CN103319550B

CN103319550B - 甜叶菊粗品中甜菊糖苷的分离纯化方法

Info

Publication number: CN103319550B
Application number: CN201310291675.1A
Authority: CN
Inventors: 陈振斌; 龙佳朋; 刘晓娇
Original assignee: Lanzhou University of Technology
Current assignee: Stillwell biological technology (Suzhou) Co., Ltd.
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2033-07-12
Also published as: CN103319550A

Abstract

甜叶菊粗品中甜菊糖苷的分离纯化方法，其步骤为：（1）将活化好的大孔吸附树脂采用湿法装柱装入交换柱中；（2）将甜叶菊粗品配成0.05～0.6 g/L做为吸附液，使其流经大孔树脂树脂混合床，进行动态吸附；（3）将步骤(2)得到的吸附后的大孔吸附树脂混合床用蒸馏水洗涤，然后加入洗脱剂 5%，60%乙醇以及乙醇和乙酸乙酯混合液，使其依次以相同流速流经树脂混合床，进行梯度洗脱;（4）将解吸液蒸发浓缩，烘干，即得甜菊苷。

Description

甜叶菊粗品中甜菊糖苷的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及高甜度、低热值天然甜味剂的分离纯化方法，具体涉及吸附分离纯化甜菊苷的方法。

背景技术

甜叶菊(steviarebaudiana)别名甜菊﹑糖草，属菊科(Compositae),斯台维亚属，原产地在南美亚热带地区。我国自1976年开始由南京中山植物园、中国农业科学院等科研单位先后从日本引进甜叶菊试种成功。甜叶菊含有14种微量元素﹑32种营养成分，在体内不代谢、不蓄积、不致癌、无毒性，其安全性已得到国际FAO和WHO以及美国FAD等组织的认可，因此它既是极好的糖源，又是良好的营养来源。

甜叶菊糖苷，简称甜菊苷，是从干燥后的甜叶菊叶片中提取出来的一类具甜味的萜烯类配糖体，主要包含8种具有不同甜度的糖苷。甜菊苷具有高甜度(为蔗糖的200-300倍)﹑低热量(仅为蔗糖的1/300)的特性，长期食用不会使人发胖，特别适宜肥胖病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者使用，而且物理、化学性能稳定、无发酵性，可延长甜叶菊糖苷制品的保质期。因而日益引起人们的关注和重视，被广泛应用在食品和药物行业中，被誉为继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源，是最有发展前途的新糖源。

天然产物研究的成果己广泛应用于医药和保健业，为保障人类健康提供了许多有价值的药物。从植物中提取的一些产物，大多数具有针对性强、毒副作用小等特点，是医药工业中新药研究的主要源泉之一。MAR在天然产物有效成分分离纯化中的优势主要表现在以下两个方面：其一，已有许多天然产物的有效成分成功通过MAR技术提取，这为其它天然产物有效成分的提取研究打下了基础；其二，不断有新的MAR问世，这为天然产物有效成分的分离提供了可供选择的高效树脂。

大孔吸附树脂（MAR）是由可聚合单体、交联剂等可聚合成分与致孔剂、分散剂等添加剂经悬浮（或反相悬浮）聚合反应制备而成的一种球状、具有多孔结构的高分子吸附分离材料，具有吸附容量大、一定的选择性、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，已被广泛应用于废水处理、医药工业、化学工业、分析化学、临床鉴定等领域。MAR的品种很多，不同MAR对不同物质的吸附选择性也有差异。MAR的选择性不仅表现在对某些物质吸附程度的差别，有时还直接表现为对目标物质的吸附与分离，这样，MAR可用于从混合物中对有效成分的分离、纯化。

虽然目前对MAR应用的研究已经相当广泛，但主要集中在利用合成或市售的某一种MAR对底物进行简单的吸附分离实验。由于不同的MAR在极性、功能基、孔径、孔容及比表面积等结构参数方面都有所不同，而某一种MAR对多种成分也有不同程度的吸附，因此，对于一些物质结构较为相似成分的分离，采用单一类型的MAR往往很难达到对其较好的分离效果，通常分离后纯度高的回收率低，回收率高的产品纯度低，这在一定程度上限制了MAR应用研究更好地发展。

利用静态吸附，虽可在相同条件下平行地进行多个实验，同时可在等温条件下进行吸附，研究吸附量与时间或平衡浓度的关系，可以得到吸附动力学曲线或吸附等温线，进行相关的理论研究，但其并不适合于大规模的工业生产，这限制了MAR在工业生产中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种甜叶菊粗品中甜菊糖苷的分离纯化方法。

本发明是甜叶菊粗品中甜菊糖苷的分离纯化方法，其步骤为：

（1）将活化好的大孔吸附树脂采用湿法装柱装入交换柱中；

（2）将甜叶菊粗品配成0.05～0.6g/L做为吸附液，使其流经大孔树脂树脂混合床，进行动态吸附；

（3）将步骤(2)得到的吸附后的大孔吸附树脂混合床用蒸馏水洗涤，然后加入洗脱剂5%，60%乙醇以及乙醇和乙酸乙酯混合液，使其依次以相同流速流经树脂混合床，进行梯度洗脱;

（4）将解吸液蒸发浓缩，烘干，即得甜菊苷。

本发明的有益之处是：(1)在最佳工艺条件下，采用MAR混合床法实现了对甜菊苷的更高效分离，为甜菊苷的工业化生产打下了基础；(2)本发明所设计到的工艺路线、所用试剂等均为国际上所公认的绿色环保技术。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

（1）将活化好的大孔吸附树脂采用湿法装柱装入交换柱中；

（4）将解吸液蒸发浓缩，烘干，即得甜菊苷。

根据以上所述的方法，步骤(1)中，所述的交换柱内径为1.6cm。

根据以上所述的方法，步骤(2)中，所述大孔吸附树脂混合床采用接枝法进行筛选，即先用单一大孔吸附树脂对甜菊糖粗品溶液进行吸附/解吸，然后选出吸附率＞0.92的大孔吸附树脂为干枝，剩余树脂为侧枝，进行接枝，以此类推，最后筛选出吸附率＞0.98，解析率＞0.80，纯度＞0.90的大孔吸附树脂组合组成混合床。

根据以上所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的吸附条件为：吸附液体积为2～4倍的树脂混合床体积BV，吸附液的流速为1BV/h，h的单位为小时。

根据以上所述的方法，步骤(3)中，所述的洗脱条件为：所加洗脱剂的体积为1倍的树脂混合床体积，洗脱剂的流速为3BV/h。

根据以上所述的方法，所述大孔吸附树脂的组合是从极性树脂和非极性树脂中选出的。

根据以上所述的方法，最优的大孔吸附混合床是从极性树脂和非极性树脂中选出来的几种混合在一起。

根据以上所的方法，乙醇和乙酸乙酯混合液按3比1混合在一起。

本发明中大孔吸附树脂含水率的测定及其活化方法如下:

(1)大孔吸附树脂含水率的测定：

称取一定量的MAR，在110℃的真空干燥箱中烘36h，取出并置于干燥器内冷却0.5h，称重；在同样的温度条件下再烘30min，取出并置于干燥器内冷却0.5h，称重。重复前面测重过程，直到前后两次质量差≤0.05mg。根据烘干前后的质量差计算其含水率。每种树脂在测定含水率时取两份平行样，以保证称量的精确性。

（2）大孔吸附树脂的活化与纯化：

称取干重约为10.0g的MAR，放入100mL烧杯中，先加入一定体积乙酸乙酯浸泡24h后，到处浸泡液，再加入一定体积乙醇浸泡24h后，回收浸泡液。随后再加入适量乙醇洗涤至加入3倍体积的蒸馏水已无白色浑浊物出现。加入适量的蒸馏水洗涤树脂，浸泡5min以后弃去洗涤液，如此反复三次，使得残留在树脂中的乙醇能够较充分的被水逐渐替换。

本发明中，甜菊苷含量、提取率及纯度的测定和计算方法如下：

(1)甜菊糖含量的测定：

采用高效液相色谱法(HPLC)测定甜菊苷的含量，具体色谱条件为：色谱仪：Agilent1200series;G1315B型二极管阵列紫外检测器，检测波长：210nm;色谱柱：ATLichromNH₂(150mm×4.6mm,5μm,兰州中科安泰分析科技有限公司)；流动相：V_乙腈:V_水=80:20;柱温：30^oC；流速：1.2mL/min；进样量：20μL。

准确称取约0.20000g甜菊糖标准品，加入70%乙醇（V/V）搅拌溶解，将部分甜菊糖苷溶解后的悬浊液移入200mL容量瓶，如此反复多次，直至烧杯中的甜菊糖苷完全被移入容量瓶后，用70%乙醇洗涤烧杯，洗涤液并入容量瓶，之后用70%乙醇定容至刻度线，得浓度为1.0g/L的甜菊糖标准溶液。

用移液管分别移取上述标准品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0mL一定量至8个10mL容量瓶中，加70%乙醇定容，制得浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7g/L的甜菊糖苷标准溶液，采用高效液相色谱仪测定各标准溶液的峰面积值，绘制甜菊糖苷溶液浓度(C)-峰面积(A)标准曲线，所得线性回归方程为：A=3089.998C-29.98（R²=0.9991），且在0.05~0.06g/L浓度范围内线性关系良好。

（2）甜菊苷纯度的计算：

将活化处理过的MAR按编号装入内径为1.6cm的交换柱中，准确移取两倍树脂柱体积，总浓度为7.00g/L的甜菊糖粗品溶液，控制流速为1BV/h进行吸附，接收残液，用HPLC测定残液中甜菊苷含量。将吸附后的MAR用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后依次准确移取1倍树脂床体积的5%，60%乙醇以及乙醇和乙酸乙酯混合液，控制其流速为3BV/h进行梯度洗脱，依次接收洗脱液，用HPLC法测定各洗脱液中甜菊苷的含量。利用所测定的吸附残液及洗脱液的峰面积，依式（1）-（4）计算MAR的吸附率、解吸率、吸附量及解吸附量。

吸附率：

(1)

吸附量：

(2)

其中，F代表吸附率（%），q_a代表吸附量（mg/g）；C₀和C₁分别代表甜菊苷的原液浓度和残液浓度（g/L）；m是所用MAR干重质量（g）；V是所用甜菊糖溶液体积（mL）。

解吸率：

(3)

解吸量：

(4)

其中，D是解吸率（%）；q_d是解吸附量（mg/g）；C_d是洗脱液中甜菊苷浓度（g/L）；V_d是解吸液体积（mL）。

甜菊苷纯度：

解析之后，将所收集的解析液烘干，然后称取一定量的干样品，加70%乙醇溶解后定容至25mL，用HPLC法测定所配溶液中甜菊苷的含量，依式（5）计算经吸附解吸附分离过程后所得样品的纯度。

(5)

其中，P是经吸附/解吸附分离过程后所得甜菊苷样品的纯度，C是所配溶液中甜菊苷的浓度，25是所配溶液的体积，m是称取配溶液的样品质量。

实施例1：

如图1所示，为本发明对甜菊糖粗品中甜菊糖苷分离纯化方法的工艺流程图，具体步骤包括：

将10.0g的MAR放入100mL烧杯中，按照前面所述进行活化与纯化处理；

将上述处理好的MAR装入内径为1.6cm的交换柱中，甜叶菊粗品配成0.05～0.6g/L的溶液作为吸附液，使其以1BV/h的速度流经大孔树脂树脂混合床，进行吸附；

待吸附结束后，收集吸附残液，用HPLC测定残液中甜菊苷含量，依式(1)-(2)计算吸附率以及吸附量；

将上述MAR柱用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后控制流速为3BV/h，依次加入5%，60%乙醇以及乙醇和乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，待洗脱完成后，分别接收洗脱液，用HPLC法测定各洗脱液中甜菊苷的含量，依式(3)-(4)计算解吸率以及解吸量；

将各洗脱液倒入培养皿中于60^oC烘箱进行干燥，得到甜菊糖苷；

将上述所得甜菊糖苷配成0.1～0.4g/L的溶液，用HPLC测定残液中甜菊苷含量，依式(5)计算所得甜菊糖苷的纯度。

下面结合实施例2和3对本发明做进一步的说明：

实施例2：

称取干重约为10.0g的MAR混合床AB-8+LSA-21，放入100mL烧杯中，先加入一定体积乙酸乙酯浸泡24h后，到处浸泡液，再加入一定体积乙醇浸泡24h后，回收浸泡液。随后再加入适量乙醇洗涤至加入3倍体积的蒸馏水已无白色浑浊物出现。加入适量的蒸馏水洗涤树脂，浸泡5min以后弃去洗涤液，如此反复三次，使得残留在树脂中的乙醇能够较充分的被水逐渐替换。将活化处理过的AB-8装入内径为1.6cm的交换柱中，准确移取130mL，总浓度为7.00mg/mL的甜菊糖粗品溶液，控制流速为1BV/h进行吸附，接收残液，用HPLC测定残液中甜菊苷含量。将吸附后的MAR用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后依次准确移取65mL的5%，60%乙醇以及乙醇和乙酸乙酯混合液，控制其流速为3BV/h进行梯度洗脱，依次接收洗脱液，用HPLC法测定各洗脱液中甜菊苷的含量。利用所测定的吸附残液及洗脱液的峰面积，依式（1）-（5）得吸附率F=0.99，解吸附率D=0.68，吸附量q_a=91.72mg/g，解吸量q_d=62.37mg/g，纯度P=0.87。

实施例3：

称取干重约为10.0g的MAR混合床AB-8+LSA-21+DM30，放入100mL烧杯中，先加入一定体积乙酸乙酯浸泡24h后，到处浸泡液，再加入一定体积乙醇浸泡24h后，回收浸泡液。随后再加入适量乙醇洗涤至加入3倍体积的蒸馏水已无白色浑浊物出现。加入适量的蒸馏水洗涤树脂，浸泡5min以后弃去洗涤液，如此反复三次，使得残留在树脂中的乙醇能够较充分的被水逐渐替换。将活化处理过的AB-8装入内径为1.6cm的交换柱中，准确移取136mL，总浓度为7.00mg/mL的甜菊糖粗品溶液，控制流速为1BV/h进行吸附，接收残液，用HPLC测定残液中甜菊苷含量。将吸附后的MAR用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后依次准确移取68mL的5%，60%乙醇以及乙醇和乙酸乙酯混合液，控制其流速为3BV/h进行梯度洗脱，依次接收洗脱液，用HPLC法测定各洗脱液中甜菊苷的含量。利用所测定的吸附残液及洗脱液的峰面积，依式（1）-（5）计算可得吸附率F=0.99，解吸附率D=0.87，吸附量q_a=94.25mg/g，解吸量q_d=81.99mg/g，P=0.93。

本发明所用的甜菊糖粗品产自甘肃酒泉。

以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

Claims

1.甜叶菊粗品中甜菊糖苷的分离纯化方法，其步骤为：

（1）将活化好的大孔吸附树脂采用湿法装柱装入交换柱中，所述交换柱的内径为1.6cm；

（2）将甜叶菊粗品配成0.05～0.6g/L做为吸附液，使其流经大孔吸附树脂混合床，进行动态吸附；

所述动态吸附的条件为：吸附液体积为2～4倍的大孔吸附树脂混合床体积BV；吸附液的流速为1BV/h；

所述大孔吸附树脂混合床采用接枝法进行筛选，即先用单一大孔吸附树脂对甜菊糖粗品溶液进行吸附/解吸，然后选出吸附率＞0.92的大孔吸附树脂为干枝，剩余树脂为侧枝，进行接枝，以此类推，最后筛选出吸附率＞0.98，解析率＞0.80，纯度＞0.90的大孔吸附树脂组合组成混合床；

所述大孔吸附树脂混合床中的树脂为极性树脂和非极性树脂中的几种；

（3）将步骤（2）得到的吸附后的大孔吸附树脂混合床用蒸馏水洗涤，然后依次加入洗脱剂5%乙醇，60%乙醇和乙醇与乙酸乙酯混合液，使洗脱剂依次以相同流速流经树脂混合床，进行梯度洗脱；所述乙醇与乙酸乙酯混合液中，乙醇与乙酸乙酯的体积比为3:1；

所述梯度洗脱的条件为：洗脱剂的体积为1倍的大孔吸附树脂混合床体积；洗脱剂的流速为3BV/h；

（4）将解吸液蒸发浓缩，烘干，即得甜菊糖苷。