CN103304630A - 东亚钳蝎蝎毒中的gpcr活性多肽及其提取分离和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布从东亚钳蝎蝎毒中分离的新结构多肽,并对其G-蛋白偶联受体(GPCR)活性进行测定。应用RPLC-HILIC二维液相色谱联用方法从该毒素中纯化分离出一个由8个氨基酸组成的多肽BmK-YA,质谱法测得该肽的序列为Tyr-Gly-Gly-Tyr-Met-Asn-Pro-Ala-amide,分子量为870.3088Da,并用钙离子测定法测定了该多肽的GPCR活性。根据其序列组成,对此活性多肽进行了结构改造,合成了另一活性多肽Phe4-BmK-YA,序列为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Asn-Pro-Ala-amide。
Description
技术领域
本发明涉及一种从东亚钳蝎蝎毒中分离得到的新的活性多肽及其分离纯化方法和应用。
背景技术
蝎子属节肢动物门,蛛形纲,蝎目,钳蝎科。蝎子的药用始载于《开宝本草》,《本草纲目,为中医珍贵药材,具有息风镇痉,攻毒散结,通络止痛的功效,可用于小儿惊风,抽搐痉挛,中风口歪,半身不遂,破伤风,风湿顽痹,偏正头痛,疮疡,瘰疬等疾病的治疗。
我国境内的主要的蝎种是东亚钳蝎,分布于长江以北至辽宁铁岭等地区。对东亚钳蝎蝎毒的研究表明,该毒液中含多种蝎毒素,包括昆虫类神经毒素,甲壳类神经毒素,哺乳动物神经毒素,抗癫痫活性的多肽,镇痛活性多肽等,能特异性作用于各种离子通道。因此,东亚钳蝎蝎毒中的这些大量的活性多肽,是新药发现的一个重要来源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从东亚钳蝎蝎毒中分离得到的活性多肽及其分离方法,以及该活性多肽具有μ-,δ-和κ-阿片受体活性。
本发明所提供的活性多肽序列是利用质谱方法测得其氨基酸序列的,序列为Tyr-Gly-Gly-Tyr-Met-Asn-Pro-Ala-amide,该多肽的C-端被酰胺化,分子量870.3088Da,命名为BmK-YA。以及在其基础上氨基酸改造的活性多肽Phe4-BmK-YA,序列为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Asn-Pro-Ala-amide。这两个多肽都为一级线性结构多肽。
本发明所提供的活性多肽BmK-YA的分离方法为:
a.将冻干的东亚钳蝎蝎毒用5%乙腈(含0.1%TFA)溶解,然后上样至C18固相萃取柱进行固相萃取,收集洗脱液并且冻干。
b.将上述冻干样品溶解于5%乙腈(含0.1%TFA),并用反相色谱C18(XTerra MS C18,长100mm,直径19mm,Waters公司产品)进行第一维粗分离,收集活性组分并冻干(参考图1)。
c.将冻干的活性组分样品溶解于50%乙腈,用亲水作用色谱柱ClickMaltose(长150mm,直径4.6mm.,大连思谱精工有限公司产品)进行分离得到活性多肽(参考图2)。
本发明所提供的多肽BmK-YA和Phe4-BmK-YA,在表达了阿片受体的稳定细胞株上进行检测发现具有阿片受体活性:BmK-YA对δ-阿片受体的活性为2.6μM,μ-阿片受体的活性为17μM,κ-阿片受体的活性为30μM.Phe4-BmK-YA对δ-阿片受体的活性为157nM,μ-阿片受体的活性为57nM,κ-阿片受体的活性为77nM.
附图说明
图1为第一维反相色谱分离的色谱图:带*号的峰为活性组分。
图2为第二维亲水色谱分离的色谱图:箭头标出的为活性多肽BmK-YA的色谱峰。
图3为活性多肽的二级MSMS谱图及氨基酸序列分析图。
图4为合成的BmK-YA对HEK293T内Ca2+浓度的剂量效应曲线。
图5为合成的Phe4-BmK-YA对HEK293T内Ca2+浓度的剂量效应曲线。
具体实施方式
本发明从东亚钳蝎蝎毒中分离的新结构多肽,并对其G-蛋白偶联受体(GPCR)活性进行测定。应用RPLC-HILIC二维液相色谱联用方法从该毒素中纯化分离出一个由8个氨基酸组成的多肽BmK-YA,质谱法测得该肽的序列为Tyr-Gly-Gly-Tyr-Met-Asn-Pro-Ala-amide,分子量为870.3088Da,并用钙离子测定法测定了该多肽的GPCR活性。根据其序列组成,对此活性多肽进行了结构改造,合成了另一活性多肽Phe4-BmK-YA,序列为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Asn-Pro-Ala-amide。本发明中的BmK-YA和Phe4-BmK-YA均具有μ-,δ-和κ-阿片受体活性,具有作为镇痛药的前景。
1.东亚钳蝎蝎毒活性多肽BmK-YA的纯化分离
a.首先用固相萃取的方法来对东亚钳蝎蝎毒样品前处理(该蝎毒产自河南洛阳),将规格为的C18固相萃取柱(填料量30g,柱管体积100mL,大连思谱精工有限公司产品)依次用100甲醇、水、甲醇淋洗,接着用100mL的5%乙腈(含0.1%TFA)平衡萃取柱,将1.5g东亚钳蝎蝎毒用5mL 5%乙腈(含0.1%TFA)溶解,然后上样至C18固相萃取柱,先用100mL 5%乙腈(含0.1%TFA)淋洗,然后用100mL 60%乙腈(含0.1%TFA)洗脱,收集此洗脱液并且冻干。
b.将上述冻干样品溶解于1mL 5%乙腈(含0.1%TFA),并用反相色谱C18(XTerra MS C18,长100mm,直径19mm,Waters公司产品)进行第一维色谱粗分离。
先用5%乙腈(含0.05%TFA)平衡柱子15min,然后50min进行5%乙腈(含0.05%TFA)-35%乙腈(含0.05%TFA)梯度洗脱,流速为17mL/min,一分钟收集一个馏分,共收集50个馏分,冻干,通过活性测定确定17号馏分为活性馏分(参考图1,活性测定过程参考具体实施方式的第4部分)。
c.将上述冻干的活性馏分样品溶解于100uL 50%乙腈,用亲水作用色谱柱Click Maltose(长150mm,直径4.6mm.,大连思谱公司产品)进行活性多肽的分离。
100mM,pH 2.3的磷酸三乙胺缓冲盐的配制:取3.4mL磷酸慢慢加入到500mL纯水中,然后滴加4.8mL三乙胺使得pH为2.3。流动相为纯水(A),乙腈(B),100mM磷酸三乙胺缓冲盐(C),其中流动相C的体积浓度一直维持5%不变,A+B+C的体积浓度之和为100%,0-60min,流动相A的体积浓度从10%升至50%,流动相B的体积浓度从85%降到45%,流速为1mL/min,手动收集所有色谱峰,冻干,通过活性测定确定活性多肽的色谱峰(参考图2所标示色谱峰,活性测定过程参考具体实施方式的第4部分)。
图1为第一维反相色谱分离的色谱图:带*号的峰为活性组分。
图2为第二维亲水色谱分离的色谱图:箭头标出的为活性多肽BmK-YA的色谱峰。
2.蝎毒活性多肽BmK-YA的序列测定
本发明所提供的蝎毒活性多肽序列是用质谱方法测得的。用质谱鉴定多肽序列所用的仪器是NanoLC-Q-TOF(Waters公司,美国),离子源温度为80℃,喷雾电压为2.0kV,采用正离子扫描模式,对于一级离子分子量扫描范围是m/z 500-1500Da,二级碎片离子分子量扫描范围是m/z 50-1000Da,二级的碰撞能为27eV。将二级谱图用PepSeq软件(Waters公司,美国)进行谱图分析,测定出BmK-YA多肽的氨基酸序列,测出的序列为:YGGYMNPA-NH2。
序列号:1(SEQ ID NO:1)
序列长度:8AA
序列类型:氨基酸
来源:东亚钳蝎(Buthus martesii Karsch)
序列特征:C端酰胺化(AMIDATION,通常位于成熟的活性肽的C末端)
图3为活性多肽的二级谱图及氨基酸序列分析图。
3.BmK-YA和Phe4-BmK-YA的合成
BmK-YA和Phe4-BmK-YA采用化学合成法由上海强耀生物技术有限公司合成并纯化,序列分别为YGGYMNPA-NH2和YGGFMNPA-NH2,活性测定过程中的剂量效应曲线所用的样品是合成的BmK-YA和Phe4-BmK-YA。
4.BmK-YA和Phe4-BmK-YA的GPCR活性的测定
a.稳定细胞系的创建
人胚肾293T细胞(HEK293T)用质量浓度10%胎牛血清(FBS)在DMEM培养基中置于37℃,含体积浓度5%CO2(其余为空气)的细胞培养箱中培养24小时。用转染试剂lipofectamine(invitrogen,USA)根据厂家提供的的转染方法将Gqi3与μ-阿片受体DNA质粒共转染到HEK293T细胞中,同样方法将Gqi3与δ-阿片受体DNA质粒共转染到HEK293T细胞中,将Gqi3与κ-阿片受体DNA质粒共转染到HEK293T细胞中,如此得到三种细胞株,然后在这三种细胞株中均加入200μg/mL G418、200μg/mL hygromycin和200μg/mL zeocin进行抗性选择从而进行单克隆稳定细胞株的筛选。最后将各阿片受体对应的激动剂(Endomorphin-1(μ),deltorphin(δ),dynorphin a(κ))100ul加入到已表达对应阿片受体的细胞株中,通过仪器FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader;Molecular DevicesCorp)进行筛选鉴定(监测细胞内的Ca2+浓度变化)。
b.用FLIPR对Ca2+浓度的监测
以每孔80000个单克隆稳定细胞株接种于用poly-D-lysine涂层的96孔细胞培养板中,24小时后除去培养基(DMEM含10% FBS),并于每孔中加入100μl荧光染料溶液(2μM Fluo-4 AM先溶解于pluronic acid,然后溶解于由Hank’s buffer与20mM HEPES组成的缓冲液中,pH 7.4)在37℃下恒温1小时,然后将细胞用100ul缓冲液洗3次。
将合成的BmK-YA和Phe4-BmK-YA多肽样品用DMSO溶解后分别用缓冲液稀释至8个不同浓度(20uM,6uM,2uM,0.6uM,0.2uM,0.06uM,0.02uM,0.006uM),采用仪器FLIPR进行自动加样100ul不同浓度的多肽样品于上面已经处理好的96孔细胞培养板中孵育3分钟后,在520nm和488nm波长下进行荧光检测从而对细胞内的Ca2+浓度进行监测[可参考文献[1]Saito,Y.;Nothacker,H.P.;Wang,Z.W.;Lin,S.H.S.;Leslie,F.;Civelli,O.,Molecularcharacterization of the melanin-concentrating-hormonereceptor.Nature 1999,400(6741),265-269.文献[2]Wang,Z.W.;Takahashi,T.;Saito,Y.;Nagasaki,H.;Ly,N.K.;Nothacker,H.P.;Reinscheid,R.K.;Yang,J.;Chang,J.K.;Shichiri,M.;Civelli,O.,Salusin beta is a surrogate ligand of the mas-likeG protein-coupled receptor MrgA1.Eur.J.Pharmacol.2006,539(3),145-150.]。
图4为合成的BmK-YA对HEK293T内Ca2+浓度的剂量效应曲线,从图中可以看出BmK-YA对δ、μ和κ-阿片受体具有一定的激活作用,其中对δ-阿片受体的活性最高,为2.6μM。
图5为合成的Phe4-BmK-YA对HEK293T内Ca2+浓度的剂量效应曲线,从图中可以看出Phe4-BmK-YA对δ、μ和κ-阿片受体活性分别为157nM,57nM,77nM。
Claims (5)
1.一种东亚钳蝎蝎毒中的GPCR活性多肽,其特征在于:
为下述活性多肽之一,
BmK-YA该多肽由Tyr-Gly-Gly-Tyr-Met-Asn-Pro-Ala-amide组成的八肽;
或,基于BmK-YA的序列改造的GPCR活性多肽Phe4-BmK-YA,该多肽的序列为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Asn-Pro-Ala-amide。
2.根据权利要求1所述的多肽,其特征在于:该多肽的C-端被酰胺化,多肽BmK-YA分子量870.3088Da。
3.一种权利要求1所述多肽的提取分离方法,其特征在于:该多肽是从东亚钳蝎蝎毒中分离得到的,具体过程为,
a.将东亚钳蝎蝎毒上样至C18固相萃取柱进行固相萃取,先用含体积浓度0.1%TFA的体积浓度5-10%乙腈淋洗,然后用含体积浓度0.1%TFA的体积浓度20-60%乙腈洗脱,将洗脱液冻干;
b.将上述冻干样品采用反相色谱进行第一维分离,
采用含体积浓度0.05%TFA的乙腈水溶液线性梯度洗脱,0-50min:线性洗脱过程洗脱液中乙腈的体积浓度由2-10%乙腈升至20-40%乙腈,收集馏分,当洗脱剂乙腈的体积浓度为14%-16%时收集到的馏分为活性馏分;
c.将上述活性馏分进一步用亲水色谱进行第二维分离,流动相为:纯水(A),乙腈(B),100mM磷酸三乙胺缓冲盐(C),线性梯度洗脱过程洗脱液中流动相C的体积浓度一直维持2-20%不变;0-60min:线性梯度洗脱过程洗脱液中流动相A的体积浓度由5-10%变化为30-40%,流动相B的体积浓度由93-70%变化为68-40%,且线性梯度洗脱过程洗脱液中流动相A+B+C的体积浓度等于100%,当洗脱液中的水含量为22%-24%的时候收集得活性多肽。
4.一种权利要求1所述多肽作为活性组份在制备镇痛药中的应用。
5.根据权利要求4所述多肽的应用,其特征在于:该多肽能够作用于μ-,δ-和κ-阿片受体,其中对δ-阿片受体的活性最高,临床上可作为镇痛药应用。
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