CN103308659B - 一种基于人鼠杂交瘤细胞的水体有机污染的毒性评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于人鼠杂交瘤细胞的水体有机污染的毒性评价方法，包括萃取水样中的有机物；用水样有机物对细胞进行染毒处理；克隆培养；毒性量化。本发明对不同类型的水体有机污染进行基于生物体的毒性评价，弥补了单纯依靠水体理化指标变化对水质污染进行检测和评估的不足；对有机毒物的种类不具有特异性，适用范围广；培养皿经过宽离子束辐照改性后更加有利于细胞对培养皿的附着，有利于细胞的生长和存活，以及提高该评价方法的精准度；亚甲基蓝染液相比于结晶紫染液和吉姆萨染液，其成本更低，对细胞的毒性更小，具有很好的经济和环境效益，因此选用该染液对细胞克隆进行染色。
Description
技术领域
本发明涉及一种水污染鉴定评价方法，尤其涉及的是一种基于人鼠杂交瘤细胞的水体有机污染的毒性评价方法。
背景技术
当前，世界水源污染的状况已经十分严重。据称，全世界每年约有4200多亿立方米的污水排入江河湖海，污染了55000亿立方米的淡水，约占全球径流量的14%以上。而且，目前还正呈日益恶化的趋势。由于水源被重金属离子以及有毒的有机物污染，因此严重威胁到人类的健康。这些物质可引起人们畸形、患癌症、器官病变。目前，我国在环境领域方面的研究多集中于环境中有毒化学物质的检测方法和相关技术的开发，以及有毒有害物质环境浓度的监测上，或者停留在传统流行病学调查的基础上。对于效应解析，国内学者的研究也仅仅停留在浓度水平和一些毒性数据或环境基准的相对比较上，很少涉及定量评估，远远落后于欧美日等发达国家。
国内外研究表明，水污染的预警和评价大多是针对长期、低剂量暴露的遗传毒性物质。为了能够全面地评价化合物的遗传毒性，需要采用一系列的遗传毒性物质的致癌风险评价方法：人群流行病学调查、哺乳动物致癌试验、致突变试验及体外细胞转化试验。但是污染水环境的有毒化合物并不都是遗传毒性的，通过一些致癌风险评价方法无法真实地反映水污染情况。而本发明采用的检测终点—细胞克隆形成能力，对于水环境中有毒化合物的种类没有选择性，可以灵敏地反映任何区域水介质中的任何有毒混合物对细胞增殖能力的影响。目前国内主要基于物理和化学原理研发了一系列水污染检测和预警的系统或装置，相关专利申请如：中国专利CN101882350A，基于微生物燃料电池原理的水污染生物预警系统和方法，将该系统安装于待监测水体，原水进入微生物燃料电池（MFC）敏感单元，调整外电阻大小使得系统灵敏度最高，MFC敏感单元的输出电压/电流由信号采集单元采集，经计算处理后进行上传存储并实时显示在显示屏上。中国专利CN101692034A，便携式水污染物在线检测装置，该装置采用导流方式将待测水样引导到会聚高斯光束的束腰区，通过透过率起伏法测量水中微米级颗粒污染物的平均粒径和颗粒数浓度，通过DSP进行信号采集和处理。但是这些技术检测水污染的原理均是基于污染物的物理或化学特性，不能反映出污染物的潜在毒性危害。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于人鼠杂交瘤细胞的水体有机污染的毒性评价方法，模拟了更为接近实际的一套水污染环境对生物体有害影响的系统，对水污染毒性的鉴定具有更高指导性的意义。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
（1）萃取水样中的有机物；
（2）用水样有机物对人鼠杂交瘤细胞AL细胞进行染毒处理；
（3）克隆培养
a、将染毒处理后的人鼠杂交瘤细胞种植在经过宽离子束辐照改性后的培养皿中；
b、将培养皿在37℃，体积浓度为5%的CO2细胞培养箱中培养7～10天形成细胞克隆；
（4）毒性量化
c、对培养皿中的细胞克隆用PBS缓冲液清洗1～3次，使用固定液固定15～30分钟，用移液器吸去固定液，然后使用亚甲基蓝染液对细胞克隆染色，染色6～24小时，流水洗除染液后，空气干燥；
d、计数培养皿中细胞克隆的个数，使用下面公式对水样的毒性进行评价：
细胞种植率%=培养皿中的细胞克隆数/所种植的细胞数×100%；
细胞存活率%=处理组细胞种植率%/对照细胞种植率%×100%。
所述步骤（1）中，萃取水样的装置包括原水容器、丙酮容器、氮气瓶、萃取柱、废液容器、富集液容器、第一阀门、第二阀门、第三阀门、第四阀门和三通阀，所述原水容器和第一阀门连通，氮气瓶分别连接第二阀门和第四阀门，丙酮容器和第三阀门连通，废液容器和富集液容器分别连通三通阀，萃取柱的入口分别连通第一阀门、第三阀门和第二阀门，萃取柱的出口连通三通阀。
所述萃取柱内的填料是质量比为1:1～1:3的亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮。
所述步骤（2）中，染毒处理的方法为：用4℃冰浴的无水乙醇对水样有机物溶解，无水乙醇和水样有机物所在原水的体积比为1:100000～1:125000，染毒处理4～24小时。无水乙醇相比于DMSO等其他有机溶剂成本更低，另外，4℃冰浴无水乙醇能够最大程度地减少溶解的水体有机污染物热失活或变性。
所述步骤a中，宽离子束辐照的能量为10～20keV，剂量为10～20kGy，辐射时间为5～20min。
所述步骤c中，固定液为甲醇:乙酸按体积比8:1～10:1混合而成。
所述步骤c中，每次染色前对亚甲基蓝染液超声处理30分钟，增加了染液的分散性，使得染色的效果更好，并避免染液中颗粒物造成的假阳性干扰。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明利用人鼠杂交瘤细胞模型和细胞克隆形成能力终点，真实客观地评价了水体有机污染的生物毒性；对不同类型的水体有机污染进行基于生物体的毒性评价，弥补了单纯依靠水体理化指标变化对水质污染进行检测和评估的不足；对毒物的种类不具有特异性，适用范围广；
本发明设计的萃取装置，能够实时在线萃取不同类型水体中的有机污染物，具有自动化程度高、快速准确、重现性好等优点；
培养皿经过宽离子束辐照改性后更加有利于细胞对培养皿的附着，有利于细胞的生长和存活，以及提高该评价方法的精准度；
亚甲基蓝染液相比于结晶紫染液和吉姆萨染液，其成本更低，对细胞的毒性更小，具有很好的经济和环境效益，因此选用该染液对细胞克隆进行染色。
每次染色前对亚甲基蓝染液超声处理30分钟能够增加染液的分散性，使得染色的效果更好，并避免染液中颗粒物造成的假阳性干扰。
附图说明
图1是本发明萃取水样的装置的结构示意图；
图2是丰水期五个选样点水样富集物对细胞存活率的影响；
图3是枯水期五个选样点水样富集物对细胞存活率的影响。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
检测贾鲁河丰水期水样富集物对细胞存活率的影响。
本实施例包括以下步骤：
（1）萃取水样中的有机物；
如图1所示，本实施例的萃取水样的装置包括原水容器1、丙酮容器2、氮气瓶3、萃取柱4、废液容器5、富集液容器6、第一阀门7、第二阀门8、第三阀门9、第四阀门10和三通阀11，所述原水容器1和第一阀门7连通，氮气瓶3分别连接第二阀门8和第四阀门10，丙酮容器2和第三阀门9连通，废液容器5和富集液容器6分别连通三通阀11，萃取柱4的入口分别连通第一阀门7、第三阀门9和第二阀门8，萃取柱4的出口连通三通阀11。三通阀11为L型。
由于酸性物质容易渗透到地下水中，因此为了富集酸性的遗传毒性物质，水样用盐酸调pH为3。本实施例的萃取柱4为HLB柱（固相萃取柱），萃取柱4内的填料是质量比为1:2的亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮，用来富集水样中的遗传毒性物质，一根HLB柱的上样量为2L，上样速度为8mL/min，富集完毕，采用氮气吹干的浓缩方法。
具体萃取方法如下：取2L的原水至装置的原水容器1中，打开第一阀门7和三通阀11，控制第一阀门7的大小，使其以8mL/min流过萃取柱4，废液流入废液容器5中；
打开第二阀门8，用普通氮气吹干富集了水样的萃取柱4；
将10ml丙酮注入丙酮容器2中，打开第三阀门9和三通阀11，让丙酮自然流过萃取柱4，洗脱下来的有机物进入了富集样品的富集液容器6中；
打开第四阀门10，用普通氮气对富集样品的富集液容器6中的有机物进行氮吹浓缩。
（2）对水样有机物中的AL细胞进行染毒处理，用4℃冰浴的20ul无水乙醇加入到2L水样中，溶解其中的水样有机物，处于对数生长期的AL细胞分别与1ml/ml,10ml/ml,50ml/ml（每毫升培养基中含有的水样富集物的量）的水样富集物共同孵育1，8，16天；
（3）克隆培养
a、将染毒处理后的细胞种植在经过宽离子束辐照改性10min后的培养皿中，宽离子束辐照的能量为15keV，剂量为15kGy；细胞与水样富集物孵育后，Hank’s缓冲液清洗3次，0.25%胰蛋白酶-EDTA酶解2分钟并吹打成单个细胞，悬浮于F12完全培养液中，利用细胞计数仪计数，稀释，重新种植300个细胞于经过宽离子束辐照改性后的培养皿中；
b、将培养皿在37℃，体积浓度为5%的CO2细胞培养箱中培养8天形成细胞克隆，出现肉眼可见克隆时，终止培养；
（4）毒性量化
c、对培养皿中的细胞克隆用PBS缓冲液清洗2次，使用固定液固定20分钟，固定液为甲醇:乙酸按体积比9:1混合而成，用移液器吸去固定液，然后使用亚甲基蓝染液对细胞克隆染色，染色12小时，流水洗除染液后，空气干燥，每次染色前对亚甲基蓝染液超声处理30分钟；
d、计数培养皿中细胞克隆的个数，肉眼直接记数克隆数（每个克隆包含细胞数应大于50），使用下面公式对水样的毒性进行评价：
细胞种植率%=培养皿中的细胞克隆数/所种植的细胞数×100%；
细胞存活率%=处理组细胞种植率%/对照细胞种植率%×100%。
图2显示了采集于2009年9月的五个水样作用AL细胞后，对AL细胞克隆形成能力的影响。图中SM-1是河水，SM-2是距河1公里的井水，SN-1、SN-2和SN-3分别是距河20公里的井水。从图中可以看出，在丰水期时，50ml/ml剂量组的SM-1和SM-2水样富集物处理AL细胞24小时后，细胞的存活率分别显著下降到10.67±0.74%（p<0.01，图2A）和20.55±6.09%（p<0.01，图2B），下降约90%和80%，处理8天后，细胞的存活率都为0；10ml/ml剂量组的SM-1和SM-2水样富集物处理AL细胞8天后，细胞的存活率分别显著下降到31.06±2.58%（p<0.01，图2A）和21.84±9.44%（p<0.01，图2B），下降约69%和79%，处理16天后，细胞的存活率都为0。而SN-1和SN-3水样富集物处理AL细胞16天后，对细胞的克隆存活均无明显影响（图2C和图2E）；10ml/ml剂量组的SN-2水样富集物处理AL细胞16天后，对细胞的克隆存活也无明显影响（图2D）。由此我们得出，SM-1和SM-2水样富集物的细胞毒性相当，它们较之SN-1、SN-2和SN-3水样富集物的细胞毒性更大。
实施例2
检测贾鲁河枯水期水样富集物对细胞存活率的影响。
方法和实施例1相同。为了比较丰水期和枯水期之间水样富集物的细胞毒性，对采集于2010年3月的五个水样同样进行细胞克隆形成能力研究。图3显示，在枯水期时，对于50ml/ml剂量组的水样富集物，SM-1水样富集物处理AL细胞24小时后，细胞的存活率为0（图3A）；SM-2水样富集物处理AL细胞24小时后，细胞的存活率显著下降到19.74±10.49%（p<0.01，图3B），下降约80%。然而，同样是50ml/ml剂量组的水样富集物，SN-2水样富集物处理AL细胞24小时后，对细胞的克隆存活无明显影响（图3D）；SN-1和SN-3水样富集物处理AL细胞24小时后，细胞的存活率也只是显著下降到35.67±15.76%（p<0.05，图3C）和27.63±10.22%（p<0.01，图3E），下降约65%和73%。由此可以得出结论，SM-1水样富集物的细胞毒性最高，其次是SM-2水样富集物，SN-1、SN-2和SN-3水样富集物的细胞毒性则比SM-1和SM-2水样富集物的细胞毒性小。
从实施例1和例2可以看出，水样富集物处理AL细胞24小时后，细胞的克隆形成能力就有显著性的降低，因此优选的细胞染毒时间范围为4小时～24小时。
Claims (4)
1.一种基于人鼠杂交瘤细胞的水体有机污染的毒性评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)萃取水样中的有机物；
(2)用水样有机物对人鼠杂交瘤细胞AL细胞进行染毒处理；
(3)克隆培养
a、将染毒处理后的人鼠杂交瘤细胞种植在经过宽离子束辐照改性后的培养皿中；
b、将培养皿在37℃，体积浓度为5％的CO2细胞培养箱中培养7～10天形成细胞克隆；
(4)毒性量化
c、对培养皿中的细胞克隆用PBS缓冲液清洗1～3次，使用固定液固定15～30分钟，用移液器吸去固定液，然后使用亚甲基蓝染液对细胞克隆染色，染色6～24小时，流水洗除染液后，空气干燥；
d、计数培养皿中细胞克隆的个数，使用下面公式对水样的毒性进行评价：
细胞种植率％＝培养皿中的细胞克隆数/所种植的细胞数×100％；
细胞存活率％＝处理组细胞种植率％/对照细胞种植率％×100％；
所述步骤(2)中，染毒处理的方法为：用4℃冰浴的无水乙醇对水样有机物溶解，无水乙醇和水样有机物所在原水的体积比为1:100000～1:125000，染毒处理4～24小时；
所述步骤a中，宽离子束辐照的能量为10～20keV，剂量为10～20kGy，辐射时间为5～20min；
所述步骤c中，固定液为甲醇:乙酸按体积比8:1～10:1混合而成。
2.根据权利要求1所述的一种基于人鼠杂交瘤细胞的水体有机污染的毒性评价方法，其特征在于，所述步骤(1)中，萃取水样的装置包括原水容器、丙酮容器、氮气瓶、萃取柱、废液容器、富集液容器、第一阀门、第二阀门、第三阀门、第四阀门和三通阀，所述原水容器和第一阀门连通，氮气瓶分别连接第二阀门和第四阀门，丙酮容器和第三阀门连通，废液容器和富集液容器分别连通三通阀，萃取柱的入口分别连通第一阀门、第三阀门和第二阀门，萃取柱的出口连通三通阀。
3.根据权利要求2所述的一种基于人鼠杂交瘤细胞的水体有机污染的毒性评价方法，其特征在于，所述萃取柱内的填料是质量比为1：1～1：3的亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮。
4.根据权利要求1所述的一种基于人鼠杂交瘤细胞的水体有机污染的毒性评价方法，其特征在于，所述步骤c中，每次染色前对亚甲基蓝染液超声处理30分钟。
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