CN103282091A

CN103282091A - 姚虻纤维蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和应用

Info

Publication number: CN103282091A
Application number: CN2010800301210A
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 马东莹
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2010-06-14
Publication date: 2013-09-04
Also published as: CN101608176A; WO2011000263A1; US20120183525A1; EP2450440A4; EP2450440A1

Abstract

本发明涉及一种姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin及其基因和应用，属于生物医学领域。本发明的姚虻唾液腺蛋白酶分子量27145.5道尔顿。其全序列由255个氨基酸组成，其编码序列由768个核苷酸组成。本发明的姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin具有显著的水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的作用，能作为制备治疗血栓性疾病药物的应用。

Description

姚虻纤维蛋白原水解酶 tabfiblysin及其基因和应用

技术领域

本发明提供一种姚虻纤维蛋白原水解酶 tabfiblysin及其基因和应用，属于生物医学技术领域。背景技术

血栓性疾病是一类严重影响人类健康的疾病，尤其是心脑血管血栓栓塞性疾病，已成为我国人口死亡的首要原因。及时给予抗栓药物，可大大提高病人的存活率，减轻脏器损害的程度和范围。抗栓药物主要包括溶栓药、抗凝药和抗血小板药。现有的抗凝药和抗血小板药存在着出血、血小板减少及停药后反弹等副作用。因此，人们正在积极寻找着各种生物来源的高效、特异、低毒的新型抗栓药物。

虻科昆虫俗称牛虻（horsefly), 隶属于节肢动物门双翅目短角亚目虻科，是重要的医学和兽医学昆虫。其成虫是一种中药材，俗称虻虫，具有活血化瘀，破积痛经的功效。其药用历史悠久，能为开发现代新药提供靶标和启示。与此同时，传统中药药物成分的复杂性及其炮制方法的局限性造成药物活性成分不能更好的发挥作用，因而从这些传统药物中寻找特定的活性单体化合物是中药现代化的重要内容之一。发明内容

本发明的目的旨在现有技术的基础上，提供一种姚虻纤维蛋白原水解酶及其基因和应用本发明的技术方案为：

姚虻蛋白酶 tabfiblysin是我们首次从姚虻唾液腺中分离得到的一种活性蛋白质，分子量 27145.5道尔顿。其全序列一级结构为 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。

姚虻唾液腺蛋白酶 tabfiblysin基因的克隆包括：姚虻唾液腺总 R A提取， mR A纯化， mRNA反转录及 cDNA文库构建，设计引物，利用 PCR方法筛选编码基因。基因测序结果表明编码唾液腺蛋白酶 tabfiblysin基因由 768个核苷酸组成，自 5'端至 3'端序列为 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。本发明的姚虻唾液腺蛋白酶 tabfiblysin具有显著的水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的作用，能作为制备治疗血栓性疾病药物的被应用。附图说明

图 1为姚虻唾液腺匀浆物（SGE) 的 Sephadex G-75凝胶过滤层析

其中，图中箭头所示为活性峰

图 2为本发明的水解纤维蛋白原作用 SDS-PAGE分析图

图 3为 tabfiblysin对 ADP诱导的人血小板聚集的影响具体实施方式

实施例一：姚虻唾液腺蛋白酶 tabfiblysin基因的克隆：

一、姚虻唾液腺总 R A提取：

A.活体解剖姚虻（出自中国陕西省，学名 T. >^。 Macquart) ,挑取唾液腺立即放入液氮中，迅速取一定量（0.5-2 mg ) 唾液腺组织，加入已预冷的 Trizol提取缓冲液（美国 Invitrogen公司产品），置于冰上匀浆 15分钟。

B.加入 Trizol 1/5体积的氯仿，剧烈混匀约 15秒，室温放置 5分钟， 4 °C， 12000 rpm离心 10分钟，取上清。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置 10分钟， 4°C， 12000 rpm离心 10分钟，沉淀用 75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为姚虻唾液腺总 R A。

二、姚虻唾液腺 mRNA的纯化：

姚虻唾液腺 mR A分离纯化采用美国 PROMEGA公司的 PolyATtract® mRNA Isolation Systems试齐 Ll盒。

A. 取姚虻唾液腺总 RNA 500 溶于 500 L DEPC水中， 65 °C水浴 10分钟，加人 3 的 Oligo(dT) 探针和 13 L 20xSSC 溶液，混匀，放置室温冷却，称为 A液。

B. 磁珠 (SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附 30秒，弃上清，加 0. 5x SSC 300 L，至磁力架吸附 30秒，最后加 100 L 0. 5xSSC 悬浮，称之为 B液。

C. 将 A液加入 B液中，室温放置 10分钟，至磁力架吸附 30秒，弃上清，用 0. l xSSC洗涤 4次，最后弃上清，力口 lOO L DEPC水悬浮，至磁力架上吸附 30秒，将上清移至新的试管，再加入 150 L DEPC水重悬，至磁力架吸附 30秒，移上清至上述试管，即为纯化的姚虻唾液腺 mRNA。

D. 加入 1/10体积 3 M乙酸钠， pH5. 2,等体积异丙醇，于 -70 °C放置 30分钟， 4°C， 12000 rpm离心 10分钟，弃上清，沉淀溶解于 lO L DEPC水中。

三、姚虻唾液腺 cDNA文库构建：采用 CLONTECH公司 Creator™ SMART™ cDNA Library Construction Kit质粒 cDNA文库构建试剂盒。

A. cDNA第一链合成（mRNA反转录)： 1. 在无菌 PCR管加入 1 姚虻唾液腺 mRNA、 1 SMART IV引物、 1 CDS ΙΠ/3'PCR引物，力 B 2μ\,去离子水使总体积达到 5 L。

2. 混匀并短暂离心， 72°C 保温 2分钟。

3. 将离心管在冰上孵育 2分钟。

4. 在离心管中加入以下试剂 2.0 L5x第一链缓冲、 1.0 L20mMDTT、 l.O LlO mMdNTP混合物、 l.O LPowerScript逆转录酶。

5. 混合离心管中试剂并短暂离心，在 42°C保温 1小时。

6. 将离心管置于冰上中止第一链的合成。

7. 从离心管取 2 L所合成的 cDNA第一链备用。

B. 采用长末端聚合酶链式反应（LD-PCR) 方法扩增第二链

1、 95°C预热 PCR仪。

2、将 2 LcDNA第一链（mR A反转录）、 80 μΐ^去离子水、 10 μΐ^ 1 Ox Advantage 2 PCR缓冲、 2 L50xdNTP混合物、 2 5 'PCR引物、 2 CDS III/3' PCR引物以及 2 L大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

3、在 PCR仪中按以下程序扩增： 95°C， 20秒钟； 22个循环： 95°C， 5秒钟， 68°C，

6分钟。

4、循环结束后，将离心管中合成的 cDNA双链进行抽提。

C. 大肠杆菌 DH5ct感受态细胞的制备：

1. 挑取单个 DH5ct菌落（购自北京天根生化科技有限公司），接种于 3mL不含氨苄青霉素的 LB培养基中， 37°C培养过夜，次日取上述菌液按比例 1:100再接种于 50 mLLB培养液中， 37°C振荡 2小时。当 OD_6QQ值达到 0.35时，收获细菌培养物。冰浴 10min，于 4°C以 5000 rpm离心 10 min，以回收细胞。

2. 每 mL初始培养液加 60(^L预冷的 0.1mol/LCaCl₂-MgCl₂溶液重悬。

3. 于 4°C以 5000 rpm离心 10 min，以回收细胞。

4. 每 mL初始培养液加 60 预冷的 0.1mol/L CaCl₂重悬细胞沉淀，分装后备用。

D. 酶切、连接以及连接产物的转化：

1. 在微量离心管中加入 1 μί ρΜϋ19-Τ载体（购自日本 Takara公司）、 4 姚虻唾液腺 cDNA双链溶液，全量为 5 L。

2. 加入 5 L (等量）的连接酶缓冲混合物。

3.16°C反应 2小时。

4. 全量（10 L) 加入至 100 μΐ, DH5a感受态细胞中，冰浴 30分钟。

5.42°C加热 90秒钟后，再在冰中放置 1分钟。

6. 加入 37°C温浴过的 LB培养基 900 L， 37°C缓慢振荡培养 60分钟。

7. 取 200 涂布于含有 X-Gal、 IPTG、 Amp的 LB培养基上 37°C培养 16小时，形成单菌落。

8. 每个 LB平皿用 5 mL LB液体培养基洗涤菌落，加 30%甘油冻存。构建的 cDNA 大约含 l x lO⁶个单独克隆。

四、姚虻唾液腺蛋白酶 tabfiblysin基因序列测定和结果：

根据分离纯化所得姚虻蛋白酶 tabfiblysin的内肽氨基酸序列和双翅目昆虫密码子的偏嗜性，我们设计了一条简并引物 NT3-F21 , 与构建姚虻唾液腺 cDNA文库时所使用的接头引物 CDSIII配对，正反向引物序列为：

NT3-F21： 5'-Tac tec gg(g/c) gac aa(a/g) ct(g/a) cc(c/g) cgc-3' ;

CDSIII -primer: 5'-att cta gag gcc gag gcg gcc atg-3 '

其中，括号内的两个碱基表示简并引物。

以 NT3-F21和 3'PCR 为引物，在我们已经构建好的姚虻唾液腺 cDNA文库中筛选插入了编码 tabfiblysin的 cDNA序列的克隆。

根据测得的成熟蛋白的核苷酸序列设计反向引物和所构建的 cDNA文库克隆的 5'端保守序列为正向引物，正反向引物序列分别为：

5 'primer: 5 '-aag cag tgg tat caa cgc aga gt-3 '

NT3-R21 : 5'-(c/g)gg ( t/c)ag (c/t)tt gtc (g/c)cc gga gta-3'

以构建的姚虻唾液腺 cDNA为模板，进行 PCR。其反应条件为： 95 °C预变性 4 min，接着在如下条件进行 35轮循环， 94°C 30 sec， 58°C 30 sec, 72°C 40 sec。然后 72°C 10 min。通过上述方法，在已经构建好的姚虻唾液腺 cDNA文库中筛选插入了编码 Tabfiblysin 的 cDNA序列。测序结果表明编码 tabfiblysin的 cDNA序列由 768个核苷酸组成，自 5'端至 3' 端序列为 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。实施例二：制备姚虻唾液腺蛋白酶 tabfiblysin :

一、姚虻唾液腺的解剖，匀浆与处理

姚虻 (中国陕西省，学名 r. y^ Macquart) )解剖的方法如下：用小剪刀将虫体沿背中线剪开，放入 4°C含 0.15M NaCl， pH7.2的 0.01M的磷酸盐缓冲液中浸泡，挑取唾液腺，放入含上述缓冲液的烧杯中存于 -20 °C，解剖完毕后 10000 rpm离心 10 min,上清继续存放于 -20 °C，沉淀用玻璃匀浆器在冰上充分匀浆后 lOOOO rpm/min离心 10 min，合并两次离心上清，冻干并取部分样品水溶后用 Sephadex G-25脱盐，冻干。

二、分离纯化的每一个步骤都用水解纤维蛋白原检测方法进行活性跟踪。第一步， Sephadex G-75凝胶过滤：姚虻唾液腺匀浆液冻干粉溶解于 0.05 M Tris-HCl + 0.1M NaCl, pH7.2的缓冲液，上样于 Sephadex -75( Pharmacia产品)凝胶过滤柱 (长 1000 mm, 直径 26 mm)，用同样缓冲液洗脱，收集活性成分。

第二步， FPLC Resource S 离子交换层析： Sephadex G-75 凝胶过滤得到的活性成分峰 (如图 1所示），冻干溶解于水，于 0.05 M Tris-HCl pH 8.3 缓冲液透析 12 hr;上样于 Resource S柱，用一个 0-0.5M NaCl 的线性梯度进行洗脱，纯化得到纤维蛋白原水解酶。该步操作在 AKTA Purifier FPLC系统中进行。实施例三：姚虻唾液腺蛋白酶的药理实验：

一、纤维蛋白原水解活性检测

取 10 浓度为 2 mg/mL的纤维蛋白原（购自美国 Sigma公司，溶于含有 150 mM NaCl 的 50 mM Tris-HCl， pH7.4缓冲液）与样品于 37°C保温 24 hr后，进行 12% SDS-PAGE还原电泳分析，如图 2所示。实验结果发现此酶能明显地水解纤维蛋白原的（X-链，而对 β- 链的水解活性低，不能水解 γ链，其水解活性排序为 α > β > γ。

二、血小板聚集抑制实验

富血浆小板聚集（PRP ) 抑制实验：健康人血小板用血浆稀释至 2.5X 10⁸ 个 /mL。取富血浆血小板 300 μL, 加入适量样品保温 5min后，添加 ADP诱导聚集，记录 5 min血小板聚集情况。

聚集抑制率（I) 的计算：

A=激动剂所能达到的最大聚集（本文为透光率，％);

B=样品作用后加入激动剂所能达到的最大聚集。

结果表明， Tabfiblysin能够明显的抑制 ADP诱导的血小板聚集，且抑制率随抑制剂浓度的增大而升高（如图 3所示）。

三、出血活性检测

将样品溶解到生理盐水中，使其浓度为 0.6 mg/mL。取 30 μΐ对 ICR小鼠（体重 18-22 g，昆明医学院实验动物中心提供）进行皮下注射， 24 小时后，剥离小鼠皮肤，观察内皮出血斑的大小。以生理盐水做对照。结果表明高达 18 μ_§/只的剂量的 Tabfiblysin都不引起小鼠皮下出血。

姚虻唾液腺蛋白酶的药理实验表明：姚虻唾液腺蛋白酶 tabfiblysin具有显著的水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的作用。姚虻唾液腺蛋白酶 tabfiblysin能作为制备治疗血栓性疾病药物的被应用。

Claims

权利要求

1、姚虻蛋白酶 tabfiblysin, 其特征在于姚虻蛋白酶 tabfiblysin是从姚虻唾液腺中分离得到的一种活性蛋白质，分子量 27145.5道尔顿，其全序列一级结构为 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
2、姚虻蛋白酶 tabfiblysin基因，其特征在于该基因由 768个核苷酸组成，自 5'端至 3'端序列为 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
3、姚虻蛋白酶 tabfiblysin的应用，其特征在于姚虻蛋白酶 tabfiblysin能水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集，且无出血活性，能作为制备治疗血栓性疾病药物的应用。