100mM Gly-NaOH溶液(100mM，pH9.0)150mL，1.125g瓜尔胶(或羟丙基瓜尔胶，羧甲基瓜尔胶，羧甲基羟丙基瓜尔胶)，1.5g硫代硫酸钠，3g KCl，1mg重组甘露聚糖酶DtMan。测定方法为黏度降半时间法。测定结果如表4所示。

表4.重组甘露聚糖酶对瓜尔胶及其衍生物溶液黏度降低能力表

实施例8静态破胶能力测试

本实施例中，发明人考察了DtMan在羟丙基瓜尔胶与硼砂交联状态下的催化破胶能力。

水基压裂液按照国家标准《水基压裂液性能评价方法》SY/T5107-2005配制。先配制除增稠剂以外的基液，包括pH缓冲液、黏土稳定剂、稳定剂、杀菌剂，待其完全溶解后，缓慢加入羟丙基瓜尔胶，磁力搅拌以促使其充分溶解。反应体系中的各组分含量如表5所示。

基液配制完成后，静置4小时以使增稠剂羟丙基瓜尔胶充分溶胀。随后再次搅拌基液，加入破胶剂，搅拌30秒后迅速加入交联剂，继续搅拌2分钟，立刻放入预先预热的密闭反应器中，再将反应器置于80°C烘箱中，开始静态破胶实验。待反应0.5、1、2、4、12、24小时后取出反应液，测定其黏度。为了检测破胶结果的可靠性，进行了对照实验，对照组不加破胶剂，其他组分含量相同。

表5.水基压裂液的组分及含量

实验结果：空白对照试验中，4小时以内，水基压裂液黏度保持在50mPa·s以上，12小时后黏度为34mPa·s。而加入重组甘露聚糖酶DtMan的水基压裂液，于0.5小时后黏度已降为17mPa·s，2小时后黏度为6mPa·s，4小时后黏度为4mPa·s，已达到破胶的要求，反应进程如图5所示。

表6.静态破胶进程

实施例9破胶程度分析

考察了破胶液冷却后黏度回复能力和破胶液中残渣含量。

破胶液冷却后黏度回复能力分析方法：按照实施例8中所述方法，将反应12小时和24小时后的反应液迅速置入4°C冰箱中，冷藏1小时后取出用粘度计测定冷却后的反应液的黏度。

破胶液中残渣含量分析方法：按照实施例8中所述方法，取100mL反应12小时和24小时后的热反应液，将其全部倒入离心管中，3000rpm离心30分钟，取上清测黏度；用蒸馏水洗涤残渣，再次离心1小时，倒去上清，残渣在80°C恒温干燥箱中烘干至恒重。

实验结果：选择DtMan作为破胶剂的时候，水基压裂液的低温黏度回复能力非常低。以冷却后的破胶液黏度来比较，水基压裂液在采用

破胶后的低温黏度回复能力是采用DtMan破胶后的66倍。此外，以DtMan作为破胶剂时所形成的残渣量远小于以

作为破胶剂时所形成的残渣量。

表7.破胶程度分析

实施例10突变酶的克隆表达

采用定点突变方法对实施例1中所得到的甘露聚糖酶DtMan全长序列(SEQ ID No.1)进行适当的碱基突变，将甘露聚糖酶DtMan的第76位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，第228位异亮氨酸突变为甘氨酸，第315位谷氨酸变为甘氨酸，第318位色氨酸变为半胱氨酸，第410位天冬酰胺变为赖氨酸，得到的突变基因的序列如SEQ ID No.3所示。其编码DtMan^mut，该酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

采用如实施例2和3所述的方法对突变基因进行克隆和表达，制备重组突变甘露聚糖酶DtMan^mut。用DtMan^mut替代DtMan以实施例5-9相同的条件进行反应，获得的实验效果与实施例5-9基本相同。在此基础上，发明人比较了DtMan和DtMan^mut的反应特性和稳定性，具体实验数据如表7所示。可见，DtMan^mut的破胶能力和反应特性与DtMan大致相当，而80°C的半衰期有所延长。

表8.甘露聚糖酶突变前后实验结果对比

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围内。

Claims

1.一种分离的表达甘露聚糖酶的嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)CGMCC7283。

2.一种甘露聚糖酶，其特征在于，所述甘露聚糖酶是：

(a)具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质；或

(b)具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的蛋白质；或

(c)由SEQ ID No.2或4所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有甘露聚糖酶活性的衍生蛋白质。

3.一种甘露聚糖酶的编码基因，其特征在于，所述基因编码的蛋白质是：

(a)具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质；或

(b)具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的蛋白质；或

(c)由SEQ ID No.2或4所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有甘露聚糖酶活性的衍生蛋白质；

可选地，所述基因的碱基序列为：

(1)如SEQ ID No.1所示；

(2)如SEQ ID No.3所示；

(3)对(1)或(2)所示碱基序列的一个或多个碱基进行替换、缺失或增加得到的多聚核苷酸的同系物，前提是其所编码的蛋白质仍具有甘露聚糖酶活性。

4.一种重组表达载体，其包含如权利要求3所述的甘露聚糖酶编码基因。

5.一种重组表达转化体，其包含如权利要求4所述的重组表达载体。

6.一种制备重组甘露聚糖酶的方法，所述方法包括：培养如权利要求5所述的重组表达转化体，获得重组表达的甘露聚糖酶或含重组甘露聚糖酶的重组生物细胞。

7.用如权利要求2所述的甘露聚糖酶或如权利要求6所述方法获得的重组甘露聚糖酶降低水基压裂液黏度的方法，其中所述甘露聚糖酶用作破胶剂，所述水基压裂液是以瓜尔胶及其衍生物为基础的；可选地，所述甘露聚糖酶用作破胶剂时的反应条件为：温度在60至90°C之间，pH4.0～10.0。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述瓜尔胶及其衍生物具体包括：瓜尔胶、羟丙基瓜尔胶、羧甲基瓜尔胶和羧甲基羟丙基瓜尔胶。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的水基压裂液中含有0.35～0.75%的瓜尔胶或其衍生物。

10.一种水基压裂液，其中含有瓜尔胶及其衍生物作为增稠剂，其特征在于，所述水基压裂液中还含有如权利要求2所述的甘露聚糖酶或如权利要求6所述方法获得的重组甘露聚糖酶作为破胶剂；可选地，所述水基压裂液中含有0.35～0.75%的瓜尔胶或其衍生物作为增稠剂，0.04～0.06%的硼砂作为交联剂，2.5～10%的KCl或KBr或CaCl₂或CaBr₂或HCOONa作为黏土稳定剂，0.005%的戊二醛作为杀菌剂，0.1～1%的Na₂S₃O₃作为抗氧化剂。