CN103328507A - Alphabody文库及其产生方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含至少100种不同序列单链Alphabody多肽的单链Alphabody文库，其中所述Alphabody多肽在确定的5至20个多样化氨基酸残基位置组中的至少一处彼此相异，且其中所述多样化氨基酸残基位置的至少70%但非全部位于所述Alphabody的环，螺旋表面或连接子区域中。本发明还提供通过本发明的方法可获得的Alphabody文库和Alphabody的使用方法。

Description

ALPHABODY文库及其产生方法

发明领域

本发明涉及下列领域：多肽文库及其产生方法，以及此类多肽文库用于开发用于预防、治疗或诊断目的的Alphabody的用途。

背景技术

（基于）抗体的文库在过去被广泛用于选择和鉴别特异性结合一种或多种目的靶化合物的蛋白。

各种类型的抗体文库的适用性不同。例如，免疫文库的特征在于高百分比的针对有限量的靶抗原(免疫原)的高亲和性抗体，因为在此类文库中，体内抗体亲和性成熟已在经免疫的动物或人患者中发生了。因此，具有相对小的复杂性的免疫文库能够产生特定抗原的高亲和性结合子。然而，通常对于每个所研究的抗原或患者组，需要构建单独的免疫文库。此外，由于显然的伦理学原因，不可能进行人的主动免疫接种，因此，通过这种方法针对大多数靶标产生人抗体是不可行的。

另一方面，在幼稚和合成的（基于）抗体的文库中，抗体库呈递不通过抗原驱动的抗体成熟而演变。因此，这些文库的复杂性必须非常高以确保足够的统计学机会使得所述文库中的某些抗体能够以合理的或高的亲和性结合任意给定的靶标。

抗体是相当大的蛋白并且对于处理（如加热、冻融、蛋白水解性裂解和硫酸铵沉淀）是敏感的。此外，抗体的大小限制其施用模式。

因此，鉴于抗体支架的不足，仍存在对于备选和改进的蛋白文库(及其产生方法)的需求，其可靠地产生对于各种目的靶蛋白具有高亲和性和活性的优质蛋白。

WO2010/066740和EP 2 161 278将Alphabody结构描述为单链三股α螺旋卷曲螺旋支架。然而，迄今为止还未公开或暗示如何能够操作Alphabody支架以获得下述Alphabody文库：其产生大量能够以足够的亲和性特异性结合目的靶分子的结合伴侣。

发明概述

当前的发明人开发了新的方法，其允许产生Alphabody文库(在本文中称作“本发明的(单链)Alphabody文库”)。此外，发明人发现了本发明的Alphabody文库能够被用于筛选和/或选择特异性结合目的靶分子的一种或多种Alphabody。因此，当前的发明人开发了包含不同序列Alphabody多肽的新的和改进的文库，由其中可分离出以高亲和性和特异性结合目的靶分子的结合子并且所述结合子克服现有技术结合子的一种或多种不足。另外，发现了与本领域中已知的传统(免疫球蛋白和非免疫球蛋白)结合剂相比，所述分离的Alphabody结合子具有数个优势。所述优势包括而不限于下列事实：它们是致密的且尺寸小(在10至14kDa之间，这10倍更小于抗体)，它们极度(热)稳定(具有超过100℃的融化温度)，对于pH的改变和蛋白水解性降解相对不敏感。此外，从所述文库且通过本发明的方法分离的Alphabody结合子是高度可溶的且具有基于天然基序但是通过蛋白质工程化技术设计的结构。

本发明的一个重要方面是被选择用于在本发明的Alphabody文库中引入氨基酸序列变化的Alphabody区域（即多样化Alphabody区域）。如本文中将详述的，对于折叠的Alphabody支架结构定义了不同的区域，即“螺旋表面”、“沟”和“环”区域且每个区域具有其本身固有的三维(3-D)形状。例如，Alphabody沟将固有地具有(拉长的)凹陷形状，螺旋表面将固有地具有(拉长的)凸起形状，而连接子片段将固有地具有柔性的(可变的)形状。Alphabody在这方面是独特的，因为它们是将沟、螺旋表面和柔性的连接子片段(或环)统一在一个且相同的支架结构中的唯一的支架分子。

然而，当前的发明人考虑了构建这样的Alphabody文库，其中所引入的序列变化不唯独地限于一个特定的区域。

因此，在本发明的一个方面中提供单链Alphabody文库，其包含至少100种不同序列单链Alphabody多肽，其中所述Alphabody多肽在确定的5至20个多样化氨基酸残基位置组中的至少一处彼此相异，且其中至少70%但不是所有所述多样化氨基酸残基位置位于：

(i)Alphabody多肽的第一α螺旋中的七序列e位置和平行于第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列g位置，和任选地在Alphabody多肽的第一α螺旋中的七序列b位置和/或Alphabody多肽的第二α螺旋中的七序列c位置处,

或

(ii)Alphabody多肽的一个α螺旋中的七序列b，c和f位置,

或

(iii)连接Alphabody多肽的两个连续α螺旋的连接子片段中的位置。

因此，根据本发明，至少70%但不是所有多样化氨基酸残基位置位于选自本文中所描述的“环”、“螺旋表面”或“连接子”区域的区域之一中。

在某些特别的实施方案中，本发明的单链Alphabody文库可以是包含至少两个不同的构成文库的Alphabody文库的混合物。

在其它方面，本发明还提供核酸和载体文库，其编码本发明的单链Alphabody(多肽)文库或本发明的单链Alphabody文库的混合物。

在其它方面，本发明提供宿主细胞的文库，其中每个宿主细胞最大限度包含核酸或载体文库的一个成员，所述核酸或载体文库编码本发明的单链Alphabody(多肽)文库或本发明的单链Alphabody文库的混合物。

在另一个方面，本发明提供本发明的单链Alphabody文库或本发明的单链Alphabody文库的混合物用于体外蛋白进化（例如噬菌体展示、酵母展示、细菌展示或mRNA展示）的用途。

在其它方面，本发明提供用于产生本发明的单链Alphabody文库的方法，这些方法包括至少下列步骤：

a)产生编码本发明的单链Alphabody文库或编码本发明的单链Alphabody文库的混合物的核酸或载体文库，和

b)在适于产生所述单链Alphabody文库的条件下表达所述核酸或载体文库。

在这些生产方法的某些实施方案中，表达所述核酸或载体文库的所述步骤b)包括将所述核酸或载体文库的单个成员引入宿主细胞中以及在适于产生所述单链Alphabody文库的条件下在培养基中培养所述宿主细胞。

在其它具体的实施方案中，用于产生本发明的单链Alphabody文库的方法还包括从宿主细胞和/或从培养基中分离步骤b)中所产生的单链Alphabody文库的步骤。

在其它方面，本发明提供本发明的单链Alphabody文库在产生对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性的单链Alphabody多肽中的用途。更特别地，本发明提供用于产生一种或多种单链Alphabody多肽的方法，所述一种或多种单链Alphabody多肽对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性，或对于目的靶蛋白或细胞具有可检测的体外活性，所述方法至少包括下列步骤：

a)产生根据本发明的单链Alphabody文库或根据本发明的单链Alphabody文库的混合物,

b)选择一种或多种单链Alphabody多肽，其对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性，或对于目的靶蛋白或细胞的可检测的体外活性，和任选地,

c)分离所述一种或多种单链Alphabody多肽。

在某些特别的实施方案中，选择对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性的一种或多种单链Alphabody多肽的步骤包括：

b1)使目的靶分子与根据本发明的单链Alphabody文库或根据本发明的单链Alphabody文库的混合物相接触,

b2)从与所述目的靶分子相接触的单链Alphabody文库或单链Alphabody文库的混合物中鉴别对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性的一种或多种单链Alphabody多肽;和任选地,

b3)确定对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性的所述一种或多种单链Alphabody多肽的氨基酸或核苷酸序列。

在用于产生对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性的一种或多种单链Alphabody多肽的方法的某些特别的实施方案中，还通过重复执行所述选择的接触步骤b1)和鉴别步骤b2)而富集所述Alphabody文库或Alphabody文库的混合物中对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性的单链Alphabody多肽。

在其它方面，本发明还提供对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性，或对于目的靶蛋白或细胞具有可检测的体外活性的单链Alphabody多肽，其中这些单链Alphabody多肽可通过本发明的方法获得。

在其它方面，本发明提供编码通过本发明的方法产生的单链Alphabody多肽的核酸。

在其它方面，本发明提供包含编码通过本发明的方法产生的单链Alphabody多肽的核酸的载体和包含编码通过本发明的方法产生的单链Alphabody多肽的核酸或载体的宿主细胞。

发明详述

如本文中所使用的，除非上下文清楚地另行规定，单数形式“一个(a)”，“一个(an)”和“所述”包括单数和复数指代物。

如本文中所使用的，术语“包含（comprising）”，“包含（comprises）”和“包含（comprised of）”与“包括（including）”，“包括（includes）”或“含有（containing）”，“含有（contains）”同义，并且是包含性的或开放式的且不排除其它的、未列举的成员、元素或方法步骤。

通过端点对数值范围的列举包括归入相应范围内的所有数字以及部分，还有所列举的端点。

如本文中所使用的，当指可测量的值（例如参数、量、持续时间等）时术语“约”意在涵盖距所指定的值+/-10%或更少，优选+/-5%或更少，更优选+/-1%或更少，且更优选+/-0.1%或更少的变化，只要在所公开的发明中适于进行这种变化。要理解修饰语“约”所指的值本身也是具体且优选地公开的。

如本文中所使用的，“(本发明的)Alphabody”能够一般性地被定义为自我折叠的、单链、三股、主要是α螺旋的、卷曲螺旋氨基酸序列。

因此，“单链Alphabody”中的术语“单链”是多余的，但其通常被包括以强调Alphabody的组成为单一多肽链，这与许多已知的寡聚(例如三聚)肽卷曲螺旋的出现相反。更特别地，如本发明的情境中所使用的，Alphabody可被定义为具有通式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的氨基酸序列、多肽或蛋白，其中

·HRS1，HRS2和HRS3中的每一个都独立地为由2至7个连续的七序列重复单元组成的七序列重复序列（HRS），全部七序列a和d位置中的至少50%被异亮氨酸残基占据，每个HRS都以位于七序列a或d位置的脂肪族或芳香族氨基酸残基开始和结束，且HRS1、HRS2和HRS3一起形成三股、α螺旋、卷曲螺旋结构;和

·L1和L2中的每一个都独立地为连接子片段，其分别共价连接HRS1与HRS2以及HRS2与HRS3，并且由至少4个氨基酸残基组成，优选其中的至少50%选自脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸。

如本文中所使用的，“平行Alphabody”应当具有下述含义：(本发明的)Alphabody，其中所述三股、α螺旋、卷曲螺旋结构的α螺旋一起形成平行的卷曲螺旋结构，即其中所有三个α螺旋都是平行的卷曲螺旋。

如本文中所使用的，“反向平行Alphabody”应当具有下述含义：(本发明的)Alphabody，其中所述三股、α螺旋、卷曲螺旋结构的α螺旋一起形成反向平行卷曲螺旋结构，即其中两个α螺旋是平行的而第三个α螺旋相对于这两个螺旋是反向平行的卷曲螺旋。

如从本文中的进一步描述将变得清楚的，本发明还设想了包含具有通式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的序列的多肽，但是其在某些特别的实施方案中包含其它基团、部分和/或残基，其被共价连接（更特别地经N和/或C末端共价连接）至具有式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的基本Alphabody结构。这些在本文中被称作“本发明的Alphabody多肽”。

术语“七序列”、“七序列单元”或“七序列重复单元”在本文中可互换地使用且在本文中应具有下列含义：在每个Alphabody的七序列重复序列中重复2次或更多次的7-残基(多)肽片段且被表示为“abcdefg”或“defgabc”，其中符号“a”至“g”表示常规的七序列位置。例如通过使用专门的软件例如Lupas等人的COILS方法(Science1991，252：1162-1164;http：//www.russell.embl-heidelberg.de/cgi-bin/coils-svr.pl)将常规的七序列位置分配给本发明的Alphabody、多肽或组合物中存在的七序列、七序列单元或七序列重复单元中的特定氨基酸残基。然而，应注意Alphabody中所存在的所述七序列或七序列单元不严格限于上述表示(即“abcdefg”或“defgabc”)（如从本文中的进一步描述将变得清楚的）并且在其最广泛的意义上构成7-残基(多)肽片段本身，其至少包含可分配的七序列位置a和d。

术语“七序列a位置”、“七序列b位置”、“七序列c位置”、“七序列d位置”、“七序列e位置”、“七序列f位置”和“七序列g位置”分别是指Alphabody的七序列、七序列重复或七序列重复单元中常规的“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”和“g”氨基酸位置。

如本文中所使用的，“七序列基序”应当具有7-残基(多)肽模式的含义。“abcdefg”类型的“七序列基序”可通常被表示为“HPPHPPP”，而“defgabc”类型的“七序列基序”可通常被表示为“HPPPHPP”，其中符号“H”表示非极性或疏水氨基酸残基而符号“P”表示极性或亲水性氨基酸残基。然而，应注意Alphabody中所存在的七序列基序不严格限于上述表示(即“abcdefg”，“HPPHPPP”，“defgabc”和“HPPPHPP”)，如从本文中的进一步描述将变得清楚的。

如本文中所使用的，“七序列重复序列”(“HRS”)应具有由n个连续的七序列组成的氨基酸序列或序列片段的含义，其中n为等于或大于2的数字。

在(如本文中所定义的)Alphabody的单链结构的情境中，术语“连接子”、“连接子片段”或“连接子序列”在本文中可互换地使用并且指这样的氨基酸序列片段：其为单链(单体)Alphabody的连续氨基酸序列的一部分且使所述Alphabody的HRS序列相互共价连接。

在本发明的情境中，“卷曲螺旋”或“卷曲螺旋结构”应在本文中可互换地使用且基于公知常识以及本文的描述和所引述的其它参考文献对于本领域技术人员将是清楚的。在这方面特别参考关于卷曲螺旋结构的综述文章，例如Cohen and Parry Proteins 1990，7：1-15;Kohnand Hodges Trends Biotechnol1998，16：379-389;Schneider等人FoldDes 1998，3：R29-R40;Harbury等人Science 1998，282：1462-1467;Mason and Arndt ChemBioChem 2004，5：170-176;Lupas and GruberAdv Protein Chem 2005，70：37-78;Woolfson Adv Protein Chem 2005，70：79-112;Parry等人J Struct Biol 2008，163：258-269;McFarlane等人Eur J Pharmacol 2009，625：101-107。

“Alphabody的α螺旋部分”在本文中应具有下列含义：具有α螺旋二级结构的Alphabody的那部分。此外，具有α螺旋二级结构的Alphabody的完整部分的任意部分也被认为是Alphabody的α螺旋部分。更特别地，在结合位点的情境中，当位于Alphabody的α螺旋部分中的一个或多个氨基酸促成所述结合位点时，所述结合位点被认为是由Alphabody的α螺旋部分形成的。

Alphabody的α螺旋的“溶剂朝向”或“溶剂暴露”区域在本文中应具有下列含义：直接暴露于其所存在的溶剂、环境、周遭或周围环境，或直接与其所存在的溶剂、环境、周遭或周围环境相接触的Alphabody上的那部分。此外，直接暴露于所述溶剂或直接与所述溶剂相接触的Alphabody的完整部分的任何部分也被认为是Alphabody的溶剂朝向或溶剂暴露区域。更特别地，在结合位点的情境中，当位于Alphabody的溶剂朝向部分中的一个或多个氨基酸促成所述结合位点时，所述结合位点被认为是由所述Alphabody的溶剂朝向部分形成的。

术语“Alphabody的沟”在本文中应具有下列含义：相应于凹陷的、沟样局部形状的Alphabody上的那部分，其是由Alphabody中任意空间上相邻的α螺旋对形成的。

如本文中所使用的，氨基酸残基将由其全称或根据标准三字母或单字母氨基酸编码显示。

如本文中所使用的，术语“同源性”表示来自相同或不同分类的两个大分子（特别是两个多肽或多核苷酸）之间至少一级结构的相似性，其中所述相似性是由于共享的祖先。优选地，同源的多肽在二级或三级结构中也将显示相似性。因此，术语“同源物”表示具有所述一级和任选地（对于蛋白质性的大分子）二级或三级结构相似性的如此相关的大分子。为了比较两个或更多个核苷酸序列，可使用本领域技术人员已知的方法来计算第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性（百分比）”，例如通过用第一核苷酸中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目除以所述第一核苷酸序列中的核苷酸总数并乘以100%，或通过使用用于序列比对的已知计算机算法例如NCBI Blast。在确定两个Alphabody之间的序列同一性程度时，本领域技术人员可考虑所谓的“保守性”氨基酸取代，其通常可被描述为这样的氨基酸取代：其中一个氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基所取代并且这对于多肽的功能、活性或其它生物学特性有很小的影响或基本上没有影响。可能的保守性氨基酸取代对于本领域技术人员将是清楚的。如果两个或更多个Alphabodie或者两个或更多个核酸序列在其整个长度中具有100%的序列同一性，则称它们是“完全相同的”。

如果本发明的Alphabody，多肽或组合物针对特定靶标（或者其至少一部分或片段）具有亲和性、特异性和/或特异性地针对所述靶标，则称所述本发明的Alphabody，多肽或组合物为“特异性地结合”所述靶标。

如本文中所使用的，可基于亲和性和/或亲合力来确定本发明的Alphabody，多肽或组合物的“特异性”。本发明的Alphabody，多肽或组合物的“亲和性”由所述Alphabody，多肽或组合物与其所结合的目的靶蛋白相解离的平衡常数表示。KD值越低，所述Alphabody，多肽或组合物与其所结合的目的靶蛋白之间的结合强度越强。备选地，所述亲和性也可以亲和常数(KA)的形式表达，其对应于1/KD。取决于具体的目的靶蛋白，本发明的Alphabody，多肽或组合物的结合亲和性可用本领域技术人员已知的方式确定。

本领域中通常已知的是KD可被表示为复合物的解离速率常数（表示为kOff(以秒-1或s-1表示)）与其结合速率常数（表示为kOn(以摩尔-1秒-1或M-1s-1表示))之比。大于约1毫摩尔的KD值通常被认为表示非结合或非特异性结合。

本发明的Alphabody，多肽或组合物的“亲合力”是本发明的Alphabody，多肽或组合物与相关目的靶蛋白之间的结合强度的量度。亲合力与目的靶蛋白上的结合位点和本发明的Alphabody，多肽或组合物上的结合位点之间的亲和性以及本发明的Alphabody，多肽或组合物上存在的相关结合位点的数目均相关。可通过本领域技术人员已知的方法手段来确定结合亲和性、kOff和kOn率。这些方法包括但不限于RIA(放射性免疫测定)，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫测定，免疫放射测定，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散测定，蛋白质印迹，沉淀反应，凝集测定(例如凝胶凝集测定，血凝测定等)，补体固定测定，免疫荧光测定，免疫电泳测定，等温滴定量热法，表面等离子共振，荧光活化细胞分选分析等。

与本发明的Alphabody，多肽或组合物结合第二目的靶蛋白的亲和性相比，如果其结合第一目的靶蛋白的亲和性为至少5倍，例如至少10倍，例如至少100倍，优选至少1000倍更高，则称本发明的Alphabody，多肽或组合物“相对于第二目的靶蛋白而特异于第一目的靶蛋白”。因此，在某些实施方案中，当称Alphabody，多肽或组合物相对于第二目的靶蛋白而“特异于”第一目的靶蛋白时，其可特异性地结合(如本文中所定义的)所述第一目的靶蛋白，而非所述第二目的靶蛋白。

当本发明的Alphabody，多肽或组合物以高于任意下列方法的检测极限的亲和性结合目的蛋白时，则称其对所述目的蛋白“具有可检测的结合亲和性”，所述方法包括但不限于RIA(放射性免疫测定)，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫测定，免疫放射测定，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散测定，蛋白质印迹，沉淀反应，凝集测定(例如凝胶凝集测定，血凝测定等)，补体固定测定，免疫荧光测定，免疫电泳测定，等温滴定量热法，表面等离子共振，荧光活化细胞分选分析等。

本发明的Alphabody，多肽或化合物的“半衰期”可一般性地被定义为所述Alphabody，多肽或化合物的体内血清或血浆浓度减少50%所需的时间。可以本领域技术人员已知的任何方法（例如通过药代动力学分析）确定本发明的Alphabody，化合物或多肽的体内半衰期。如对于本领域技术人员将是清楚的，可使用参数（例如t1/2-α，t1/2-β和曲线下面积(AUC)）来表述所述半衰期。增加的体内半衰期通常被表征为参数t1/2-α，t1/2-β以及曲线下面积(AUC)中的一个或多个且优选所有三个的增加。

如本文中所使用的，术语“抑制”、“减少”和/或“防止”可指根据本发明的Alphabody，多肽或组合物（的应用），其特异性结合目的靶蛋白并且抑制、减少和/或防止所述目的靶蛋白与其天然结合伴侣之间的相互作用。术语“抑制”、“减少”和/或“预防”也可指根据本发明的Alphabody，多肽或组合物（的应用），其特异性地结合目的靶蛋白并抑制、减少和/或防止所述目的靶蛋白的生物学活性，如使用合适的体外、细胞或体内测定所测量的。因此，“抑制”、“减少”和/或“防止”也可指根据本发明的Alphabody，多肽或组合物（的应用），其特异性地结合目的靶蛋白并抑制、减少和/或防止所述目的靶蛋白所参与的一种或多种生物学或生理学机制、效应、应答、功能通路或活性。取决于目的靶蛋白，根据本发明的Alphabody，多肽或组合物作为拮抗剂的这种作用可用本领域中已知的任何合适的方式和/或使用本领域中已知的任何合适的(体外而通常为细胞或体内)测定来确定。在这种情境中，以本领域中已知的任何合适的方式和/或使用本领域中已知的任何合适的体外测定而确定的Alphabody，多肽或组合物作为拮抗剂的所述体外作用，在本文中也被称作对于目的靶蛋白的“可检测的体外(拮抗性)活性”。

如本文中所使用的，术语“增强”、“增加”和/或“活化”可以指根据本发明的Alphabody，多肽或组合物（的应用），其特异性地结合目的靶蛋白并增强、增加和/或活化目的靶蛋白与其天然结合伴侣之间的相互作用。术语“增强”、“增加”和/或“活化”也可指根据本发明的Alphabody，多肽或组合物（的应用），其特异性地结合目的靶蛋白并且增强、增加和/或活化所述目的靶蛋白的生物学活性，如使用合适的体外、细胞或体内测定所测量的。因此，“增强”、“增加”和/或“活化”也可指根据本发明的Alphabody，多肽或组合物(的应用)，其特异性地结合目的靶蛋白且增强、增加和/或活化所述目的靶蛋白所参与的一种或多种生物学或生理学机制、效应、应答、功能通路或活性。取决于目的靶蛋白，根据本发明的Alphabody，多肽或组合物作为激动剂的这种作用可用本领域中已知的任何合适的方式和/或使用本领域中已知的任何合适的(体外而通常为细胞或体内)测定来确定。

本发明的Alphabody，多肽或组合物的抑制或拮抗活性或者增强或激动活性可以是可逆的或不可逆的，但是对于制药和药理学应用将通常可逆地发生。

如本文中所使用的，本发明的Alphabody，多肽，组合物或核酸序列被认为是“(为)基本上分离的(形式)”，这相应于这样的Alphabody：当其是从产生其的宿主细胞和/或培养基中提取或纯化的。

关于Alphabody、多肽和(药物)组合物，Alphabody，多肽或药物组合物上存在的术语“结合区域”、“结合位点”或“相互作用位点”在本文中应当具有下列含义：所述Alphabody、多肽或药物组合物上负责与靶分子结合的特定位点、部分、结构域或氨基酸残基段。此类结合区域基本上由来自与所述靶分子相接触的Alphabody的特定氨基酸残基组成。

如果本发明的Alphabody，多肽或组合物对于两种不同的目的靶蛋白均为特异性的(如本文中所定义的)，则称本发明的Alphabody，多肽或组合物对于这些不同的目的靶蛋白显示出“交叉反应性”。

如果Alphabody含有一个针对或特异性结合目的靶标的位点、决定簇、部分、结构域或氨基酸残基段的结合位点，则称本发明的Alphabody，多肽或组合物是“单价的”。在其中Alphabody的两个或更多个结合位点针对或特异性结合目的靶标的相同位点、决定簇、部分、结构域或氨基酸残基段的情形中，称所述Alphabody为“二价的”(在Alphabody上有两个结合位点的情形中)或“多价的”(在所述Alphabody上有超过两个结合位点的情形中)例如三价的。

当指Alphabody时，术语“双特异性的”表示a)Alphabody的两个或更多个结合位点针对或特异性结合相同的目的靶标但不是所述靶标上相同的(即针对或特异性结合不同的)位点、决定簇、部分、结构域或氨基酸残基段，或者b)Alphabody的两个或更多个结合位点针对或特异性结合不同的目的靶分子。在Alphabody上存在超过两个结合位点的情形中使用术语“多特异性的”。

因此，如本文中所使用的，“双特异性Alphabody”或“多特异性Alphabody”应当具有下列含义：分别包含两个或至少两个结合位点的式(N)HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3(-C)的单链Alphabody，其中所述两个或更多个结合位点具有不同的结合特异性。因此，如果分别有两个或超过两个不同的结合区域存在于相同的、单体的、单结构域Alphabody中，则本文中的Alphabody被认为是“双特异性”或“多特异性”的。

如本文中所使用的，术语“预防和/或治疗”包括预防和/或治疗某种疾病和/或病症，预防某种疾病和/或病症的出现，减缓或逆转某种疾病和/或病症的进展，预防或减缓与某种疾病和/或病症相关的一种或多种症状的出现，减少和/或改善与某种疾病和/或病症相关的一种或多种症状，减少某种疾病和/或病症的严重性和/或持续时间，以及一般性地本发明的Alphabody或多肽对被治疗的患者或受试者有益的任何预防或治疗效果。

本说明书中所引述的所有文件均在此以其整体通过引用而并入。除非另行定义，公开本发明中所使用的所有术语（包括技术和科学术语），均具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。介由进一步的指导，包括了术语定义以更好地理解本发明的教导。

当前的发明人鉴别了用于制造(即，构建、生产、产生)单链Alphabody文库[在本文中称作“（本）发明的(单链)Alphabody文库”或“（本）发明的文库”]的方法，所述文库包含不同序列的Alphabody多肽。更特别地，本发明的所述Alphabody文库是基本上随机的文库，这在于它们包含多样化位置，而在所述位置处放置基本上随机的氨基酸残基。本发明的文库具有产生结合不同的目的靶蛋白的优质Alphabody或Alphabody多肽的固有潜能。

当前的发明人进一步考虑了使用随机化的Alphabody文库，其中在Alphabody的特定、确定的区域内引入氨基酸序列变化。所述特定、确定的Alphabody区域基本上相应于（如本文中所定义的）Alphabody内的沟、螺旋表面或连接子片段。相应的Alphabody文库在本文中被分别称作“沟”文库，“螺旋”(或“螺旋表面”)文库或“连接子”(或偶尔地“环”)文库。

本发明的重要方面是下列事实：被选择用于引入氨基酸序列变化的Alphabody区域(即，所述多样化Alphabody区域)每一个在折叠的Alphabody支架结构中都具有其自身固有的三维(3-D)形状。例如，Alphabody沟将固有地具有(拉长的)凹陷形状，螺旋表面将固有地具有(拉长的)凸起形状，且连接子片段将固有地具有柔性的(可变的)形状。Alphabody在这方面是独特的，因为它们是将沟，螺旋表面和柔性的连接子片段(或环)统一在一个且相同的支架结构中的唯一的支架分子。

鉴于这种独特的特征，当前的发明人考虑了构建Alphabody文库，其中所引入的序列变化不唯独地限于一个特定的区域。例如，当构建连接子或环文库时可在螺旋表面中引入有限的序列变化。备选地，可在沟文库中邻接多样化位置的完全暴露的螺旋残基位置处引入有限的序列变化。备选地，可在沟或螺旋表面文库中侧翼于多样化α螺旋的连接子片段内引入有限的序列变化。在确定的、特征性区域之外的所述有限的序列变化(与确定的、特征性区域（例如沟，螺旋表面或连接子片段)内的序列变化相组合）将通常被限制在少于所有多样化氨基酸残基位置的30%以维持大多数多样化残基位置所位于的所述特征性区域(通常，所有多样化位置的至少70%将位于沟、螺旋表面或连接子片段内)的(凹陷，凸起或可变形状)形状特性。

发明人还发现了本发明的Alphabody文库可被用于筛选和/或选择特异性结合目的靶分子的一种或多种Alphabody或Alphabody多肽。

还进一步显示了，使用本发明的Alphabody文库所鉴别和/或分离的靶标结合Alphabody和Alphabody多肽克服了现有技术的靶标结合分子的一个或多个不足。的确，发现了从本发明的文库中分离的靶标结合Alphabody能够以至少相当于且经常优于传统结合试剂的亲和性结合靶标。另外，可从本发明的所述文库中选择和分离的靶标结合Alphabody保持对于基本Alphabody支架结构（例如WO2010/066740和EP2161278中所提供的Alphabody支架）起初所鉴别的优势，这包括但不限于小的尺寸(10至14kDa之间)，极度的热稳定性，高蛋白酶抗性，高可工程化性(在多个取代通常将不消除它们正确且稳定的折叠的意义上)，以及基于天然基序且通过蛋白质工程化技术重新设计的结构。最后，使用具有不同固有形状的Alphabody支架文库的可能性解决了支架文库(从中需获取好的结合子)与靶分子(其形状可非常多样)之间一般(缺少)固有的形状互补性的技术问题。此外，任选地使用不同固有形状的Alphabody文库的组合或混合物可帮助解决(缺少)与目的靶分子的固有形状互补性的技术问题。

作为主要的目的，本发明提供单链Alphabody文库。这些本发明的单链Alphabody文库的特征在于，它们包含不同序列单链Alphabody多肽的集合。

本发明的文库内所包含的的不同序列Alphabody多肽的特征在于这些多肽在确定的多样化氨基酸残基位置组中彼此相异。因此，术语“不同序列”是指在本发明的文库的两个或更多个Alphabody多肽之间确定的氨基酸残基位置组中出现序列变化或序列差异。

Alphabody序列的文库或集合可含有任何适当数目的不同Alphabody序列，例如至少2，至少5，至少10，至少50，至少100，至少1000，至少10,000，至少10⁵，至少10⁶，至少10⁷，至少10⁸，至少10⁹或更多个不同序列的(单链)Alphabody。

更特别地，根据本发明的不同Alphabody序列的文库或集合含有至少100种不同序列的Alphabody多肽，例如至少200，至少300，至少400，至少500，例如至少1000，至少10000，至少10⁵，至少10⁶，至少10⁷，至少10⁸，至少10⁹或更多个序列。

在具体的实施方案中，本发明的Alphabody序列组、集合或文库(如本文中可互换地使用的)含有至少100种不同序列的Alphabody多肽。

此外，本发明的单链Alphabody文库的特征在于，包含在那些文库中的不同序列的单链Alphabody多肽在确定的多样化氨基酸残基位置组中的至少一处彼此相异。

因此，在具体的实施方案中，本发明的文库中所包含的不同Alphabody序列（也在本文中称作不同序列的(单链)Alphabody）仅在确定的（即固定的或预先确定的）氨基酸残基位置组中彼此相异。

所述确定的多样化氨基酸残基位置组由数个特定的氨基酸残基位置组成，其特征在于当将所产生的文库中不同序列的(单链)Alphabody相互比较时，氨基酸残基类型的多种或多样性。

当指不同序列Alphabody的文库时，“多样化氨基酸残基位置”的概念是指当将来自所述Alphabody文库的不同序列Alphabody的至少两个氨基酸序列相互比较时，至少两个不同的氨基酸残基类型(确定类型的氨基酸残基，例如天然氨基酸残基类型)所位于的氨基酸残基位置(注意，这些位置将不是对于所述文库的任意两个不同序列Alphabody不同的，而是所述文库包含至少两个在此氨基酸残基位置相异的不同序列Alphabody)。当指不同序列Alphabody的文库时，“多样化氨基酸残基位置组”是指当将来自所述Alphabody文库的不同序列Alphabody的至少两个氨基酸序列相互比较时，至少两个不同的氨基酸残基类型所位于的氨基酸残基位置组(注意，这些位置将不是对于所述文库的任意两个不同序列Alphabody不同的)。当指不同序列Alphabody的文库时，“确定的多样化氨基酸残基位置组”是指当将来自所述不同序列Alphabody的文库的所有氨基酸序列同时相互比较时，至少两个不同的氨基酸残基类型所位于的特定的氨基酸残基位置组。因此，同时比较来自所述不同序列Alphabody的文库的所有氨基酸序列，并鉴别出在这种同时比较中至少两个不同的氨基酸残基类型所位于的氨基酸残基位置，允许了鉴别Alphabody文库中所述确定的多样化氨基酸残基位置组。在此提出，本领域技术人员将知晓如何确定序列文库（例如单链Alphabody文库）中的序列。还要理解，在氨基酸序列水平或代表（编码）这些氨基酸序列的核苷酸序列水平均能够将Alphabody序列进行比较。

比较两个或更多个不同序列Alphabody的优选方法是基于成对或多重序列比对，这是由已知的用于自动化序列比对的计算机算法（例如NCBI Blast）产生的。备选地，可基于熟练的用户所产生的成对或多重序列比对来比较两个或更多个不同序列Alphabody，这种比对方法也已知为手动序列比对。应用于不同序列Alphabody的自动化和手动序列比对技术均可基于总体序列同一性或总体序列相似性(或者同源性或对应性)的最大化，或基于所述不同序列Alphabody的核心氨基酸位置(即，如本文中所定义的七序列a和d位置)的序列同一性或相似性的最大化。

因此，可从Alphabody文库中所有不同序列Alphabody、或至少所有不同序列Alphabody的代表性亚组的氨基酸或核苷酸比较来推断确定的多样化氨基酸残基位置组。还理解在产生Alphabody文库后，可发生所谓的非预期突变、插入或缺失。这种非预期的突变，插入或缺失是在设计或产生所述Alphabody文库时不预期被多样化的位置所发生的核苷酸或氨基酸突变，插入或缺失。如本领域技术人员将理解的且在用目前的工艺技术产生所述Alphabody文库的条件下，这种非预期的突变，插入或缺失将仅在所述Alphabody文库序列中偶尔地且以分散的方式(即在不同的位置处)发生。优选地，这种非预期的突变，插入或缺失将以少于10%，更优选少于5%，更优选少于2%，1%或甚至少于1%的频率在任何给定的位置发生。因此，可基于相较于在显示预期序列变化的位置处所观察到的变化性时它们的低频率来鉴别Alphabody文库内非预期的突变，插入或缺失。因此，不具有关于本发明的Alphabody文库的设计或产生的知识而确定所述文库内确定的多样化氨基酸残基位置组的优选方法是通过下述：确定此文库内含有的至少代表性序列亚组的核苷酸或氨基酸序列，随后在（优选多重）比对中比较所有确定的序列，随后鉴别观察到序列变化的位置，随后鉴别在每个可变位置观察到的核苷酸或氨基酸残基类型的频率，随后鉴别具有高于给定的截止百分比的突变、插入或缺失频率的位置，其中这一截止百分比被设为10%，5%，2%，1%或甚至少于1%（例如0.5%，0.1%或0%(在此情形中所有所观察到的变化都被包括在所述确定的多样化氨基酸残基位置组中)）。备选地，如果能够获得关于单链Alphabody文库的原始设计或产生的知识，则此文库中的所述多样化氨基酸残基位置组优选基于所述知识而非基于对文库本身的分析。下文中描述了用于设计单链Alphabody文库（包括选择多样化位置）的方法。

在根据本发明的文库中，所述确定的组中多样化氨基酸残基位置的数目可在5至20个氨基酸残基位置的范围内。因此，本发明的文库中所述确定的多样化氨基酸残基位置组可包含5至20个，例如5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个确定的多样化氨基酸残基位置。

本发明的文库中所包含的不同序列的Alphabody多肽可在所述确定的5至20个位置组中的至少一个氨基酸残基位置处彼此相异。因此，例如当文库中确定的多样化氨基酸残基位置组包含13个多样化氨基酸残基位置的组时，本发明的文库中不同序列的Alphabody多肽可在这些氨基酸残基位置中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或全部13个处彼此相异。因此，清楚的是本发明的文库中所包含的不同序列Alphabody多肽序列可通过所述确定的5至20个多样化氨基酸残基位置组中存在的序列差异而彼此相区别，条件是在所述确定的多样化位置组的那些位置之外的位置处可发生其它，优选偶尔、非预期的突变，插入或缺失。

作为用于构建本发明的文库的基础所使用的Alphabody支架（即作为参照或模板结构）形成表示为HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的单链，3股α螺旋卷曲螺旋结构。七序列重复序列(HRS)1，2和3中的每一个都采取α螺旋构型并且被称作Alphabody的(α)螺旋。这三个螺旋(存在于Alphabody中)通常分别被称作螺旋A，B和C。

取决于多样化氨基酸残基位置组位于Alphabody结构内的何处，利用Alphabody单链卷曲螺旋支架可产生不同类型的Alphabody文库。多样化氨基酸组的位置也决定通过应用本发明的方法在Alphabody上产生的结合位点的类型和位置。在此情境中可提及“沟文库”(其中结合位点主要是位于由Alphabody三个螺旋中的两个之间的沟中的氨基酸残基形成的)，“螺旋文库”(其中结合位点主要是由位于Alphabody的三个α螺旋之一的溶剂朝向侧的氨基酸残基形成的)，或“环文库”(其中结合位点主要由位于一个或多个实行环角色的Alphabody连接子序列中的氨基酸残基形成的)。

其中所述多样化氨基酸残基位置唯独地(即100%)位于Alphabody的沟、表面或连接子中的文库在本文中称作“纯沟”、“纯表面”或“纯环”文库。然而，如本文在下文中将详述的，所述方法料想利用Alphabody文库，其不需要是“纯的”沟、表面或环文库。

在本发明的具体实施方案中，提供了Alphabody文库，其中多样化氨基酸残基位置主要位于Alphabody三个螺旋中的两个之间的沟中。在这些实施方案中，在包含在本发明的文库内的Alphabody中，用于与靶蛋白结合的结合位点主要由位于Alphabody的三个α螺旋中的两个之间的沟内氨基酸残基位置形成。

参与形成Alphabody中两个邻接的α螺旋之间的沟（表面）的残基通常位于七序列e和g位置，但是某些更为暴露的b和c位置以及某些基本上被包埋的核心a和d位置也可促成沟表面；这将基本上取决于置于这些位置处的氨基酸侧链的大小。

取决于所产生的Alphabody的性质（其是作为平行的或反向平行的单链卷曲螺旋折叠），需要被多样化以获得沟文库的Alphabody序列内的位置将变化。

当Alphabody的两个空间上相邻的α螺旋(即用于结合的沟位于它们之间的那些)平行时（如对于平行Alphabody中的所有螺旋对以及对于反向平行Alphabody中螺旋A和C的情形），位于沟中的结合位点可通过至少某些来自第一螺旋的e残基和至少某些来自平行的第二螺旋的g残基的多样化形成。除了这些残基之外，所述结合位点可任选地还通过使第一螺旋中b位置处的残基和/或平行的第二螺旋中c位置处的残基多样化而形成。因此，在这些实施方案中，为了获得其中结合位点位于e/g沟中的Alphabody，用于产生靶标特异性Alphabody的Alphabody文库的多样化氨基酸残基位置位于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e位置和平行于所述第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列g位置，且任选地还位于所述Alphabody多肽的第一α螺旋中的七序列b位置和/或第二α螺旋中的七序列c位置。在本发明的具体实施方案中，料想了提供这样的Alphabody文库，其中所述多样化氨基酸残基位置主要(即至少70%)位于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e(和任选地还位于b)位置和平行于所述第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列g(和任选地还位于c)位置。

备选地或另外地，可利用包含反向平行放置的两个空间上相邻的α螺旋的Alphabody支架(如果料想结合位点位于这些反向平行螺旋之间的沟中的话)。这通常是对于反向平行Alphabody中的螺旋A与B或B与C的情形。在这些实施方案中，对于需要多样化以确保结合位点由反向平行螺旋之间的沟形成的多样化氨基酸残基位置的类型通常有两种可能性。

在第一种可能性中，两个反向平行螺旋之间的沟是由至少某些来自第一螺旋的e残基和至少某些来自反向平行的第二螺旋的e残基形成的。因此，为了获得在所述e/e沟之内形成的结合位点，至少这些氨基酸残基位置是多样化的。除了这些残基之外，结合位点可任选地还由第一螺旋中b位置处的残基和/或反向平行的第二螺旋中b位置处的残基形成。因此，在这些实施方案中，为了获得针对目的靶蛋白且其中所述结合位点位于e/e沟中的Alphabody，所述多样化氨基酸残基位置位于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e位置和反向平行于所述第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列e位置，以及任选地还位于所述Alphabody多肽的第一α螺旋中的七序列b位置和/或第二α螺旋中的七序列b位置。在本发明的具体实施方案中，料想了提供这样的Alphabody文库，其中所述多样化氨基酸残基位置主要（即至少70%)位于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e(及任选地还有b)位置和反向平行于所述第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列e(及任选地还有b)位置处。

在第二种可能性中，两个反向平行螺旋之间的沟是由至少某些来自第一螺旋的g残基和至少某些来自反向平行的第二螺旋的g残基形成的。因此，为了获得在所述g/g沟中形成的结合位点，至少这些氨基酸残基位置经多样化。除了这些残基之外，所述结合位点可任选地还由第一螺旋中c位置处的残基和/或反向平行的第二螺旋中c位置处的残基形成。因此，在这些实施方案中，为了获得其中所述结合位点位于g/g沟中的Alphabody，所述多样化氨基酸残基位置位于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列g位置和反向平行于所述第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列g位置处，以及任选地还位于Alphabody多肽的第一α螺旋中的七序列c位置处和/或第二α螺旋中的七序列c位置处。在本发明的具体实施方案中，料想提供Alphabody文库，其中所述多样化氨基酸残基位置主要(即至少70%)位于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列g(和任选地还有c)位置处和反向平行于所述第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列g(及任选地还有c)位置处。

因此，将是清楚的是平行的Alphabody（其具有每个都彼此平行朝向的三个α螺旋）含有三个e/g沟。另一方面，反向平行的Alphabody（其包含彼此平行的两个α螺旋和反向平行的一个α螺旋）含有一个e/g沟、一个e/e沟和一个g/g沟。Alphabody沟的任何部分也被认为是沟区域。

原则上，“纯的”沟文库是这样的Alphabody文库，其特征在于所述文库中的多样化氨基酸残基位置均位于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e和b或g和c位置以及所述Alphabody多肽的第二α螺旋中的七序列e和b或g和c位置处。当前的发明人已发现，下述Alphabody文库产生更多且更好的靶标特异性Alphabody，所述文库的特征在于，此类文库中的多样化氨基酸残基位置不是唯独地而仅是主要位于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e和b或g和c位置处以及所述Alphabody多肽的第二α螺旋中的七序列e和b或g和c位置处。因此，本发明的方法特别料想了这样的Alphabody文库，其中在所述文库中多样化氨基酸残基位置主要(即至少70%)而非唯独地位于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e和b或g和c位置处以及Alphabody多肽的第二α螺旋中的七序列e和b或g和c位置处。在具体的实施方案中，所使用的Alphabody文库中多样化氨基酸残基位置至少70%位于所示的形成沟的位置。在其它具体的实施方案中，所述文库中的至少一个多样化氨基酸残基位置位于下述位置之外：其相应于Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e和b或g和c位置以及相应于所述Alphabody多肽的第二α螺旋中的七序列e和b或g和c位置。

此外或备选地，提供了Alphabody文库，其中结合位点主要由Alphabody的三个螺旋之一的表面形成。因此，在这些实施方案中，提供了Alphabody文库，其中所述多样化氨基酸残基位置主要位于Alphabody多肽的三个螺旋之一的溶剂朝向侧。此类Alphabody文库在本文中被称作“螺旋表面文库”或“螺旋文库”。

被认为是在Alphabody表面的氨基酸残基位置可以位于螺旋A、B或C中。在具体的实施方案中，所述Alphabody文库含有Alphabody，其中所述多样化氨基酸残基相应于螺旋C的完全溶剂暴露的氨基酸残基。最突出因而为溶剂朝向的残基位于Alphabody的每个α螺旋中的b、c和f位置。因此，在具体的实施方案中，本发明的Alphabody文库包含多样化氨基酸残基位置，其位于Alphabody多肽的一个α螺旋中的七序列b、c和f位置。

原则上，“纯的”螺旋表面文库是这样的Alphabody文库，其特征在于所述文库中的多样化氨基酸残基位置均位于Alphabody多肽的一个α螺旋中的七序列b、c和f位置。当前的发明人已发现下述Alphabody文库产生更多且更好的靶标特异性Alphabody，所述文库的特征在于，所述多样化氨基酸残基位置不是唯独地而仅是主要位于Alphabody多肽中α螺旋的七序列b、c和f位置处。因此，本发明特别料想了这样的Alphabody文库，其中所述文库中的多样化氨基酸残基位置主要(即至少70%)但非唯独地位于所述Alphabody多肽的α螺旋中的七序列b、c和f位置处。在具体的实施方案中，所使用的Alphabody文库中的多样化氨基酸残基位置至少70%位于所示的溶剂暴露位置。在其它具体的实施方案中，所述文库中的至少一个多样化氨基酸残基位置位于下述位置之外：其相应于Alphabody多肽的α螺旋的七序列b、c和f位置。

此外或备选地，提供了Alphabody文库，其中Alphabody上的结合位点主要由位于将α螺旋相互连接的Alphabody连接子序列之一中的氨基酸残基位置形成。在平行的Alphabody中，两个连接子将卷曲螺旋结构的远端相互连接(即它们在位于相对端的螺旋C末端和螺旋N末端之间形成连接)。在反向平行Alphabody中，两个连接子将卷曲螺旋结构的近端相互连接(即它们在位于相同端的螺旋C末端和螺旋N末端之间形成连接)。在这两种Alphabody中，所述连接子均被认为在构象上是柔性的。此外，这两种类型的Alphabody中的连接子也被认为关于其氨基酸序列是柔性的。因此，可使这两种类型的Alphabody中的连接子经受氨基酸序列变化而不对所述Alphabody卷曲螺旋支架的折叠及稳定性有显著影响。因此，提供了Alphabody“环”或“连接子文库”，其中在任意的平行或反向平行Alphabody类型中任意的连接子片段的氨基酸位置中引入序列多样化。在具体的实施方案中，提供了这样的文库，其中一个连接子片段的所有氨基酸残基位置均被多样化。在其它具体的实施方案中，位于接近连接子片段中间的所选残基位置被多样化(为了不干扰α螺旋末端)。在其它具体的实施方案中，接近连接子片段末端之一的所选残基位置可被改变；虽然这增加了干扰α螺旋末端的风险，所述Alphabody通常将足够稳定以容忍这种潜在的干扰。在其它的具体实施方案中，环序列的部分或全部长度中的交替残基位置可以被多样化。

“纯的”连接子或环文库是这样的Alphabody文库，其特征在于所述文库中多样化氨基酸残基位置均位于Alphabody多肽的连接子片段中。当前的发明人发现了，下述Alphabody文库产生更多且更好的靶标特异性Alphabody，所述文库的特征在于所述多样化氨基酸残基位置不是唯独地而仅是主要位于Alphabody多肽中的连接子位置。因此，本发明特别料想了这样的Alphabody文库，其中所述文库中多样化氨基酸残基位置主要(即至少70%)而非唯独地位于Alphabody多肽的连接子之一中。在具体的实施方案中，所提供的Alphabody文库中多样化氨基酸残基位置至少70%位于Alphabody连接子片段之一中的位置处。在其它具体的实施方案中，所述文库中的至少一个多样化氨基酸残基位置位于Alphabody多肽的连接子片段的氨基酸残基位置之外。

如上文所示，在本发明的方法的具体实施方案中，提供了Alphabody文库，其特征在于多样化氨基酸组含有至少一个、更特别地两个或更多个下述氨基酸残基位置：其分别位于所述Alphabody的沟、螺旋表面或连接子片段之外而结合位点分别主要由所述沟、螺旋表面或连接子片段形成。在这些实施方案中，具有分别主要由沟、螺旋表面或连接子片段形成的结合位点的Alphabody的所述沟、螺旋表面或连接子片段中多样化氨基酸位置的百分比少于100%。然而，位于所述沟、螺旋表面或连接子片段中的多样化氨基酸位置的百分比通常为至少70%。

因此，在本发明的具体实施方案中，所述Alphabody文库不是纯沟、纯表面或纯环文库。更特别地，所述多样化氨基酸位置的至少70%而非全部（例如所述多样化氨基酸位置的少于95%、例如少于90%或少于85%）位于所述Alphabody的沟、螺旋表面或连接子片段内。

取决于多样化的氨基酸残基位置的数目，上文所述的百分比将对应于不同数目的实际氨基酸残基位置。因此，如从上文所述将是清楚的，在本发明的方法的具体实施方案中，提供了Alphabody文库，其中这5至20个位置的例如至少5%(即5至20个多样化位置中的至少1个位置)，或特别地至少10%(即至少1个或至少2个位置)，或特别地至少15%(即至少1到至少3个位置)，或特别地至少20%(即，至少1到至少4个位置)，或特别地至少25%(即，至少2到至少5个位置)，或特别地30%(即2至6个位置之间)位于下述之外的位置：

(i)Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e或g位置和第二α螺旋中的七序列e或g位置，以及任选地Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列b或c位置和/或Alphabody多肽的第二α螺旋中的七序列b或c位置，例如

(i1)Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e位置和平行于所述第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列g位置，以及任选地Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列b位置和/或Alphabody多肽的第二α螺旋中的七序列c位置,

或

(i2)Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e位置和反向平行于所述第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列e位置，以及任选地Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列b位置和/或所述Alphabody多肽第二α螺旋中的七序列b位置,

或

(i3)Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列g位置和反向平行于所述第一α螺旋的第二α螺旋中的七序列g位置，以及任选地Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列c位置和/或所述Alphabody多肽第二α螺旋中的七序列c位置,

或者

(ii)Alphabody多肽的一个α螺旋中的七序列b，c和f位置,

或者

(iii)连接Alphabody多肽的两个连续α螺旋的连接子片段中的位置。

因此，文库中不同序列(单链)Alphabody在确定的5至20个氨基酸残基位置组中有差异，其中对于每个文库，这5至20个位置中的至少70%(即至少4到至少14个位置)，例如至少75%(即至少4到至少15个位置)，至少80%(即至少4到至少16个位置)，至少85%(即至少4到至少17个位置)，例如至少90%(即至少5到至少18个位置)，例如至少95%(即至少5到至少19个位置)，或更多例如100%(即全部5至20个位置)位于所述文库中每个Alphabody多肽的：

(i)由两个邻接的α螺旋形成的、或它们之间的沟处，或

(ii)一个α螺旋的溶剂朝向表面，或

(iii)将两个α螺旋相互连接的连接子片段之一中；

更特别地，这些多样化位置位于对于上述每种选择所列的位置处。

应注意，对于其中多样化氨基酸残基位置主要(即至少70%)位于所述沟中的Alphabody文库，位于所述七序列e，g，b或c位置之外的其余多样化位置可例如位于所述Alphabody的七序列a位置，七序列d位置，七序列f位置或连接子中的氨基酸残基位置处。本发明的Alphabody的每个七序列重复序列中的a位置和d位置(也称作核心残基)为形成基本上为溶剂屏蔽的(即包埋的)Alphabody部分的卷曲螺旋结构的氨基酸残基位置。料想在大多数本发明的Alphabody沟文库中，保持这些核心残基中的全部或某些是保守的从而维持所述Alphabody的稳定性。在这些实施方案中，其余的多样化位置可位于例如连接子残基位置或七序列f位置处。

类似地，对于其中多样化氨基酸残基位置主要(即至少70%)位于Alphabody螺旋的溶剂朝向表面的Alphabody文库，不位于所述七序列b，c或f位置的其余的多样化位置可例如位于所述Alphabody的七序列e，g，a或d位置或连接子中的氨基酸残基位置。如上文中详述的，料想了在大多数根据本发明的Alphabody螺旋表面文库中，保持这些核心残基（在a和d位置）中的全部或某些是保守的从而维持所述Alphabody的稳定性。在这些实施方案中，其余的多样化位置可位于例如七序列e或g位置处或者连接子残基位置处。

最后，对于其中多样化氨基酸残基位置主要(即至少70%)位于Alphabody的连接子片段中的Alphabody文库，不位于所述连接子片段中的其余多样化位置可例如位于所述Alphabody的七序列e，g，f，b，c，a或d位置，或者所述两个连接子片段的另一个中的氨基酸残基位置。再次地，Alphabody的每个七序列单元中的a位置和d位置在某些实施方案中将不是变化的以确保稳定性。在这些实施方案中，其余的多样化氨基酸残基位置可位于所述Alphabody的七序列e，g，f，b或c位置或者所述两个连接子片段的另一个中的氨基酸残基位置。

当提及由每个Alphabody多肽的两个邻接的α螺旋形成的或者它们之间的沟中的多样化氨基酸残基位置时，是指这些多样化氨基酸残基位置在包含在文库中的每个Alphabody多肽中位于一个且相同的沟（即由两个相同的邻接α螺旋形成的沟）中。类似地，当提及位于Alphabody多肽的一个α螺旋中的多样化氨基酸残基位置时，是指这些多样化氨基酸残基位置在包含在文库中的每个Alphabody多肽中位于一个且相同的α螺旋中。另外，当提及位于将两个连续的α螺旋相互连接的连接子片段内的位置处的多样化氨基酸残基位置时，是指这些多样化氨基酸残基位置在包含在文库中的每个Alphabody多肽中位于将两个连续的α螺旋相互连接的一个且相同的连接子片段中。

然而，可以料想，将不同的沟、表面或环文库进行组合而用于例如开发针对特定靶标的Alphabody。更特别地，可以料想，将包含主要位于螺旋C表面上的多样化氨基酸位置的螺旋表面文库与包含主要位于螺旋A表面上的多样化氨基酸位置的螺旋表面文库和/或包含主要位于螺旋B表面上的多样化氨基酸位置的螺旋表面文库相组合。类似地，可以料想，将包含主要位于e/g沟中的多样化氨基酸位置的沟文库与包含主要位于e/e沟中的多样化氨基酸位置的沟文库和/或包含主要位于g/g沟中的多样化氨基酸位置的沟文库相组合。类似地，可以料想，将包含主要位于第一连接子片段中的多样化氨基酸位置的连接子文库与包含主要位于第二连接子片段中的多样化氨基酸位置的连接子文库相组合。最后，可以料想，将一个或多个螺旋表面文库与一个或多个沟文库和/或一个或多个连接子文库相组合。组合单链Alphabody文库的一种实际的方式可通过例如以大约相等的量混合不同的文库来实现。

可以不同的形式提供本发明的Alphabody文库，并且其可以是但不限于蛋白质文库，核酸文库，载体文库或宿主细胞文库。

在具体的实施方案中，本发明的文库为宿主细胞文库，其中每个宿主细胞最大限度包含核酸或载体文库的一个成员，每个所述核酸或载体文库成员编码本发明的单链Alphabody(多肽)。更特别地，所述文库是其中表达Alphabody的宿主细胞的文库。

在具体的实施方案中，所述文库的Alphabody被展示在噬菌体颗粒、核糖体、细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞或任何其它合适的(微)生物体的表面上，从而促进筛选或选择以分离对于目的靶蛋白或细胞具有可检测的结合亲和性或可检测的体外活性的所需Alphabody序列。

因此，在具体的实施方案中，本发明的文库代表蛋白序列的组或集合并因此是Alphabody蛋白质文库。所述文库的Alphabody成员在所述文库中可作为分别的Alphabody序列呈现，或者可作为不同Alphabody序列的混合物被提供。

在其它方面，本发明提供了核酸和载体文库，其编码本发明的单链Alphabody(多肽或蛋白质)文库或单链Alphabody文库的混合物。

在其它方面，本发明提供用于产生本发明的单链Alphabody文库的方法。因此，这些方法包括产生多肽，核酸或载体文库。

本领域技术人员将理解,本发明的Alphabody文库通常是通过重组DNA技术产生的。更特别地，编码每一个都在特定氨基酸位置处不同的Alphabody的核酸序列的文库是通过对模板序列进行定点或随机诱变而获得的。如本领域技术人员将理解的，可通过例如在编码氨基酸序列的核苷酸序列中的相应位置选择(引入)“NNK”或“NNS”密码子而在所述氨基酸序列中的特定位置处引入随机的氨基酸残基。

因此，产生(部分)随机化的单链Alphabody文库需要将模板或标准或参照Alphabody支架序列中的特定位置（部分）随机化。用于产生此类文库的方法是本领域技术人员已知的并且可用商业服务来产生此类文库。以不同的方式突变确定目的位置处相关氨基酸残基的核苷酸，例如用于获得编码不同Alphabody的核苷酸序列的文库。

在本发明的具体实施方案中，存在于所述单链Alphabody文库中的单链Alphabody多肽的恒定、非多变部分不相应于天然存在的蛋白序列，因此代表所述支架的非多变部分的序列是非天然来源的。的确，通常本发明文库中的Alphabody多肽的恒定、非多变部分是人工序列。

模板Alphabody支架序列是基于其(接近-)最优的物理化学特性而选择的参照Alphabody的序列。如WO2010/066740中的实施例所示，单链Alphabody通常具有高的热(即热力学)稳定性，高可溶性，对于pH变化的高抗性，以及重要地，对于氨基酸序列变化的高容忍性。可选择这种单链Alphabody或具有合适的物理化学特性（例如对于氨基酸序列变化的高容忍性）的其它单链Alphabody作为参照或模板Alphabody支架(或支架序列)用于产生本发明的单链Alphabody文库。

在本发明的文库中料想的多样化料想涵盖天然存在的和合成的氨基酸残基。然而，在本发明的具体实施方案中，所述多样化氨基酸残基位置唯独地被天然存在的氨基酸类型占据，例如但不限于天然氨基酸类型，例如甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，组氨酸，精氨酸，赖氨酸，苏氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸和缬氨酸。

在具体的实施方案中，产生本发明的Alphabody多肽文库包括产生至少100种成员的核酸或载体文库的步骤，其中每个成员编码包含单链Alphabody的多肽并且其中所编码的不同序列的Alphabody多肽在确定的5至20个多样化氨基酸残基位置组中的至少一处彼此相异。在具体的实施方案中，这些多样化氨基酸残基位置中的至少70%但非全部位于：

(i)Alphabody多肽第一α螺旋的七序列e或g位置和第二α螺旋的七序列e或g位置，以及任选地Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列b或c位置和/或所述Alphabody多肽第二α螺旋中的七序列b或c位置，

或

(ii)Alphabody多肽的一个α螺旋中的七序列b、c和f位置，或

(iii)连接Alphabody多肽的两个连续的α螺旋的连接子片段中的位置。

在宿主细胞中表达这些Alphabody序列后，获得了Alphabody多肽文库。可以不同的方式实现随机文库的产生，如本领域技术人员将知晓的。一般地，用于产生本发明的Alphabody文库的方法通常包括用编码单链Alphabody文库的核酸或载体文库或感染性颗粒转化或转染合适的宿主细胞的步骤。此外，用于产生Alphabody文库的方法通常包括在适于所述宿主细胞增殖(复制、生长)的条件下培养所述宿主细胞的步骤以及在适于产生（表达、合成）所编码的单链Alphabody的条件下的培养步骤。在适于增殖或表达的条件下培养宿主细胞通常是在包含适于细胞生长或诱导表达的组分的培养基的存在下完成的。在具体的实施方案中，用于产生本发明的Alphabody文库的方法还包括从所述宿主细胞或培养基中分离所产生的单链Alphabody的步骤。还应注意的是，除了所述不同序列多肽之外，所表达的Alphabody文库还可含有多个拷贝的相同多肽。

在其它方面，本发明提供本发明的单链Alphabody文库用于产生针对目的靶蛋白的Alphabody的用途。更特别地，本发明提供了本发明的Alphabody文库或单链Alphabody文库的混合物用于体外展示方法（例如噬菌体展示，酵母展示，细菌展示或mRNA展示）的用途。

本发明因此还提供用于产生对于目的靶分子或细胞具有可检测的结合亲和性(如本文中所定义的)，或具有可检测的体外活性(如本文中所定义的)（例如可检测的体外拮抗活性或激动活性）的一种或多种单链Alphabody的方法。这些方法是基于随机文库的产生和对于目的靶分子的结合或活性的筛选的概念。

为了获得靶标特异性Alphabody，用于产生靶标特异性Alphabody的方法包括下列步骤：a)产生根据本发明的单链Alphabody文库和b)从所述根据本发明的单链Alphabody文库中选择至少一个对于目的蛋白或细胞具有可检测的结合亲和性或可检测的体外活性的单链Alphabody。

因此，根据本发明的用于产生对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性，或对于目的靶蛋白或细胞具有可检测的体外活性的一种或多种单链Alphabody的方法至少包括下列步骤：

a)产生根据本发明的单链Alphabody文库或根据本发明的单链Alphabody文库的混合物,

b)选择一种或多种对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性，或对于目的靶蛋白或细胞具有可检测的体外活性的单链Alphabody，和任选地,

c)分离所述一种或多种单链Alphabody。

可以不同的方式进行选择特异性结合或针对目的靶分子或蛋白或对目的靶分子或蛋白具有可检测的结合亲和性的单链Alphabody的步骤，例如通过通常已知为选择法的方法方式或者通过通常已知为筛选法的方法方式。这两种方法均料想了从包含所需和非所需组分的原始集合(即Alphabody文库)中鉴别和随后分离(即选择步骤)所需组分(即Alphabody文库成员)。在选择法的情形中，将通常通过其中应用了所需的特性以获得所需目标的步骤来分离文库成员；在这种情形中，所需的特性通常限于对于给定目的靶分子的高亲和性特性而所需目标通常限于将所述高亲和性文库成员与其它的相分离。这种方法通常已知为亲和性选择方法，并且在本发明的情境中，这种亲和性选择方法将被应用于单链Alphabody文库为了选择对于目的蛋白或者其子域或亚区具有高亲和性的Alphabody的目的。备选地，在筛选法的情形中，通常将通过下列步骤分离文库成员：其中相关于给定的所需特性单独检测所有文库成员或至少文库成员的主要集合，并且其中保留具有所需特性的成员而丢弃不具有所需特性的成员；在这种情形以及在本发明的情境中，所需的特性可关于对于目的蛋白或其子域或亚区的高亲和性，或者功能活性（包括抑制、减少和/或防止目的靶蛋白的活性）。因此，提出了本发明的方法的选择步骤可以通过(亲和性)选择技术或者基于亲和性或基于活性的功能性筛选技术完成，这两种技术都引起与本发明的单链Alphabody文库的未选择的Alphabody相比，选择具有有益(有利、所需、卓越)的亲和性或活性特性的一种或多种单链Alphabody。

因此，在具体的实施方案中，所述选择步骤包括使本发明的单链Alphabody文库或本发明的单链Alphabody文库的混合物与目的靶分子相接触，和确定所述靶分子与所述文库中存在的Alphabody之间的结合。可以本身已知的任何合适的方式确定Alphabody与目的靶分子或蛋白的特异性结合，所述方式包括例如生物淘选，Scatchard分析和/或竞争结合测定，例如放射性免疫测定(RIA)，酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，以及本领域中已知的它们的不同变体。

应注意，可以不同的方式进行Alphabody文库的选择或筛选，并且将对于所述Alphabody文库的提供形式对所述方法进行调整。用于展示和选择或筛选多样化多肽序列或编码所述多样化多肽序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的合适的方法、技术和宿主生物体（且其可被应用于Alphabody）是本领域技术人员已知的。这种方法被描述于例如，Georgiou等人Nat Biotechnol 1997，15：29-34;Wittrup CurrOpin Biotechnol 2001，12：395-399;Lipovsek和Pluckthun J ImmunolMethods 2004，290：51-67;Reiersen等人Nucl Acids Res 2005，33：e10;Levin和Weiss Mol BioSyst 2006，2：49-57;Bratkovic Cell MolLife Sci 2010，67：749-767中。

在具体的实施方案中，作为噬菌体文库提供本发明的Alphabody文库并通过下述鉴别结合的Alphabody：使所述噬菌体与经标记的靶分子相接触，之后通过检测或经标记的结合的靶标的选择性集合来找回结合的噬菌体。

在具体的实施方案中，使用了生物淘选方法。在直接生物淘选方案中，将靶标固定在固体支持物上。固体支持物的实例是微量滴定板或管(例如Maxisorp板，Maxisorp管，Nunc)或磁珠(Dynabeads，Invitrogen)。靶标可以被直接涂覆在塑料上或珠子上(表面活化的Dynabeads，例如Dynabeads M270 Epoxy，Invitrogen)或者当靶标经生物素化时是通过抗生蛋白链菌素涂覆的(例如Dynabeads MyOneStreptavidin T1，Invitrogen)。可使用其它的标签来捕获靶标，例如His标签或备选地，也可使用针对所述靶标的抗体来将靶标捕获在所述支持物上。这些备选的标签也与Dynabeads(Dynabeads His标签分离和拉下，Invitrogen)以及蛋白A或蛋白G偶联的Dynabeads(Dynabeads-蛋白A/G，Invitrogen)相匹配。为了将靶标固定在磁珠上，对于每种特定的珠子类型都遵循生产商的推荐。

此外，可使用可溶性生物淘选方案。这表示在用噬菌体文库孵育之后将靶标捕获到所述固体支持物上。在溶液中进行靶标-噬菌体相互作用。为了能够洗掉未结合的噬菌体，需要将靶标固定在固体支持物上。在可溶性生物淘选法中，靶标的固定与直接生物淘选方案中的固定可能性是相同的。

在具体的实施方案中，使用了生物素化的靶标，从而用经抗生蛋白链菌素涂覆的支持物(例如磁珠)捕获展示与靶标结合的Alphabody的噬菌体。可选择噬菌体文库展示技术，以及介由噬菌体展示技术的选择来作为靶标特异性结合子的高通量鉴别的方法，因为这是可获得的最强大和灵活的选择技术之一(Scott和Smith Science 1990，249：386-390;Bratkovic Cell Mol Life Sci 2010，67：749-767)。此技术的主要优势是将基因型(即所包覆的编码所展示的蛋白的DNA)与表型(即所展示的蛋白，例如本发明的Alphabody)相联合，这允许在相对简单的体外测定中从含有数百万至数万亿多肽变体的大文库中进行基于亲和性的选择。

在包含在Alphabody多肽序列的组、集合或文库中的Alphabody多肽序列被展示在合适的细胞或噬菌体或颗粒上的情形中，也可能从所述细胞或噬菌体或颗粒中分离出编码所述Alphabody多肽序列的核苷酸序列。然后，可通过常规测序方法确定所选Alphabody文库成员的核苷酸序列。最后，可通过在合适的条件下在宿主生物体中表达所述核苷酸序列而获得实际所需的Alphabody多肽序列，如本领域技术人员已知的。

本发明的方法还可包括下列步骤：扩增对于目的靶蛋白或细胞具有可检测的结合亲和性或可检测的体外活性的所述至少一种单链Alphabody。例如，可通过再感染宿主细菌以及在生长培养基中孵育而扩增从本发明的方法的选择步骤中获得的、展示特定单链Alphabody的噬菌体克隆。

此外，所获得的对于目的靶蛋白或细胞具有可检测的结合亲和性或可检测的体外活性的Alphabody序列可作为可溶性蛋白构建体被合成，任选地在鉴别了其序列之后。

例如，可使用本领域中已知的重组或化学合成方法来合成通过本发明的方法获得的、可获得的或所选择的Alphabody。此外，可通过遗传工程化技术产生通过本发明的方法获得的、可获得的或所选择的Alphabody。因此，用于合成通过本发明的方法获得的、可获得的或所选择的Alphabody的方法可包括用编码对于目的靶蛋白或细胞具有可检测的结合亲和性或可检测的体外活性的Alphabody序列的核酸或载体转化或感染宿主细胞。因此，可通过重组DNA方法来制造对于目的靶蛋白或细胞具有可检测的结合亲和性或可检测的体外活性的Alphabody序列。可使用常规程序容易地合成编码Alphabody的DNA。一旦准备好，所述DNA可被引入表达载体中，然后所述表达载体可被转化或转染到宿主细胞（例如大肠杆菌）或任何合适的表达系统中，从而在重组的宿主细胞和/或这些重组的宿主细胞所存在的培养基中获得Alphabody的表达。

可通过本领域技术人员已知的各种手段来完成将核酸或载体转化或转染到宿主细胞中，所述手段包括磷酸钙DNA共沉淀，DEAE-葡萄糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体融合，脂转染，原生质体融合，反转录病毒感染和基因枪法。

用于表达所需的Alphabody的合适的宿主细胞可以是任何真核或原核细胞(例如，细菌细胞例如大肠杆菌，酵母细胞，哺乳动物细胞，禽类细胞，两栖类动物细胞，植物细胞，鱼细胞和昆虫细胞)，无论是位于体外还是体内。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。

在本发明的具体实施方案中，用于产生对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性(如本文中所定义的)的一种或多种单链Alphabody的方法的选择步骤可包括通过重复执行下列步骤来（进一步）富集Alphabody文库或Alphabody文库的混合物中对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性的单链Alphabody：使目的靶分子与本发明的单链Alphabody文库或单链Alphabody文库的混合物相接触，以及随后从与所述目的靶分子相接触的单链Alphabody文库或单链Alphabody文库的混合物中鉴别出对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性的一种或多种单链Alphabody。

本发明还提供了专用的Alphabody文库，其可在改进或优化使用本发明的Alphabody文库获得的靶标特异性Alphabody的结合特异性和/或效力的情境中被生产。

在具体的实施方案中，用于基于根据上文所述的发明的Alphabody文库而产生一种多种靶标结合Alphabody的方法，可被进一步继以包括使所获得或产生的Alphabody序列合理化的步骤或方法。这种序列合理化过程可包括鉴别或确定在针对(即结合)特定目的靶分子的不同Alphabody间保守的特定氨基酸残基，氨基酸残基位置，段，基序或模式。因此，这种合理化过程可通过比较已被鉴别结合目的靶蛋白的不同Alphabody序列，以及通过鉴别这些序列之间的序列保守性来进行。此类过程可任选地通过使用用于分子建模和交互配位体对接的技术来进行或被所述技术支持。

被鉴别为在针对特定目的靶分子的不同Alphabody之间保守的特定氨基酸残基、氨基酸残基位置、段、基序或模式可被认为显著地促成所述靶标特异性Alphabody的结合或活性。

在具体的实施方案中，如上文所述的序列合理化过程可进一步继以从使用本发明的方法产生且被鉴别为对于目的靶分子特异的不同Alphabody序列组开始，创造新的Alphabody序列文库。在这种实施方案中，在不同靶标结合Alphabody之间保守的所述氨基酸残基、段、基序或模式所位于的位置保持恒定，并且所述Alphabody序列在新的确定的多样化氨基酸残基位置组中是变化的。在这一新确定的组中，所述多样化位置位于在不同靶标结合Alphabody之间保守的所述氨基酸残基、段、基序或模式所位于的位置之外。如此获得的Alphabody文库被称作Alphabody的“专用的文库”。然后，这些专用的文库可再次被筛选以鉴别最佳的靶标结合Alphabody。

因此，本发明还提供用于产生对于目的靶蛋白专用的文库的方法，所述方法包括（除了用于产生上文所述的靶标结合Alphabody的方法步骤之外，在从随机文库中鉴别了两个或更多个靶标结合Alphabody之后）下列步骤：

-比较所产生的结合目的靶蛋白的Alphabody序列，

-鉴别在这些不同Alphabody序列之间保守的氨基酸残基，氨基酸残基位置，段，基序或模式，和：

-从所比较的两个或更多个Alphabody序列中的至少一个开始，产生专用的文库，其中所述文库包含在氨基酸位置组中经多样化的不同Alphabody序列，所述氨基酸位置组不是在所述不同靶标结合Alphabody序列之间保守的所述氨基酸残基、氨基酸残基位置、段、基序或模式。

这些专用的文库可被用于获得具有改进的特性的Alphabody。更特别地，这包括：

-从所述专用的文库中选择和/或鉴别对于目的靶分子或细胞具有改进的或优化的结合特异性和/或体外活性的那些Alphabody序列，和任选地

-分离对于目的靶分子或细胞具有改进的或优化的结合特异性和/或体外活性的这些Alphabody序列。

将理解，可以用对用于产生本发明的靶标结合Alphabody的方法的相应步骤所描述的相似的方式进行如上文所述的用于产生专用的文库和用于选择、鉴别并分离对于目的靶分子或细胞具有改进的或优化的结合特异性和/或体外活性的Alphabody序列的方法中所涉及的步骤。

如本文中所进一步描述的，本发明的Alphabody中氨基酸残基的总数可以在约50至约210的范围内，这主要取决于每个七序列重复序列的七序列数目以及将所述七序列重复序列相互连接的柔性的连接子的长度。本发明的Alphabody，多肽或组合物的部分、片段、类似物或衍生物在其长度和/或大小方面不特别受限，只要所述部分、片段、类似物或衍生物仍具有其所源自的本发明的Alphabody，多肽或组合物的生物学功能并且仍能够被用于所料想的(药理学)目的。

在其它方面，本发明还提供对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性或对于目的靶分子或细胞具有可检测的体外活性的单链Alphabody，其中这些单链Alphabody可通过涉及本发明的Alphabody文库的方法获得，这些靶标特异性Alphabody以及包含这些靶标特异性Alphabody的多肽和组合物在本文中也分别称作“本发明的Alphabody”和“本发明的多肽和组合物”。

因此，本发明还提供特异性结合目的靶分子或蛋白的Alphabody，以及包含一种或多种此类Alphabody或基本上由其组成的多肽和药物组合物，以及所述Alphabody、多肽或组合物用于预防、治疗或诊断目的的用途。

因此，本发明的Alphabody，多肽和组合物可被用于预防和治疗由涉及所述Alphabody、多肽和/或组合物所针对的目的靶分子的生物学通路所介导的疾病和病症。

根据特定的实施方案，通过结合至一种或多种特定的目的靶分子，本发明的Alphabody、多肽和药物组合物可被用于预防或抑制一种或多种目的靶标分子与它们相应的受体或天然结合伴侣之间的相互作用，从而预防、抑制或减少由那些目的靶分子介导的信号通路和/或调节那些目的靶分子所参与的生物学通路和机制。

因此，在具体的实施方案中，本发明的Alphabody、多肽和组合物特异性结合目的靶分子，且更特别地结合那些目的靶分子上的受体-结合位点。

因此，在具体的实施方案中，本发明的所述Alphabody、多肽和组合物针对目的靶分子。与没有本发明的所述Alphabody，多肽或药物组合物时目的靶分子与其受体的结合相比，所述Alphabody与目的靶分子结合的结果可以是使得与所述目的靶分子结合后，其防止、减少或抑制所述目的靶分子与其受体或至少其一个亚基的结合，并且这为至少20%，例如至少50%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或更多，如通过本领域已知的合适的测定所确定的。

备选地，与没有本发明的所述Alphabody、多肽或药物组合物时目的靶分子与其受体结合后的信号传导相比，Alphabody与目的靶分子的结合使得其仍允许所述目的靶分子与其受体结合，但是防止、减少或抑制通过目的靶分子与其受体或至少其一个亚基的结合所将触发的信号传导，并且这是至少20%，例如至少50%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或更多，如通过本领域中已知的适当测定所确定的。在其它具体的实施方案中，所述Alphabody与目的靶分子的结合使得其防止、减少或抑制受体的活化和/或缔合，特别是目的靶分子介导的受体缔合(即与不存在本发明的所述Alphabody、多肽和组合物时目的靶分子介导的受体缔合相比)，且其为至少20%，例如至少50%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或更多，如通过本领域中已知的合适的测定所确定的。

在具体的实施方案中，与在相同条件下但不使用本发明的Alphabody，多肽或组合物时目的靶蛋白在相同测定中的活性相比，使用本发明的文库获得的Alphabody，多肽或组合物抑制、减少和/或防止目的靶蛋白与其天然结合伴侣之间的相互作用，或者抑制、减少和/或防止目的靶蛋白的活性，或抑制、减少和/或防止所述目的靶蛋白参与的一种或多种生物学或生理学机制、效应、响应、功能通路或活性，例如以至少10%，但优选至少20%，例如至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或更多，如使用合适的体外、细胞或体内测定所测量的。此外，“抑制”、“减少”和/或“防止”也可指与不存在本发明的Alphabody，多肽或组合物时相同的条件相比，诱导目的靶蛋白对于一种或多种其天然结合伴侣的亲和性、亲合力、特异性和/或选择性的减少和/或诱导目的靶蛋白对于所述目的靶蛋白所存在的介质或周遭中的一种或多种条件(例如pH，离子强度，辅助因子的存在等)的敏感性的降低。在本发明的情境中，“抑制”、“减少”和/或“防止”也可涉及对目的靶蛋白活性的变构抑制、减少和/或防止。

如本领域技术人员将知晓的，上述本发明的Alphabody、多肽和组合物一般将作为目的靶分子介导的信号传导（即通过目的靶分子与其受体的结合所产生的信号传导）、以及由所述信号传导诱导的生物学机制和效果的拮抗剂起作用。

在某些非限制性实施方案中，根据本发明的Alphabody、多肽或组合物可特异性结合目的靶分子，从而增强、增加和/或活化目的靶分子与其受体之间的相互作用。备选地，本发明的Alphabody，多肽或组合物也可模拟天然配体并直接结合受体，从而增强、增加和/或激活所述受体的生物学功能。根据本发明的这种激动性Alphabody，多肽或组合物可从而增强、增加和/或激活所述目的靶分子的生物学活性和/或一种或多种生物学或生理学机制、效果、应答、功能或途径，如使用合适的体外、细胞或体内测定所测量的。

因此，在这些具体的实施方案中，本发明的Alphabody，多肽和药物组合物可被用于在受试者中增加一种或多种特定的细胞应答，其中本发明的所述一种或多种Alphabody，多肽和组合物所结合的目的靶分子参与所述特定的细胞应答。结合某些目的靶分子的本发明的激动性Alphabody，多肽或药物组合物能够例如被用于刺激或增强受试者中的一种或多种免疫应答，例如用于防止和/或治疗特征在于被扰乱的免疫系统、或者由于具有被扰乱的免疫系统而发生的疾病。

在其它方面，本发明提供包含下述或基本上由下述组成的多肽(在本文中也称作本发明的多肽)：至少一个特异性结合目的蛋白的本发明的Alphabody。所述本发明的多肽可包含至少一个本发明的Alphabody以及任选地通过一个或多个连接子连接的、任选的一个或多个其它基团、部分、残基。

因此，本发明的多肽可任选地含有一个或多个其它基团、部分或残基用于结合其它目的靶标或目的靶蛋白。应该清楚的是，此类其它基团、残基、部分和/或结合位点可向本发明的Alphabody（和/或其所存在的多肽或组合物)提供或不提供其它功能，并且可以修饰或不修饰本发明的Alphabody的特性。所述基团、残基、部分或结合单元也可以是例如能够在生物学和/或药理学上有活性的化学基团。

在特定的实施方案中，这些基团、部分或残基在N或C末端与Alphabody连接。然而，在具体的实施方案中，一个或多个基团、部分或残基与Alphabody的本体连接，例如通过偶联至α螺旋中的半胱氨酸。

在具体的实施方案中，本发明的多肽包含经化学修饰的Alphabody。例如，此类修饰可包括将一个或多个官能团、残基或部分引入或连接到本发明的Alphabody之中或之上。这些基团、残基或部分可赋予本发明的Alphabody一种或多种所需特性或功能。此类官能团的实例对于本领域技术人员将是清楚的，并且包括而不限于纯化标签、检测标签、荧光标签、多糖部分、PEG部分。

向本发明的Alphabody中引入或连接官能团也可具有增加本发明的Alphabody的半衰期，溶解性和/或稳定性的效果，或者其可具有减少本发明的Alphabody的毒性的效果，或者其可具有消除或减小本发明的Alphabody的任何不希望的副作用的效果，和/或其可具有其它有利特性的效果。

在具体的实施方案中，本发明的多肽包含经修饰以特异性增加其半衰期的Alphabody，例如，介由聚乙二醇化，介由添加结合或者是血清蛋白(例如血清白蛋白)的基团或蛋白或蛋白结构域，一般性地，通过所述Alphabody与增加本发明的Alphabody的半衰期的部分连接。通常，与缺少所述化学修饰的相应本发明Alphabody的半衰期相比，具有增加的半衰期的本发明的多肽具有至少两倍，例如至少三倍，例如至少五倍，例如至少十倍或超过十倍更长的半衰期。

本发明的Alphabody的特定修饰可包括引入一个或多个可检测的标记物或其它产生信号的基团或部分，这取决于经标记Alphabody的所欲用途。而其它的特定修饰可包括引入螯合基团，例如用于螯合一种或多种金属或金属阳离子。特定的修饰可包括引入为特定结合对（例如生物素-抗生蛋白链菌素结合对）的一部分的官能团。其它潜在的化学和酶促修饰对于本领域技术人员将是清楚的。

在具体的实施方案中，所述一个或多个基团、残基、部分通过一个或多个合适的连接子或间隔子与Alphabody相连接。

在其它具体的实施方案中，本发明的多肽包含两个或更多个靶标特异性Alphabody。在这种特定的实施方案中，所述两个或更多个靶标特异性Alphabody可以直接或间接的方式彼此相连(偶联、连结、互联、融合)。在其中所述两个或更多个Alphabody彼此直接连接的实施方案中，它们没有间隔子或连接子片段或部分的辅助而连接。备选地，在其中两个或更多个Alphabody彼此间接连接的实施方案中，它们通过合适的间隔子或连接子片段或连接子部分而连接。

在其中两个或更多个Alphabody直接连接的实施方案中，它们可作为单链融合构建体(即作为单链蛋白构建体，其中两个或更多个Alphabody序列在单一的连续氨基酸序列中直接彼此相继)产生。备选地，Alphabody的直接连接也可通过在两个Alphabody之间形成二硫桥的半胱氨酸完成(即在合适的条件下（例如氧化条件），每一个都包含游离半胱氨酸的两个Alphabody可彼此反应以形成二聚体，其中组成的单体通过二硫桥共价连接)。

备选地，在其中两个或更多个Alphabody间接连接的实施方案中，它们可通过合适的间隔子或连接子片段或连接子部分彼此连接。在这种实施方案中，它们也可作为单链融合构建体产生(即作为单链蛋白构建体，其中两个或更多个Alphabody序列在单一的连续氨基酸序列中彼此相继，但是其中所述Alphabody通过作为间隔子片段的适当选定的氨基酸序列片段的存在而保持是分开的)。备选地，Alphabody的间接连接也可通过氨基酸侧基团或通过Alphabody N或C末端实现。例如，在适当选定的条件下，每个都包含游离半胱氨酸的两个Alphabody可与同型双功能化合物反应，产生其中组成的Alphabody通过所述同型双功能化合物共价交联的Alphabody二聚体。类似地，一种或多种Alphabody可通过反应活性侧基团或末端与适当选择的用于蛋白质交联的同型或异型双功能化合物的任意组合而交联。

在相连的Alphabody的具体实施方案中，两个或更多个相连的Alphabody可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。所述两个或更多个相连的Alphabody也可具有相同的结合特异性或不同的结合特异性。所述两个或更多个相连的Alphabody也可具有相同的结合亲和性或不同的结合亲和性。

用于偶联本发明的不同Alphabody的适当间隔子或连接子对于本领域技术人员将是清楚的，并且一般可以是本领域中用于连接肽和/或蛋白的任何连接子或间隔子。特别地，这种连接子或间隔子适于构建意欲用作制药用途的蛋白或多肽。

用于在单链氨基酸序列中偶联Alphabody的一些特别合适的连接子或间隔子包括例如但不限于，多肽连接子，例如甘氨酸连接子、丝氨酸连接子、混合的甘氨酸/丝氨酸连接子、富含甘氨酸和丝氨酸的连接子或者主要由极性多肽片段构成的连接子。用于通过化学交联来偶联Alphabody的一些特别适合的连接子或间隔子包括例如但不限于，同型双功能化学交联化合物，例如戊二醛，亚氨酸酯例如己二亚氨酸二甲酯(DMA)，辛二亚氨酸二甲酯(DMS)和庚二亚氨酸二甲酯(DMP)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯例如二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP)和二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)。用于交联的异型双功能试剂的实例包括但不限于，具有一个胺反应端并在另一端具有巯基反应部分的交联剂或者在一端具有NHS酯而在另一端具有SH反应活性基团(例如马来酰亚胺或吡啶基二硫)的交联剂。

用于单链连结Alphabody构建体中的多肽连接子或间隔子可以是任何适合的(例如富含甘氨酸的)氨基酸序列，其具有1至50个氨基酸之间的长度，例如1至30个，特别是1至10个氨基酸残基。应当清楚的是，所述间隔子的长度、柔性程度和/或其它特性可对最终的本发明的多肽的特性有一些影响，这包括但不限于对目的靶蛋白的亲和性、特异性或亲合力。应当清楚的是，当两个或更多个间隔子被用于本发明的多肽中时，这些间隔子可以是相同或不同的。在本发明的情境和公开中，本领域技术人员将能够确定用于偶联本发明的Alphabody的最佳间隔子而没有任何过度实验负担。

本发明的相连的Alphabody多肽一般可通过下列方法制备，所述方法至少包括一个将一个或多个本发明的Alphabody与一个或多个其它基团、残基、部分和/或其它本发明的Alphabody适当连接的步骤，任选地这是通过一个或多个合适的连接子，从而提供本发明的多肽。

此外，可通过至少包括下列步骤的方法来产生本发明的多肽：(i)在合适的宿主细胞或表达系统中表达本发明的多肽，和(ii)分离和/或纯化本发明的多肽。用于进行上述步骤的技术是本领域技术人员已知的。

本发明还涵盖本发明的Alphabody及多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物，和/或包含一个或多个所述部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物或基本上由其组成的多肽。

根据本发明的此类部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物可仍能够特异性地结合目的靶分子。在具体的实施方案中，本发明提供本发明的Alphabody的靶标结合片段、变体或衍生物。

应注意，本发明的文库、Alphabody、多肽或组合物(或者用于表达它们的本发明的核苷酸序列)不是天然存在的蛋白(或核苷酸序列)。通常，本发明的Alphabody是重组、合成或半合成的氨基酸序列、多肽或蛋白(或核苷酸序列)。

本发明所提供的Alphabody、多肽和组合物可以是基本上分离的形式(如本文中所定义的)，或者备选地可以形成本发明的多肽或组合物的一部分，其可包含至少一个本发明的Alphabody或基本上由其组成并且其可任选地还包含一个或多个其它基团、部分或残基(均任选地通过一个或多个合适的连接子连接)。

基于本文中的公开将理解，对于预防、治疗和/或诊断应用，使用本发明的文库可获得的Alphabody、多肽和组合物将原则上针对或特异性结合人目的靶分子。然而，当本发明的Alphabody，多肽和组合物意在用于兽医目的时，它们将针对或特异性结合来自意欲治疗的物种的目的靶分子，或者它们将至少与来自待治疗的物种的目的靶分子交叉相互作用。因此，与来自一个受试物种的目的靶分子特异性结合的Alphabody、多肽及组合物可显示或不显示与来自一个或多个其它受试物种的目的靶分子的交叉反应性。当然，料想了在开发用于人或动物的Alphabody的情境中，可开发这样的Alphabody：其结合来自待治疗的物种之外的另一物种的目的靶分子而用于研究和实验室测试。

还预期，本发明的Alphabody和多肽可结合目的靶分子的某些天然存在或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。更特别地，预期了本发明的Alphabody和多肽将至少结合目的靶分子的下述类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段：其（仍）含有（天然/野生型）目的靶分子和/或那些Alphabody和多肽所结合的目的靶分子的结合位点，部分或结构域。在具体的实施方案中，特异性结合目的靶分子的Alphabody，多肽和组合物不显示与除目的靶蛋白之外的天然存在的蛋白的交叉反应性。

在其它方面，本发明提供编码通过本发明的方法选择和/或产生的单链Alphabody的核酸。

在其它方面，本发明提供编码可根据本发明的方法获得的单链Alphabody的核酸(在本文中也称作“本发明的核酸或核酸序列”)以及包含所述核酸序列的载体和宿主细胞。

这些核酸序列也可以是载体或遗传构建体或多核苷酸的形式。本发明的核酸序列可以是合成的或半合成的序列，从文库（特别是表达文库）中分离的核苷酸序列，使用重叠的引物通过PCR制备的核苷酸序列，或者使用本身已知的用于DNA合成的技术制备的核苷酸序列。

本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选是双链DNA。本发明的遗传构建体也可以是适于转化所欲的宿主细胞或宿主生物体的形式，适于整合到所欲宿主细胞的基因组DNA中的形式或者适于在所欲的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体的形式，例如质粒、粘粒、YAC、病毒载体或转位子。特别地，所述载体可以是表达载体，即能够提供体外和/或体内(例如，在合适的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)表达的载体。本发明的遗传构建体可包含合适的前导序列用于将所表达的Alphabody引入所欲的细胞内或细胞外区室。例如，本发明的遗传构建体可在pelB前导序列位点处被插入合适的载体中以将所表达的Alphabody引向细菌周质空间。此外，所述载体可被配备以合适的启动子系统以，例如，最优化所述Alphabody的产率。

在其它方面，本发明提供包含编码根据本发明的方法可获得的单链Alphabody的核酸的载体。

在其它方面，本发明提供包含编码单链Alphabody的核酸、或者包含这些核酸的载体的宿主细胞，所述单链Alphabody可通过根据本发明的方法获得。因此，本发明的特定实施方案是经载体转染或转化的宿主细胞，所述载体包含编码通过本发明的方法可获得的Alphabody的核酸序列并且所述载体能够表达所述Alphabody。用于表达本发明的Alphabody或多肽的宿主或宿主细胞的合适实例对于本领域技术人员将是清楚的并且包括任何合适的真核或原核细胞(例如，细菌细胞例如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼细胞和昆虫细胞)，无论是位于体外或体内。

在其它方面，本发明提供包含可通过根据本发明的方法获得的一种或多种Alphabody、多肽和/或核酸序列和任选地至少一种药物可接受载体的药物组合物(在本文中也称作本发明的药物组合物)。根据某些具体的实施方案，本发明的药物组合物还可任选地包含至少一种其它的药物活性化合物。

本发明的药物组合物可被用于诊断、预防和/或治疗与目的靶分子有关的疾病和病症。

特别地，本发明提供包含本发明的Alphabody和多肽的药物组合物，其适于温血动物（特别是哺乳动物、更特别是人类）中的预防，治疗和/或诊断性应用。

本发明还提供包含本发明的Alphabody和多肽的药物组合物，其可被用于兽医目的，用于预防和/或治疗与目的靶分子相关和/或由其介导的一种或多种疾病、病症或病况。

一般地，对于制药用途，本发明的多肽可被配制为药物制备物或组合物，其包含至少一种本发明的Alphabody或多肽和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，和任选地一种或多种其它药学上有活性的多肽和/或化合物。此类制剂可以是适于口服、肠胃外、局部施用或用于通过吸入施用。因此，本发明的Alphabody或多肽和/或包含其的组合物可例如通过口服，腹膜内，静脉内，皮下，肌内，透皮，局部施用，介由栓剂、通过吸入施用，这也取决于所使用的特定药物制剂或组合物。医师将能够选择要在所述施用中使用的合适的施用途径和合适的药物制剂或组合物。

所述药物组合物还可包含合适的粘合剂，崩解剂，甜味剂或调味剂。片剂、丸剂或胶囊可用例如明胶、蜡或糖等涂覆。此外，本发明的Alphabody和多肽可被掺入缓释制备物和设备中。

适于注射或输注的药物剂型可包括包含活性成分的无菌液体溶液或散剂或无菌粉末，其被调适而用于临时制备无菌可注射的或可输注的溶液或散剂，任选地被包覆在脂质体中。在所有的情形中，最终的剂型在制造和存储条件下必须是无菌的、流体和稳定的。流体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)，植物油，非毒性甘油酯，以及它们的合适混合物。可任选地加入抗细菌和抗真菌试剂等。

可通过在动物模型中确定本发明的Alphabody和多肽的体外活性和体内活性来确定它们的有用剂量。用于将在小鼠和其它动物中的有效剂量推断到人中的方法是本领域技术人员已知的。

用于预防和/或治疗所需的本发明的Alphabody和多肽的量不仅可随着所选择的的特定Alphabody或多肽而变化也可随着施用途径、被治疗的病况的性质、以及患者的年龄和情况而变化，并最终将由临床医生或医师决定。此外，本发明的Alphabody和多肽的剂量可取决于靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官，或者靶分子的血浆浓度而变化。

根据适于预防和/或治疗待预防或治疗的疾病或病症的治疗方案施用本发明的Alphabody或多肽和/或包含其的组合物。医师一般将能够确定合适的治疗方案。一般地，所述治疗方案将包括以一种或多种药学上有效的量或剂量施用一种或多种本发明的Alphabody和/或多肽，或者一种或多种包含它们的组合物。

所需剂量可方便地以单一剂量或作为在合适的间隔施用的分份剂量（可被再次分份）被呈递。施用方案可包括长期(即至少两周，和例如数月或数年)或每天治疗。

将由医疗从业者基于特别是待治疗的病况和患者的严重性来决定本发明的Alphabody和多肽将被施用的量。通常，对于每种疾病指征将确定最佳剂量，其指定每天每公斤体重要施用的量，为连续的(例如通过输注)、作为单一每日剂量还是作为一天中的多个分剂量施用。根据本文中所提到的因素，医师一般将能够确定合适的每日剂量。还将清楚的是，在特定的情形中，医师可选择偏离这些量，例如基于上文所述的因素以及他的专业判断。

特别地，本发明的Alphabody和多肽可与被用于或可被用于预防和/或治疗涉及所述目的靶分子的疾病和病症的其它药物活性化合物或成分组合使用，由此可获得或不获得协同效应。此类化合物和成分，以及施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物的实例对于医师将是清楚的。

根据其它方面，本发明提供特异性结合目的靶分子的本发明的Alphabody或多肽用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗涉及目的靶分子的至少一种所述目的靶分子介导的疾病和/或病症。因此，本发明提供特异性结合目的靶分子的Alphabody，多肽和药物组合物，其用于预防和/或治疗涉及至少一种目的靶分子的所述目的靶分子介导的疾病和/或病症。在具体的实施方案中，本发明还提供用于预防和/或治疗至少一种目的靶分子介导的疾病和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用，药学活性量的一种或多种本发明的Alphabody、多肽和/或药物组合物。特别地，所述药学活性量可以是足以(在循环中产生所述Alphabody或多肽的水平)抑制、预防或减少涉及所述目的靶分子的生物学活性和/或生物学通路或信号传导的量。

待用本发明的Alphabody或多肽治疗的受试者或患者可以是患有或有风险患有涉及本发明的Alphabody或多肽所特异性结合的目的靶分子的疾病和病症的任何温血动物，但特别是哺乳动物，且更特别地为人。

取决于所涉及的特定疾病或病症，可使用任何合适的本身已知的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或动物模型或它们的任意组合来测试本发明的Alphabody和多肽、以及包含其的组合物的效力。合适的测定和动物模型对于本领域技术人员将是清楚的。取决于所涉及的目的靶分子，本领域技术人员一般将能够选择合适的体外测定、细胞测定或动物模型来就下列测试本发明的Alphabody和多肽：其影响这些目的靶分子的活性和/或涉及它们的生物学机制的能力；以及它们关于与目的靶分子相关的一种或多种疾病和病症的治疗和/或预防效果。

附图说明

现在将通过下列非限制性实施例和附图来进一步描述本发明，其中附图显示：

图1.描绘了Alphabody沟。此图显示了与本文所述的“scAB013_L16”Alphabody同样尺寸的单链Alphabody的简化表示。所有的氨基酸残基都被显示为丙氨酸(仅Cβ原子)。以带表示显示骨架迹线。对主要，次要和核心沟位置(如本文中所定义的)进行了表面渲染以描绘沟的位置和形状。据此标记了来自一个α螺旋(文库scLib_AC11中的A螺旋)的c和g残基以及来自第二α螺旋(文库scLib_AC11中的C螺旋)的b和e残基。

图2.描绘了单链Alphabody scAB013_L16的氨基酸序列。全氨基酸序列以单字母编码被列在底部，在标记“全”的右边。也在顶部显示了同一序列内的特定区段以方便鉴别N和C末端侧翼区段(分别标记为“N”和“C”)，连接子区段(分别标记为“L1”和“L2”)和实际的七序列重复序列(标记为“HRS1”、“HRS2”和“HRS3”)。在顶行提供了七序列a和d位置以方便在所述七序列重复序列中鉴别它们。

图3.描绘了单链Alphabody文库。显示了三个Alphabody文库，每个都在C末端与噬菌体衣壳蛋白pIII的N末端相连。每个文库的名称都显示在三组中每一组的顶行(“scLib_AC11”，“scLib_C9”和“scLib_C7”)。它们的全氨基酸序列(以单字母符号)被列在每个表格组的底部，标记“全”的右侧。在随机化的位置处使用符号“x”。“PIII”表示噬菌体pIII衣壳蛋白。同一序列内的特定区段也显示在顶部，以方便鉴别N和C末端侧翼片段(分别标记为“N”和“C”)，连接子区段(分别标记为“L1”和“L2”)和实际七序列重复序列(标记为“HRS1”、“HRS2”和“HRS3”)。在顶行提供了七序列a和d位置以方便在七序列重复序列内鉴别它们。

图4.描绘了其它的单链Alphabody文库。每个文库的名称显示在这三组中每组的顶行(“scLib_AC11b”、“scLib_AC12”和“scLib_B10”)。符号，标记和格式与图3中的相同。一些氨基酸残基位置以灰色背景显示以强调多样化位置相关于其所源自的文库的差别(scLib_AC12与scLib_AC11相比，scLib_B10与scLib_C9相比)。

图5.Alphabody文库噬菌体的蛋白质印迹分析。在每一泳道中应用了2x10¹¹噬菌体。测试了来自每个文库的数批噬菌体。在还原条件下进行了SDS-PAGE之后，将样品印迹在硝酸纤维素膜上。通过如下显示融合产物的存在：使用小鼠抗-gpIII抗体，随后使用AP-抗小鼠缀合物并通过加入NBT-BCIP底物使印迹显色。

图6.其它Alphabody文库噬菌体的蛋白质印迹分析。使噬菌体在12%SDS-PAGE凝胶上跑胶并将其转移到PVDF膜上用于蛋白质印迹分析。用抗pIII抗体使pIII蛋白可视。A图框：前两个泳道分别为大小梯度(ColorPlus预染色的蛋白梯度宽范围10-230kDa，NEB)和空的噬菌体。所述空的噬菌体仅展示野生型pIII蛋白。接下来三个泳道分别是参照Alphabody文库，scLib_AC12和scLib_AC11b文库。B图框：前两个泳道分别为大小梯度(ColorPlus预染色的蛋白梯度宽范围10-230kDA，NEB)和噬菌体。接下来两个泳道分别为参照Alphabody文库和scLib_B10文库。箭头表示显示出比野生型pIII蛋白更高的分子量的Alphabody融合pIII蛋白。

图7.在文库scLib_B10（标示为B10）和scLib_AC12(标示为AC12)的连续生物淘选轮中阳性克隆的百分比。

图8.表3：产生自针对IL-23的AC12文库的77个Alphabody序列的多重比对。

实施例

实施例1.单链Alphabody文库的产生

本实施例显示了可获得这样的单链Alphabody文库，其很好地展示在噬菌体上并且潜在地可用于获得结合目的靶蛋白的单链Alphabody序列。

从表示为“scAB013_L16”的参照Alphabody的经注释的氨基酸序列和3D模型开始，设计了单链Alphabody随机文库。此参照Alphabody的简化3-D模型显示在图1中。在此也提供了scAB013_L16的氨基酸序列为SEQ ID No：1。此序列还被显示在图2中，其中也指明了常规的七序列核心位置。

Alphabody沟是由折叠的Alphabody蛋白的两个空间上相邻的α螺旋形成的(图1)。所述沟被表征为(拉长的)凹陷形状。因为每个Alphabody有三个α螺旋，原则上有三个可被随机化的候选沟。首先检视了所述3-D模型以选择最适合用于随机化的沟。决定了选择第一α螺旋(“A螺旋”)和第三α螺旋(“C螺旋”)之间的沟，它们在所述3-D模型中是平行的。然后，进一步检视所述模型以鉴别每个α螺旋中最适合被随机化（多样化，改变）的氨基酸残基位置。观察到所述沟实际上是由位于A螺旋中的七序列c和g位置以及C螺旋中的七序列b和e位置的残基形成的。发现所述g和e位置对所述沟贡献最大(即最直接)，并因而被表示为“主要沟位置”。所述c和b位置位于距所述沟的中央有些远的位置，因此被表示为“次要沟位置”。除了这些主要和次要沟位置之外，沟的底部是由一些核心(a和d)位置形成的；特别地，所述模型显示了A螺旋的核心d位置和C螺旋的a位置也可能促成所述沟的形状，特别是如果主要沟位置被小的氨基酸残基（例如甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸）占据的话。可条件性地促成沟的形状的所述核心a和d位置在此被表示为“核心沟位置”。

图1显示了在scAB013_L16 Alphabody模型的卷曲螺旋部分中有3个主要的e以及3个主要的g位置。还发现了在次要沟位置处有4个b和4个c位置。此外，有4个核心d和4个核心e位置，其可潜在地促成所述沟。因此，当对沟进行多样化时，总共有22个可影响所述沟的形状的位置。当所有的22个将被完全随机化为20个天然氨基酸残基时，这将对应于20²²或约4×10²⁸个不同序列的序列空间(即可能的组合的总数)。显然，不能以其中所有的不同序列都在物理上存在的形式制造这种巨大的文库(即此类文库不能够是“完全的”)。因此，如果目的是所料想的文库是完全的(或接近完全的)，则应当大幅减少可变位置的数目。

因此决定不改变任何核心沟位置。这一决定的其它动机在于(避免)与诱变卷曲螺旋中核心位置相关的风险：许多这样的取代对于相应Alphabody构建体的稳定性和/或正确折叠将是不利的。此外，还决定了不改变两个次要沟位置。具体地，保持所述A螺旋中的第一个c位置和所述C螺旋中的第一个b位置是恒定的。最后，也保持所述C螺旋中的第一个主要沟e位置是固定的。这使得在关于参照AlphabodyscAB013_L16的情境中选择了11个多样化位置。因此，当完全随机化时，此类文库的理论序列空间为20¹¹或约2×10¹⁴个不同的序列。

除了所述多样化位置之外，进行了对所述参照AlphabodyscAB013_L16的两种其它类型的修饰。首先引入了2个赖氨酸至谷氨酸的突变，即在螺旋A和C的每个中第二个七序列的f位置引入一个所述突变。第二，引入了两个精氨酸至丙氨酸的突变，即在螺旋B和C的每个中第四个七序列的c位置引入一个所述突变。图3中显示了这种经修饰的单链Alphabody的序列，其中将被多样化的位置以“x”符号标示。这一序列也被提供为SEQ ID No：2。基于这种设计而构建的单链Alphabody文库在下文中称作“scLib_AC11”。因为所有多样化位置均位于Alphabody沟中，这种文库也被称作“纯沟文库”。

从表示为“scAB140_L14”的更小的Alphabody参照构建体的3-D模型开始，设计了第二个单链Alphabody纯沟文库。scAB140_L14基本上相应于scAB013_L16构建体，其中删除了每个α螺旋中的第三个七序列，将甘氨酸/丝氨酸连接子序列从16个残基减少为14个残基，且用备选的、带更少负电的基序取代N末端α螺旋加帽残基。除了这些区别之外，在设计文库时，对待多样化的主要、次要和核心沟位置作出完全相同的选择。鉴于删除了每个所述螺旋中的一个七序列单元，此文库仅包含7个可变残基位置。因此，完全随机化的理论序列空间为207或约109，这应当确保实际产生的文库的近乎完全。图3中显示了此单链Alphabody沟文库的序列，表示为“scLib_AC7”。此序列也被提供为SEQ ID No：3。

设计了第三个单链Alphabody纯沟文库，其实际上是对scLib_AC11文库的修改。表示为“scLib_AC11b”的这一文库包含相同的(十一个)多样化沟残基位置，但是在N末端螺旋加帽区域和连接子区域内进行了一些修饰。首先，将α螺旋七序列重复序列之前的甲硫氨酸突变为了甘氨酸。这些突变的原因是，这些甲硫氨酸行使螺旋加帽的功能且用于构建scLib_AC11文库的3-D模型表明它们处于所述沟中；在沟中的这种位置可对占据所述沟的配体形成空间阻塞，因而用最小的可能的且结构上更柔性的氨基酸残基类型（即甘氨酸）替代它们。此外，每个α螺旋的第一个七序列中c位置处的谷氨酸被取代成为谷氨酰胺，从而减少每个螺旋N末端处的负电荷，并因而减少由这种负电荷产生的潜在静电偏置。第三，改变了甘氨酸和丝氨酸在连接子片段中的分布，从而减少重复特征。scLib_AC11b文库的序列显示在图4中，并且也被提供为SEQ ID No：4。

设计了第四个单链Alphabody文库以探索产生通过单一α螺旋上的溶剂暴露区域结合其靶标的Alphabody的潜力。这种溶剂暴露α螺旋区域的特征在于(拉长的)凸起形状。换言之，这一设计的目的在于产生这样的Alphabody“螺旋文库”(与为沟文库的scLib_AC11和scLib_AC7文库相反)：其中在单一Alphabody螺旋的凸起的、溶剂朝向区域中引入序列多样化。再次使用scAB013_L16的3-D模型作为模板结构，用于指导对于待多样化位置的选择。决定了选择此结构中的C螺旋作为将被多样化的一个。对于此模型的进一步检视显示出b、c和f位置一同形成具有(拉长的)凸起形状的连续边缘。有11个这种表面位置可在这一α螺旋中辨识。观察到了，原则上，一些侧翼e和g位置可潜在地辅助形成连续的结合表面，但是鉴于使Alphabody不稳定的风险以及因为可变位置的数目将提高太多而抛弃了这种选择。因此，C螺旋中的所有11个b、c和f位置起初被考虑用于多样化，但是最终使得两个N末端谷氨酰胺未改变，从而不取消它们的加帽功能并为了在合理的界限内保持文库完整性。这最终使得文库中的9个b，c和f位置被多样化。相应地，这一文库被称作“scLib_C9”。因为所有的多样化残基位置均位于单一α螺旋中完全溶剂暴露的残基位置，此文库是“纯螺旋(表面)文库”的实例。此文库的序列显示在图3中。这一序列也被提供为SEQ ID No：5。

设计了第五个单链Alphabody文库以检测包含不唯独地限于沟中的序列变化的Alphabody文库的潜能。设计了此类“非纯沟文库”以检查沟外（但紧接着侧翼于这一沟区域）的多样化残基位置是否也将在有利的意义上促成发现特异性靶标结合Alphabody。这种策略的其它动机在于下列事实：在沟外的这种多样化的扩展将产生具有不同于拉长的沟形状的固有构象形状的多样化表面区域。包含在含有扩展的多样化表面的文库中的Alphabody可潜在地结合目的靶分子上形状互补的表位(表面区域)，所述表位不同于最佳地匹配纯沟的那些。因此，设计了这种扩展的文库以检查它们是否将固有地更适于处理各种形状的靶分子(及其上的表面区域)(即产生它们的结合子)。从scLib_AC11文库开始并再次使用所述scAB013_L16 Alphabody模型做出了此类文库的具体设计。第一个修饰涉及减少连接子片段的长度(两个连接子都缩短了8个残基)。关于可变位置，一个次要沟位置(螺旋A的第四个七序列中的位置c)不再经多样化，而保持固定为丙氨酸。除了scLib_AC11文库中的多样化沟位置之外，选择了螺旋C中的两个非沟f位置进行多样化(这些非沟位置在螺旋C的第二和第三个七序列的f位置)。所述模型显示，新选择的12个多样化残基位置产生更密集的、“片样”可变表面；与纯沟文库的表面相比，此表面的固有形状为更少拉长的且更宽，并且凹陷区域被附以主要由新选择的f位置形成的小的凸起亚区域。这一文库被相应地称作“scLib_AC12”。此文库的序列显示在图4中且也被提供为SEQ ID No：6。

设计了第六个单链Alphabody文库以检测包含不唯独地限于单一螺旋表面中的序列变化的Alphabody文库的潜能。设计了此类“非纯螺旋文库”以检测螺旋表面之外但紧接着侧翼于这一螺旋表面区域的多样化残基位置是否也将在有利的意义上促成发现特异性的靶标结合Alphabody。再一次地，这一策略的动机在于下列事实：螺旋表面之外的这种多样化扩展将产生具有不同于螺旋表面残基的拉长边缘的固有构象形状的多样化表面区域。此类文库中所含有的Alphabody可潜在地结合目的靶分子上形状互补的表位，所述表位不同于最优地匹配单一螺旋的那些。因此，设计了这种扩展的文库以检测它们是否将固有地更适于处理各种形状的靶分子(以及其上的表面区域)。从scLib_C9文库开始并再次使用所述scAB013_L16 Alphabody模型来进行此类文库的具体设计。第一个修饰涉及选择连接子片段，它们被选择为与scLib_AC11b文库中的那些相同。第二个修饰涉及选择待随机化的螺旋：在此选择在B螺旋中而非如scLib_C9中在C螺旋中引入序列变化。关于可变位置的实际选择，保持两个之前经修饰的、拓扑上等同的螺旋表面位置是恒定的(分别保持螺旋B的第一个和第二个七序列中的位置f和b固定为赖氨酸和丙氨酸)。然后，除scLib_C9的C螺旋中为多样化的螺旋表面位置之外，选择了B螺旋中的两个沟g位置进行多样化(这些沟位置在螺旋B的第二和第三个七序列的g位置处)。最后，所述模型表明C螺旋位置(C螺旋的第一个七序列中的g位置)将直接邻接其它多样化位置，并且此位置也因此被保持是可变的。总之，此模型表明新选择的10个多样化残基位置产生更密集的、“片样”可变表面；与纯螺旋表面文库的表面相比，此表面的固有形状为更少拉长的且更宽的，且所述凸起的区域被附以主要由新选择的沟g位置形成的小的凹陷亚区域。这一文库相应地被称为“scLib_B10”。此文库的序列被显示在图4中且也被提供为SEQ ID No：7。

在Geneart AG(Regensburg，德国)订购了实际的单链Alphabody文库。采用了“3+3”的单价展示形式(Smith，Gene128：1-2(1993))，其中使用pCx1载体（源自pHEN的噬菌粒）。作为经转化的大肠杆菌TG1细胞，以10⁸个独特克隆的确保最小值递送了文库scLib_AC11，scLib_AC7和scLib_C9。以10⁹个独特克隆的确保最小值递送了文库scLib_AC11b，scLib_AC12和scLib_B10。将Alphabody序列与M13噬菌体的pIII衣壳蛋白融合。通过含有琥珀密码子(在遗传水平)和His6标签的连接子序列，经由其C末端将它们连接至所述pIII衣壳蛋白。通过在N末端存在PelB前导序列来确保将融合的Alphabody输出到周质中。使用蛋白质印迹法检测噬菌体上的展示水平并发现其适当地高。分析显示出，一般地，三分之一的所述噬菌体展示Alphabody(图5)。

实施例2.本发明的Alphabody文库用于产生靶标特异性 Alphabody的用途。

使用Alphabody文库（例如上文所述的那些），产生了用于人IL-23的结合子。白细胞介素23(IL-23)是由两个亚基p40和p19组成的异二聚细胞因子，其中p40由每个都由β链形成的3个结构域组成，而p19具有四个-螺旋的束组织。所述p40亚基也被发现在IL-12中。因此，稍微调整了所述生物淘选方案以进一步选择结合P19亚基的Alphabody，从而获得特异于IL-23的Alphabody。

文库

使用了如实施例1中所描述的而获得的噬菌体文库scLib_AC12和scLib_B10。这些噬菌体文库将经随机化的Alphabody序列展示为与病毒pIII蛋白的融合蛋白。

scLib B10是螺旋文库，而scLib AC12是沟文库。

文库的定义显示在图7中。

噬菌体文库的拯救***请考虑我们实际上必须以什么程度提供所有这些细节。这些不是公知常识+技术诀窍吗?***

将文库储备的接种物(分别为0.608ml和1.157ml)转移到经计算的体积(分别为933和1466ml)的生长培养基中，所述生长培养基由补充以0.1mg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的2xTY组成(2xTY-AG)。伴随摇动（300rpm）在挡板摇瓶中、在37℃下培养细菌培养物，以达到0.5的OD600nm(对数中期)。使用所述细菌培养物，用于以帮助噬菌体M13K07(GE Healthcare)进行重感染，以产生噬菌体颗粒。应用于所述重感染的帮助噬菌体/细菌比例为20：1。

不摇动而在37℃下将感染培养物孵育30分钟以允许感染所述细菌。孵育后，取感染培养物的样品用于在2xTY-AG琼脂板和2xTY-AGK琼脂板(K代表卡那霉素(25微克/ml)，因为帮助噬菌体是卡那霉素抗性的)上滴定，以分别确定存活的和被感染的细菌数目。然后伴随摇动在37℃下将所述感染培养物再孵育30min。

孵育后，通过在室温下、以4000rpm将所述培养物离心10min而获得细菌细胞粒状沉淀。在与初始体积为相同体积的预热的2xTY-AK培养基中重悬所述细菌粒状沉淀。伴随摇动(300rmp)在30℃下过夜培养所述培养物。

过夜孵育后，取所述培养物的样品用于在2xTY-AGK琼脂板上滴定，以确定存活的细胞。在冰上将所述培养物冷却5min并以7000rpm离心20min。收集上清液，以通过加入1/5体积的20% PEG 4000/2.5M NaCl溶液并在冰上孵育1-2小时来沉淀噬菌体。孵育后，通过在4℃下，以7000rpm离心20min而回收噬菌体。将噬菌体粒状沉淀溶解在35ml磷酸盐缓冲液(PBS)/900ml细菌培养物中，通过以12000rpm离心10min来去除细菌碎片。进行第二次PEG/NaCl离心1hr，随后去除细菌碎片。最后，获得了对应于所述文库的经纯化的噬菌体(10ml/900ml初始细菌培养物)。向所述噬菌体中加入15%的甘油用于在-80℃储存。

通过用经纯化的噬菌体的系列稀释物感染细菌（大肠杆菌TG1菌株）并将这些稀释物涂布在2xTY-AG琼脂板上来确定对应于所述文库的噬菌体制备物的滴度。这种滴定允许确定感染性噬菌体颗粒的数目(菌落形成单位(cfu)或转染单位(TU))。虽然作为经转化的大肠杆菌ER2738细菌提供了所述文库，使用大肠杆菌TG1菌株(Stratagene)（噬菌体展示技术中所使用的常见菌株）来进行所有其它的噬菌体繁殖。

在蛋白质印迹分析中评价Alphabody的表达，其中使用抗pIII抗体以确定野生型pIII蛋白和Alphabody融合pIII蛋白的存在。融合pIII蛋白的分子量比野生型pIII蛋白的高并且将因此在SDS-PAGE凝胶中迁移得更慢。当存在融合蛋白时，利用抗pIII抗体应可见两条带。

此特定实施例的经拯救的文库的滴度显示在表1中。对于文库scLib013APL8_AC12，scLib013APL16_B10，分别获得了为文库大小的14倍和8倍的滴度。蛋白质印迹分析显示了对于所有的文库，都存在Alphabody-融合pIII蛋白(图6)。可见两条带。较低的带对应于野生型pIII，而具有较高分子量的较高的带对应于融合pIII蛋白(图6)。总之，所述文库的拯救是成功的。获得了初始文库大小以上10倍的滴度，并且根据蛋白质印迹，所有的文库均展示融合pIII蛋白。

表1

生物淘选方案

使用了可溶性生物淘选方案。在与噬菌体文库相互作用之后，使用识别细胞因子IL-23的亚基p40的生物素化抗p40IL-23抗体(Biolegend，508802，克隆C8.6)捕获靶标IL-23。

在用所述文库进行孵育之前，用抗p40抗体孵育细胞因子IL-23(eBioscience，34-8239-85，批次E034049)。开发了这种策略来通过用抗体阻断所述p40单元而驱使选择IL-23的p19亚基的结合子。然后也将这种特定的抗体用于将IL-23固定在固体支持物上，用于清洗。

具体地，以两倍浓度的0.1%BSA(于PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.2)缓冲液中)中的生物素化抗-p40 IL-23抗体孵育可变浓度的IL-23 1小时。所述IL-23的浓度随着选择轮而变化，作为严紧方案的一部分以获得靶标特异性噬菌体。使用200，100，50，25，12.5nM的IL-23进行了五轮。反之，输入噬菌体（即在每轮选择中加入靶标中的噬菌体）的浓度保持恒定。

为了避免因为使用了抗p40抗体来结合IL-23而选择出IgG-Fc结合子，从第二轮起，将20微摩尔的全IgG(Sanguin，荷兰)加入IL-23_抗p40抗体_噬菌体混合物中。在室温下用靶标(抗-p40+IL-23)孵育所述噬菌体1hr，随后在0.1ml经抗生蛋白链菌素涂覆的磁性Dynabead(Dynabeads M280抗生蛋白链菌素，Invitrogen)上捕获30min。使用之前，如制造商所推荐的对所述磁珠进行清洗并在旋转轮上在室温下用PBS中0.1%的BSA封闭1hr。

捕获之后，然后用1ml含有0.1% Tween20的PBS将所述磁珠清洗10遍以去除非特异性噬菌体。通过使用磁体可容易地清洗磁珠，如生物淘选领域中的任何技术人员所知晓的。

使用0.2ml甘氨酸-HCl缓冲液（pH2）从所述珠子上洗脱靶标特异性噬菌体5min。随后用0.05ml的Tris缓冲液（pH8）进行中和。通过将对数中期的细菌直接加至磁珠而回收补充级分。

使用经洗脱的噬菌体的样品在2xTY中制备所述经洗脱的噬菌体的十倍稀释物(1E-1至1E-4)，用于通过感染生长至对数中期(OD600nm=0.5)的大肠杆菌TG1细菌而进行滴定。也从在选择轮中用作输入的噬菌体的小样品制备了相同的稀释物(1E-7至1E-9)。这些滴定结果将允许使用之前所描述的公式来计算所述选择轮的产率。

在这一实施例中，将0.9ml细菌加入了0.1ml噬菌体稀释物中并在37℃下孵育了30min。将0.1ml的感染培养物涂布到2xTY-AG琼脂板上用于菌落计数和滴度确定。

在37℃下，在30min的过程中，使用经洗脱的噬菌体来感染20ml对数中期的噬菌体大肠杆菌TG1细菌。孵育后，通过以4000rpm离心10min而获得了细菌粒状沉淀。将所述粒状沉淀重悬于2ml的2xTY中并涂布在2块大的2xTY-AG琼脂板(25X25cm)上。

将体积为0.25ml的对数中期的细菌直接加在磁珠上并在37℃下孵育30min。如之前所述，取样用于滴定。将感染培养物涂布在大的2xTY-AG琼脂板上。

次日计数每块板上的菌落并确定输入和输出噬菌体的滴度用于产率计算。使用LB从所述板上刮取所述大琼脂板上相应于大感染培养物的细菌，通过在OD600nm下测量而确定细菌的数目并加入15%甘油以在-80℃储存。如之前所描述的，从这些甘油储备物中拯救噬菌体以获得纯化的噬菌体用于连续的选择轮。取1E12噬菌体用于下一轮选择。

使用单独的和集合的文库对于IL-23进行5轮选择所获得的滴度显示在表2中。对于用AC12文库进行的生物淘选在四轮选择后获得了最高的产率(表2)。用文库B10进行的生物淘选在五轮后产生了最高的产率(表2)。对于生物淘选活动（campaign），观察到了富集，因为输出滴度增加了48至100倍。

表2

为了从不同的选择轮中分离靶标阳性克隆并且为了进一步确定所述生物淘选的效力，进行了通过ELISA测定的筛选。在这一测定中，测试了来自小体积细菌培养物的上清液。这些细菌培养物对应于来自不同选择轮的从滴定板上随机挑取的单独的克隆(=单独的噬菌体)。伴随摇动(180rpm)，在30℃下、在0.12ml 2xTY-AG中将这些细菌克隆在96深孔板中培养过夜(母板（MASTERPLATE）)。次日，将此板的0.002ml用于接种0.1ml/孔不含葡萄糖的2xTY-A，并立即加入M13K07帮助噬菌体(2x109噬斑形成单位/0.02微升/孔)。伴随摇动(180rpm)在37℃下孵育2.5小时后，将0.030ml 2xTY-AK(Amp：0.1mg/ml和Kan：0.05mg/ml)加入所述培养物并伴随摇动(180rpm)在30℃下继续过夜孵育用于噬菌体繁殖。

对于母板，加入0.020ml 80%甘油用于在-80℃存储。母板用作培养单独的阳性克隆和随后的噬菌体纯化，以进一步表征它们的靶标相互作用。

在此实施例中，筛选了来自4个生物淘选活动的44个克隆/轮选择。没有筛选来自第一轮选择的克隆因为从这一轮中分离靶标特异性克隆的期望是低的。

ELISA的设置如下。以PBS(0.100ml)中0.010mg/ml的浓度在室温(RT)下将中性抗生物素蛋白固定在板上1小时。用含有0.05%Tween20的PBS(PBST)将板子清洗5遍，洗5min。随后，在含有0.1%BSA的PBS中向所述板子加入0.1ml生物素化的抗-p40抗体(100nM)并在4℃下孵育过夜或在RT下孵育1小时。孵育后，用PBST将所述板子清洗5次并用含有0.1%BSA和0.5%明胶的PBS(0.120ml/孔)在室温下封闭至少1小时或在4℃孵育过夜。用PBST清洗5遍后，加入0.1ml PBS（0.1%BSA）中的100nM IL-23(=靶标)。对于单独的阴性对照，不加入IL-23(=背景)。

同时，以1700rpm将细菌平板离心10min以使细菌粒状沉淀。用PBST将含有经固定的IL-23的平板清洗5遍并将0.050ml含有0.2% BSA的PBS与0.050ml含有噬菌体的细菌培养物上清液一起加入平板。伴随摇动在室温下将所述平板孵育1至1.5小时。摇动平板增强了ELISA信号。

孵育后，用PBST将所述平板清洗5次并伴随摆动用与HRP缀合的抗-M13抗体(0.1ml/孔)在室温下孵育40min，其中所述与HRP缀合的抗-M13抗体以1：5000在含有0.1% BSA的2% PBS中被稀释。将平板清洗5次并加入TMB(HRP的底物)溶液(0.1ml/孔)，且将平板在黑暗中孵育5至30min。通过向每个孔中加入0.05ml 2N H₂SO₄而使反应停止并且在450nm处对所述平板进行读数。

阳性克隆的鉴别

当对于靶标的信号为背景之上至少3倍时，认为克隆是阳性的。

对于AC12的生物淘选活动产生了通过ELISA确定的阳性克隆百分比与渐增的选择轮之间的正相关。

文库B10表现得欠佳并且从此文库中仅回收了少数阳性克隆。对于AC12文库，在4轮选择后获得了超过90%的阳性克隆。

也可使用可溶性Alphabody而非展示在噬菌体上的Alphabody来进行所述ELISA。可溶性Alphabody的产生是基于通过使用无葡萄糖条件而对lacZ启动子的分解代谢阻遏以及通过使细菌基因组上的lacIq抑制子失活用异丙基硫代-β半乳糖苷酶(IPTG)诱导转录。编码Alphabody的基因被转录并产生可溶的Alphabody。

从选择轮的滴定板上随机挑取细菌菌落并伴随摇动(180rpm)在30℃下、在0.12ml 2xTY-AG中使其在96孔板中生长过夜。次日，将此板的0.002ml用于接种0.1ml/孔含有0.1%葡萄糖的2xTY-A并在37℃下继续培养以达到OD600nm为0.9(大约2至3小时)。然后，将含有3.3mM IPTG的0.03ml 2xTY-A加入培养物中并伴随摇动(180rpm)在30℃下继续孵育16至18小时。在用IPTG诱导表达之后，每孔中加入0.014ml新鲜制备的B-per(Pierce)并伴随混合在室温下孵育15min。然后将上清液用于ELISA测定。

测序

对于来自AC12生物淘选的所有结合IL-23的阳性克隆(挑取自不同的生物淘选轮)确定了Alphabody序列。通过VIB遗传服务设施（安特卫普大学(比利时)）的标准DNA测序服务确定了这些序列，其中使用了Sanger测序和M13RS测序引物。表3(图8)显示了产生自AC12文库的77个抗IL-23的Alphabody序列的多重比对。如上文所述，这些Alphabody也可以可溶性Alphabody被容易地制备(即噬菌体形式之外)并随后通过标准Ni-NTA/SEC程序被纯化，如蛋白纯化领域的任何技术人员所知晓的。Ni-NTA纯化是直接的第一纯化步骤，因为通常可溶性Alphabody在所述Alphabody的C末端(如在Alphabody文库形式AC12，B10中的情形)或N末端含有His标签，这是重克隆步骤的结果，其中将给定的Alphabody基因从其噬菌体环境中切除(通过标准的分子生物学技术)并插入合适的表达载体中（例如pET16，其中中his标签和蛋白酶裂解位点在所述Alphabody基因之前）。为了确定结合IL-23的Kd(解离常数)，使可溶性Alphabody经受(动力学)Biacore分析或Friguet(间接ELISA)分析(Friguet等人，1985)或经受测量结合强度领域中的任何技术人员知晓的另一种合适的方法。

与小鼠IL-23的交叉反应性

使用ELISA测定研究了与小鼠IL-23的交叉反应性，其中类似于人IL-23策略通过小鼠抗p40抗体捕获了小鼠IL-23。如之前所描述的进行了ELISA测定，且当对于靶标的信号是背景上的信号之上至少2.5倍时，认为克隆是阳性的。观察到了对于AC12文库产生的IL-23阳性克隆，所分析的克隆的26%与小鼠IL-23交叉反应(T/B>2.5)。

与IL-12的交叉反应性

还在人IL-12上测试了127个不同克隆的结构域特异性。如对于IL-23所描述的进行了ELISA。通过抗人p40抗体在平板上捕获了人IL-12且如之前所描述的进行了ELISA。ELISA结果显示了分别来自AC12和B10文库的5/76和0个克隆与人IL-12交叉反应。对于AC12文库，5个人IL-12阳性克隆上的4个也与小鼠IL-23交叉反应。

Claims (18)

1.包含至少100种不同序列单链Alphabody多肽的单链Alphabody文库，其中所述Alphabody多肽在确定的5至20个多样化氨基酸残基位置组中的至少一处彼此相异，并且其中所述多样化氨基酸残基位置中的至少70%但非全部位于：

(i)所述Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列e位置和第二α螺旋中的七序列g位置，和任选的所述Alphabody多肽第一α螺旋中的七序列b位置和/或所述Alphabody多肽的所述第二α螺旋中的七序列c位置,

或

(ii)所述Alphabody多肽的一个α螺旋中的七序列b，c和f位置,

或

(iii)连接所述Alphabody多肽的两个连续α螺旋的连接子片段中的位置。

2.权利要求1的单链Alphabody文库，其中所述至少100种不同序列单链Alphabody多肽中每一个的恒定、非多样化部分是非天然来源的。

3.权利要求1或2的单链Alphabody文库，其中所述多样化氨基酸残基位置被天然存在的氨基酸类型唯独地占据。

4.如权利要求1-3中任一项所定义的Alphabody文库的混合物，其包含2至6个不同的构成文库。

5.核酸或载体文库，其编码如权利要求1-3中任一项所定义的单链Alphabody文库或者编码根据权利要求4的单链Alphabody文库的混合物。

6.宿主细胞文库，其中每种宿主细胞包含如权利要求5中所定义的所述核酸或载体文库的成员。

7.如权利要求1-3中任一项所定义的单链Alphabody文库、或如权利要求4中所定义的单链Alphabody文库的混合物用于体外蛋白展示，例如噬菌体展示、酵母展示、细菌展示或mRNA展示的用途。

8.用于产生单链Alphabody文库的方法，其至少包括下列步骤：

a)产生核酸或载体文库，其编码如权利要求1-3中所定义的单链Alphabody文库或者编码如权利要求4中所定义的单链Alphabody文库的混合物，和

b)在适于产生所述单链Alphabody文库的条件下表达所述核酸或载体文库所编码的Alphabody多肽。

9.根据权利要求8的方法，其中表达由所述核酸或载体文库编码的所述Alphabody多肽的步骤b)包括将所述核酸或载体文库的成员引入宿主细胞中和在适于产生所述单链Alphabody文库的条件下、在培养基中培养所述宿主细胞。

10.权利要求8或9的方法，还包括下列步骤：从所述宿主细胞和/或所述培养基中分离步骤b)中产生的单链Alphabody文库。

11.用于产生对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性、或对于目的靶分子或细胞具有可检测的体外活性的一种或多种单链Alphabody多肽的方法，所述方法至少包括下列步骤：

a)产生如权利要求1-3中的任一项所定义的单链Alphabody文库或如权利要求4中所定义的单链Alphabody文库的混合物,

b)选择对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性、或对于目的靶分子或细胞具有可检测的体外活性的一种或多种单链Alphabody多肽，和

c)分离所述一种或多种单链Alphabody多肽。

12.权利要求11的方法，其中所述选择对于目的靶分子具有可检测的结合亲和性的一种或多种单链Alphabody多肽的步骤包括:

a)使所述目的靶分子与如权利要求1-3中所定义的单链Alphabody文库或如权利要求4中所定义的单链Alphabody文库的混合物相接触,

b)从与所述目的靶分子相接触的所述单链Alphabody文库或单链Alphabody文库的混合物中鉴别出对于所述目的靶分子具有可检测的结合亲和性的一种或多种单链Alphabody多肽，和任选地

c)确定对于所述目的靶分子具有可检测的结合亲和性的所述一种或多种单链Alphabody多肽的氨基酸或核苷酸序列。

13.权利要求12的方法，其中通过重复执行步骤a)和b)而关于对所述目的靶分子具有可检测的结合亲和性的单链Alphabody多肽进一步富集所述Alphabody文库或Alphabody文库的混合物。

14.权利要求11的方法，其中所述选择对于目的靶分子或细胞具有可检测的体外活性的一种或多种单链Alphabody多肽的步骤包括：

a1)在所述目的靶细胞中表达如权利要求1-3中的任一项所定义的单链Alphabody文库或如权利要求4中所定义的单链Alphabody文库的混合物,

或

a2)使如权利要求1-3中的任一项所定义的单链Alphabody文库或如权利要求4中所定义的单链Alphabody文库的混合物与所述目的靶细胞相接触,

b)从所述表达的单链Alphabody文库或单链Alphabody文库的混合物中鉴别出对于所述目的靶分子或细胞具有可检测的体外活性的一种或多种单链Alphabody，和任选地

c)确定对于所述目的靶分子或细胞具有可检测的体外活性的所述一种或多种单链Alphabody多肽的氨基酸或核苷酸序列。

15.通过权利要求11至14中任一项所定义的方法可获得的单链Alphabody多肽。

16.核酸，其编码权利要求15中所定义的单链Alphabody多肽。

17.载体，其包含权利要求16中所定义的核酸。

18.宿主细胞，其包含根据权利要求16的核酸或根据权利要求17的载体。

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