CN103301444B - 重组人胸腺素alpha原蛋白的新用途 - Google Patents

Abstract

重组人胸腺素alpha原蛋白的新用途，涉及重组人胸腺素alpha原蛋白。提供重组人胸腺素alpha原蛋白在制备抗疲劳药物中的应用。所述重组人胸腺素alpha原蛋白（简称为胸腺素α原)为重组人胸腺素α原和由组织分离纯化的胸腺素α原。所述胸腺素α原在各种抗疲劳中作用是通过增加肝脏和肌肉的糖原储存量，降低血清尿素氮水平来提高抗疲劳能力的。

Description

重组人胸腺素alpha原蛋白的新用途

技术领域

本发明涉及重组人胸腺素alpha原蛋白，尤其是涉及重组人胸腺素alpha原蛋白的新用途。

背景技术

胸腺素原α(prothymosinα)是一个小的酸性蛋白，相对分子质量12，000，最初由大鼠的胸腺分离得到。虽然胸腺素是由胸腺分泌的，但是在体内许多组织都有胸腺素原α的表达，而且是不含内含子的一种保守的DNA序列。人胸腺素alpha原由109个氨基酸残基组成，它对提高机体免疫力、抗机会感染以及促进淋巴细胞的成熟与分化，对IL-2和IL-2R的表达有一定的促进作用，甚至于发现它对肿瘤也有一定治疗作用。

近年来，糖尿病的病因和发病机理研究表明，氧化应激与糖尿病的发生和发展密切相关（1、曹文彬等，抗氧化微量营养素防治糖尿病的研究进展，长春中医药大学学报，2006，22(2)：73-74），为了防止糖尿病的发生发展，人们对一些具有防治糖尿病作用的天然抗氧化物进行了系统的研究，发现它们通过表达不同的机制与作用环节打断氧化侵袭引致胰岛β细胞损害的恶性循环，从而为天然抗氧化治疗糖尿病提供了一个新的策略。

Nrf2(NF-E2-related factor2)是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，生理状态下它与胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch-like ECH—associated protein1)结合使活性处于相对抑制状态。在氧化应激源作用下，Nrf2与Keap1解偶连后与抗氧化反应元件ARE(antioxidantresponse element)上GCTGAGTCA位点结合，启动ARE调控的第II相解毒酶及抗氧化酶基因表达，增加细胞对氧化应激的抗性。Nrf2-Keap1系统在细胞抵御外源性或内源性氧化应激的机制中有重要地位（2、Dinkova Kostova AT，Holtzclaw WD，Cole RN，et al.Direct evidencethat sulfhydryl groups of Keap1are the sensors regulating induction of phase2enzymes that protectagainst carcinogens and oxidants.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(18):11908–11913；3、Zhang DD，Hannink M，Distinct cysteine residues in Keap1are required for Keap1-dependentubiquitination of Nrf2and for stabilization of nrf2by chemopreventive agents and oxidativestress[J].Mol Cell Biol，2003，23(22):8137–5151；4、GEOFFREY F.KELSO，CAROLYNM.PORTEOUS，GILLIAN HUGHES，ELIZABETH C.LEDGERWOOD，ALISON M.GANE，ROBIN A.J.SMITH AND MICHAEL P.MURPHY.Prevention of MitochondrialOxidative Damage Using Targeted Antioxidants.Annals of the New York Academy of Sciences.2002，959:263-274）。

Nrf2缺失和激活障碍与包括化合物致癌、药物性肝损伤、炎症修复延迟、细胞凋亡等病变过程相关。目前认同的Nrf2激活机制包括Nrf2与Keap1的解偶连、蛋白酶对Nrf2的降解减弱、Nrf2磷酸化等。随着对Nrf2-Keap1在细胞应激保护、损伤修复等诸多方面作用认识的深入及作用机制的了解，Nrf2-Keap1将为抗肿瘤、抗炎症治疗提供新的思路（5、Rolo AP，Palmeira CM.Diabetes and mitochondrial function:role of hy-perglycemia and oxidativestress[J].Toxicol Appl Pharmacol，2006，212(2):167-178；6、Olga V.Markova，AlexandraG.Evstafieva，Svetlana E.Mansurova，Sergey S.Moussine，Larisa A.Palamarchuk，MikhailO.Pereverzev，Andrey B.Vartapetian and Vladimir P.Skulachev，Prothyomosin alpha interactionwith KEAP1doesn't lead to prothymosin alpha ubiquination and degradation，Mol Biol(Mosk).2007，41(5):868-75）。最新研究表明（7、Ruben N.Karapetian，1Alexandra G.Evstafieva，1Irina S.Abaeva，1Nina V.Chichkova，Grigoriy S.Filonov，Yuri P.Rubtsov，1Elena A.Sukhacheva，Sergey V.Melnikov，Ulrich Schneider，Erich E.Wanker，and Andrey B.Vartapetian，Nuclear Oncoprotein Prothymosin Is a Partner of Keap1:Implications forExpression of Oxidative Stress-Protecting Genes，MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，Feb.2005，1089–1099）胸腺素alpha原能够与Nrf2-Keap1复合物中的Keap1相结合，使Nrf2从由Keap1抑制状态脱离出来，Nrf2与Keap1的解偶连。脱离了束缚的Nrf2在细胞核内，与Maf蛋白结合成异二聚体后识别并与ARE结合，启动第II相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因的转录，提高细胞抗氧化应激能力。研究结果发现，胸腺素alpha原与Nrf2-Keap1复合物中的Keap1结合是特异性的，突变的胸腺素alpha原（M胸腺素alpha原）无法行使该功能。广泛存在的胸腺素alpha原为细胞内恒定的抗氧化基因的基本水平的表达，以达到防止细胞被氧化损伤的目的发挥了重要作用。以上研究结果揭示了胸腺素alpha原的另一个功能，即有利于氧化应激保护基因的表达。

近来研究发现，胸腺素alpha原能够保护神经细胞在缺氧状态下引起的损失和细胞凋亡，证明胸腺素alpha原能够有效保护逆境中细胞受损（HiroshiUeda。Review.Prothymosinplaysakeyroleincelldeathmode-switch，Anewconceptforneuroprotectivemechanismsinstroke。Naunyn-Schmiedeberg!sArchPharmacol(2008)377:315-323）。

但是目前还未见有关于胸腺素alpha原能够有效提高机体抗疲劳能力的报道和专利。

本申请人在中国专利200810072084.4中公开一种重组蛋白在制备预防糖尿病口服药物中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供重组人胸腺素alpha原蛋白在制备抗疲劳药物中的应用。

所述重组人胸腺素alpha原蛋白（简称为胸腺素α原)为重组人胸腺素α原和由组织分离纯化的胸腺素α原。

所述胸腺素α原在各种抗疲劳中作用是通过增加肝脏和肌肉的糖原储存量，降低血清尿素氮水平来提高抗疲劳能力的。

实验证明，胸腺素alpha原能够显著改善动物抗疲劳能力，并且通过对肝糖原，肌糖原以及血清尿素氮水平的检测证明，胸腺素alpha原能够增加肝糖原和肌糖原的储存量，显著降低血清尿素氮的水平。

本发明涉及的胸腺素alpha原来源可以是动物来源，也可以是人来源，可以是基因工程表达，也可以是合成或动物组织中提取。

附图说明

图1为胸腺素alpha原和GST-胸腺素alpha原对小鼠游泳时间的影响。横坐标代表组别，A:GST-胸腺素alpha原1μg/d剂量；B：胸腺素alpha原1μg/d剂量；C：GST-胸腺素alpha原10/μg/d剂量；D：胸腺素alpha原10μg/d剂量；E：空白对照组，纵坐标代表游泳时间（min）。

图2为胸腺素alpha原和GST-胸腺素alpha原对小鼠肝糖原水平的影响。横坐标代表组别，A:GST-胸腺素alpha原1μg/d剂量；B：胸腺素alpha原1μg/d剂量；C：GST-胸腺素alpha原10μg/d剂量；D：胸腺素alpha原10μg/d剂量；E：空白对照组，纵坐标代表肝糖原水平/mg/g。

图3为胸腺素alpha原和GST-胸腺素alpha原对小鼠肌糖原水平的影响。横坐标代表组别，A:胸腺素alpha原1μg/d剂量；B：空白对照组。纵坐标代表肌糖原水平/mg/g。

图4为胸腺素alpha原和GST-胸腺素alpha原对小鼠血清尿素氮水平的影响。横坐标代表组别，A:GST-胸腺素alpha原1μg/d剂量；B：胸腺素alpha原1μg/d剂量；C：GST-胸腺素alpha原10μg/d剂量；D：胸腺素alpha原10μg/d剂量；E：空白对照组，纵坐标代表血清尿素氮水平mmol/L。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明所述的的重组蛋白单体和融合蛋白参见本申请人的中国专利200810072084.4（一种重组蛋白在制备预防糖尿病口服药物中的应用）和中国专利200710009083.0（一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法及其应用）。

胸腺素alpha原单体和GST-胸腺素alpha原融合蛋白抗疲劳试验。具体步骤如下：

①选择4～5周龄昆明鼠，分为5组，A，B，C，D，E组，E组空白对照组，注射相同体积PBS，A，B，组分别注射1μg/d剂量的胸腺素alpha原单体和GST-胸腺素alpha原融合蛋白，C，D组分别注射10μg/d剂量的胸腺素alpha原单体和GST-胸腺素alpha原融合蛋白，胸腺素alpha原和GST-胸腺素alpha原抗疲劳试验小鼠分组设计表见表1，连续2周。

表1

②2周后，将实验小鼠放入35～37℃水浴锅内，同时在小鼠尾根部系上占小鼠体重5%的铅块。以小鼠身体整个淹没水中8s仍没有抬头为截止时间。计算小鼠游泳时间。结果见图1。图中看出，胸腺素alpha原单体和GST-胸腺素alpha原融合蛋白实验组小鼠的游泳时间明显比空白对照组长。差异极显著（P<0.01），并且发现有量效关系，及浓度高的，游泳时间相应延长。说明胸腺素alpha原单体和GST-胸腺素alpha原融合蛋白能够有效增加小鼠游泳时间。

③实验结束取小鼠血清，肝脏和后腿肌肉。分别用试剂盒测量小鼠血清尿素氮，肝糖原和肌糖原水平，所有数据进行Graph软件进行统计分析。*为显著差异（P<0.05），**为极显著差异（P<0.01）。结果见图2～4。从肝糖原和肌糖原比空白对照组明显增加，差异极显著（P<0.01），见图2和3。说明实验组能够储存更多的糖原用于抗疲劳能量供应。而实验组的血清尿素氮水平则比空白组明显减少，差异极显著（P<0.01），见图4。说明实验组能够在游泳中更快地排除体内的尿素氮，减少对身体的危害，更有利于抗疲劳。

抗疲劳实验结果表明，胸腺素alpha原单体和GST-胸腺素alpha原融合蛋白能够显著延长小鼠的负重游泳时间，减少或抑制疲劳小鼠血清尿素氮产生，促进肝糖原和肌糖原储备的作用。

按照功能学评价检验方法，实验小鼠负重游泳实验结果阳性，血清尿素氮，肝糖原和肌糖原生化指标中有两项指标阳性，可以判断该产品具有缓解体力疲劳功能的作用。根据本实验结果证明，胸腺素alpha原单体和GST-胸腺素alpha原融合蛋白具有缓解体力疲劳功能的作用。

Claims (1)

1.重组人胸腺素alpha原蛋白在制备抗疲劳药物中的应用。