CN103320381A

CN103320381A - 一种多能干细胞表面标志物及其用途

Info

Publication number: CN103320381A
Application number: CN2012100825202A
Authority: CN
Inventors: 曾凡一; 王琳琳; 黄淑帧
Original assignee: Shanghai Fanyi Biological Science & Technology Co Ltd; Shanghai City Children Hospital
Current assignee: Shanghai Fanyi Biological Science & Technology Co Ltd; Shanghai City Children Hospital
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN103320381B

Abstract

本发明公开了紧密连接蛋白家族的Cldn6作为多能干细胞表面标志物的新用途及其用于分离多能干细胞的方法。采用本发明的干细胞表面标志物，可以将干细胞由小鼠畸胎瘤的混合细胞系统中分离纯化出来。表达Cldn6可以有效地判断细胞为干细胞，并用于分离干细胞。本发明的干细胞表面标志物特异性及可应用性强，符合干细胞标志的作用和要求。

Description

一种多能干细胞表面标志物及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种多能干细胞表面标志物及其用于分离多能干细胞的方法。

背景技术

多能干细胞包括胚胎干细胞(ESCs，自然胚和重构胚胚胎干细胞等)和诱导性多能干细胞(iPSCs)，是研究分化和发育的良好模型，也是再生医学中进行替代治疗的重要材料。干细胞表面分子，因在干细胞膜表面特异的表达，不需要以破坏细胞为代价，即可准确判断细胞是否是干细胞，从而是分离、纯化自然状态下干细胞的有效标志。

虽然目前已经发现报道了一些多能干细胞的标志物，但在特异性上有所欠缺，即在干细胞和分化细胞上均有表达，这给分离、纯化干细胞带来了困难，也是进一步研究干细胞功能的障碍。因此，寻找、鉴定干细胞特异性的标志物，用于分离纯化真正的干细胞，具有十分重要的意义。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的多能干细胞表面分子不够特异、不能准确分离多能干细胞的问题，提供一种新的多能干细胞表面标志物。本发明也提供用该新于分离多能干细胞表面标志物多能干细胞的方法。

Claudin6(简称Cldn6)是具有跨膜结构的紧密连接蛋白家族中的一个成员，本发明人通过芯片数据分析，筛选出Cldn6为候选干细胞表面标志物。Cldn6在干细胞中高表达且定位在细胞表面，在分化细胞中几乎无表达。应用Cldn6作为标志物，可以将未分化的干细胞从混合细胞畸胎瘤模型中分离出来，证明了Cldn6的干细胞特异性表面标志物作用，从而完成了本发明。

本发明的第一方面提供紧密连接蛋白家族的成员Cldn6作为多能干细胞表面标志物的用途。

本发明中，Cldn6是紧密连接蛋白家族(tight junction family)的成员。小鼠Cldn6蛋白由小鼠Claudin6基因(定位在小鼠17号染色体上，Gene ID：54419)编码，由219个氨基酸组成，是包含4个跨膜结构域的细胞膜分子(参见文献Genome Biol.2009；10(8)：235-241.)。

Cldn6作为多能干细胞表面标志物可以用于分离、纯化或者检测、鉴定多能干细胞。

本发明的第二方面提供紧密连接蛋白家族的成员Cldn6在分离或者检测多能干细胞中的用途。

本发明中，优选的，所述的多能干细胞是胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞。所述的胚胎包括自然胚和重构胚等。克隆的重构胚等也可以产生胚胎干细胞，用于重构胚中的胚胎干细胞也在本发明的保护范围之内。

本发明中，优选的，所述的多能干细胞是小鼠多能干细胞。更优选的，所述的小鼠多能干细胞是小鼠胚胎干细胞CGR8.8或者小鼠胚胎干细胞R1。

优选的，Cldn6作为唯一的多能干细胞表面标志物单独使用或者和其它常规的多能干细胞标志物联合使用。优选的，所述的其它多能干细胞标志物是Oct-4、Nanog和/或ALP。

本发明的第三方面提供一种分离或者检测多能干细胞的方法，包括荧光标记细胞分选法、免疫磁分离法或免疫吸附柱分离法，这些方法都采用多能干细胞的表面标志物、其抗体和连接荧光标记、磁性物质或者吸附柱的二抗，来实现多能干细胞的分离或者检测，其中所采用的多能干细胞表面标志物是Cldn6。

利用细胞表面标记物来分离纯化细胞的方法是本领域常规的方法，包括荧光标记细胞分选法、免疫磁分离法或免疫吸附柱分离法等。这些方法都采用多能干细胞的表面标志物的抗体以及连接荧光标记、磁性物质或者吸附柱的二抗，将通过抗体和目标细胞表面的标志物的结合，将目标细胞分离纯化出来。本发明可以采用这些常规的技术，其中所使用的细胞表面标志物是Cldn6。

本发明还提供一种分离或者检测多能干细胞的试剂盒，其包含特异性的测量Cldn6所需的试剂。所述的特异性的测量Cldn6所需的试剂优选包括Cldn6的抗体和/或Cldn6的二抗。也可以进一步包括其他特异性的测量其他干细胞表面标记物(如Oct4或Nanog)所需的试剂。

本发明人发现，紧密连接蛋白家族的成员Cldn6在小鼠多能干细胞中特异性高表达，不仅在RNA水平，而且在蛋白水平都呈高表达。在小鼠已分化的细胞、组织中几乎无表达，包括RNA水平和蛋白水平都无表达。所述的小鼠已分化细胞、组织包括小鼠胚胎成纤维细胞MEF(mouseembryonic fibroblasts)和成体小鼠各胚层代表性组织如心、肝、脾、肺、肾等。并且小鼠Cldn6定位在干细胞细胞膜上，ICC(immunocytochemistry)染色表现为细胞表面着色，而在分化细胞中无着色。进一步的，Cldn6作为干细胞表面标志物可以将干细胞由畸胎瘤混合细胞中分离出来。Cldn6作为标志物由畸胎瘤中分离出来的干细胞呈ALP染色阳性，同时表达多能基因Oct4和Nanog。

本发明寻找干细胞表面标志物的方法，包括通过对基因芯片表达谱的分析，得到干细胞及分化细胞差异表达基因，然后根据已知的功能和结构预测可能的干细胞表面标志物。

本发明鉴定干细胞表面标志物的方法，包括标志物在干细胞中定位和表达量特异性的检测和应用表面标志物分选含有干细胞的混合细胞系统，分离得到干细胞。所述的含有干细胞的混合细胞系统包括畸胎瘤混合细胞等。

本发明中，应用小鼠畸胎瘤作为混合细胞模型，将畸胎瘤组织剪碎，消化后制成单细胞悬液，Cldn6作为标志物筛选畸胎瘤细胞。分离出来的Cldn6阳性和阴性细胞分别进行培养，ALP染色检测干细胞克隆的形成情况，RT-PCR和Western Blot方法检测干细胞多能性转录因子的表达情况即可鉴定分离得到的细胞是否为干细胞。

小鼠畸胎瘤因含有干细胞及其分化的三胚层不同阶段的分化细胞，通常用于小鼠干细胞分化功能的分析。本发明利用畸胎瘤含有混合细胞的特点，用于干细胞表面标志物的研究。以干细胞表面标志物作为分选条件，筛选畸胎瘤混合细胞，培养后得到干细胞克隆，表达干细胞转录因子即可确定此标志物为干细胞特异性表面标志物。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明人发现Cldn6是多能干细胞特异性的表面标志物，特异地在干细胞中高表达中，并定位在细胞表面，从而可以将多能干细胞由混合细胞中分离纯化出来。在采用Cldn6作为表面标志物时可以有效地判断细胞是否为干细胞，并分离出干细胞，特异性及可应用性增强，本发明的干细胞表面标志物更加符合干细胞标志的作用和要求。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1Cldn6在干细胞及分化细胞的ICC染色定位。

图2RNA水平，Cldn6分选获得细胞的多能基因表达。

图3蛋白水平，Cldn6分选获得细胞的多能基因表达。

具体实施方式

本发明人以Cldn6为例，通过表达谱芯片数据分析，发现Cldn6是小鼠多能干细胞特异性的表面标志物。检测发现Cldn6在多能干细胞中高表达并特异性定位在细胞表面，而分化细胞中几乎无表达。应用Cldn6作为标志物，对混合细胞系统畸胎瘤模型进行分选，分离纯化得到干细胞。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“常温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

实施例1寻找干细胞表面标志物

本发明应用公共数据库(GEO Datasets，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)的资源，下载分析干细胞与分化细胞的表达谱芯片数据。第一阶段，根据基因表达量的差异，获得干细胞比分化细胞表达高的(2倍以上)基因，定义为干细胞相关基因。第二阶段，对这些相关基因进行功能和定位分析，得到定位在干细胞膜表面并且与干细胞功能相关的基因，定义为干细胞候选表面分子。第三阶段，结合文献查阅分析，对候选表面分子进行细胞水平的差异表达鉴定和能否作为标志物分选获得干细胞的检测，获得新的干细胞表面标志物。

1.数据资源的下载

①应用数据库寻找有意义的芯片

应用公共数据库GEO Datasets，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds，在搜索窗口输入关键词，mouse pluripotent stem cell，检索得到一系列的实验信息。根据寻找干细胞表面分子的目的，确定包含不同来源的小鼠干细胞和分化细胞信息的芯片为有意义芯片。

②下载芯片实验数据

下载实验数据，保存，用于进一步分析。

2.数据分析获得干细胞相关基因

③通过Expression Console v1.1.1.软件，将CEL格式文件转换为XLS格式文件。

Expression Console v1.1.1.软件为公开免费软件。

打开Expression Console v1.1.1.软件后，新建一个study，导入CEL文件，选择RMA的算法，等程序运行完以后，保存一个study文件。得到信号值结果(为TXT格式)，转换为XLS格式。以上步骤详细方法请参见Expression Console_User Guide。

④挑选差异基因

对得到的结果进行差异基因的分析，取干细胞比分化细胞表达高2倍以上(p值＜5％)的基因为干细胞相关基因。

3.获得干细胞候选表面分子

⑤对干细胞相关基因进行功能分析

将④中获得的干细胞相关基因，应用DAVID Analysis(http://david.abcc.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp)进行基因功能、参与的生物过程以及在细胞中的定位等方面的分析。

⑥获得干细胞候选表面分子

将⑤中详细分析的基因按细胞定位进行归类，其中定位在细胞膜同时在干细胞中高表达的基因定义为候选表面分子。

通过文献阅读分析，结合基因的表达量差异(见表1)，确定感兴趣的候选表面分子Cldn6，进行进一步特异性的鉴定和分选实验。

表1.芯片数据中Cldn6在干细胞及分化细胞中的信号差异

	ES1高MEF	ES2高MEF	iPS1高MEF	iPS2高MEF
					差异倍数	87.08	137.88	110.42	118.24
P值	＜0.05	＜0.05	＜0.05	＜0.05

实施例2Cldn6在干细胞中特异性的鉴定

本发明首先通过免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)的方法，鉴定Cldn6在干细胞中膜表面定位的特异性。利用Cldn6抗体识别Cldn6蛋白，结合荧光二抗后，将Cldn6在细胞中的定位显现出来，确定Cldn6分别在干细胞和分化细胞MEF细胞中是否表达及其表达的部位。为了进一步证明Cldn6在干细胞中表达量的特异性，我们分别从RNA水平和蛋白水平比较干细胞及分化细胞中Cldn6的表达量差异。第一阶段，提取干细胞和小鼠不同组织的RNA，经反转录为cDNA后，应用PCR检测及灰度分析确定Cldn6的RNA水平表达量；第二阶段，提取干细胞和小鼠不同组织的蛋白，经Western Blotting聚丙烯酰胺凝胶电泳，Cldn6抗体的识别，结合灰度分析得到Cldn6的蛋白水平表达量。

1.Cldn6在干细胞中的膜定位

(1)细胞株：小鼠胚胎干细胞CGR8.8和R1购自ATCC细胞库。

(2)细胞培养基：高糖DMEM、胎牛血清、β巯基乙醇、100×非必须氨基酸、100×丙酮酸钠、100×青链霉素、100×谷氨酰胺均购自Gibco公司。白血病抑制因子(LIF)购自Millipore。Cldn6抗体购自Santa Cruz。Cldn6驴抗羊绿色荧光二抗购自Invitrogen公司。丝裂霉素C、DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)购自Sigma公司。

(3)细胞培养：

小鼠胚胎皮肤成纤维细胞(MEF)的获取及培养：取孕13.5天的小鼠(ICR品系小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司)，脱臼处死后，无菌条件下取出胎鼠。在无菌PBS液中，去除胎鼠的头部、四肢和内脏。将留下的躯干部的皮肤剪碎，0.5％(wt)胰酶消化5分钟，吹打至无明显组织块。终止消化，1000rpm 3分钟离心后，MEF培养液(含10％(v/v)胎牛血清、1％(wt)青链霉素和1％(wt)谷氨酰胺的DMEM培养基)重悬，加入培养瓶中，37℃，5％(v/v)CO₂培养，记为第0代。2到3天后传代。接种到带有小玻片的培养皿中。待MEF细胞长至80％密度时，用于免疫荧光检测(ICC)。

干细胞培养：将3代以内的长满的MEF细胞用10μg/ml丝裂霉素C处理后用于干细胞培养的滋养层细胞。37℃水浴复苏干细胞，将冻融细胞1000rpm 3分钟离心，倾去上清，细胞沉淀加入干细胞培养液(含15％(wt)胎牛血清、0.1mmol/L β巯基乙醇、1％(wt)非必需氨基酸、1％(wt)丙酮酸钠、1％(wt)青链霉素、1％(wt)谷氨酰胺和1000U/ml LIF的DMEM培养基)重悬，转移入准备好的滋养层细胞上，37℃，5％(v/v)CO₂培养。每天换液。

2、3天后，干细胞克隆变厚，变大，接近接触时，将干细胞进行传代。PBS冲洗，0.5％(wt)胰酶消化3分钟，血清终止消化后，1000rpm离心3分钟，弃上清。干细胞培养液重悬细胞沉淀，转移至培养皿中静止沉降20分钟，根据干细胞与滋养层细胞的贴壁时间差(滋养层先贴壁)，除去混合的滋养层细胞。将较纯的干细胞按照1∶3～1∶6的比例(细胞接种面积比)转移至带有玻片的培养皿里，培养3天用于ICC检测。

MEF细胞的获取及干细胞的培养方法详细步骤请参见现代生物技术与医药科技出版中心2005年出版的《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》第8章囊胚来源的干细胞系的分离和培养。

(4)免疫荧光检测(ICC)：

①将准备好的种植细胞的玻片，PBS洗2遍后，4％(wt)多聚甲醛固定细胞10分钟。

②吸除固定液，加入PBS室温放置5分钟，洗2遍。

③用3％(wt)牛血清白蛋白室温封闭30分钟，弃去封闭液。

④加入稀释好的Cldn6一抗(将Cldn6一抗按1∶50v/v的比例用3％牛血清白蛋白稀释)于玻片上，4℃过夜。

⑤加入PBS室温放置5分钟，洗3遍。

⑥加入稀释好的Cldn6荧光二抗[将Cldn6荧光二抗按1∶500v/v的比例用3％(wt)牛血清白蛋白稀释]，室温放置1小时。⑦加入PBS室温放置5分钟，洗3遍。

⑧加入DAPI室温放置5分钟，进行细胞核染色。

⑨PBS洗2遍后，加入封片剂封片。Leica共聚焦显微镜检测。

经过ICC检测后，结果见图1。可见，干细胞R1，CGR8.8中，Cldn6表达定位在细胞表面，细胞膜上，而在MEF细胞中无Cldn6的表达，细胞无着色。如图1所示：绿色荧光表示Cldn6在细胞中的表达定位，蓝色DAPI染色表示细胞核的定位，最后Merge是将绿色荧光与蓝色荧光重叠的图像，可以很清楚地看到在干细胞中Cldn6的绿色荧光包裹着蓝色的细胞核定位在细胞表面，而MEF细胞只有细胞核着色。

2.Cldn6在干细胞中表达量的特异性

(1)RNA水平，Cldn6在干细胞及小鼠各组织中表达量的比较

取抽提得到的干细胞(R1，CGR8.8)和小鼠各组织细胞RNA，逆转录得到cDNA，分别用Cldn6引物和内参Gapdh引物进行PCR扩增。同一基因，所有样本反应体系和反应条件完全相同，包括样本中的RNA量也是相同的，唯一不同的是所用的样本不同。Gapdh用作内参，消除试验过程中的操作误差。Cldn6和Gapdh的引物序列分别为：

Cldn6 F：5’-CATTTGGTAGGCAAGCAC-3’；

Cldn6 R：5’-GGTTGGAAGTCTCAGGGTA-3’；

Gapdh F：5’-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3’；

Gapdh R：5’-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3’。

PCR扩增反应体系为(TianGen)：

反应条件为Cldn6：94℃ 5min；(94℃ 10sec，60℃ 45sec，72℃ 45sec)×32个循环；72℃ 10min；Gapdh：94℃ 5min；(94℃ 10sec，60℃ 45sec，72℃ 45sec)×28个循环；72℃ 10min。扩出436bp的Cldn6片段和500bp的Gapdh片段，琼脂糖凝胶电泳后，对电泳条带进行灰度分析。每个样本的Cldn6灰度值/Gapdh灰度值即得到每个样品的Cldn6相对表达量，结果见表2。可见干细胞R1，CGR8.8中Cldn6均有高表达，而成体组织中几乎无Cldn6的表达。证明RNA水平，Cldn6在干细胞中特异性表达。

(2)蛋白水平，Cldn6在干细胞及小鼠各组织中表达量的比较

取抽提得到的干细胞(R1，CGR8.8)和小鼠各组织细胞蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜后，分别加入Cldn6和Gapdh抗体孵育，4℃过夜。第二天TBST洗去多余抗体，加入HRP标记的驴抗羊二抗，室温孵育2小时。化学发光、显影后对条带进行灰度值分析。同一基因，抗体稀释浓度、孵育时间完全相同，发光、显影时间相同，样本中蛋白上样量也是相同的，唯一不同的是所用的样本不同。Gapdh用作内参，消除试验过程中的操作误差。

每个样本的蛋白条带Cldn6灰度值/Gapdh灰度值即得到每个样品的Cldn6相对表达量，结果见表3。可见干细胞R1，CGR8.8中均有Cldn6蛋白水平的高表达，而成体组织中几乎无Cldn6的表达。证明蛋白水平，Cldn6在干细胞中特异性表达。

实施例3应用Cldn6作为标志物，分离纯化畸胎瘤混合细胞中干细胞

畸胎瘤由联合免疫缺陷小鼠(NOD-SCID)皮下注射干细胞形成，含有干细胞及其发育分化的三胚层的组织细胞，通常用于干细胞多能性的验证。本发明采用畸胎瘤作为混合细胞系统，检测Cldn6是否可以作为干细胞分选的标志物，分为三个阶段。第一阶段，将R1注射入NOD-SCID小鼠腋下的皮下，形成畸胎瘤；第二阶段，将畸胎瘤分离出来，制成混合细胞悬液，以Cldn6作为标志物，经流式细胞仪分选；第三阶段，干细胞碱性磷酸酶(ALP)染色呈阳性，并表达多能性转录因子Oct4，Nanog和Sox2，对Cldn6表达阳性和阴性的畸胎瘤细胞分别进行碱性磷酸酶染色和基因表达测定，可以确定分选细胞是否是干细胞。

1.畸胎瘤的制备

(1)制备R1单细胞悬液

将待传代R1细胞消化离心后(同实施例2，1中的干细胞培养)，通过沉降除去滋养层细胞，用DMEM培养基重悬较纯的R1细胞，吹打为单细胞悬液。

(2)在受体NOD-SCID小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)的腋下处皮下注射R1细胞悬液(每只小鼠2×10⁶个细胞)。

(3)移植6周后，脱臼处死NOD-SCID受体鼠。将皮下形成的畸胎瘤组织解剖分离出来。

2.应用Cldn6作为标志物，分选畸胎瘤混合细胞。

(1)将成熟的畸胎瘤切除5mm×5mm组织，PBS冲洗后，用眼科剪剪碎。收集畸胎瘤碎组织，加入0.5％(wt)胰酶，37℃消化10分钟，期间吹打3次，至无明显组织块时，加入血清终止消化，1000rpm离心3分钟，经40μm滤网过滤后，用PBS重悬畸胎瘤混合细胞1000rpm离心3分钟洗涤。

(2)将畸胎瘤混合细胞沉淀，加入稀释好的Cldn6一抗(按1∶50v/v的比例用3％牛血清白蛋白稀释)37℃孵育2小时。PBS洗2次后，加入绿色荧光标记的驴抗羊二抗，37℃孵育1小时，PBS洗2次后，重悬待上机检测及分选。为排除抗体非特异性染色造成的假阳性，同时准备对照组细胞，即同样的畸胎瘤混合细胞，但一抗用山羊血清代替，其余操作相同。

(3)将畸胎瘤混合细胞液经BD FACSAria III流式机检测Cldn6的表达，结果可见实验组有2％的阳性率，而对照组没有Cldn6阳性率为0％。这说明，在排除抗体原因致的假阳性后，可检测到畸胎瘤中有2％的细胞为Cldn6阳性表达细胞。将实验组中2％的Cldn6阳性及98％的Cldn6阴性细胞分选，并分别收集。

3.分选后Cldn6阳性及阴性细胞的干细胞验证

(1)分选畸胎瘤细胞的碱性磷酸酶(ALP)染色

①分选得到的Cldn6阳性及阴性细胞经PBS洗1遍后，干细胞培养液重悬细胞沉淀，并接种在培养皿中。每天换液，显微镜下观察。2～3天后进行ALP染色，判断是否为干细胞克隆。

②培养细胞经PBS洗3遍，4％(wt)多聚甲醛固定10分钟。PBS洗3遍后，染色缓冲液(100mM Tris-HCl、100mM NaCl和50mM MgCl₂·6H₂O配制)孵育10分钟。NBT/BCIP(染色缓冲液1∶100稀释，购自Sigma公司)室温染色15-30min。PBS洗1遍，观察拍照。

③200倍显微镜下Cldn6阳性及阴性细胞组均随机观察5个视野，记数染色克隆数，取均数并进行统计分析。结果见表4。可见Cldn6阳性细胞组ALP染色阳性克隆数达35个/视野，未见ALP阴性克隆；而Cldn6阴性细胞组无克隆形成，并无ALP染色，这表明Cldn6阳性细胞均为具有多能性的干细胞，所有克隆ALP染色均阳性，而Cldn6阴性细胞不能形成干细胞克隆，并无ALP染色，并非干细胞。

表4.Cldn6分选获得细胞的ALP染色

(2)分选畸胎瘤细胞多能性基因的表达情况

①多能性基因RNA水平的表达：分选得到的Cldn6阳性及阴性细胞经PBS洗2遍后，加入Trizol(Invitrogen)，进行RNA抽提，逆转录为cDNA。分别用多能性基因Oct4和Nanog引物进行PCR扩增。同时扩增Gapdh作为内参。Cldn6阳性及阴性细胞组操作均相同，包括样本中的RNA量也是相同的。Cldn6及Gapdh引物和PCR扩增条件同实施例2中2所述。Oct4和Nanog的引物序列分别为：

Oct4 F：5’-TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC-3’

R：5’-TGCGGGCGGACATGGGGAGATCC-3’

Nanog F：5’-AGGGTCTGCTACTGAGATGCTCTG-3’

R：5’-CAACCACTGGTTTTTCTGCCACCG-3’

PCR体系同实施例2中2所述，Oct4和Nanog的反应条件均为：94℃5min；(94℃ 10sec，63℃ 45sec，72℃ 45sec)×30个循环；72℃ 10min。Oct4和Nanog的片段大小分别为223bp和363bp。琼脂糖凝胶电泳后，观察Cldn6阳性和阴性细胞多能基因条带，见图2。发现，Cldn6阳性细胞有多能基因Oct4和Nanog的条带，而Cldn6阴性细胞没有条带。同时扩增的Gapdh表明PCR过程正常，排除了人为操作对结果的影响。Cldn6条带也证明了分选细胞分别为Cldn6阳性及阴性细胞群。可见，分选获得的Cldn6阳性及阴性细胞分别表达和不表达多能性基因，分别代表了干细胞和非干细胞。

②多能性基因蛋白水平的表达：分选得到的Cldn6阳性及阴性细胞经PBS洗2遍后，加入蛋白裂解液(Invitrogen)，进行蛋白抽提。进行WesternBlot实验，检测多能基因蛋白水平的表达情况，实验过程同实施例2中2所述。Oct4抗体稀释浓度为1∶200(购自SantaCruz公司)，Nanog抗体稀释浓度为1∶400(购自Millipore公司)。发光显影后，通过蛋白条带，分析不同细胞组基因的蛋白水平表达情况。结果见图3。可见，与RNA水平类似，Cldn6阳性细胞组，有Cldn6及多能基因Oct4、Nanog的表达条带，而Cldn6阴性细胞组无条带出现。Gapdh条带表示，无人为操作问题，结果真实可靠。因此，分选获得的Cldn6阳性细胞蛋白水平也表达多能性基因，进一步证明了Cldn6阳性细胞即干细胞，而Cldn6阴性细胞不具有干细胞的基因表达特征。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.紧密连接蛋白家族的成员Cldn6作为多能干细胞表面标志物的用途。

2.紧密连接蛋白家族的成员Cldn6在分离或者检测多能干细胞中的用途。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的多能干细胞是胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞。

4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的多能干细胞是小鼠多能干细胞。

5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的小鼠多能干细胞是小鼠胚胎干细胞CGR8.8或者小鼠胚胎干细胞R1。

6.如权利要求2所述的用途，其特征在于，Cldn6作为唯一的多能干细胞表面标志物单独使用或者和其它常规的多能干细胞标志物联合使用。

7.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的其它多能干细胞标志物是Oct-4、Nanog和/或ALP。

8.一种分离或者检测多能干细胞的方法，包括荧光标记细胞分选法、免疫磁分离法或免疫吸附柱分离法，这些方法都采用多能干细胞的表面标志物、其抗体和连接荧光标记、磁性物质或者吸附柱的二抗，来实现多能干细胞的分离或者检测，其特征在于，所采用的多能干细胞表面标志物是Cldn6。

9.一种分离或者检测多能干细胞的试剂盒，其特征在于，其包含特异性的测量Cldn6所需的试剂。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性的测量Cldn6所需的试剂包括Cldn6的抗体和/或Cldn6的二抗。