CN103298485B - 丝虫病的多价疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于免疫动物以抵抗丝虫病的多价疫苗。在某些实施方式中，所述多价疫苗的抗原是基于蛋白质的抗原、基于DNA的抗原或其组合。

Description

丝虫病的多价疫苗

简介

本专利申请要求2010年11月15日提交的美国临时申请系列号61/413,681、2011年3月7日提交的美国临时申请系列号61/449,954和2011年8月10日提交的美国临时申请系列号61/522,079的优先权权益，每个上述临时申请的内容在此以其全文引为参考。

本发明在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予的合同号为5R01AI064745-04的政府支持下做出。美国政府在本发明中享有一定权利。

背景技术

由丝状线虫班氏吴策线虫（Wuchereria Bancrofti）、马来丝虫（Brugia malayi）和帝汶布鲁丝虫（Brugia timori）引起的淋巴丝虫病，在全世界感染超过一亿二千万人（WHO（1992）World Health Organ.Tech.Rep.Ser.821:1-71）。世界卫生组织（World Health Organization）的大规模药物给药计划（Mass drug administration program）在世界上许多地区显著降低了淋巴丝虫病的发病率（Hotez（2009）Clin.Pharmacol.Ther.85（6）:659-64）。然而，从数个流行病地区报告了大规模药物给药缺乏效用，这主要由不遵医嘱造成（Babu&（2008）Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.102（12）:1207-13；El-Setouhy等，（2007）Am.J.Trop.Med.Hyg.77（6）:1069-73）。此外，已报道了针对大规模药物组合中的至少一种药物的耐药性（Horton（2009）Ann.Trop.Med.Parasitol.103（1）:S33-40；Schwab等，（2007）Parasitology134（Pt7）:1025-40）。由于为了有效控制需要每年施用大规模药物，因此对于选择出耐药性寄生虫存在着令人惊恐的担忧。因此，对于多管齐下地控制这种蚊虫传播的传染病的方法，存在着迫切需求。

疫苗接种是用于控制这种传染病的一种策略，并且数种候选亚基疫苗抗原已在实验室动物中得到测试，获得了不同的结果（Bottazzi等，（2006）Expert Rev.Vaccines5（2）:189-98；Chenthamarakshan等，（1995）Parasite Immunol.17（6）:277-85；Dissanayake等，（1995）Am.J.Trop.Med.Hyg.53（3）:289-94；Li等，（1993）J.Immunol.150（5）:1881-5；Maizels等，（2001）Int.J.Parasitol.31（9）:889-98；Thirugnanam等，（2007）Exp.Parasitol.116（4）:483-91；Veerapathran等，（2009）PLoS Negl.Trop.Dis.3（6）:e457）。淋巴丝虫是多细胞生物体，其具有复杂的生命周期并产生大量宿主调节分子。因此，使用单一抗原疫苗对抗这种传染病可能是困难的。通过用来自于有免疫性个体的血清筛选马来丝虫（B.malayi）寄生虫的噬菌体展示cDNA表达文库，鉴定到数种潜在的疫苗候选物（Gnanasekar等，（2004）Infect.Immun.72（8）:4707-15）。然而，当每种候选疫苗抗原作为DNA、蛋白质或引发-加强疫苗（prime boost vaccine）提供时，获得了不同程度的保护（Veerapathran等，（2009）同上）。

发明内容

本发明的特征在于由两种以上来自于一种或多种丝状线虫的分离的抗原构成的多价疫苗。在某些实施方式中，所述丝状线虫选自马来丝虫（Brugia malayi）、班氏吴策线虫（Wuchereria Bancroft）、帝汶布鲁丝虫（Brugia timori）、旋盘尾丝虫（Onchocerca volvulus）和罗阿丝虫（Loa loa）。在一种实施方式中，所述抗原是基于蛋白质的抗原、基于DNA的抗原或其组合。在另一种实施方式中，所述抗原被共价连接。在其他实施方式中，所述抗原包括幼虫高丰度转录本（AbundantLarval Transcript）（ALT-2）、四旋蛋白（Tetraspanin）、小热休克蛋白（HSP）12.6、胡蜂毒素过敏原类似物样蛋白（VAL-1），或其类似物或片段，包括例如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。还提供了包含一种或多种丝状线虫的一种或多种抗原的重组载体和表达载体，以及含有它们的重组宿主细胞。

本发明还涉及通过向需要的动物施用本发明的多价疫苗来免疫动物以抵抗丝虫病的方法。

附图说明

图1示出了疫苗接种的小鼠血清中抗BmHSP和抗BmALT-2IgG抗体的滴度。使用引发-加强方法，用单价疫苗（Bmhsp引发和rBmHSP加强或Bmalt-2引发和rBmALT-2加强）和多价疫苗（Bmhsp/Bmalt-2引发以及rBmHSP和rBmALT-2加强）免疫6周龄balb/c小鼠。使用间接ELISA测量血清中IgG抗体的滴度。显示的数据是最后一次加强后2周的抗体滴度。结果显示，二价和多价疫苗两者都诱导针对每种组分抗原的显著的IgG抗体。该发现还显示，单价和多价制剂中的抗原在加强免疫应答中发挥协同作用。N=5。统计学显著的**p<0.001，*p<0.05。值表示平均值±SD。

图2示出了用单价（BmHSP或BmALT-2）或多价疫苗接种的小鼠的脾脏中IL-4（图2A）和IFN-γ（图2B）分泌细胞的数量。在用rBmHSP或rBmALT（1μg/ml）刺激细胞后进行ELISPOT测定。将脾细胞的单细胞制备物用相应的抗原刺激48小时，并计数斑点形成细胞。结果显示，单价和多价疫苗两者都促进IL-4分泌细胞。与对照相比，多价疫苗接种诱导更高数量的IL-4产生细胞。IFN-γ产生细胞相对低。这些发现还证实，在多价疫苗接种后，BmHSP和BmALT-2在疫苗接种的动物中协同性加强免疫应答。N=5。结果被表示成每3x106个细胞的斑点形成单位的平均数量±SD。

图3示出了在小鼠模型中由多价疫苗所提供的保护程度。使用引发-加强方法，用HAT（HSP/ALT-2/TSP）杂合DNA、重组HAT蛋白或二者的组合免疫Balb/c品系的小鼠。使用HAT杂合DNA进行引发。在引发后2周，用HAT杂合蛋白对小鼠进行加强。将另一组小鼠用HAT杂合DNA或HAT杂合蛋白进行免疫。对照组小鼠仅接受空白载体或明矾佐剂。在最后一次免疫后2周，通过将20个马来丝虫（Brugiamalayi）的感染性幼虫置于免疫后小鼠腹膜腔中的微孔室中，用它们对小鼠进行激惹。48小时后，测量幼虫的死亡以确定疫苗接种的成功。

图4示出了用来自于cHAT疫苗接种的小鼠的血清探测到的重组BmTSP（第1道）和分离的重组旋盘尾丝虫（O.volvulus）TSP的两个不同级分（第2和3道）的蛋白质印迹。

具体实施方式

现在已开发了丝虫病的多价疫苗。将抗原例如幼虫高丰度转录本（ALT-2）、四旋蛋白（TSP）、小热休克蛋白（HSP）12.6、胡蜂毒素过敏原类似物样蛋白（VAL-1）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）的组合制备在一个杂合DNA抗原或一个融合蛋白抗原中。当在实验动物（即小鼠、沙鼠、乳鼠）中测试时，杂合DNA加上杂合蛋白的疫苗接种的组合提供了100%的保护。单独的杂合蛋白疫苗提供>80%的保护。因此，本发明的特征在于由丝状线虫抗原或其编码核酸构成的基于蛋白质和基于DNA的多价疫苗，以及所述疫苗在人类和动物中预防或控制丝虫病的用途。

出于本发明的目的，多价疫苗是指从数种抗原制备的疫苗。根据某些实施方式，抗原是核酸分子，在本文中将其称为“基于DNA的”抗原。根据其他实施方式，抗原是蛋白质或多肽，在本文中将其称为“基于蛋白质的”抗原。本发明的多价疫苗可以由2、3、4、5、6或多达10种抗原或其片段以各种不同的排列组合构成。在特定实施方式中，多价疫苗由2、3或4种抗原构成。在某些实施方式中，多价疫苗仅由蛋白质抗原构成。在其他实施方式中，多价疫苗仅由基于DNA的抗原构成。在另外的其他实施方式中，多价疫苗由基于蛋白质的抗原和基于DNA的抗原的混合物构成。

本发明的抗原可以由在抗原之间含有例如内部核糖体进入位点的单一核酸分子提供或表达。此外，本发明的多价疫苗的抗原可以被共价连接以形成杂合或嵌合分子，其中抗原彼此直接相邻（例如使用或不使用短间隔物在框架内融合）。或者，本发明的抗原可以被提供成单个抗原的混合物。此外，设想了本发明的疫苗可以由含有例如两种抗原的杂合分子与第三种非共价连接的抗原的混合物构成。作为说明，本发明的多价疫苗可以由嵌合TSP-HSP蛋白与编码ALT-2的核酸分子的混合物构成。

在一种实施方式中，多价疫苗的抗原是来自于一个丝状线虫物种的不同蛋白质。作为这种实施方式的实例，多价疫苗由从一株或多株马来丝虫（B.malayi）分离的ALT-2、TSP和HSP抗原构成。在另一种实施方式中，抗原是相同的，但来自于不同的丝状线虫物种。作为这种实施方式的实例，多价疫苗由从班氏吴策线虫（W.bancrofti）、马来丝虫（B.malayi）、帝汶布鲁丝虫（B.timori）、旋盘尾丝虫（O.volvulus）和罗阿丝虫（L.loa）分离的ALT-2抗原构成。在另一种实施方式中，多价疫苗由来自于不同丝状线虫物种的不同抗原的组合构成。作为说明，多价疫苗可以由从班氏吴策线虫（W.bancrofti）、旋盘尾丝虫（O.volvulus）和罗阿丝虫（L.loa）分离的ALT-2抗原以及从马来丝虫（B.malayi）和帝汶布鲁丝虫（B.timori）分离的HSP抗原构成。

为了制备多价DNA疫苗或多价重组DNA疫苗，目标基因（也可以与DNA分子互换使用）的DNA序列不必含有编码相应蛋白质的全长DNA。类似地，当制备基于蛋白质的多价疫苗或多价重组蛋白质疫苗时，蛋白质序列不必含有全长蛋白质。在大多数情况下，蛋白质或编码表位区的基因的片段足以用于免疫。表位区的DNA/蛋白质序列可以通过对来自于各种株系或物种的基因的相应部分进行测序并对它们进行比较来发现。主要抗原决定簇可能是显示出最大异源性的区域。此外，这些区域可能可接近地位于蛋白质的构象结构中。一种或多种这样的蛋白质或编码抗原决定簇的基因的片段可以通过化学合成或通过重组DNA技术来制备。如果需要，这些蛋白质或基因片段可以连接在一起或分别与其他蛋白质或DNA分子连接。

正如在本文中所描述的，ALT-2、TSP、VAL-1和HSP抗原被鉴定为提供针对丝虫幼虫感染的保护。因此，在特定实施方式中，本发明的多价疫苗包括ALT-2、TSP、VAL-1和/或HSP蛋白质抗原，和/或编码ALT-2、TSP、VAL-1和/或HSP蛋白质的核酸分子，或其片段。在本技术领域中，这些抗原的蛋白质和核酸序列可以在表1中列出的GENBANK登记号下获得。

表1

此外，编码旋盘尾丝虫（O.volvulus）TSP的核苷酸序列可以在GENBANK登记号JN861043下找到。本发明的蛋白质抗原和核酸分子可以作为全长分子或小于全长的分子使用。就此而言，本发明还包括使用上述蛋白质抗原和核酸分子的片段。在本文中，片段被定义为全长蛋白质抗原（例如表1中列出的那些）的20、30、40、50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸残基的部分，或全长核酸分子（例如表1中列出的那些）的60、90、120、150、180、210、240、270、300、350或600个核苷酸的部分。示例性的蛋白质片段包括TSP的细胞外环（ECL）结构域（参见例如SEQ ID NO：63的班氏吴策线虫（W.bancrofi）TSP的ECL结构域）和HSP12.6的N-端缺失（cHSP；参见例如SEQ ID NO：64的班氏吴策线虫（W.bancrofi）HSP片段），以及编码它们的核酸分子（分别参见SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66）。

对于本发明的某些实施方式来说，本发明的多价疫苗包括来自于班氏吴策线虫（W.bancrofti）、马来丝虫（B.malayi）、旋盘尾丝虫（O.volvulus）、罗阿丝虫（L.loa）和帝汶布鲁丝虫（B.timori）的其他已知抗原。其他适合的抗原的实例包括但不限于谷胱甘肽过氧化物酶（参见Cookson等，（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5837-5841；Maizels等，（1983）Parasitology87:249-263；Maizels等，（1983）Clin.Exp.Immunol.51:269-277）、重组抗原（BmR1；参见Noordin等，（2004）Filaria J.3:10）、II类氨酰-tRNA合成酶（参见Kron等，（1995）FEBS Lett.374:122-4）、热休克同源70（hsc70）蛋白（参见Selkirk等，（1989）J.Immunol.143:299-308）和副肌球蛋白（参见Li等，（1991）Mol.Biochem.Parasitol.49:315-23）。在某些实施方式中，抗原从选自班氏吴策线虫（W.bancrofti）、马来丝虫（B.malayi）、旋盘尾丝虫（O.volvulus）、罗阿丝虫（L.loa）和帝汶布鲁丝虫（B.timori）的丝状线虫获得。

根据本发明，多价疫苗的抗原从丝状线虫分离。就此而言，分离的核酸分子或蛋白质是已从其天然环境中移出（即已经历过人类操作）的核酸分子或蛋白质。因此，“分离的”并不反映出核酸分子或蛋白质被纯化的程度。在特定实施方式中，将抗原纯化（例如纯化至高于95%的均匀性）。本发明的分离的并任选纯化的核酸分子或蛋白质可以从其天然来源获得，或者使用重组DNA技术（例如聚合酶链反应（PCR）扩增或克隆）或化学合成来生产。分离的核酸分子和蛋白质也可以包括例如在宿主中诱导免疫应答的天然等位基因变体或异构体。

本发明的一种实施方式包括重组载体，所述载体包含至少一种本发明的分离的核酸分子，所述核酸分子被插入在能够将核酸分子递送到宿主细胞中的载体中。这样的载体含有异源核酸序列，所述异源核酸序列是不与本发明的核酸分子天然相邻存在并优选源自于所述核酸分子所源自的物种之外的物种的核酸序列。载体可以是原核载体或真核载体，并且通常是病毒或质粒。重组载体可用于本发明核酸分子的克隆、测序和/或其他操作中。

本发明还包括表达载体，其包含重组载体中的本发明的核酸分子，所述表达载体在被转化到宿主细胞中时能够表达核酸分子。优选地，表达载体也能在宿主细胞中复制。表达载体可以是原核表达载体或真核表达载体，并且通常是病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明的重组细胞中起作用（即指导基因表达）的任何载体，所述重组细胞包括细菌、真菌、寄生虫、昆虫、其他动物和植物细胞。本发明的优选表达载体可以在细菌、酵母、蠕虫或其他寄生虫、昆虫和哺乳动物细胞中指导基因表达。

具体来说，本发明的表达载体含有调控序列例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点以及与重组细胞相容并控制本发明的核酸分子表达的其他调控序列。具体来说，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的序列，例如启动子、增强子、操纵基因和抑制子序列。适合的转录控制序列包括能够在本发明的至少一种重组细胞中起作用的任何转录控制序列。各种这样的转录控制序列对于本领域技术人员来说是已知的。优选的转录控制序列包括在细菌、酵母、蠕虫或其他体内寄生虫或昆虫和哺乳动物细胞中起作用的转录控制序列，例如但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、λ噬菌体（例如λp_L和λp_R以及包含这样的启动子的融合体）、T7噬菌体、T7lac、T3噬菌体、SP6噬菌体、SP01噬菌体、金属硫蛋白、α交配因子、毕赤酵母（Pichia）醇氧化酶、甲病毒亚基因组启动子、抗生素抗性基因、杆状病毒、玉米夜蛾昆虫病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、浣熊痘病毒、其他痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒（例如立即早期启动子）、猴肾病毒40、反转录病毒、肌动蛋白、反转录病毒长末端重复序列、劳氏肉瘤病毒、热休克蛋白、磷酸盐和硝酸盐转录控制序列，以及能够在原核或真核细胞中控制基因表达的其他序列。其他适合的转录控制序列包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子（例如可以由干扰素或白介素诱导的启动子）。本发明的转录控制序列还可以包括与寄生蠕虫天然相伴的天然存在的转录控制序列，例如马来丝虫（B.malayi）的转录控制序列。

本发明的重组分子也可以含有（a）能够使本发明的表达的蛋白质从产生所述蛋白质的细胞分泌出去的分泌信号（即信号区段的核酸序列），和/或（b）使本发明的核酸分子表达为融合蛋白的融合序列。适合的信号区段的实例包括能够指导本发明的蛋白质的分泌的任何信号区段。优选的信号区段包括但不限于组织纤维蛋白溶酶原激活剂（t-PA）、干扰素、白介素、生长激素、组织相容性和病毒包膜糖蛋白的信号区段。此外，本发明的核酸分子可以连接于将编码的蛋白质导向蛋白体的融合区段，例如泛素融合区段。真核重组分子也可以在本发明的核酸分子的核酸序列周围和/或内部含有间插和/或非翻译序列。

本发明的另一种实施方式包括带有一种或多种本发明的重组分子的重组宿主细胞。将核酸分子转化到细胞中，可以通过能够将核酸分子插入到细胞中的任何方法来实现。转化技术包括但不限于转染、电穿孔、微注射、脂质体转染、吸附和原生质体融合。重组细胞可以保持为单细胞，或者可以生长成组织、器官或多细胞生物体。本发明的转化的核酸分子可以保持在染色体外，或者可以以保留其表达能力的方式整合到被转化（即重组）细胞的染色体内的一个或多个位点中。

适用于转化的宿主细胞包括可以被本发明的核酸分子转化的任何细胞。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经被至少一种核酸分子（例如编码一种或多种本发明的蛋白质和/或可用于生产多价疫苗的其他蛋白质的核酸分子）转化的细胞。本发明的宿主细胞能够内源性地（即天然地）生产本发明的蛋白质，或者能够在被至少一种本发明的核酸分子转化后生产这样的蛋白质。本发明的宿主细胞可以是能够生产至少一种本发明的蛋白质的任何细胞，包括细菌、真菌（包括酵母）、寄生虫（包括蠕虫、原生动物和外寄生虫）、其他昆虫、其他动物和植物细胞。优选的宿主细胞包括细菌、分枝杆菌、酵母、蠕虫、昆虫和哺乳动物细胞。更优选的宿主细胞包括沙门氏菌（Salmonella）、埃希氏菌（Escherichia）、芽孢杆菌（Bacillus）、李斯特菌（Listeria）、酵母菌（Saccharomyces）、夜蛾（Spodoptera）、分枝杆菌（Mycobacteria）、Trichoplusia、BHK（幼仓鼠肾）细胞、MDCK细胞（Madin-Darby犬肾细胞系）、CRFK细胞（Crandell猫肾细胞系）、CV-1细胞（用于例如培养浣熊痘病毒的非洲猴肾细胞系）、COS（例如COS-7）细胞和Vero细胞。特别优选的宿主细胞是大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、包括大肠埃希氏菌K-12衍生株，伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi），鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda），粉纹夜蛾（Trichoplusia ni），BHK细胞，MDCK细胞，CRFK细胞，CV-1细胞，COS细胞，Vero细胞，以及非致瘤性小鼠成肌细胞G8细胞（例如ATCC CRL1246）。其他适合的哺乳动物细胞宿主包括其他肾细胞系、其他成纤维细胞系（例如人、鼠或鸡胚胎成纤维细胞系）、骨髓瘤细胞系、中华仓鼠卵巢细胞、小鼠NIH/3T3细胞、LMTK³¹细胞和/或HeLa细胞。在一种实施方式中，可以使用免疫球蛋白启动子将所述蛋白质作为异源蛋白质表达在骨髓瘤细胞系中。

优选地通过用一种或多种重组分子转化宿主细胞来产生重组细胞，每种所述重组分子包含一种或多种本发明的核酸分子和一种或多种转录控制序列，其实例被公开在本文中。

可以使用重组DNA技术，通过操纵例如宿主细胞内核酸分子的拷贝数、那些核酸分子的转录效率、得到的转录本的翻译效率以及翻译后修饰的效率，来提高转化的核酸分子的表达。可用于提高本发明的核酸分子的表达的重组技术包括但不限于：将核酸分子可操作地连接于高拷贝数质粒，将核酸分子整合在一条或多条宿主细胞染色体中，向质粒添加载体稳定性序列，替换或修饰转录控制信号（例如启动子、操纵基因、增强子）、替换或修饰翻译控制信号（例如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列）、修饰本发明的核酸分子以对应于宿主细胞的密码子用法、缺失使转录本不稳定的序列以及使用在发酵期间使重组细胞生长与重组酶生产在时间上分开的控制信号。表达的本发明重组蛋白的活性，可以通过将编码这样的蛋白的核酸分子片段化、修饰或衍生化来提高。此外，尽管可以使用密码子未优化的序列在宿主细胞例如大肠埃希氏菌中表达融合蛋白（参见表1），但在与DNA疫苗有关的实施方式中，可以对核酸分子进行密码子优化以便于在哺乳动物细胞中表达。就此而言，班氏吴策线虫（W.bancrofti）的BmALT-2、N-端缺失的HSP12.6（cHSP）和班氏吴策线虫（W.bancrofti）四旋蛋白的ECL结构域的密码子优化后的序列分别如SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：68和SEQ ID NO：69中所示。

本发明的分离的基于蛋白质的抗原可以通过各种方式来生产，包括天然蛋白的生产和回收、重组蛋白的生产和回收以及蛋白质的化学合成。在一种实施方式中，通过将能够表达蛋白质的细胞在有效生产蛋白质的条件下进行培养并回收蛋白质，来生产本发明的分离的蛋白质。用于培养的优选细胞是本发明的重组细胞。有效的培养条件包括但不限于允许蛋白质生产的有效的培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效的培养基是指细胞在其中进行培养以生产本发明的蛋白质的任何培养基。这样的培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷源以及适合的盐、矿物质、金属和其他营养物例如维生素的水性培养基。本发明的细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定板和皮氏培养皿中进行培养。培养可以在适合于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。这样的培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围之内。

取决于用于生产的载体和宿主系统，得到的本发明的蛋白质可以保留在重组细胞内，分泌到发酵培养基中，分泌到两个细胞膜之间的空间例如在大肠杆菌中的周质空间中，或被保持在细胞的外表面或病毒膜上。

本发明的蛋白质的回收可以包括收集含有蛋白质的全部发酵培养基，不一定暗含其他分离或纯化步骤。可以使用各种标准的蛋白质纯化技术来纯化本发明的蛋白质，所述标准的蛋白质纯化技术例如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、伴刀豆球蛋白A层析、层析聚焦和差异溶解。本发明的蛋白质优选以基本上纯的形式回收，因此允许将蛋白质有效地用作治疗性组合物。用于动物的治疗性组合物例如应该表现出无显著毒性，并且优选应该能够在被治疗的动物中刺激抗体的产生。

本发明的一种实施方式是一种免疫原性组合物或疫苗，其在以有效方式施用于动物时，能够保护动物免于由丝状线虫引起的丝虫病。免疫原性组合物包含两种以上的下述保护性分子：本发明的分离的抗原性蛋白质、本发明的分离的核酸分子及其杂合体和混合物。当在本文中使用时，本发明的疫苗是保护性的，因为当以有效方式施用于动物时，它能够治疗、改善和/或预防由丝状线虫引起的疾病，所述丝状线虫包括但不限于班氏吴策线虫（W.bancrofti）、马来丝虫（B.malayi）、旋盘尾丝虫（O.volvulus）、罗阿丝虫（L.loa）、链尾曼森线虫（Mansonellastreptocerca）、麦地那龙线虫（Dracunculus medinensis）、常现曼森线虫（M.perstans）、奥氏曼森线虫（M.ozzardi）和/或帝汶布鲁丝虫（B.timori）。本发明的疫苗可以施用于对这种疗法易感的任何动物，优选施用于哺乳动物，更优选施用于人类、宠物例如猫、经济的食用动物和/或动物园动物。针对象皮病进行保护的优选动物包括人类。

在一种实施方式中，本发明的疫苗在施用于宿主时能够产生抗体，当丝状线虫在其中发育的媒介例如蚊虫叮咬宿主时，所述抗体能够杀死其中的寄生虫。

为了保护动物免于由丝状线虫引起的疾病，将本发明的免疫原性组合物以有效方式施用于动物，使得组合物能够保护该动物免于由丝状线虫引起的疾病。本发明的组合物可以在感染之前施用于动物以预防感染（即作为预防性疫苗），和/或可以在感染后施用于动物以便治疗由丝状线虫引起的疾病（即治疗性疫苗）。

本发明的组合物可以被配制在待治疗动物能够耐受的赋形剂中。这样的赋形剂的实例包括水、盐水、林格式溶液、右旋糖溶液、Hank's溶液和其他水性生理平衡的盐溶液。也可以使用非水性介质，例如不挥发性油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其他有用的制剂包括含有增粘剂例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖的悬液。赋形剂也可以含有少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，而防腐剂的实例包括硫汞撒、间甲酚或邻甲酚、福尔马林和苯甲醇。标准制剂可以是可注射液体或可以被配制在适合的液体中作为注射用悬液或溶液的固体。因此，在非液体制剂中，赋形剂可以包含右旋糖、人血清白蛋白、防腐剂等，并可以在施用前向其添加无菌水或盐水。

在本发明的一种实施方式中，疫苗可以包括佐剂。佐剂是能够增强动物对特定抗原的免疫应答的试剂。适合的佐剂包括但不限于细胞因子、趋化因子和诱导细胞因子和趋化因子产生的化合物（例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、集落刺激因子（CSF）、红细胞生成素（EPO）、白介素-2（IL-2）、白介素-3（IL-3）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、白介素-6（IL-6）、白介素-7（IL-7）、白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）、白介素-12（IL-12）、γ-干扰素、γ-干扰素诱导因子I（IGIF）、转化生长因子-β、RANTES（活化后调控、正常T细胞表达且可能为分泌的）、巨噬细胞炎性蛋白（例如MIP-1α和MIP-1β）以及利什曼原虫延伸起始因子（LEIF）），细菌组分（例如内毒素，特别是超抗原、外毒素和细胞壁组分），toll样受体激动剂（例如TLR4激动剂），基于铝的盐，基于钙的盐，二氧化硅，多核苷酸，类毒素，血清蛋白，病毒外壳蛋白，嵌段共聚物佐剂（例如Hunter'sTITERMAX佐剂（VAXCEL,Inc.Norcross,GA）、Ribi佐剂（RibiImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,MT）），以及皂苷及其衍生物（例如QUIL A（Superfos Biosector A/S,Denmark））。本发明的蛋白质佐剂可以以蛋白质本身或编码这样的蛋白质的核酸分子的形式，使用本文描述的技术进行递送。

在本发明的一种实施方式中，疫苗可以包含载体。载体包括增加治疗性组合物在被治疗动物中的半衰期的化合物。适合的载体包括但不限于受控释放的聚合物介质、可生物降解的植入物、脂质体、细菌、病毒、其他细胞、油、酯和二醇。

本发明的一种实施方式是能够将本发明的组合物缓慢释放到动物中的受控释放制剂。当在本文中使用时，受控释放制剂包含在受控释放介质中的本发明组合物。适合的受控释放介质包括但不限于生物相容性聚合物、其他聚合物基质、胶囊、微胶囊、微粒、推注制剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球和透皮递送系统。本发明的其他受控释放制剂包括在施用于动物后原位形成固体或凝胶的液体。优选的受控释放制剂是可生物降解的（即生物蚀解的）。

优选的受控释放制剂能够以恒定速率将本发明的疫苗释放在被治疗动物的血液中，所述速率足以获得组合物的治疗性剂量水平，以保护动物免于由丝状线虫引起的疾病。疫苗优选地在约1至约12个月范围的时间段内释放。本发明的受控释放制剂能够实现优选至少约1个月、更优选至少约3个月、甚至更优选至少约6个月、甚至更优选至少约9个月、甚至更优选至少约12个月的治疗。

本发明的疫苗可以在感染前施用于动物以预防感染，和/或可以在感染后施用于动物以治疗由丝状线虫引起的疾病。例如，蛋白质、核酸及其混合物可以用作免疫治疗剂。以有效方式施用组合物的可接受的方案包括单个剂量大小、剂量数、剂量施用频率和施用方式。这样的方案的确定可以由本领域技术人员来完成。适合的单剂量是当在适合的时间段内施用一次或多次时，能够保护动物免于疾病的剂量。例如，基于蛋白质的疫苗的优选单剂量是每千克动物体重约1微克（pg）至约10毫克（mg）基于蛋白质的疫苗。加强疫苗接种可以在初始施用后约2周至数年内施用。加强施用优选在动物的免疫应答变得不足以保护动物免于疾病时施用。优选的施用时间安排是在约2周至约12个月的时间段内施用每kg动物体重约10μg至约1mg疫苗约1次至约2次。施用方式可以包括但不限于皮下、皮内、静脉内、鼻内、口服、透皮和肌内途径。

在疫苗包括核酸分子的情况下，疫苗可以以能够使该核酸分子在动物中表达成保护性蛋白的方式施用于动物。可以通过各种方法将核酸分子递送至动物，所述方法包括但不限于施用作为基因疫苗的裸（即未包装在病毒外壳或细胞膜中的）核酸（例如作为裸DNA分子，例如在Wolff等，（1990）Science247:1465-1468中所教导的），或施用被包装成重组病毒疫苗或重组细胞疫苗的核酸分子（即通过病毒或细胞介质递送核酸分子）。

本发明的基因（即裸核酸）疫苗包含本发明的核酸分子，并优选包含本发明的重组分子，其优选地能够复制或通过其他方式扩增。本发明的基因疫苗可以包含一种或多种本发明的核酸分子，所述核酸分子为例如双顺反子重组分子的形式。优选的基因疫苗包含病毒基因组的至少一部分（即病毒载体）。优选的病毒载体包括基于甲病毒、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、小核糖核酸病毒和反转录病毒的病毒载体，其中基于甲病毒（例如辛德毕斯或西门利克（Semliki）森林病毒）、种特异性疱疹病毒和痘病毒的病毒载体是特别优选的。可以使用任何适合的转录控制序列，包括所公开的适用于蛋白质生产的那些。特别优选的转录控制序列包括巨细胞病毒立即早期（优选与内含子-A联用）、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列和组织特异性转录控制序列，以及如果使用病毒载体的话，还包括病毒载体内源性的转录控制序列。引入“强的”多腺苷化信号也是优选的。

本发明的基因疫苗可以以各种方式施用，包括肌内、皮下、皮内、透皮、鼻内和口服施用途径。此外，设想了疫苗可以通过基因枪、皮肤贴片、电穿孔或纳米基递送方式来递送。就此而言，基于DNA和基于蛋白质的疫苗可以同时施用。取决于施用途径和/或递送方法，基因疫苗的优选单剂量在约1纳克（ng）至约600μg的范围内，其可以由本领域技术人员来确定。适合的递送方法包括例如通过注射、作为滴剂、气溶胶化和/或局部递送。本发明的基因疫苗可以被包含在单独的水性赋形剂（例如磷酸盐缓冲盐水）中或被包含在载体（例如基于脂类的介质）中。

本发明的重组病毒疫苗包含本发明的重组分子，所述重组分子被包装在病毒外壳中并在施用后能够在动物中表达。优选地，重组分子是包装或复制缺陷的，和/或编码减毒病毒。可以使用许多重组病毒，包括但不限于基于甲病毒、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、小核糖核酸病毒和反转录病毒的重组病毒。优选的重组病毒疫苗是基于甲病毒（例如辛德毕斯病毒）、浣熊痘病毒、种特异性疱疹病毒和种特异性痘病毒的重组病毒疫苗。生产和使用甲病毒重组病毒疫苗的方法的实例被公开在PCT公开号WO94/17813中。

当施用于动物时，本发明的重组病毒疫苗感染免疫后动物中的细胞，并指导能够保护动物免于由丝状线虫引起的丝虫病的保护性蛋白的生产。作为说明，本发明的重组病毒疫苗的单剂量可以为每千克动物体重约1X10⁴至约1X10⁸个病毒噬斑形成单位（pfu）。施用方案与本文中为基于蛋白质的疫苗所描述的相似，使用皮下、肌内、鼻内和口服作为施用途径。

本发明的重组细胞疫苗包含表达本发明的蛋白质的本发明的重组细胞。用于这种实施方式的优选重组细胞包括沙门氏菌（Salmonella）、大肠埃希氏菌（E.coli）、李斯特菌（Listeria）、分枝杆菌（Mycobacterium）、草地贪夜蛾（S.frugiperda）、酵母（包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris））、BHK、CV-1、成肌细胞G8、COS（例如COS-7）、Vero、MDCK和CRFK重组细胞。本发明的重组细胞疫苗可以以各种方式施用，但是具有以下面的方式施用的优势：可以优选以每千克体重约10⁸至约10¹²个细胞范围内的剂量口服施用。施用方案与本文中为基于蛋白质的疫苗所描述的相似。重组细胞疫苗可以包括完整细胞、剥离细胞壁后的细胞或细胞裂解物。

正如本领域中已知的，根据丝状线虫占据的体内生境，将丝状线虫分成三类：淋巴丝虫，皮下丝虫和浆膜腔丝虫。淋巴丝虫病由班氏吴策线虫（W.bancrofit）、马来丝虫（B.malayi）和帝汶布鲁丝虫（B.timori）这些虫引起。这些虫占据包括淋巴结在内的淋巴系统，并引起发热、淋巴结炎（淋巴结肿大）、淋巴管炎（淋巴管对感染做出响应的炎症）和淋巴水肿（象皮病）。皮下丝虫病由罗阿丝虫（Loa loa）（非洲眼丝虫）、链尾曼森线虫（Mansonella stretocerca）、旋盘尾丝虫（O.volvulus）和麦地那龙线虫（Dracunculus medinensis）引起。这些虫占据脂肪层中皮肤的皮下层，并表现为皮疹、荨麻疹性丘疹和关节炎以及色素沉积增高和减低的斑疹。旋盘尾丝虫（Onchocercavolvulus）表现在眼中，引起“河盲症”。浆膜腔丝虫病由常现曼森线虫（M.perstans）和奥氏曼森线虫（M.ozzardi）这些虫引起，这些虫占据腹部浆膜腔。除了腹痛之外，浆膜腔丝虫病表现出与皮下丝虫病相似的症状，因为这些虫也是深部组织栖居者。

本发明的疫苗保护动物免于由丝状线虫引起的丝虫病的功效可以通过各种方式来测试，包括但不限于检测保护性抗体（使用例如本发明的蛋白质），检测被治疗动物中的细胞免疫，或用丝状线虫激惹被治疗动物以确定被治疗动物是否对疾病有抗性并且不表现出疾病的一种或多种征兆。激惹研究可以包括将包含丝状线虫幼虫的室片植入被治疗动物中和/或将幼虫直接施用于被治疗动物。在一种实施方式中，治疗性组合物可以在动物模型例如小鼠、沙鼠（长爪沙鼠（Merionesunguiculatus））和/或乳鼠（例如南非乳鼠（Mastomys natalensis））中进行测试。这样的技术对于本领域技术人员来说是已知的。

通过下面的非限制性实施例对本发明进行更详细描述。

实施例1：小热休克蛋白疫苗

寄生虫。马来丝虫（B.malayi）L3从乔治亚州Athens的佐治亚大学（University of Georgia,Athens,GA）的NIAID/NIH丝虫病研究试剂资源中心（Filariasis Research Reagent Resource Center）（FR3）获得。

人血清样品。从下列临床对象组收集约10ml血样：（1）流行病地区正常（EN）对象，他们是无症状且无微丝蚴血症的个体；（2）无症状的微丝蚴血症对象（Mt），他们在血液中具有循环的微丝蚴，并通过他们的过夜血涂片的显微镜检而被鉴定到；（3）慢性病（CP）患者，包括表现出淋巴水肿和丝虫病的其他慢性临床症状的对象；以及（4）非流行病地区正常对象（NEN），他们生活在非流行病地区，并且没有循环的寄生虫或抗体，并且没有显示出任何丝虫病的迹象。从他们的血样分离血清并储存在-80℃下直到使用。

重组马来丝虫（B.malayi）热休克蛋白的表达和纯化。为了生产重组马来丝虫（B.malayi）的小热休克蛋白12.6（rBmHSP），将全长基因序列克隆到pRSET-A（带有N-端6个组氨酸的标签）中，并转化到含有pLysS的BL21（DE3）（Invitrogen,Carlsbad,CA）中，以使由蛋白质造成的毒性最小化。当培养物的吸光度达到0.6OD值时，向培养物加入1mM IPTG（异丙基硫代-d-吡喃半乳糖苷）并继续温育3小时以诱导基因表达。在将细胞裂解后，将总蛋白在15%SDS-PAGE上分离以证实带有his标签的蛋白质的表达。随后，使用固定化的钴金属亲和柱层析（Clontech,Mountain View,CA），按照制造商的推荐，纯化带有组氨酸标签的重组蛋白。然后将重组蛋白在15%SDS-PAGE上分离，并用考马斯亮蓝R250染色。在柱纯化后获得单一条带。

BmHSP的三维模型。通过同源性建模来构建BmHSP蛋白的三维模型。在PDB数据库中进行BLAST序列同源性检索，以鉴定模板蛋白质。一种最近结晶的蛋白质人α-晶状体蛋白A显示出显著的序列同一性，因此被选为用于BmHSP建模的模板。使用MODELLER9v6（Sali&Blundell（1993）J.Mol.Biol.234:779-815）进行模型建造。随后使用PROCHECK程序（Laskowski等，（1993）J.Appl.Cryst.26:283-29）验证获得的3-D结构。由PROCHECK预测的最佳模型具有-0.46的分值，并被选择用于进一步建模并用于使用Rasmol程序产生3-D结构。

BmHSP结构的分析。在欧洲分子生物学实验室（EuropeanMolecular Biology Laboratory,Heidelberg）的PDBsum和预测蛋白质电子邮件服务器（Predict Protein E-mail server）上预测BmHSP的二级结构和蛋白质-蛋白质相互作用位点（Roos等，（1995）Parasitol.Today11:148-150）。通过PROSITE图案分析进行基序扫描以鉴定BmHSP中的功能性基序。使用免疫表位数据库和分析资源（Immune EpitopeDatabase and Analysis Resource）（lEDB）预测BmHSP序列中的B-细胞、T-细胞和CTL表位。

BmHSP的系统进化分析。将BmHSP的氨基酸序列与来自于不同生物体的其他小热休克蛋白家族的成员进行比较。分析了下列序列。括号中给出了登记号。Aconthocheilonema vitae（CAA48631）；Archaeoglobus fulgidus（O28308）；牙买加果蝠（Artibeus jamaicensis）（P02482）；烟曲霉（Aspergillus fumigatus）（Q4WV00）；拟南芥（Arabidopsis thaliana）（O81822）；Artemia persimilis（DQ310578）；棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）（P96193）；彭亨布鲁线虫（Brugiapahangi）（CAA61152）；马来丝虫（Brugia malayi）（AAU04396）；蚜虫巴克纳菌（Buchnera aphidicola）（P57640）；家蚕（Bombyx mori）（AF315318_1）；大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）（P70918）；秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）（Q7JP52）；粗球孢子菌（Coccidioides immitis）（Q1E6R4）；番木瓜（Carica papaya）（Q69BI7）；Caenorhabditis remanei（AAZ42349）；盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）（Q54I91）；大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）（ibpA；P0C054）；大肠埃希氏菌（Escherichia coli）（ibpB；P0C058）；智人（Homo sapiens）（P02489）；捻转血茅线虫（Haemonchuscontortus）（AAN05752）；图画柳趾虎（Lygodactylus picturatus）（Q6EWI0）；旋盘尾丝虫（Onchocercara volvulus）（CAA48633）；Ostertagia ostergi（CAG25499）；恒河猴（Macaca mulatta）（P02488）；结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）（P0A5B7）；小家鼠（Musmusculus）（AAA37861）；巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis）（BAI81970）；恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）（Q8IB02）；褐家鼠（Rattus rattus）（CAA42910）；酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）（P15992）；番茄（Solanum lycopersicum）（O82545）；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）（P80485）；旋毛虫（Trichinellaspiralis）（ABJ55914）；布氏锥虫（Trypanosoma brucei）（Q57V53）；刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）（Q6DUA8）。使用ClustalW算法将来自于所有sHSP序列的α-晶状体蛋白结构域比对，并使用数据集，用PHYLIP软件建立系统进化树。使用邻接算法，使用泊松校正的氨基酸距离来建造进化树。

伴侣蛋白测定法。伴侣蛋白的典型特征之一在于它们能够结合细胞蛋白质并保护其免于热损伤。当蛋白质暴露于热损伤时，它们聚集（热聚集）。伴侣蛋白防止这种聚集。为了确定BmHSP是否能够防止热聚集，使用瓜氨酸合酶（CS）（Sigma,St.Louis,MO）热聚集测定法。选择CS是因为这种蛋白质对热变性高度敏感。使用已建立的方法（Gnanasekar等，（2009）Biochem.Biophys.Res.Commun.386:333-337）。简单来说，在存在或不存在被悬浮在含有100mM NaCl的50mM pH7.4的磷酸钠缓冲液中的BmHSP（2μM）的情况下，将1μM CS暴露于45℃。使用BSA作为对照。将CS与BmHSP以（1:2）的摩尔比温育从0至40分钟的各种时间间隔。在360nm处通过分光光度法监测热变性（聚集）。

伴侣蛋白活性的体外肽结合测定法。热休克蛋白的另一种特征在于它们能够结合于各种蛋白质。为了确定BmHSP是否也具有这种功能，根据已知方法将CS和另一种蛋白质萤光素酶用6M盐酸胍化学变性（Gnanasekar等，（2009）同上）。然后将天然和化学变性的蛋白质在96孔板板上在4℃包被过夜。在用PBS洗涤后，将孔在室温下用3%BSA封闭。在进一步洗涤后，将孔与带有his标签的rBmHSP在37℃下温育1小时。在再次用PBS洗涤后，加入最适稀释的抗his标签抗体HRP偶联物，并在37℃下温育1小时。在最后洗涤后，使用ABTS[2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]显色，并在405nm处测量OD。

人血清中的抗BmHSP抗体水平。使用间接ELISA（Cheirmaraj等，（1992）J.Trop.Med.Hyg.95:47-51）分析属于不同临床组例如Mf、CP、EN和NEN的共20个血清样品中抗BmHSP IgG抗体的存在和滴度。简单来说，将96孔微量滴定板的孔用pH9.6的碳酸盐缓冲液中的rBmHSP（1μg/ml）在4℃下包被过夜，并用3%BSA在37℃下封闭1小时。向孔添加血清样品，并将板在4℃下温育过夜。在将孔洗涤后，加入HRP标记的小鼠抗人类IgG抗体（1:5000），并在37℃下进一步温育1小时。使用ABTS底物显色。在酶标仪（BIO-RAD,Hercules,CA）中在405nm处测量吸光度。也使用同种型特异性ELISA测定了对象血清中的抗BmHSP IgG抗体同种型。使用生物素标记的小鼠单克隆抗人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体作为第二抗体，并使用亲和素-HRP偶联物（Sigma,St.Louis,MO）作为第二抗体进行显色。

将密码子优化的BmHSP克隆在用于DNA疫苗的pVAX载体中。使用插入序列特异性引物（含有BamHI位点的正向引物5'-CGC GGATCC ATG GAA GAG AAG GTG GTG-3'（SEQ ID NO：1）和含有EcoRI位点的反向引物5'-CCG GAA TTC TCA CTT GTC GTT GGT G-3'（SEQID NO：2）），将密码子优化的Bmhsp基因克隆在真核表达载体pVAX（Invitrogen）中。PCR参数如下：94℃变性30秒，50℃引物退火30秒，72℃引物延伸30秒，共30个循环；并且在72℃下进行5分钟的最终延伸。对插入DNA进行测序以确保两条链上克隆的核苷酸序列的真实性。质粒在大肠杆菌TOP10F'细胞中维持和扩增。随后，使用无内毒素的质粒提取试剂盒（Qiagen,Hilden,Germany）纯化质粒。DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分析并通过分光光度法定量（OD260/280，比率>1.8）。

小鼠的免疫。在这些实验中使用购自于Charles River Laboratories的6周龄雄性Balb/c小鼠。在本研究中动物的人道使用和流程方案得到伊利诺伊大学医学院（College of Medicine,University of IllinoisRockford）的IACUC委员会的批准。每个组由5只小鼠构成，并且使用三种不同免疫方案对所有小鼠进行腹膜内免疫。对A组小鼠使用引发-加强方案进行免疫。以2周的时间间隔，将小鼠用悬浮在50μl体积中的100μg无内毒素、密码子优化的pVAX Bmhsp DNA引发两次。在引发后，所有小鼠以2周的时间间隔接受两个悬浮在明矾中的15μgrBmHSP蛋白（各50μl）的加强剂量。对B组小鼠单独用rBmHSP蛋白进行免疫。这些小鼠以2周的时间间隔接受4个悬浮在明矾中的15μgrBmHSP蛋白剂量。对C组小鼠单独用DNA进行免疫。这些小鼠以2周的时间间隔接受4个100μg pVAX Bmhsp DNA剂量。D组小鼠以相同的时间间隔接受100μg pVAX载体对照和佐剂，并留作阴性对照。在免疫前和最后一个加强剂量后1个月，从每只小鼠收集血样。在分离血清后，测定循环的抗BmHSP IgG抗体的滴度和相应的同种型。显示出高的抗BmHSP抗体滴度的血清被用在本文中描述的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）测定法中。

小鼠血清中的抗BmHSP抗体水平。使用间接ELISA（Veerapathran等，（2009）PLoS Negl.Trop.Dis.3:e457）测定免疫后小鼠和对照组小鼠的血清中抗BmHSP IgG抗体的水平。也使用小鼠抗体同种型分型ELISA试剂盒（ThermoFisher Scientific,Rockford,IL）测定IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗BmHSP抗体水平。使用ABTS[2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]发色底物显色，并在ELISA酶标仪（BIO-RAD）中在405nm处测量吸光度。

从人类和小鼠血清贫化抗BmHSP抗体。按照已建立的方法（Veerapathran等，（2009）同上），通过将EN对象和免疫后小鼠的合并血清与偶联有带his标签的rBmHSP的钴IMAC树脂温育，从所述合并血清中贫化抗BmHSP抗体。简单来说，将1mg带有his标签的rBmHSP与2ml床体积的IMAC树脂在37℃下偶联2小时。在将树脂用10ml PBS（pH.8）洗涤一次后，加入200μl合并血清并在4℃下温育过夜。在温育后，将树脂混合物以750rpm离心2分钟，并收集上清液。上清液中抗BmHSP抗体的贫化通过本文所述的ELISA来证实。

使用NHS（N-羟基琥珀酰亚胺基）树脂（Thermo fisher scientific），从EN对象的合并血清和免疫后小鼠的合并血清中贫化抗BmHSPIgG1、抗BmHSP IgG2a、抗BmHSP IgG2b、抗BmHSP IgG3和抗BmHSPIgG4抗体。简单来说，将1μg相应的单克隆抗体偶联到NHS树脂柱。在将树脂用PBS（pH.8）洗涤两次后，使100μl血清穿过所述柱。收集流过液作为抗体贫化的血清。特定抗体同种型的贫化通过本文中所述的同种型特异性ELISA来证实。在将柱用PBS（pH7.4）洗涤3次后，使用甘氨酸-HCI缓冲液（pH2.7）从树脂洗脱结合的抗体，并用1M Tris缓冲液（pH8）将pH调整至7.4。正如再次通过ELISA证实的，回收的洗脱液含有特定抗体。也使用洗脱的抗体重构抗体贫化的血清。使用由早先在纯净血清样品上的ELISA测定的值，将贫化的血清的等分试样用洗脱的抗体重构至其原始浓度。然后，抗体贫化的血清、洗脱的抗体和重构的血清样品被用在ADCC测定法中。

抗体依赖性细胞毒性（ADCC）测定法。按照已知方法进行体外ADCC测定（Chandrasekhar等，（1985）Parasite Immunol.7:633-641）。简单来说，将10个马来丝虫（B.malayi）L3与2x10⁵个从正常小鼠收集的腹膜细胞（PEC）、50μl合并的小鼠血清样品和50μl RPMI1640培养基在96孔培养板（Thermo Fisher Scientific）中温育。在37℃和5%CO₂下温育48小时后，使用光学显微镜在400X下确定幼虫的存活率。透明和损坏的幼虫被计数为死亡。此外，死亡的幼虫还具有与其附着的细胞团块，并且比活幼虫更透明。活动、卷曲和半透明的幼虫被计数为存活。ADCC被估算为使用下式计算的幼虫死亡百分数：

死亡幼虫的数量÷幼虫的总数x100。

还使用如本文中所述的合并的人类血清样品进行ADCC测定，区别在于将人类血清样品与从正常健康对象收集的2x10⁵个PBMC和6-12个马来丝虫（B.malayi）L3在37℃和5%CO₂下温育48小时。如上所述确定幼虫的存活和死亡。

在小鼠中的保护研究。在小鼠的激惹感染模型中评估BmHSP的疫苗潜力。如上所述使用引发-加强、单独的DNA或单独的蛋白质的方法免疫小鼠。载体和明矾组用作阴性对照。使用本领域中已知的微孔室方法对免疫后动物和对照动物进行激惹（Abraham等，（1986）Immunology57:165-169）。简单来说，使用14x2mm PLEXI环（MilliporeCorporations,Bedford,MA）和5.0μm核孔聚碳酸酯膜（MilliporeCorporations）组装微孔室。用氰基丙烯酸胶粘剂和牙科粘固剂将膜连接到PLEXIGLASS环。将微孔室在37℃下在含有庆大霉素和抗真菌溶液的无菌RPMI培养基中浸泡过夜。在激惹实验之前，将悬浮在增补有15%热灭活的胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养基中的20个活的感染性L3导入微孔室中，并用牙科粘固剂密封开口。然后将含有L3的微孔室在麻醉下手术植入到每只小鼠的腹膜腔中。遵从无菌条件进行手术程序。在植入48小时后，将动物处死并从腹膜腔回收微孔室。取出每个微孔室的内含物，并通过显微镜检查幼虫的细胞附着和幼虫死亡。如上在ADCC下所述，鉴定死的和活的幼虫。保护百分率被表示成死寄生虫的数量÷回收的总寄生虫数量x100。

脾细胞增殖测定法。从来自于上述实验的所有小鼠收集脾脏并制备脾细胞的单细胞悬液。将悬浮在增补有10%热灭活的FCS的完全RPMI1640培养基中的约2x10⁵个细胞/孔，与rBmHSP（1μg/ml）、ConA（1μg/ml）或单独的培养基在37℃和5%CO₂下温育72小时。在温育后，使用购自于Dojindo Molecular Technologies,Inc.（Gaithersburg,MD）的细胞计数试剂盒（CCK-8）测定细胞增殖。使用下式计算脾细胞增殖的刺激指数：刺激细胞的吸光度÷未刺激细胞的吸光度。

细胞因子分析。如上所述，将来自于免疫后小鼠和对照小鼠的脾细胞与rBmHSP（1μg/ml）、ConA（1μg/ml）或单独的培养基在37℃和5%CO₂下培养72小时。72小时后，分开收集培养上清液和细胞沉淀物用于细胞因子分析。为了测量细胞因子mRNA，将细胞沉淀物悬浮在TRIZOL试剂（GIBCO-BRL,Life technologies,Carlsbad,CA）中，并按照制造商的说明提取总RNA。在乙醇洗涤后，将RNA沉淀物溶解在无RNAse水（Sigma）中，并用DNase I处理，然后使用Beckman分光光度计在260nm处测定总RNA浓度。使用第一链cDNA合成试剂盒（SABiosciences,Frederick,MD），按照制造商的推荐，进行总RNA的反转录。目标基因的表达的相对定量在Applied BioSystem7300实时PCR机（Applied BioSystems,Foster City,CA）中进行测量。使用LightCycler-DNA SYBR Green混合物（SAbiosciences）进行PCR扩增。使用下述PCR条件进行反应：95℃下15分钟的活化步骤1个循环，95℃下15秒的变性步骤，50℃下20秒的引物退火和72℃下15秒的延伸步骤。将DNA扩增50个循环。监测荧光DNA结合染料SYBR Green。产生RT-PCR数据阵列集并使用SABiosciences基于网络的数据分析系统进行分析。

在与rBmHSP（1μg/ml）、ConA（1μg/ml）或单独的培养基温育后72小时，然后从脾细胞培养物收集培养上清液。使用购自于ThermoFisher Scientific的夹心ELISA试剂盒测定培养上清液中IL-2、IL-4、IFN-γ和IL-10蛋白的分泌水平。从使用重组小鼠IL-2、IL-4、IFN-γ或IL-10绘制的标准曲线确定每种细胞因子的浓度。

统计分析。使用XL STAT软件v.7.5.2（Kovach Computing Services,Anglesey,UK）进行统计分析。使用适合的非参数检验估算可比组之间的统计学显著性，其中显著性水平设置为p<0.05。

重组BmHSP12.6（BmHSP）的表达。BmHSP被克隆在pRSET A载体中，并在大肠杆菌BL21（DE3）PLysS中被表达为带有组氨酸标签（带有his标签）的融合蛋白。然后使用IMAC柱纯化重组BmHSP蛋白。据发现，纯化的带his标签的重组融合蛋白的分子量为约18kDa。柱纯化的重组蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带。

BmHSP的预测的三维结构。人类α-晶状体蛋白A链的氨基酸序列与BmHSP具有42%的相似性。由于人类α-晶状体蛋白A链的晶体结构已经可以获得，因此它被用作使用Modeller9v6程序对BmHSP的推测的结构进行建模的模板。使用PROCHECK分析来选择最佳模型，所述最佳模型与模板相比显示出-0.41的分值（Laskowski等，（1993）J.Appl.Cryst.26:283-29）。还在BmHSP序列上进行Ramachandran作图分析。这些分析显示，92%的残基位于没有空间位阻的最有利区域中。约6.7%的残基存在于其他容许区域中。显示出超过90%的残基位于最有利区域中的模型被预测为最理想的三维模型，正如通过Ramachandran作图所预测的（Balazs等，（2001）Protein Eng.Des.Sci.14:875-880）。也使用EMBL的PDBsum服务器对BmHSP蛋白进行了二级结构预测分析。该分析显示，BmHSP单体的每个α-晶状体蛋白结构域具有由排列在2个反向平行片层中的7个β-链构成的免疫球蛋白核心。BmHSP的二级结构预测显示出在BmHSP的结构中具有2个片层、4个β-发夹、1个β凸起、7条链、2个螺旋、7个β转角和1个γ转角。

以前的研究显示，BmHSP结合于人类IL-10受体Iα链（Gnanasekar等，（2008）Mol.Biochem.Parasit.159:98-103）。为了鉴定BmHSP上的IL-10受体结合位点，进行了预测性蛋白质-蛋白质相互作用分析（Ofran&Rost（2007）Bioinformatics23:e13-e16）。预测分析的结果显示，BmHSP的N-端片段（从Metl至Asn26的氨基酸）具有强的蛋白质-蛋白质相互作用区域。该区域的进一步序列分析显示，从Val5至Glu42的氨基酸序列与人类IL-10的人类IL-10R结合区具有显著的序列同一性。这些发现证实BmHSP的N-端区域可能参与BmHSP与人类IL-10受体Iα链的结合。

BmHSP的基序和系统进化分析。在PROSITE上进行的基序分析显示出BmHSP上的数个推测的翻译后修饰位点，例如N-糖基化位点（11至14位和98至101位残基）、蛋白激酶-c磷酸化位点（83至85位和100至102位残基）、酪蛋白激酶II磷酸化位点（68至71位和88至91位残基）和N-十四烷基化位点（40至45位残基）。在人类IL-10中也观察到类似的基序，这进一步表明BmHSP可能模拟IL-10的功能（Gnansekar等，（2008）同上）。BmHSP上的表位作图揭示出B-细胞、T-细胞和CTL表位区的存在，表明BmHSP可能是高免疫原性蛋白（表2）。

表2

使用来自于不同组生物体的代表性sHSP序列进行的系统进化分析显示，BmHSP、秀丽隐杆线虫（C.elegans）HSP和C.remani HSP形成与其他组生物体分开的单源组。

BmHSP是伴侣蛋白。到目前为止报告的大多数热休克蛋白具有伴侣蛋白功能。为了确定BmHSP是否也具有类似的伴侣蛋白功能，使用模型底物瓜氨酸合酶（CS）进行热聚集反应。CS在42℃下温育引起蛋白质解折叠，并随后在10分钟内聚集。在热处理之前向CS蛋白添加BmHSP（以1:2的摩尔比），显著（P<0.01）抑制CS蛋白的热聚集。非伴侣蛋白对照蛋白BSA对CS蛋白的热诱导的聚集没有任何影响。

伴侣蛋白的另一种功能在于它们能够特异性结合于变性蛋白。为了确定BmHSP是否能够特异性结合于变性蛋白，将rBmHSP与天然和变性CS或天然和变性萤光素酶底物温育。这些研究显示，与天然或对照蛋白相比，rBmHSP优先结合于变性的蛋白底物。因此，这些发现证实，BmHSP能够起到可能保护寄生虫细胞蛋白免受宿主破坏效应影响的分子伴侣的作用。

人类中的抗体应答。本文显示的结果表明BmHSP具有数个T-细胞和B-细胞表位。因此，评估了丝虫病感染的个体是否携带针对BmHSP的抗体。因此，测量了EN、CP、Mf和NEN对象的血清中抗BmHSP IgG抗体的滴度。结果显示，EN对象具有最高的抗BmHSP抗体水平（p<0.001）。随后IgG抗体的同种型分析显示，与感染组（Mf和CP）个体相比，来自于EN对象的血清具有高的IgG1和IgG3抗BmHSP抗体滴度。Mf携带者在其血清中仅具有显著水平的抗BmHSPIgG2抗体。类似地，CP个体在其血清中仅具有显著水平的抗BmHSPIgG4抗体。在这些Mf和CP个体的血清中，抗BmHSP IgG1和IgG3水平非常低。在NEN对象的血清中不能检测到抗BmHSP抗体。

ADCC测定的结果。由于在所有感染的个体组（Mf和CP）和EN对象中都存在针对BmHSP的抗体，因此确定了这些抗体是否有功能。使用抗体依赖性细胞毒性测定法，测试了抗BmHSP12.6IgG抗体是否具有针对马来丝虫（B.malayi）的任何保护性功能。这些研究显示，在体外，合并的EN血清促进PBMC与L3的附着并诱导马来丝虫（B.malayi）的显著（77.37%）死亡（表3），然而，来自于Mf和CP的合并血清不能参与ADCC功能。这些发现表明，EN血清具有抗寄生虫活性。为了确定这种功能是否与抗体相关，进行了抗体贫化研究。从EN血清贫化抗BmHSP抗体导致幼虫死亡显著降低（21.42%）（表3），这证实了，EN对象而不是Mf或CP对象的血清中的抗BmHSP抗体参与杀死幼虫。

表3

*值表示三个孔的平均值±SD。

进一步的贫化研究显示，抗BmHSP抗体的抗寄生虫效应与抗体的IgG1同种型相关。从EN血清贫化IgG1抗体显著（40%）抑制ADCC功能（表4）。用洗脱的抗BmHSP IgG1抗体重构抗BmHSP抗体贫化的血清，重新获得了ADCC功能（表3）。因此，这些发现表明抗BmHSPIgG1抗体对于ADCC功能来说是关键的。

表4

值表示三个孔的平均值。

小鼠中的抗体应答。用rBmHSP免疫后的小鼠产生显著水平的抗BmHSP IgG抗体。更具体来说，与单独使用DNA疫苗的组相比，引发-加强疫苗方案诱导显著更高的IgG抗体滴度（p<0.05）。然而，rBmHSP蛋白质疫苗诱导最高的IgG抗体滴度。抗BmHSP IgG抗体的同种型分析显示，在疫苗接种的动物的血清中主要存在IgG1、IgG2a和IgG2b抗BmHSP抗体。还使用小鼠血清进行了ADCC测定。这些研究显示，来自于BmHSP疫苗接种的小鼠的血清促进腹膜渗出液细胞与L3的附着，并参与ADCC功能（杀死83.02%的幼虫），与此相比，对照血清为13%（p<0.002）（表5）。

表5

值表示三个孔的平均值±SD。

与人类血清类似，从疫苗接种的小鼠的血清中贫化IgG抗体的各个同种型，以确定参与ADCC功能的抗BmHSP抗体的同种型。来自于这些研究的结果显示，与使用EN血清所观察到的类似，抗BmHSPIgG1抗体在小鼠中也参与ADCC介导的L3的杀死（表6）。

表6

值表示三个孔的平均值。

BmHSP在小鼠中的疫苗潜力。在Balb/c小鼠中，使用微孔室方法评估BmHSP的疫苗潜力。结果显示，使用引发-加强疫苗接种方案和BmHSP蛋白质疫苗免疫后的小鼠，分别表现出被植入到免疫后小鼠的腹膜腔中的L3的接近72%和58%的死亡率（表7）。尽管被植入到对照动物组中的微孔室仅显示出7%的寄生虫死亡率，但对照组小鼠和疫苗接种的小鼠的保护之间的差异是显著的（P<0.001）。另一方面，用单独的DNA疫苗免疫后的小鼠仅诱导31%的保护。因此，与单独的DNA或单独的蛋白质免疫方案相比，引发-加强疫苗接种方案似乎在提供疫苗诱导的针对激惹感染的保护作用方面是高度有效的。

表7

值表示平均值±SD。N=5。数据来自于显示出可比结果的两个相似实验中的一个。

BmHSP疫苗接种后的小鼠中的免疫应答。为了确定疫苗接种后的小鼠中对BmHSP的细胞免疫应答，将从疫苗接种和对照小鼠收集的脾细胞在rBmHSP蛋白质存在下进行培养，并评估它们的增殖响应和细胞因子情况。与单独rBmHSP蛋白质疫苗接种组（刺激指数为2.22±0.018）或单独Bmhsp DNA疫苗接种组（刺激指数为3.53±0.102）相比，来自于用引发-加强疫苗方案免疫后的动物的脾细胞的增殖响应显著（P>0.05）更高（刺激指数为3.35±0.176）。来自于对照组动物的脾细胞不能对rBmHSP做出响应而增殖（刺激指数为0.98±0.013），并与单独培养基对照相似。由于来自于疫苗接种动物的脾细胞显著增殖以记忆起对rBmHSP的应答，因此测量了培养上清液中的细胞因子水平。这些结果显示，IFN-γ是由来自于用rBmHSP刺激后72小时的疫苗接种动物的脾细胞所分泌的主要细胞因子。在从rBmHSP刺激的脾细胞收集的mRNA上进行了实时PCR细胞因子基因阵列。这些结果显示，在疫苗接种后的动物中，Th1（IFN-γ、CD-28、IL-12、IL-2）和Th2（IL-4、IL-5、IL-1R）两种细胞因子基因都显著增加。

实施例2：rBmALT-2+rBmHSP多价疫苗

寄生虫。马来丝虫（Brugia malayi）L3从乔治亚州Athens的佐治亚大学（University of Georgia,Athens,GA）的NIAID/NIH丝虫病研究试剂资源中心（Filariasis Research Reagent Resource Center）（FR3）获得。

单价和多价DNA疫苗的构建。单价DNA疫苗由在pVAX1载体中的Bmhsp或Bmalt-2构成。为了制备单价疫苗，使用插入序列特异性引物（Gnanasekar等，（2004）同上）将密码子优化的Bmhsp或Bmalt-2基因克隆到真核表达载体pVAX1（Invitrogen,Carlsbad,CA）中。多价疫苗由在同样的pVAX1载体中的Bmhsp和Bmalt-2基因构成。首先将密码子优化的Bmhsp基因克隆在pVAX1载体中，其中在反向引物中没有终止密码子（5’-CCG GAA TTC TCA CTT GTC GTT GGT G-3’；SEQ ID NO：24）但含有PstI位点。然后使用基因特异性引物（Gnanasekar等，（2004）同上）将密码子优化的Bmalt-2基因插入在该克隆中。所有这3种构建物的PCR参数均为：94℃变性30秒，50℃引物退火30秒，72℃引物延伸30秒，共30个循环；在72℃下进行5分钟的最终延伸。最后对插入DNA进行测序以确保两条链上克隆的核苷酸序列的真实性。质粒在大肠杆菌TOP10F'细胞中维持和扩增。使用无内毒素的质粒提取试剂盒（Qiagen,Valencia,CA）纯化质粒。DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分析并在分光光度计中进行定量（OD260/280，比率>1.8）。

重组蛋白的表达和纯化。将所有基因克隆在pRSET-A载体（带有N-端6个组氨酸的标签）中以产生重组蛋白。将Bmhsp和Bmalt-2构建物转化到含有pLysS的BL21（DE3）大肠杆菌宿主（Invitrogen）中，以使由蛋白质造成的毒性最小化。当培养物的吸光度达到0.6OD值时，向培养物加入1mM IPTG（异丙基硫代-d-吡喃半乳糖苷）并继续温育3小时以诱导基因表达。在将细胞裂解后，将总蛋白在15%和12%SDS-PAGE上分离以证实带有his标签的重组BmHSP（rBmHSP）和rBmALT-2蛋白质的表达。然后，使用固定化的钴金属亲和柱层析（Clontech,Mountain View,CA），按照制造商的推荐，纯化重组蛋白。然后将重组蛋白在SDS-PAGE上分离，并用考马斯亮蓝R250和银染剂进行染色。这些研究显示，在柱纯化后获得单一条带。在重组制备物中如果存在任何内毒素，通过使重组蛋白穿过多粘菌素B亲和柱（Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL）来去除内毒素，并使用E-TOXATE试剂盒（Sigma,St Louis,MO），按照制造商的说明测定最终制备物中的内毒素水平。在这些重组蛋白制备物中，内毒素水平低于检测限。

小鼠的免疫。在这些实验中使用购自于Charles River Laboratories的6周龄雄性Balb/c小鼠。在本研究中动物的人道使用和流程方案得到伊利诺伊大学医学院（College of Medicine,University of IllinoisRockford）的IACUC委员会的批准。小鼠被分为4组，每组5只动物。使用DNA引发-蛋白质加强疫苗接种方案对所有小鼠进行皮下免疫。将所有实验组小鼠用提供在50μl体积中的无内毒素的密码子优化的DNA注射两次进行引发，并用两个悬浮在明矾（各50μl）中的重组蛋白剂量以2周的时间间隔进行加强。

对A组小鼠用100μg pVAXBmhsp引发并用15μg rBmHSP加强；对B组小鼠用100μg pVAX Bmalt-2引发并用15μg rBmALT-2加强；对C组小鼠用100μg pVAXBmhsp/Bmalt-2DNA引发并用15μgrBmHSP和15μg rBmALT-2加强。D组小鼠接受100μg pVAX1载体加上50μl明矾，并用作对照。在免疫前和最后一个加强剂量后1个月，从每只小鼠收集血样。分离血清并储存在-80℃下。

小鼠中抗体应答的评估。按照已建立的方法（Veerapathran等，（2009）同上；Gnanasekar等，（2004）同上），使用间接ELISA测量免疫后小鼠和对照组小鼠的血清中抗BmHSP抗体和抗BmALT-2抗体的水平。简单来说，将96孔微量滴定板的孔用碳酸盐缓冲液（pH9.6）中的rBmHSP、rBmALT-2或rBmHSP（1μg/ml）在4℃下包被过夜。在洗涤孔后，将未结合位点用3%BSA在37℃下封闭1小时。然后向孔加入稀释的血清样品，并在4℃下进一步温育过夜。在洗涤孔后，加入HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体（1:5000），并在37℃下进一步温育1小时。使用ABTS（2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）底物显色。在酶标仪（BIO-RAD,Hercules,CA）中在405nm处测量吸光度。

在小鼠中的保护研究。然后在小鼠模型中评估单价和多价疫苗制剂的疫苗潜力。如上所述使用引发-加强方法免疫小鼠。载体加上明矾组用作阴性对照。使用本领域中已知的微孔室方法对免疫后动物和对照动物进行激惹（Abraham等，（1989）Am.J.Trop.Med.Hyg.40（6）:598-604）。简单来说，使用14x2mm PLEXIGLASS环（MilliporeCorporations,Bedford,MA）和5.0μm核孔聚碳酸酯膜（MilliporeCorporations）组装微孔室，其中用氰基丙烯酸胶粘剂和牙科粘固剂将所述聚碳酸酯膜连接到PLEXIGLASS环。将微孔室在37℃下在含有庆大霉素和抗真菌溶液的无菌RPMI培养基中浸泡过夜。在激惹实验之前，将悬浮在增补有15%热灭活的胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养基中的20个活的感染性L3导入微孔室中，并用牙科粘固剂密封开口。然后将含有L3的微孔室在麻醉下手术植入到每只小鼠的腹膜腔中。遵从无菌条件进行手术程序。在植入48小时后，将动物处死并从腹膜腔回收微孔室。取出每个微孔室的内含物，并通过显微镜检查幼虫的细胞附着和幼虫死亡。在显微镜下以100x放大倍数确定幼虫的存活率。保护百分率被表示成死寄生虫的数量÷回收的总寄生虫数量x100。

小鼠中的细胞因子分析。使用ELISPOT测定法测定对照和疫苗接种的小鼠的脾脏中rBmHSP和rBmALT-2特异性的干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）分泌细胞的百分数。简单来说，将MILLIPOREMultiScreen HTS Filter板，用PBS缓冲液中浓度为10μg/ml的大鼠抗小鼠IFN-γ单克隆抗体或大鼠抗小鼠IL-4单克隆抗体（BD Pharmigen,San Diego,CA）进行包被。在洗涤板后，通过将孔在室温下在含有10%胎牛血清的完全RPMI中温育1小时，来封闭非特异性位点。然后向每个孔加入悬浮在增补有10%热灭活的FBS的完全RPMI1640培养基中的约3x10⁶个脾细胞。用rBmHSP或rBmALT-2（1μg/ml）刺激细胞。未刺激的细胞用作对照。在37℃下和加湿的5%CO₂中温育后48小时，将板进行洗涤，并与2μg生物素化的大鼠抗小鼠IFN-γ抗体或生物素化的大鼠抗小鼠IL-4抗体（BD Pharmigen）在室温下进一步温育1小时。在洗涤板后，向每个孔加入链亲和素偶联的辣根过氧化物酶（Thermo Fisher Scientific）（1:800），并在室温温育1小时。将板进行洗涤并使用DAB底物（Thermo Fisher Scientific）显色。斑点总数在解剖显微镜下进行计数。

统计分析。使用XL STAT软件v.7.5.2（Kovach Computing Services,Anglesey,UK）进行统计分析。使用适合的非参数检验估算可比组之间的统计学显著性，其中显著性水平设置为p<0.05。

小鼠中的抗体应答。首先确定多价疫苗是否能够引发显著的针对每种抗原性组分的抗体。以前的研究显示，类似地用马来丝虫（B.malayi）抗原疫苗接种的小鼠引发了显著的宿主保护性IgG抗体（Veerapathran等，（2009）同上）。因此分析了IgG抗体滴度。该分析的结果表明，用Bmhsp+rBmHSP和Bmalt-2+rBmALT-2单价免疫引发显著的（p<0.005）抗BmHSP和抗BmALT-2IgG抗体滴度（图1）。多价疫苗也引发显著的IgG抗体滴度。在使用多价疫苗后，小鼠同等地产生抗BmHSP和BmALT-2两者的IgG抗体，表明抗原不相互干扰或竞争优势地位。一个有趣的发现是与单价疫苗相比，多价疫苗引发高1.5至1.75倍（p<0.005）的IgG抗体滴度（图1）。这些发现表明，多价制剂中的两种抗原能够在疫苗接种的小鼠中通过增加疫苗诱导的针对每种抗原的抗体应答而协同增效地发挥作用。该发现还表明，将这两种抗原组合在疫苗制剂中具有极大优点。由于疫苗接种后诱导的稳健的IgG抗体应答，有可能的是，还可以降低多价制备物中组分抗原的浓度。

多价疫苗在小鼠中诱导显著的保护。本文的结果显示，在用单价和多价疫苗制备物疫苗接种后，引发了显著的IgG抗体。为了测试在疫苗接种后引发的免疫应答是否具有保护性，将疫苗接种的动物用活的第三阶段感染性的马来丝虫（B.malayi）幼虫（L3）进行激惹。由于寄生虫在这些动物中不达到成熟，因此如果将寄生虫手术植入到动物中，则可获得这些虫的更好的回收。使用标准的微孔室激惹方法（Abraham等，（1989）同上）。这些研究显示，在用单价疫苗免疫的小鼠中可以获得接近61%的保护（表8）。这与阴性对照相比是高度显著的（p<0.001）。这一发现还显示，rBmHSP和rBmALT-2在淋巴丝虫病的疫苗中具有使用价值。在使用多价疫苗免疫的小鼠中的激惹实验显示，与单价疫苗接种相比，可以获得显著（p<0.005）更高的保护（表8）。这些发现也明显与这些动物中较高的IgG抗体滴度相关，并支持了上述发现，即当以引发-加强方案给予时，rBmALT-2和rBmHSP能够在疫苗接种的动物中协同性增强保护性免疫应答（表8）。

表8

^a值是平均值+SD。N=5。数据来自于显示出可比结果的两个相似实验中的一个。

为了进一步证实功效，用各种引发-加强组合对小鼠进行免疫。如图3中所示，在用HAT杂合蛋白免疫后或在用HAT杂合DNA和HAT杂合蛋白引发-加强免疫后，可以在小鼠中获得100%的保护。

细胞因子应答。通过评估脾细胞对疫苗抗原做出响应而分泌细胞因子的应答，确定了疫苗接种的小鼠中保护性应答的免疫学特征。当将脾细胞用rBmHSP或rBmALT刺激时，存在脾细胞的显著的抗原特异性增殖，表明针对抗原的强的记忆性细胞应答。为了鉴定这些抗原应答性细胞的细胞因子情况，使用ELISPOT测定法对IFN-γ和IL-4分泌细胞进行计数。这些研究的结果显示，来自于用多价疫苗接种的小鼠的脾细胞主要分泌IL-4（图2）。IFN-γ分泌细胞的数量非常低。总的来说，这些发现表明疫苗诱导的保护主要由Th2类型的应答介导。

实施例3：BmVal-1+BmALT-2多价疫苗

血清。本研究中使用的血清样品来自于储存在印度Sevagram的圣雄甘地医学科学研究所（Mahatma Gandhi Institute of Medical Sciences,Sevagram,India）的存档样品。这些样品作为在淋巴丝虫病流行地区Wardha中及其周围进行的流行病学调查的一部分而被收集。

从该研究没能获得人口统计学数据，只是根据循环中的寄生虫、寄生虫抗原的检测或通过评估淋巴丝虫病的临床症状，将血清样品分类成微丝蚴血症（MF）、慢性病（CP）或流行病地区正常（EN）样品。按照已知方法检测对象血液中的循环微丝蚴（Haslbeck等，（2005）Nat.Struct.Mol.Biol.12:842-846；Yoo等，（2005）Biotechnol.Lett.27:443-448）。使用Og4C3试剂盒和基于WbSXP的酶联免疫吸附测定法（ELISA）来检测循环抗原的存在。没有循环抗原或微丝蚴的对象被分类为EN，而通过ELISA检测到具有循环微丝蚴和/或循环抗原的对象被认为是MF。表现出淋巴水肿和丝虫病的其他可见临床症状的对象被分组到CP中。在伊利诺伊大学诊所（University of Illinois Clinic atRockford,IL）收集非流行病地区正常（NEN）对照血清。

寄生虫。马来丝虫（Brugia malayi）L3从乔治亚州Athens的佐治亚大学（University of Georgia,Athens,GA）的NIAID/NIH丝虫病研究试剂资源中心（Filariasis Research Reagent Resource Center）（FR3）获得。

单价和多价DNA疫苗的构建。为了制备单价疫苗，使用插入片段特异性引物将密码子优化的BmVAL-l（Ace：AF042088）或Bmalt-2（Ace：U84723）基因克隆在真核表达载体pVAX1（lnvitrogen,Carlsbad,CA）中（Yoo等，（2005）同上；Huang等，（2005）Immunol.Lett.101:71-80）。为了制备多价疫苗，首先使用已经发表的没有终止密码子并带有PstI位点的引物序列将密码子优化的BmVAL-l基因克隆在pVAX1载体中。然后使用基因特异性引物将密码子优化的Bmalt-2基因插入到该克隆中。所有构建物的PCR参数均为：94℃变性30秒，50℃引物退火30秒，72℃引物延伸30秒，共30个循环；并且在72℃下进行5分钟的最终延伸。对插入DNA进行测序以确保两条链上克隆的核苷酸序列的真实性。质粒在大肠杆菌TOP10F'细胞中维持和扩增。使用无内毒素的质粒提取试剂盒（Qiagen,Valencia,CA）纯化质粒。DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分析并在分光光度计中进行定量（OD260/280，比率>1.8）。

重组蛋白的表达和纯化。将重组BmVAL-l和rBmALT-2在pRSET-A载体中进行表达，并使用固定化的钴金属亲和柱层析，按照已发表的方法进行纯化（Norimine等，（2004）Infect.Immun.72:1096-1106；Shinnick等，（1988）Infect.Immun.56:446-451）。通过使重组蛋白穿过多粘菌素B亲和柱（Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL）来去除重组制备物中的内毒素，并使用E-TOXATE试剂盒（Sigma,St Louis,MO），按照制造商的说明测定最终制备物中的内毒素水平。在这些重组蛋白制备物中，最终制备物中的内毒素水平（0.005EU/ml）低于检测限。

人类血清的免疫反应性。为了确定人类血清样品是否携带针对BmVAL-1或BmALT-2的抗体，进行了ELISA（Haslbeck等，（2005）同上；Yoo等，（2005）同上）。对于同种型特异性ELISA来说，使用碱性磷酸酶偶联的山羊抗人类IgG1、抗人类IgG2、抗人类IgG3和抗人类IgG4抗体（Sigma）作为第二抗体。

小鼠和沙鼠的免疫方案。在这些实验中使用购自于Charles RiverLaboratories（Wilmington,MA）的6周龄雄性Balb/c小鼠和35-40gm远系杂交雄性蒙古沙鼠（沙鼠）。按照实验室动物护理和使用指南（Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals）中的准则对待动物。使用了两种不同的动物模型，由于马来丝虫（B.malayi）寄生虫在小鼠中不能成熟至成年，因此可以在小鼠模型中评估疫苗诱导的针对L3阶段幼虫的保护作用。此外，在小鼠中可以测量大量免疫学参数。相反，马来丝虫（B.malayi）寄生虫在沙鼠中发育成成熟的成年虫。因此，可以在沙鼠中评估疫苗诱导的针对成年虫建立的保护作用。

进行了三套实验：（1）单价BmVAL-1疫苗接种，（2）单价BmALT-2疫苗接种和（3）多价mVAL-1/BmALT-2疫苗接种。每套实验包含4组：（a）DNA引发加上DNA加强（同质），（b）蛋白质引发加上蛋白质加强（同质），（c）DNA引发加上蛋白质加强（异质），以及pVAX加上明矾的对照。每组各包括10只动物。将所有动物用50μl体积中的密码子优化的DNA（100μg）或用50μl体积中的重组蛋白（150μg）加上明矾进行皮下免疫。对照组接受100μg pVAX1空载体或50μl明矾。以频繁的时间间隔收集血样，分离血清并储存在-80℃。用于免疫小鼠和沙鼠的方案如下所述。将动物预先取血并在第0天给予第一个剂量。在第14天施用第二个剂量，随后取血。分别在第28和42天施用第三和第四个剂量，并随后对动物取血。在第56天对小鼠进行激惹并在第58天测定保护作用。在第60天对沙鼠进行激惹并在第155天测定保护作用。

小鼠中的保护研究。在小鼠中，通过将微孔室中的20只活的感染性马来丝虫（B.malayi）L3手术植入到腹膜腔中，进行激惹研究（Veerapathran等，（2009）同上；Abraham等，（1988）同上）。遵从无菌条件进行手术程序。在植入后48小时，从腹膜腔回收微孔室并在光学显微镜下确定幼虫的存活率。保护百分率被表示成死寄生虫的数量÷回收的总寄生虫数量x100。

脾细胞增殖和细胞因子测定法。从每只小鼠制备脾细胞的单细胞悬液（悬浮在200μl培养基中的0.5x10⁶个细胞/孔），并将其一式三份培养在含有（1）1μg/ml rBmVAL-1、（2）1μg/ml rBmALT-2、（3）1μg/ml rBmVAL-1+BmALT-2、（4）非特异性重组蛋白（1μg/ml曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）G结合蛋白）的孔中，或（5）留置在培养基中不进行刺激。将所有细胞在37℃和5%CO₂下温育3天。3天后，向每个孔加入³H-胸腺嘧啶（每孔0.5lCi，Amersham Biosciences）并进一步温育。16小时后收获细胞，在液体闪烁计数器中测量³H-胸腺嘧啶摄入率，并将其表示成刺激指数（SI）=（刺激的培养物的每分钟计数/未刺激的培养物的每分钟计数）。使用购自eBioscience Inc.（SanDiego,CA）的ELISA试剂盒测定从脾培养物收集的细胞培养上清液中的IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10。

免疫后小鼠血清中的BmVAL-1和BmALT-2特异性IgG抗体。使用ELISA测定免疫后小鼠血清中抗BmVAL-1和抗BmALT-2特异性抗体的滴度（Veerapathran等，（2009）同上；Gnanasekar等，（2004）Infect.Immun.72:4707-15）。免疫前的血清用作对照。使用HRP偶联的山羊抗小鼠IgG抗体作为用于小鼠测定法的第二抗体（Thermo FisherScientific）。使用OPD（Sigma）作为底物并测量405nm处的光密度（OD）。

使用购自于Thermo Fisher Scientific的小鼠抗体同种型分型试剂盒，测定小鼠血清中的抗BmVAL-1和抗BmALT-2特异性IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4抗体。所有ELISA都按照制造商的推荐进行，并在405nm处读取吸光度。使用相应的HRP标记的山羊抗IgG同种型抗体作为第二抗体，并使用OPD底物进行显色。

沙鼠中的激惹研究。将沙鼠用100个马来丝虫（B.malayi）L3激惹，并在激惹后第95天按照已建立的方法测定虫建立（Weil等，（1992）同上）。沙鼠是马来丝虫（B.malayi）的许可宿主，该虫在约75天内成熟成成年雄性和雌性。对照组沙鼠中成熟虫的存在，通过在激惹后第80天在它们的血液中显示出微丝蚴而得以证实。使用下式来计算虫建立的降低百分数：从对照动物回收的虫的平均数-从疫苗接种的动物回收的虫的平均数/从对照动物回收的虫的平均数x100。

统计分析。使用SIGMASTAT程序（Jandel Scientific,San Rafel,California）和STATVIEW（SAS Institute,Cary,NC）软件进行统计分析。使用Wilcoxon符号秩检验来比较成对数据；使用Mann-Whitney U检验来进行组间比较。p<0.05的p值被认为是统计学显著的。

EN个体携带有高滴度的针对BmVAL-1和BmALT-2的抗体。与MF对象（p<0.01）和CP对象（p<0.005）相比，在EN对象的血清中存在显著的抗BmVAL-1和抗BmALT-2IgG抗体。NEN对象不携带针对任一种抗原的IgG抗体。EN对象的血清中IgG同种型抗体的后续分析显示，抗BmVAL-1和抗BmALT-2抗体主要是IgG1和IgG3同种型抗体。

免疫后小鼠血清中的高滴度抗体应答。已显示，用马来丝虫（B.malayi）抗原疫苗接种的小鼠引发显著的宿主保护性IgG抗体。因此，测定了免疫后小鼠血清中的IgG抗体滴度。使用BmVal-1的单价免疫和使用BmAlt-2的单价免疫两者，都在小鼠血清中引发显著的（p<0.005）抗BmVAL-1和抗BmALT-2IgG抗体滴度。与对照相比，引发-加强免疫组给出了最大的抗体滴度，其后是蛋白质免疫组和DNA免疫组。用多价疫苗制剂（BmVAL-1+BmALT-2）免疫也引发显著的针对rBmVAL-1和rBmALT-2两者的IgG抗体滴度，并且滴度是相当的，表明抗原不相互干扰或竞争优势地位。一个有趣的发现是与任一单价疫苗相比，多价疫苗在小鼠中引发显著更高（p<0.001）的IgG抗体滴度。这些发现表明，多价制剂中的两种抗原协同性增加疫苗诱导的抗体应答。

总的来说，与DNA疫苗相比，蛋白质疫苗接种引发更高的IgG抗体滴度，表明蛋白质疫苗接种是高免疫原性的。另一个观察结果是与同质引发-加强方法相比，异质引发-加强方法提供更高的血清转化。因此总体来说，异质引发-加强方法似乎刺激最高的抗体滴度。

IgG抗体亚型分析显示，BmVAL-1疫苗接种主要引发IgG1和IgG2a同种型的抗体，而BmALT-2疫苗接种诱导IgG1、IgG2a和IgG3同种型的抗原特异性抗体应答。抗原特异性IgG4抗体应答不明显。引发-加强方法显著放大了IgG同种型应答。在多价疫苗接种方案后，小鼠血清中存在IgG1、IgG2a和IgG3亚型的抗原特异性抗体。

小鼠脾脏中的抗原特异性应答。与培养基对照（SI2.1±0.9）相比，用rBmVAL-1或rBmALT-2刺激的来自于免疫后小鼠的脾细胞显著增殖（分别为SI10.8±1.1和SI14.6±1.2）。来自于用多价构建物免疫的小鼠的脾细胞对rBmVAL-1（SI18.9±2.6）和rBmALT-2（SI23.5±3.1）两者有响应，表明在用多价构建物疫苗接种后，产生了针对BmVAL-1和BmALT-2两者的强的记忆性细胞应答。

增殖的培养上清液的细胞因子分析。为了鉴定抗原应答性细胞的细胞因子情况，收集用相应抗原（rBmVAL-1或rBmALT-2）刺激的小鼠脾细胞的培养上清液，并测量IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10的水平。这些结果显示，脾细胞对rBmVAL-1做出响应分泌显著水平的IL-5和IFN-γ。用rBmALT-2刺激的脾细胞主要分泌IL-4和IL-5。

多价疫苗在小鼠和沙鼠中诱导显著保护。本文的结果表明在用单价和多价疫苗制备物疫苗接种后，引发了显著的IgG抗体。为了测试在疫苗接种后引发的免疫应答是否具有保护性，将疫苗接种的动物用活的第三阶段感染性的马来丝虫（B.malayi）幼虫（L3）进行激惹。由于寄生虫在小鼠中不达到成熟，因此使用标准的微孔室激惹方法（Gnanasekar等，（2004）同上）。这些研究显示，在用单价疫苗免疫后，在小鼠中获得了39%至74%的保护（表9）。

表9

显著性，与对照相比*p<0.01，**p<0.05。

与DNA疫苗接种相比，蛋白质疫苗接种提供了更好的结果。引发-加强方案给出总体上最好的结果。与BmVAL-1相比，用BmALT-2疫苗接种给出更高的保护百分率。类似地，与单价疫苗接种方案相比，多价疫苗接种方案给出了57%至82%的保护。这些发现表明，BmVAL-1和BmALT-2当作为多价疫苗给予时，在疫苗接种的动物中协同性增强保护性免疫应答。

从激惹后第80天的对照组沙鼠制备的厚血涂片的分析显示，所有5只沙鼠都是微丝蚴阳性的，然而，在免疫后沙鼠的外周血中没有检测到微丝蚴。15天后，将动物处死，并对腹膜腔、骨腔和胸膜腔中的雄性和雌性虫进行计数，并比较对照和疫苗接种组之间的结果（表10）。来自于沙鼠的疫苗接种的发现也证实多价引发-加强方案提供最高的保护率。从多价疫苗接种的动物没有回收到雌性虫。

表10

显著性，与对照相比p<0.01。

实施例4：WbHSP+WbALT-2+WbTSP多价疫苗

寄生虫。马来丝虫（Brugia malayi）L3从乔治亚州Athens的佐治亚大学（University of Georgia,Athens,GA.）的NIAID/NIH丝虫病研究试剂资源中心（Filariasis Research Reagent Resource Center（FR3））获得。

pVAX Wbhsp+Wbalt2+Wbtsp DNA疫苗的构建。使用含有BamHI限制性位点的正向引物5′-CGC GGA TCC ACC GTG ATC CAT TGTCG-3′（SEQ ID NO：25）和含有PstI限制性位点并且不含终止密码子的反向引物5′-AAC TGC AGC TGT TTT CCA TTT CCA TTC-3′（SEQID NO：26）扩增编码Bmhsp的密码子优化的DNA序列，并将其克隆在pVAX载体中。得到的质粒被命名为pVAX Wbhsp*。使用正向引物5′-AAC TGC AGA TGG GTA ACA AGC TCC TCA TCG-3′（SEQ IDNO：27）和不含终止密码子的反向引物5′-CGC GAA TTC GGC GCACTG CCA ACC TGC-3′（SEQ ID NO：28）扩增密码子优化的Wbalt-2基因。带下划线的序列分别表示正向和反向引物中的PstI和EcoRI限制性位点。然后将扩增的Wbalt-2DNA插入序列亚克隆到pVAXWbhsp*质粒中的PstI和EcoRI限制性位点处，得到pVAXWbhsp+Wbalt-2*质粒。为了克隆pVAXWbhsp+Wbalt-2+Wbtsp质粒最终产物，用含有EcoRI限制性位点的正向引物5′-CGC GAA TTC ACCATG GTC CTG GAG-3′（SEQ ID NO：29）和含有XbaI限制性位点并带有终止密码子的反向引物5′-GCT CTA GAT CAG TCC TTC TGGCTA G-3′（SEQ ID NO：30）扩增编码单独的Wbtsp ECL结构域的基因序列，并将其克隆到pVAX Wbhsp+Wbalt-2*质粒中。也使用相应的引物构建HSP+TSP、TSP+ALT和HSP+ALT的二价构建物。

多价融合蛋白pRSETA Wbhsp+Wbalt2+Wbtsp的构建。以与上述相同的方式构建pRSETA WbHSP+WbALT-2+WbTSP。HSP、ALT-2和TSP的引物序列如下。WbHSP，含有BamHI的正向引物5′-CGG GAT CCA TGG AAG AAA AGG TAG TG-3′（SEQ ID NO：31），含有XhoI的反向引物5′-CCC TCG AGT GCT TTC TTT TTG GCA GC-3′（SEQ IDNO：32）。WbALT-2，含有XhoI的正向引物5′-CCC TCG AG A TGAATA AAC TTT TAA TAG CAT-3′（SEQ ID NO：33），含有KpnI的反向引物5′-GGG TAC CCG CGC ATT GCC AAC CC-3′（SEQ ID NO：34）。WbTSP，含有KpnI的正向引物5′-GGG GTA CCC CGG CAA GGATCA ATT TAA AA-3′（SEQ ID NO：35），含有EcoRI的反向引物5′-CGG AAT TCT CAA TCT TTT TGA GAT GAA T-3′（SEQ ID NO：36）。类似地，也将二价构建物（HA、HT和TA）单独克隆在pRSETA载体中。

动物的免疫。对6周龄Balb/C小鼠使用作为DNA疫苗的100μgDNA进行皮内（i.d.）免疫，或使用作为蛋白质疫苗的15μg重组蛋白进行皮下（s.c.）免疫，或使用作为引发-加强疫苗的两个剂量的DNA和两个剂量的蛋白质进行免疫。将小鼠随机分为15组，每组5只小鼠。对1-3组的动物用HSP+ALT-2（HA）免疫。对4-6组用HSP+TSP（HT）进行免疫，对7-9组用TSP+ALT-2（TA）进行免疫。对10-12组的小鼠用多价疫苗HSP+ALT-2+TSP（HAT）进行免疫。对照组动物接受pVAX载体和/或明矾（传染病研究所（Infectious Disease ResearchInstitute）（IDRI））。对于所有组，该实验重复两次。

免疫后动物中的抗体应答分析。使用间接ELISA（Anandharaman等，（2009）同上），测定免疫后动物和对照组动物的血清中针对所有3种蛋白质的IgG抗体水平。简单来说，将96孔微量滴定板的孔用pH9.6的碳酸盐缓冲液中的重组蛋白（rHSP、rALT-2或rTSP；1μg/ml）在4℃下包被过夜，并用3%BSA在37℃下封闭1小时。向孔加入血清样品，并将板在4℃温育过夜。在洗涤后，加入HRP标记的小鼠抗人类IgG抗体（1:5000），并在37℃下进一步温育1小时。使用OPD（邻苯二胺）底物（Sigma Aldrich,USA）显色。在酶标仪（BIO-RAD,Hercules,CA）中测量450nm处的吸光度。

还使用免疫后小鼠的血清进行了免疫印迹分析。使用来自于用重组蛋白（rHAT、rALT2、rTSP或rWbHAT）免疫的小鼠的血清样品进行免疫印迹研究。使用二氨基联苯胺（DAB）底物对印迹进行显色。

ADCC测定法。为了评估抗原组合的保护功效，使用来自于用二价和三价疫苗构建物免疫的小鼠的血清进行体外ADCC。按照已知方法进行体外ADCC测定法（Chandrasekhar等，（1990）同上）。简单来说，通过用无菌RPMI1640培养基洗涤腹膜腔，从正常Balb/c小鼠收集腹膜渗出液细胞（PEC）。将细胞洗涤并悬浮在增补有10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养基中。向96孔培养板（Thermo FisherScientifics,USA.）中的2x10⁵个腹膜渗出液细胞（PEC）/孔加入10个马来丝虫（B.malayi）L₃，一式三份向孔加入50μl免疫后小鼠的血清和50μl RPMI1640培养基，并在5%CO₂和37℃下温育48小时。在温育48小时后，在显微镜下确定幼虫的存活率。透明、损坏和附着有细胞团块的幼虫被计数为死亡。ADCC被估算为使用下式计算的幼虫死亡百分数：死亡幼虫数量÷幼虫总数x100。

从血清样品贫化IgG抗体。使用偶联有带his标签的重组抗原的钴IMAC树脂，从用多价疫苗免疫的小鼠的血清中贫化重组抗原特异性IgG抗体（Anandharaman等，（2009）同上）。简单来说，将1mg带有his标签的重组蛋白（rHSP）与2ml床体积的IMAC树脂在37℃下偶联2小时。将钴柱用10倍床体积的PBS（pH.8）洗涤，并与200μl来自于用多价疫苗免疫的小鼠的合并血清在4℃下温育过夜。通过离心收集含有贫化的血清的上清液。将抗HSP抗体贫化的血清在rALT-2偶联的柱中在4℃下温育过夜。收集含有抗HSP和抗ALT-2抗体贫化的血清的上清液，并在rTSP偶联的柱中温育。收集并使用抗HSP、抗ALT-2和抗TSP抗体贫化的血清。通过如上所述的ELISA证实针对特异性抗原的IgG抗体的贫化。然后，抗体贫化的血清被用在ADCC测定法中。

免疫后小鼠中针对L3幼虫的原位细胞毒性分析（微孔室技术）。使用微孔室方法（Abraham等，（1989）同上），通过用感染性L3激惹免疫后动物来分析疫苗接种的保护性功效。使用14x2mm PLEXI环和5.0μm核孔聚碳酸酯膜（Millipore Corporations,Bedford,MA）组装微孔室。在植入48小时后，将动物处死并从腹膜腔回收微孔室。将每个微孔室的内含物通过显微镜检查细胞附着和感染性L3的死亡。如果寄生虫不运动并且透明，且在表面上具有数个粘附细胞，它被认为是死的。使用下式计算保护百分率：死寄生虫的数量÷回收的寄生虫的数量x100。将该实验重复两次，其中每组5只动物。

脾细胞增殖。在第60天将疫苗接种后小鼠和对照小鼠处死，并在无菌条件下取出脾脏。在增补有10%热灭活的FCS的RPMI1640培养基中制备单细胞悬液，并使其穿过NYLON筛（BD Biosciences,Bedford,USA）。在使用台盼蓝染料排出法确定细胞的存活率后，一式三份将约2x10⁶个细胞/孔铺于96孔培养板（ThermoFisher,USA）中。在37℃和5%CO₂气氛下，用1μg/100μl/孔的重组蛋白（rHSP、rALT-2或rTSP）或ConA或用单独的培养基（未刺激）刺激脾细胞72小时。使用购自于Dojindo Molecular Technologies,Inc.（Gaithersburg,MD）的细胞计数试剂盒（CCK-8）测定细胞增殖。使用下式计算脾细胞增殖的刺激指数：刺激后细胞的吸光度÷未刺激细胞的吸光度。所有培养进行一式三份，结果表示成平均S.I.±SEM。

实时PCR（RT-PCR）。通过实时PCR分析脾细胞沉淀物的mRNA中的细胞因子水平。将疫苗接种后小鼠和对照组小鼠的脾细胞，如上所述以2x10⁶个细胞/100μl/孔的浓度在96孔板中进行培养，并用重组抗原（1μg/ml）进行刺激。在72小时后，将细胞离心（1000rpm5分钟），并使用TRIZOL试剂（Invitrogen）按照制造商的描述从细胞沉淀物提取总RNA。在提取RNA后，通过RT2第一链试剂盒（SuperArrayBioscience Corporation,Frederick,MD）合成第一链cDNA。使用RT2Real-Time TM SYBR Green PCR Master混合物，按照制造商的操作规程进行PCR阵列分析。向96孔板加入该混合物的等分试样，其中每个孔含有预先分配的基因特异性引物组。在Applied BioSystem7300实时PCR机（Applied BioSystems,Foster City,CA）中测量表达的目标基因的相对定量。循环参数如下：95℃10分钟进行HOTSTART DNA聚合酶的活化，然后进行40个循环的95℃变性15秒和60℃引物延伸1分钟。产生RT-PCR数据阵列集并使用SABiosciences基于网络的数据分析系统进行分析。结果根据用管家基因的表达归一化后免疫后小鼠与对照小鼠相比的倍数变化来表示。

细胞因子测定法。在用重组抗原（1μg/ml）或用单独的培养基刺激温育72小时后，收集脾细胞培养上清液。使用购自于ThermoScientifics,USA的夹心ELISA试剂盒测定培养上清液中分泌的细胞因子IL-4和IFN-γ的水平。所有浓度从标准曲线推导出，并且数据以pg/ml为单位表示。

cHAT质粒的构建和融合蛋白的表达。由于HSP的N-端区域参与IL-10结合，因此将该区域缺失，并将cHAT重组蛋白制备为37KDa的带有His标签的蛋白。

重组质粒的构建和融合蛋白的表达。以预期的尺寸（850bp）构建了马来丝虫（B.malayi）L3阶段的全长hsp、alt-2和tsp基因。使用指定的限制性酶切割位点将这些片段进一步定向克隆在表达载体pVAX1和pRSETA中。DNA序列分析的结果证实了基因插入方向。rWbHAT被表达为45KDa的带有His标签的融合蛋白，将其纯化并在SDS-PAGE中进行分析。结果表明融合蛋白是纯的，没有任何污染的蛋白。通过免疫印迹分析证实了针对所有3种抗原的抗体的存在。

免疫后小鼠血清中的抗体滴度。与DNA组相比，来自于用引发-加强或蛋白质疫苗免疫的小鼠的血清样品的平均峰值抗体滴度显著更高（p<0.001）。从rWbHAT免疫的动物收集的血清显示出针对rALT-2抗原的最大滴度30,000，而针对rHSP或rTSP抗原的抗体滴度在18,000-20,000的范围内。类似地，用二价疫苗免疫的小鼠显示出针对ALT-2抗原的最大滴度30,000，而抗HSP和抗TSP抗体在8,000-15,000的范围内。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。在将马来丝虫（B.malayi）L3幼虫与血清和正常免疫细胞温育48小时后，观察免疫细胞对寄生虫的抗体介导的粘附和细胞毒性。在用rWbHAT或rWbHA疫苗构建物免疫的小鼠血清中，ADCC显示出约90%（p<0.001）的最大细胞毒性（表11）。rWbHT和rWbTA的二价疫苗构建物也分别给出82%和87%的较好保护，其与单价疫苗接种动物和对照动物相比是显著的（p<0.001）。为了评估由产生的针对HSP、ALT和TSP抗原的抗体介导的保护作用，将IgG抗体从免疫后血清中贫化并将其用于ADCC。贫化的抗体仅显示出6%的针对L3的保护。

表11

值表示三个孔的平均值±SD。*与其他小鼠组相比显著的幼虫死亡（P<0.001）。

原位保护研究。在最后一次免疫后2周，通过原位微孔室研究评估疫苗候选物在免疫后动物中杀死丝虫寄生虫的能力。合并来自于两次类似实验的数据，并将其表示为平均计数±SEM。与对照相比虫负荷降低百分数的分析显示，对于蛋白质和引发-加强疫苗来说，多价疫苗（HAT）提供了100%和94%的最大保护，这与对照组（5%）相比是非常显著的保护（表12）（P<0.0001）。有趣的是，二价疫苗HA、TA和HT的虫降低百分数分别为90%、80%和82%，这与对照相比也是显著高的。在整个二价疫苗组中，与DNA和蛋白质疫苗接种相比，引发-加强疫苗接种更具保护性。

表12

值是平均值±SD。N=5。数据来自于显示出可比结果的两个类似实验中的一个。*与其他小鼠组相比显著的幼虫死亡（P<0.001）。

脾细胞增殖。将从疫苗接种后动物和对照动物分离的脾细胞，在体外单独地用rHSP、rALT-2或rTSP进行刺激，以分析疫苗接种后动物中的蛋白质特异性T-细胞增殖。以所有疫苗组合和作为蛋白质疫苗的HAT，使用引发-加强方案免疫的小鼠给出最高的保护作用。因此，仅从这些动物收集脾细胞并分析免疫应答。当与单价和未刺激的对照相比时，用相应的重组蛋白刺激的来自于二价和三价疫苗接种后动物的脾细胞显示出显著高（P<0.001）的增殖（平均S.I.=4.25–5.8）。用单价构建物免疫的脾细胞的增殖指数显示出显著增殖。细胞的刺激与阳性对照相当。

RT-PCR阵列。为了确定疫苗接种后小鼠中针对多价构建物的细胞免疫应答，将从疫苗接种后小鼠和对照小鼠收集的脾细胞在相应的重组蛋白存在下进行培养，并评估它们的增殖性响应和细胞因子情况。由于来自于疫苗接种后动物的脾细胞显著增殖以记忆起应答，因此测量了细胞因子mRNA的水平。对从重组蛋白刺激的脾细胞收集的mRNA进行RT-PCR细胞因子基因阵列分析。这些结果显示，在疫苗接种后动物中Th1（IFN-γ，IL-2）和Th2（IL-4）两种细胞因子基因显著增加。

细胞因子水平。在从疫苗接种后的脾细胞分离的mRNA中鉴定到存在IFN-γ和IL-4细胞因子表达之后，调查了这些细胞因子在上清液中的分泌。用未刺激的对照对数据进行归一化。有趣的是，在上清液中观察到的细胞因子情况表现出显著更高的IFN-γ水平，显示出偏向Th1的免疫应答。这些结果证实，重组蛋白刺激IFN-γ的生产并诱导Th1介导的保护性应答。

实施例5：在各种佐剂制剂中的cHAT疫苗的分析

cHAT的制备。以前的研究显示，BmHSP12.6的N-端序列能够结合于人类IL-10受体并引发IL-10介导的应答（Gnanasekar等，（2008）Mol.Biochem.Parasitol.159（2）:98–103）。由于IL-10是免疫抑制剂，因此将IL-10受体结合序列从HSP中缺失。该截短的序列被称为cHSP。然后将cHSP用于替换多价HAT杂合疫苗中的HSP基因和HSP蛋白。因此，得到的新疫苗被称为cHAT。

在小鼠中使用cHAT融合蛋白疫苗的保护研究。用4个剂量的cHAT融合蛋白以2周的时间间隔免疫小鼠。在最后一次免疫后1个月，通过原位微孔室研究来评估疫苗候选物杀死丝虫寄生虫的能力。结果显示，与只接受磷酸盐缓冲盐水（PBS）和明矾的对照组（2%）相比，当使用明矾作为佐剂的cHAT融合蛋白免疫小鼠时疫苗提供81%的保护（表13）（P<0.0001）。然后测试了不同佐剂以观察改变佐剂是否提高cHAT的保护能力。测试了两种其他佐剂：含有TLR4激动剂的明矾（购自于Infectious Disease Research Institute,Seattle,Washington）和ALHYDROGEL（购自于Sigma,St.Louis,MO）。不含佐剂的cHAT仍然作为对照。这些研究的结果（表13）显示，使用明矾加上TLR4激动剂时获得78%保护，而在ALHYDROGEL佐剂中给予的cHAT提供70%的保护。在这些研究中的一项有趣发现是不含任何佐剂的cHAT也提供72%的保护，表明cHAT融合蛋白疫苗可以不使用任何佐剂而被施用并仍获得显著的保护。

表13

组	幼虫死亡%（平均值±SD）
		cHAT+明矾	81±7.8
PBS+明矾，对照	1.7±1.3
		cHAT+明矾和TLR4激动剂	78±8.4
cHAT+ALHYDROGEL	70±13
		cHAT，不含佐剂	72±12

值是平均值±SD。N=5。数据来自于显示出可比结果的两个类似实验中的一个。*与其他小鼠组相比显著的幼虫死亡（P<0.001）。

实施例6：HSP、ALT-2和TSP的同源物

疫苗抗原HSP、ALT-2和四旋蛋白的同源物存在于旋盘尾丝虫（O.volvulus）和罗阿丝虫（L.loa）中。来自于旋盘尾丝虫（O.volvulus）和罗阿丝虫（L.loa）的HSP、ALT-2和四旋蛋白的核苷酸序列的比较显示，在来自于所有丝虫寄生虫的蛋白之间存在显著的序列同源性（>90%）。这些发现表明，在实施例5中开发的cHAT融合蛋白疫苗可用作对抗旋盘尾丝虫（O.volvulus）和罗阿丝虫（L.loa）的疫苗。

例如，从旋盘尾丝虫（O.volvulus）L3cDNA文库克隆旋盘尾丝虫（O.volvulus）四旋蛋白，并制备重组蛋白。在将重组旋盘尾丝虫（O.volvulus）四旋蛋白在12%SDS-PAGE凝胶中分离之后，使用来自于用表13中提供81%保护的cHAT疫苗进行疫苗接种的小鼠的血清样品来探测所述蛋白。马来丝虫（B.malayi）四旋蛋白被用作阳性对照。结果显示，血清样品与旋盘尾丝虫（O.volvulus）四旋蛋白显著反应（图4），由此表明在实施例5中开发的cHAT疫苗可用作对抗旋盘尾丝虫（O.volvulus）的疫苗。

Claims (13)

1.融合蛋白，其包含三种来自于一种或多种丝状线虫的分离的抗原，其中所述抗原中的一种是小热休克蛋白（HSP）12.6或其片段，一种是幼虫高丰度转录本（ALT-2）或其片段，还有一种是四旋蛋白或其片段，

其中所述片段分别选自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64。

2.权利要求1的融合蛋白，其中所述幼虫高丰度转录本（ALT-2）的N端氨基酸序列是MGNKLLI。

3.权利要求1的融合蛋白，其中所述丝状线虫选自马来丝虫（Brugia malayi）、班氏吴策线虫（Wuchereria Bancroft）、旋盘尾丝虫（Onchocerca volvulus）、罗阿丝虫（Loa loa）和帝汶布鲁丝虫（Brugia timori）。

4.权利要求1至3任一项的融合蛋白，其中所述抗原被共价连接。

5.重组载体，其包含三种来自于一种或多种丝状线虫的分离的基于DNA的抗原，其中所述抗原中的一种编码小热休克蛋白（HSP）12.6或其片段，一种编码幼虫高丰度转录本（ALT-2）或其片段，还有一种编码四旋蛋白或其片段，

其中所述片段分别选自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64。

6.权利要求5的重组载体，其中所述幼虫高丰度转录本（ALT-2）的N端氨基酸序列是MGNKLLI。

7.权利要求5的重组载体，其中所述抗原选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69。

8.表达载体，其包含三种来自于一种或多种丝状线虫的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码基于蛋白质的抗原，以及其中所述抗原中的一种是小热休克蛋白（HSP）12.6或其片段，一种是幼虫高丰度转录本（ALT-2）或其片段，还有一种是四旋蛋白或其片段，

其中所述片段分别选自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64。

9.权利要求8的表达载体，其中所述幼虫高丰度转录本（ALT-2）的N端氨基酸序列是MGNKLLI。

10.权利要求8的表达载体，其中所述抗原选自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：63和SEQ IDNO：64。

11.重组宿主细胞，其包含权利要求5至7任一项的重组载体。

12.重组宿主细胞，其包含权利要求8至10任一项的表达载体。

13.权利要求1的融合蛋白在制备用于免疫动物以抵抗丝虫病的药物中的应用。