CN103285407A - 聚酰胺-胺型树枝状大分子包载miR-21基因抑制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为聚酰胺-胺型树枝状大分子包载miR-21基因抑制剂的制备方法；PAMAM用TE缓冲液（10mmol/L,pH8.0Tris-HCl）稀释至20mg/L浓度，as-miR-21（20μmol/L）1mmol/L乙二胺四乙酸稀释至50nM。根据预先设计好的N/P比将50nM的as-miR-21与20mg/L的PAMAM在TE缓冲液体系中混合。室温孵育20min后得到两者的复合物。当N/P为16:1-64:1时，as-miR-21能与PAMAM完全结合，形成稳定复合物，且粒径均匀的PAMAM包载miR-21抑制剂应用于恶性脑胶质瘤的临床体内外研究，成为治疗胶质瘤细胞的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及纳米基因载体领域，将基因治疗与先进纳米材料技术相结合，以聚酰胺-胺型树状大分子PAMAM为载体，实现基因miR-21反义寡核苷酸(As-miR-21)的包载，应用于恶性脑胶质瘤的临床治疗体内外研究。
背景技术
基因治疗是当前研究的热点，采用基因治疗方法可显著提高肿瘤细胞的抑制率。基因治疗用于肿瘤抑制的前提是高效的基因转染，因此，基因载体的选择成为基因治疗的关键因素。目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体（viral vector）和非病毒载体（non-viral vector）两种。病毒载体转染效率高且对大多数细胞都有靶向作用，已被广泛而有效地得到了应用。然而由于人体自身具有抗病毒的免疫系统，使用病毒载体作为媒介传递基因时就不得不面对宿主的免疫反应；病毒载体含有可转录的病毒基因，可能随机整合于宿主基因组中而对人体造成伤害；此外，病毒载体目的基因容量小、制备复杂及费用较高等都限制了其应用。因此非病毒载体的研究愈来愈受到人们的重视。
RNA干涉(RNA interference,RNAi)是近几年发展的新技术。MicroRNA即微小RNA(microRNA；miRNA)是指长度约18～25nt的小型非编码RNA家族，这些miRNA能够识别特定的目标mRNA,并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的过程。这些miRNA的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化、信号转导、疾病和死亡的过程。miRNA可在无脊椎动物的发育、神经分化、细胞增殖、凋亡和脂肪代谢过程中发挥调节作用。已有研究发现miR-21在胶质母细胞瘤标本和肿瘤细胞系中均出现过表达，而miR-21的反义寡聚核苷酸（Antisense Oligonucleotide，ASON）能在体外明显抑制A172、U87、LN229和LN308的生长并诱导细胞出现凋亡。Ambion研究报告显示，miR-21在脑组织中表达水平很低或者缺，组织芯片原位杂交结果表明6例正常脑组织miR-21表达均为阴性。到目前为止，包载miRNA高效低毒载体以及载体与基因的最佳复合比仍在探索之中。
因此本发明选用星型树枝状PAMAM纳米级高分子材料，以其高转染率、低毒性、纳米级尺寸的优势，应用到生物治疗中。同时，由于miR-21在胶质瘤细胞的高表达及抗凋亡的生物学功能，我们设计采用树形大分子载体PAMAM包载miR-21抑制剂基因治疗抗肿瘤治疗方案，利用PAMAM载体的安全性和有效性能将基因miR-21抑制剂输送至细胞中，提高转染效率，降低细胞毒性。本发明方法简单，适用性广，在基因治疗和基因免疫中显示出非常好的应用前景。发明中，我们选用G5-PAMAM树形大分子包载miR-21抑制剂（As-miR-21）进行基因治疗，通过基础生物学研究手段，实现PAMAM与As-miR-21的有效包覆，为肿瘤研究、治疗及基因治疗提供了新的思路。
发明内容
本发明针对微小RNA即miR-21在胶质瘤细胞的高表达及抗凋亡的生物学功能，设计用纳米级聚酰胺-胺型树枝状大分子载体包载基因抑制剂(As-miR-21)，我们选择用PAMAM树形大分子，通过探索载体与基因不同配比（N/P），最终确定了最优方案，成功制备出符合转染条件且性能稳定，粒径均匀的聚酰胺-胺型基因载体复合物，为基因疗法抗肿瘤研究提供了广阔的应用前景。
本发明的技术方案如下：
聚酰胺-胺型树枝状大分子PAMAM包载miR-21基因抑制剂的制备方法，其步骤如下：
1）PAMAM用含10mmol/L，pH8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Hcl)及1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)的TE缓冲液稀释至20mg/L；
2）20μmol/L的as-miR-21，用10mmol/L，pH8.0Tris-Hcl及1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)的TE缓冲液稀释至50nM；
3）选用N/P比64：1-16:1将100pmol as-miR-21与PAMAM在TE缓冲液体系中混合；
4）室温孵育20-30min后得到两者的复合物；其中，N/P比是根据PAMAM中末端氨基正电荷与miR-21中磷酸根负电荷的比值来计算的。
所制备出的抑制剂粒径为80nm本发明采用纳米级聚合物分子聚酰胺-胺型树状大分子（PAMAM）为载体。包载抗肿瘤微小RNA抑制剂as-miR-21；由于载体表面含胺基，带正电，基因表面含磷酸根基团，带负电，靠静电吸附将二者有力结合起来。通过包载基因的最佳配比进行试验，以第五代载体PAMAM包载基因miR-21。最终实现了两者的有力包覆，制备出的基因载体复合物具有良好的稳定性，且粒径在80nm±2nm，呈球形。对细胞的毒性较小。能够通过血脑屏障，应用于恶性脑胶质瘤的临床体内外研究。
附图说明
图1PAMAM/as-miR-21复合物的凝胶电泳结合图像。
图2PAMAM和PAMAM/as-miR-21(N/P=16)复合物的透射电镜照片。
具体实施方式
本发明实施例中所用的原料均为市购产品，纯度为分析纯。
本发明不同N/P比的PAMAM/as-miR-21复合物的凝胶电泳结合图像采用北京六一厂普通电泳仪和美国kodak凝胶成像分析系统。
本发明制备的PAMAM和PAMAM/as-miR-21复合物的透射电镜照片，采用JEOL-100CXII透射电子显微镜。
本发明制备的PAMAM和PAMAM/as-miR-21复合物的zeta电位测试图采用BI-90Plus激光粒度仪/Zeta电位仪。
实施例1:
1）PAMAM用10mmol/L，pH8.0的Tris-HCl TE缓冲液稀释至20mg/L。
2）20μmol/L as-miR-21用1mmol/L乙二胺四乙酸稀释至50nmol/L。
3）根据预先设计好的N/P比64:1，由下述公式
将1.44ml PAMAM与2ml as-miR-21与PAMAM在TE缓冲液体系中混匀。
4）室温孵育20min后得到两者的复合物。
PAMAM-as-miR-21复合物制备好后，通过琼脂糖凝胶电泳来考察PAMAM与as-miR-21的复合情况。取0.1g琼脂糖于锥形瓶中，加入25mL0.5×TBE，加热至琼脂糖完全融化，取出待冷至60℃加入1μL溴化乙锭溶液，摇匀后缓缓倒入有机玻璃内槽，待胶凝固后，取出梳子和封端的透明胶，放在电泳槽内，加入电泳缓冲液使液面略高于胶面1mm。PAMAM与as-miR-21复合物室温孵育20min后，加入1/5体积的加样缓冲液（6×loading dye），短暂离心混合后上样至4%的琼脂糖凝胶，每个点样孔中加10μL复合物。开始电泳，电压80V，时间0.5h。最后经紫外光照射下进行凝胶成像。由图可知，通过带正电荷的PAMAM，带负电性的as-miR-21被有效包载，形成稳定载体复合物，不存在游离的基因。
取PAMAM/as-miR-21溶液适量，滴加至喷有碳膜的铜网之上，空气中干燥制备观测样品，透射电子显微镜下观察复合物形貌，并通过透射电镜尺寸计算标准测定复合物的粒径大小。
实施例2:
1)PAMAM用TE缓冲液10mmol/L,pH8.0Tris-HCl稀释至20mg/L。
2）20μmol/Las-miR-21用1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)）稀释至50nM。
4）根据预先设计好的N/P比32:1，由下述公式
将0.72ml PAMAM与2ml as-miR-21与PAMAM在TE缓冲液体系中混匀。
4）室温孵育20min后得到两者的复合物。
PAMAM-as-miR-21复合物制备好后，通过琼脂糖凝胶电泳来考察PAMAM与as-miR-21的复合情况。取0.1g琼脂糖于锥形瓶中，加入25mL0.5×TBE，加热至琼脂糖完全融化，取出待冷至60℃加入1μL溴化乙锭溶液，摇匀后缓缓倒入有机玻璃内槽，待胶凝固后，取出梳子和封端的透明胶，放在电泳槽内，加入电泳缓冲液使液面略高于胶面1mm。PAMAM与as-miR-21复合物室温孵育20min后，加入1/5体积的加样缓冲液（6×loading dye），短暂离心混合后上样至4%的琼脂糖凝胶，每个点样孔中加10μL复合物。开始电泳，电压80V，时间0.5h。最后经紫外光照射下进行凝胶成像。
取PAMAM/as-miR-21溶液适量，滴加至喷有碳膜的铜网之上，空气中干燥制备观测样品，透射电子显微镜下观察复合物形貌，并通过透射电镜尺寸计算标准测定复合物的粒径大小。
实施例3:
1）PAMAM用10mmol/L,pH为8.0的Tris-HCl TE缓冲液稀释至20mg/L。
2）20μmol/L as-miR-21用乙二胺四乙酸稀释至50nM。
5）根据预先设计好的N/P比16:1，由下述公式
将0.36ml PAMAM与2ml as-miR-21与PAMAM在TE缓冲液体系中混匀。
4）室温孵育20min后得到两者的复合物。
PAMAM-as-miR-21复合物制备好后，通过琼脂糖凝胶电泳来考察PAMAM与as-miR-21的复合情况。取0.1g琼脂糖于锥形瓶中，加入25mL0.5×TBE，加热至琼脂糖完全融化，取出待冷至60℃加入1μL溴化乙锭溶液，摇匀后缓缓倒入有机玻璃内槽，待胶凝固后，取出梳子和封端的透明胶，放在电泳槽内，加入电泳缓冲液使液面略高于胶面1mm。PAMAM与as-miR-21复合物室温孵育20min后，加入1/5体积的加样缓冲液（6×loading dye），短暂离心混合后上样至4%的琼脂糖凝胶，每个点样孔中加10μL复合物。开始电泳，电压80V，时间0.5h。最后经紫外光照射下进行凝胶成像。
取PAMAM/as-miR-21溶液适量，滴加至喷有碳膜的铜网之上，空气中干燥制备观测样品，透射电子显微镜下观察复合物形貌，并通过透射电镜尺寸计算标准测定复合物的粒径大小。
从琼脂糖凝胶电泳图中可以看出，电荷比为16:1时，复合物停留在上样孔处。随着PAMAM比例的不断增加，as-miR-21的负电荷被中和，保留在点样孔内不再向正极迁移。因此，当电荷比大于16:1时，复合物向负极移动PAMAM能与RNA抑制剂在电荷比(N/P)大于16:1时完全结合形成稳定的复合物。
由透射电镜图可知，PAMAM为密实的实心球体，粒子分布均匀，粒径大小经过透射电镜标准尺寸测量后得出其值在80nm±2nm；粒子分布均匀，照片衬度很高，粒子呈密实的小球状；
由上述电泳结合实验和透射电镜结果综合评判，本发明所制得的聚酰胺-胺型树枝状大分子PAMAM包载基因抑制剂as-miR-21后，粒径分布均匀，80nm±2nm，表面带正电荷，形成稳定复合物，能够较好的应用于恶性脑胶质瘤临床治疗的体内外研究。
Claims (2)
1.聚酰胺-胺型树枝状大分子包载miR-21基因抑制剂的制备方法，其特征是步骤如下：
1）PAMAM用含10mmol/L，pH8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Hcl)及1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)的TE缓冲液稀释至20mg/L；
2）20μmol/L的as-miR-21，用10mmol/L，pH8.0Tris-Hcl及1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)的TE缓冲液稀释至50nM；
3）选用N/P比64：1-16:1将100pmol as-miR-21与PAMAM在TE缓冲液体系中混合；
4）室温孵育20-30min后得到两者的复合物；其中，N/P比是根据PAMAM中末端氨基正电荷与miR-21中磷酸根负电荷的比值来计算的：
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所制备出的抑制剂粒径为80nm±2nm，粒径分布均匀，表面呈正电性。
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