CN103275212B

CN103275212B - 抗人cd146的单克隆抗体，包含其的组合物，检测可溶性cd146的方法

Info

Publication number: CN103275212B
Application number: CN201310153614.9A
Authority: CN
Inventors: 阎锡蕴; 张莹; 郑超固; 杨东玲; 冯静; 卢迪
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2028-01-31
Also published as: CN103275212A

Abstract

本发明是利用生物技术研制出的一组抗人CD146分子及建立的高灵敏度夹心ELISA检测可溶性CD146的方法。本发明包括：抗人CD146鼠单克隆抗体AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，利用抗体组合及夹心ELISA特异性检测可溶性CD146的方法。这组抗体能够在分子、细胞和组织水平特异性识别人源CD146，并基于其识别不同表位而分成两类。由抗体AA1与另一株抗人CD146鼠单抗AA98组合的夹心ELISA方法能够检测到每毫升钠克量级可溶性CD146。这些抗体及此种检测手段将成为基础研究或临床应用中有效的检测或诊断的工具及方法，同时也将为与CD146相关疾病的靶向治疗提供良好载体。

Description

抗人CD146的单克隆抗体,包含其的组合物,检测可溶性CD146的方法

本申请是申请号200810057260.7，发明名称为“抗人CD146的单克隆抗体，包含其的组合物，检测可溶性CD146的方法”的分案申请。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域。具体地说本发明涉及一组抗人CD146的鼠单克隆抗体，这组抗体能够在生化、细胞和组织水平特异性识别人源CD146蛋白。本发明还涉及一种夹心ELISA检测可溶性CD146的方法，在这种检测方法中捕获抗体是本发明中涉及的鼠单克隆抗体，检测抗体是用生物素标记的发明专利ZL991075862中涉及的鼠单克隆抗体AA98。

背景技术

CD146，又名MUC18，Mel-CAM/MCAM，是一种属于免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子。CD146胞外有五个免疫球蛋白样结构域(V-V-C2-C2-C2)(HolnessandSimmons1994)，并被高度糖基化，介导钙离子非依赖的细胞间相互黏附。

CD146最早发现是黑色素瘤的标志分子，参与黑色素瘤的转移及恶化(Lehmann，Riethmuller et al.1989；Sers，Kirsch et al.1993)。CD146在黑色素肿瘤中的异常高表达增强了肿瘤细胞之间的黏附，并对于肿瘤的侵袭和转移非常重要(Johnson，Rothbacher et al.1993)。研究表明，CD146的表达与黑色素瘤细胞的转移能力直接相关，而在不表达CD146的黑色素瘤细胞中过量表达CD146可以显著增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力(Bani，Rak et al.1996；Shih，Speicher et al.1997；Xie，Luca et al.1997)。此外，CD146也表达在少量的正常组织中，比如平滑肌，血管内皮和滋养层等(Shih1999)。

同时，CD146也被广泛认为是血管内皮细胞的特异性标志分子(Bardin，Frances et al.1996；Bardin，Anfosso et al.2001)。在之前的研究中，抗人CD146抗体被应用检测血液中的循环内皮细胞(George，Poncelet et al.1991； Bardin，George et al.1996；Solovey，Gui et al.2001)。由于这一特征，在伴有内皮损伤、脱落现象的某些疾病中，CD146可作为疾病进程的参考指标。另有研究表明CD146分子还表达于单核细胞，有报道在激活的T淋巴细胞上也有高表达(Pickl，Majdic et al.1997)。像其它很多黏附分子一样，体内CD146分子以细胞膜和可溶形式(soluble CD146，sCD146)存在(Neidhart，Wehrli et al.1999；Bardin，Moal et al.2003)。研究表明sCD146在风湿性关节炎滑液以及慢性肾衰竭患者的血清中的表达水平明显高于正常人。

抗人CD146抗体在动物实验中体现出了很强的抑制肿瘤生长的治疗效果。Mills等开发的抗CD146全人抗体，ABX-MA1在裸鼠模型中显著地抑制黑色素肿瘤的生长、侵袭以及向肺部的转移(Mills，Tellez et al.2002)。发明专利ZL991075862中所述，开发的抗CD146鼠单克隆抗体AA98具有抑制肿瘤血管生成的作用，并在多种裸鼠荷瘤实验中明显抑制肿瘤(例如肝癌、胰腺癌等)的生长(Yan，Lin et al.2003)。进一步的研究还揭示了AA98的抑制肿瘤血管生成的机制是通过抑制MAPK磷酸化以及NFκB活化实现的(Bu，Gao et al.2006)。

虽然抗人源CD146的抗体已有一些报道，但是这些抗体对不同的血管内皮组织却有着不同的结合活性。例如S-endo1能够结合各种类型的血管的内皮细胞，包括动脉、细动脉、静脉、小静脉、毛细血管、高内皮微静脉和淋巴血管系统等(George，Poncelet et al.1991)。而另一株抗CD146抗体MUC18只结合毛细血管和高内皮微静脉(Kuzu，Bicknell et al.1993)。S-endo1结合脐带静脉内皮组织而MUC18不结合(Bardin，Frances et al.1996)。此外，P1H12能够同时结合肿瘤和正常组织的血管内皮细胞(St Croix，Rago et al.2000)，而AA98却特异性的结合肿瘤组织的血管内皮细胞(Yan，Lin et al.2003)。这些证据表明，很可能不同的抗体结合表位在不同的组织和微环境中的暴露情况有所差异。因此，针对CD146蛋白上不同表位开发抗体，并研究其对于不同组织的结合能力，对于阐明CD146在血管内皮细胞上的功能非常必要。

发明内容

本发明利用天然纯化的CD146蛋白免疫小鼠，获得杂交瘤细胞。用 ELISA的方法筛选与重组表达的CD146蛋白胞外区有强结合能力的抗体，获得六株抗体，分别命名为AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，同时获得分泌这些抗体的杂交瘤细胞，依次是8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②。这六株抗体均属IgG1，κ亚型。ELISA和免疫印迹的实验证实了这些抗体和CD146分子的特异性结合。

利用重组表达的CD146蛋白胞外不同的结构域以及免疫印迹的方法，证实AA1和AA2识别表位(序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置24-128)位于第一个IgV结构域，而AA3、AA4、AA5和AA7识别表位(序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置335-400)位于第二个IgC2结构域。因此，这六株抗体依照不同的抗原表位分成两类：V1类(包括AA1和AA2)和C2-2类(包括AA3、AA4、AA5和AA7)。

细胞免疫荧光，免疫沉淀及免疫组化实验发现V1类抗体能够在分子、细胞及组织水平同时识别天然构象和变性的CD146蛋白质，而C2-2类抗体只识别变性的CD146蛋白质。这证实了不同的抗原表位在不同情况下的暴露有所不同。

本发明同时利用V1类抗体，如AA1和生物素标记的发明专利ZL991075862中涉及的鼠单克隆抗体AA98，开发了一套夹心ELISA的方法，用于检测溶液和体液中可溶性CD146分子。相比之前提供的商业化检测方法报道(CyQuant ELISA assay kit，Bioxytex，Marseille，France)的双抗夹心ELISA(灵敏度为10ng/ml)，本发明的夹心ELISA方法灵敏度提高了一个数量级，达到1ng/ml。此方法能够用于人血液及脑脊液中可溶性CD146的检测，并在CD146表达异常的病症中具有临床诊断应用价值。运用本发明中的方法，发现在系统性血管炎等自身免疫病中，病人血清中的CD146分子含量显著升高，对于临床诊断具有指导意义和应用价值。

具体地，本发明涉及一种人CD146抗原表位，其氨基酸序列为SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示。

在一个实施方案中，本发明涉及一种抗人CD146抗体，其特征在于其能够特异性识别上述人CD146抗原表位。

优选地，所述抗人CD146抗体特征在于包括抗体重链和抗体轻链，

其中所述抗体重链包括作为CDR的由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成的CDR3组成，

所述抗体轻链包括作为CDR的由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成的CDR3组成。

更优选地，所述抗体的重链由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成，轻链由SEQ ID NO：33的氨基酸序列组成。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种抗人CD146抗体，特征在于包括抗体重链和抗体轻链，

其中所述抗体重链包括作为CDR的由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO：35的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成的CDR3组成，

所述抗体轻链包括作为CDR的由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO：38的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO：39的氨基酸序列组成的CDR3组成。

优选地，所述抗体的重链由SEQ ID NO：40的氨基酸序列组成，轻链由SEQ ID NO：41的氨基酸序列组成。

在本发明的另一方面，还涉及上述抗人CD146的抗体在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的应用。优选地，所述肿瘤是黑色素瘤、肝癌，胰腺癌。

在本发明的另一个方面，还涉及上述抗人CD146的抗体在制备用于靶向CD146的人体肿瘤的成像定位诊断的诊断剂中的应用。

在另一个方面，本发明还涉及一种组合物，例如用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含上述任一方面的抗人CD146抗体，和药用载体。

用于本文时，“药用载体”包括生理适合的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓试剂等。优选地，所述载体适合于静脉内的、肌内的、皮下的、肠胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如，通过注射或灌输)。

通过许多本领域已知的方法可以施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解，施用路径和/或模式将取决于所需结果而变化。

为了通过某些施用路径来施用本发明化合物，用一种材料来包被化合物，或与一种材料共同施用化合物以预防其失活可能是必需的。例如，可以以适当载体，例如脂质体或稀释剂来给受试者施用所述化合物。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。

药用载体包括用于即时制备灭菌的可注射溶液或分散体的灭菌水溶液或分散体和灭菌粉末。将这些介质和试剂用于药用活性物质的应用为本领域所知。

在用于本文时，短语“肠胃外的施用”和“经肠胃外施用”表示除肠内的和局部施用以外的通常通过注射的施用模式，包括但不局限于，静脉内的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的、胸骨内的注射和灌输。

无论选择何种施用路径，通过为本领域技术人员已知的常规方法，将可以以适合的水合形式和/或本发明的药物组合物形式使用的本发明的化合物配制成可药用剂型。

对于特定患者、组合物和施用方式，本发明药物组合物的活性成分的实际剂量水平可以变化以获得有效实现理想的治疗反应而不会对患者具有毒性的活性成分的量。选定的剂量水平将取决于许多药物动力学因素，其包括所用的本发明特定组合物的活性，施用的路径，施用的时间，所用的特定化合物的排泄率，治疗的持续时间，与所用的特定化合物结合使用的其它药物、化合物和/或物质，待治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病状况、一般健康和以前的疾病史和医学领域众所周知的类似因素。

所述组合物必须是无菌且流体的，以到达组合物可以通过注射器进行传递的程度。除了水之外，载体优选是等渗缓冲盐溶液。

在另一个方面，本发明还涉及分泌抗人CD146抗体的杂交瘤细胞株，保藏号分别为CGMCC NO：2310和CGMCC NO：2311。

在另一个方面，本发明还涉及编码能与下面定义的各个另外抗体链一起装配的多肽的核酸，其中所述多肽是下述多肽的任一种

a)抗体重链，其为上述所定义的抗体重链之一；

b)抗体轻链，其为上述所定义的抗体轻链之一。

同时，本发明还涉及包括按照权利要求11的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。以及包括所述表达载体的原核或真核宿主细胞。

在本发明的另一个方面，还涉及一种制备结合人CD146的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达上述编码抗体重链的核酸和编码抗体轻链的核酸，并且从所述细胞中回收所述多肽。

在本发明的另一个方面，涉及一种检测人CD146的方法，其利用上述的抗人CD146抗体，通过酶联免疫吸附法进行。优选地，所述酶联免疫吸附法是夹心酶联免疫吸附法，其中将上述的抗人CD146抗体的一种或多种作为捕获抗体，将中国专利ZL991075862中的鼠单克隆抗体AA98作为检测抗体。更优选地，所述人CD146存在于体液中。甚至更优选地，所述体液是组织液，血清，淋巴液或脑脊液。所述体液可采自系统性血管炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症以及格林巴利综合症等自身免疫性疾病病人或/和慢性肾衰等病症的病人。

在本发明的另一个方面，还涉及所述抗人CD146的抗体的衍生物，其中所述衍生物为所述抗体与生物标记物(如生物素、HRP、碱性磷酸酶、FITC、PE、Cy3、Cy5等常规荧光染料、纳米磁珠等纳米材料)、抗肿瘤药物(如现有技术已知的卡铂、顺铂、五氟尿嘧啶等)、毒素(如蓖麻毒素、淋巴毒素等)、放射活性剂(如¹³¹碘、⁹⁰钇、放射性铜等)结合的产物。

本领域的普通技术人员基于说明书关于抗人CD146抗体的教导，结合现有技术的知识，完全可以毫无困难地获得上述衍生物，进而确定衍生物的效果。

本发明的创新点在于：(1)研制了一组针对人CD146蛋白的鼠单克隆抗体；(2)揭示了这组抗CD146抗体识别的抗原表位，并证实了识别不同表位的抗体，在分子、细胞及组织水平上对于CD146蛋白的结合有显著差别；(3)开发了一种高灵敏度的夹心ELISA方法用于可溶性CD146分子的检测。

附图说明

图1：AA1-AA7特异识别重组人源CD146分子胞外区段蛋白。

图2：各种CD146胞外重组蛋白示意图。

图3：AA1-AA5和AA7的抗原表位鉴定。上图是D1-D5的蛋白电泳图。下图是分别利用AA1-AA5和AA7进行免疫印迹实验检测其与D1-D5的结合能力。

图4：AA1-AA5和AA7在免疫印迹中识别还原和非还原CD146蛋白。泳道1-6是非还原的A375细胞裂解液，泳道7-12是还原的A375细胞裂解液。

图5：AA1-AA5和AA7用于流式细胞术的CD146分子检测。图中mIgG作为阴性对照。只有AA1和AA2识别活细胞中的CD146分子。

图6：AA1-AA5和AA7用于细胞免疫荧光实验检测细胞膜上CD146。AA98作为实验的阳性对照，mIgG作为实验的阴性对照。只有AA1和AA2以及AA98能够结合细胞膜上CD146，箭头仅示其中之一。

图7：AA1-AA5和AA7用于免疫沉淀实验捕获细胞裂解液中的CD146。泳道1-7是分别用mIgG，AA1-5及AA7进行免疫沉淀捕获的蛋白复合物，泳道8是细胞裂解上清，作为阳性对照，用AA98进行免疫印迹检测。

图8：AA1-AA5和AA7进行冰冻切片免疫组化实验检测组织水平的CD146分子。AA98作为实验的阳性对照，CD31用于标记血管内皮细胞(如箭头所示)。如箭头所示，只有AA1和AA2能够结合冰冻切片上组织水平的CD146分子。

图9：夹心ELISA检测5ng/ml-320ng/ml标准样品的标准曲线。

图10：夹心ELISA检测5ng/ml-80ng/ml标准样品的标准曲线，及拟合方程。

图11：HMV6g载体的图谱，其含有MBP-His标签。

杂交瘤细胞株8E8和G10(其分别分泌抗体AA1和AA4)于2007年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所100101)，分类命名为小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏号分别为CGMCC No.2310和CGMCC No.2311。

具体实施方式

下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的。本发明的精神和范围由后附的权利要求所限定。

实施例1：单克隆抗体AA1-AA5和AA7的制备及鉴定。

应用杂交瘤技术(KohlerandMilstein1975；Yeh，Hellstrom et al.1979；Yeh，Hellstrom et al.1982)产生并筛选获得抗体AA1-AA6和AA7。简述如下：从人脐带静脉内皮细胞中分离天然CD146蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，按照(Yan，Lin et al.2003)描述的单克隆抗体AA98抗原纯化方法纯化，将其作为免疫原对BALB/C小鼠(北京实验动物中心)进行免疫接种，每次腹膜内注射100μg蛋白/鼠，每两星期一次，共三次。取脾细胞之前加强免疫一次，腹膜内注射100μg蛋白/鼠。加强免疫之后三天，取脾脏，并将脾细胞悬浮于RPMI培养基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，将脾细胞和SP2/0-Ag14鼠骨髓瘤细胞(ATCC)进行融合，并用HAT选择性培养基对杂交瘤进行筛选。

运用酶联免疫吸附(ELISA)的方法筛选能够大量产生高亲和力的抗人CD146抗体的杂交瘤细胞克隆。使用重组表达的CD146分子胞外区蛋白，rhCD146(序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置氨基酸24-552)作为包被抗原，检测杂交瘤细胞培养上清。具体的做法是，首先在ELISA板上过夜包被50μl 1μg/ml rhCD146蛋白，用PBS洗三遍。加入2％牛血清白蛋白(Ameresco)封闭1小时。然后先后加入分泌抗体的杂交瘤培养上清、酶标抗体(1∶5000稀释的羊抗鼠HRP，Santa Cruz)和底物(200ng/ml TMB(Ameresco)，0.03％H₂O₂(北京化学试剂公司)，pH4.5)，进行ELISA筛选。通过三轮筛选获得了六个分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞株8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②，其分泌的抗体分别对应命名为AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7。将杂交瘤细胞株8E8和G10(其分别分泌抗体AA1和AA4)于2007年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所100101)，分类命名为小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏号分别为CGMCC No.2310和CGMCC No.2311。而杂交瘤细胞株AA6是ELISA筛选时的阴性杂交瘤克隆，与CD146结合能力很弱。

分别大量培养扩增杂交瘤细胞8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②，分别收集含有AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7抗体的培养上清用于抗体功能鉴定。另外分别将杂交瘤细胞8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②用无血清RPMI-1640培养基制成细胞悬液，用于制备抗体腹水。腹水的制备方法简述如下：六周龄BALB/C小鼠腹腔注射降植烷(Sigma)0.5ml/只。10天后，将杂交瘤细胞悬液1x10⁶个/ml接种于BALB/C小鼠腹腔，0.5ml/只，约十天后，收集腹水，离心取上清。

通过蛋白A亲和层析，从培养上清或腹水中纯化单克隆抗体AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7。将纯化单克隆抗体无菌过滤，并冷藏或冷冻保存。

应用BD Pharmingen公司鼠抗体亚型鉴定试剂盒(目录号550487)，将发明专利ZL991075862中所述AA98(下同)作为实验阳性对照，ELISA方法鉴定出抗体AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7均属于IgG1亚型，如表1所示。

表1抗体AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA7和AA98抗体分型

抗体	重链亚型	轻链亚型
			AA1	IgG1	κ
AA2	IgG1	κ
			AA3	IgG1	κ
AA4	IgG1	κ
			AA5	IgG1	κ
AA7	IgG1	κ
			AA98	IgG2a	κ

ELISA方法用于鉴定纯化的AA1-AA5和AA7六种抗体对于CD146蛋白的结合特异性。原核表达的6xHis-tag融合的His-rhCD146(由6xHis-tag和序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置24-552的氨基酸组成)以及真核表达的碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，简称AP，其序列如SEQ ID NO：3所示)融合的sCD146-AP(由序列为SEQ ID NO：1的人CD146 序列中的位置24-559的氨基酸和序列为SEQ ID NO：3的AP以及序列为SEQ ID NO：42的连接区组成)分别在实验中被用作包被抗原(它们的结构示意图参见图2)。

其中，His-rhCD146制备方法简要介绍如下：将人CD146的cDNA序列(SEQ ID NO：2)中位置70-1656的核苷酸克隆至pET28b(Novagen)载体上，利用限制性内切酶NdeI和NotI(NEB提供)及引物5’-AAC ATA TGG TGC CCG GAG AGG CTG AGC AG-3’(SEQ ID NO：4)和5’-AAG CGG CCG CCA GCT TTC TCT CTG TGG AG-3’(SEQ ID NO：5)。在E.Coli BL21DE3(Invitrogen)菌株中表达，以包含体形式存在，洗涤及复性后获得所需抗原。蛋白表达及包涵体洗涤方法见下述D1，D2及D4蛋白表达及包涵体洗涤方法。

包涵体复性步骤如下：

1.将溶解的包涵体蛋白调浓度至1mg/ml，共1ml装入透析袋中，外液以140ml6M脲素，200mM精氨酸，25mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl，2mM还原型谷胱甘肽(GSH)，1mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)4℃静置透析过夜。

2.倒出上述50ml透析外液，补入50ml稀释液【600mM精氨酸，25mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl，2mM GSH，1mM GSSG.】。此时外液的的尿素浓度为4M。4℃透析6小时。

3.倒出75ml透析外液，补入75ml稀释液，尿素终浓度为2M。4℃透析6小时。

4.配200ml400mM精氨酸，25mM Tris，150mM NaCl，2mM GSH，1mM GSSG，透析过夜。尿素浓度为0M，精氨酸浓度为400mM。

5.倒出100ml透析外液，补入100ml25mM Tris，150mM NaCl。终溶液为200mM精氨酸，25mM Tris，150mM NaCl，1mM GSH，0.5mM GSSG。4℃透析6小时。

6.重复步骤5.

7.以900ml25mM Tris150mM NaCl透析过夜。

8.换新鲜1L25mM Tris150mM NaCl透析6小时。

9.测定蛋白含量，SDS-PAGE法检测。浓度可达500μg/ml以上。可通过超滤或Ni-NTA亲和层析进一步浓缩。透析用化学试剂均由Sigma公司提供。)

sCD146-AP的制备过程简单如下：融合蛋白的编码核苷酸序列(SEQ ID NO：6)用XbaI和EcoRI(NEB)克隆在pCMV-SPORTS6载体(Open Biosystems提供)上，含有插入片段的质粒利用Fugene6(Roche)转染试剂瞬时转染至293T细胞(ATCC)中，细胞培养上清按照(Yan，Lin et al.2003)描述的单克隆抗体AA98抗原纯化方法纯化，获得sCD146-AP融合蛋白。

利用ELISA检测抗体与重组蛋白的结合，简单的方法如下。

1)制备Trx-His(其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示)：按照实施例2中关于表达D3和D5蛋白的方法，即将pET32a(Novagen)转化Bl21(DE3)感受态细胞，利用IPTG诱导表达，经Ni柱纯化。用Thrombin蛋白酶(15U酶/mg蛋白，Sigma提供)4℃酶解过夜，之后再用Ni-NTA纯化带着6xHis标签的Trx-His，方法与实施例2中纯化D3和D5蛋白类似。

2)制备MBP-His(其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示)：按照实施例2中关于表达D3和D5蛋白的方法，即将HMV6g载体(载体图谱如图11所示)转化B121(DE3)感受态细胞，利用IPTG诱导表达，经Ni柱纯化。用Tev蛋白酶(1μg酶/mg蛋白，Invitrogen提供)4℃酶解过夜，之后再用Ni-NTA纯化带着6xHis标签的MBP-His，方法与实施例2纯化D3和D5蛋白类似。

3)在ELISA板上不同孔上分别包被1μg/ml抗原(His-rhCD146，sCD146-AP，Trx-His和MBP-His)，50μl/孔，4℃包被过夜；用2％BSA/PBS(Ameresco)室温封闭2小时，之后用1∶2000稀释的抗体(制备的腹水AA1-5和AA7)50μl/孔室温在板上孵育2小时，接着用PBST洗5遍，PBS洗1遍。二抗用1∶5000稀释的HRP偶联羊抗鼠IgG(Santa Cruz)室温孵育1小时，PBST洗5遍，PBS洗1遍。用TMB底物(200ng/ml TMB(Ameresco)，0.03％H₂O₂(北京化学试剂公司)，pH4.5)100μl/孔显色，硫酸终止。结果如图1所示，AA1-AA5及AA7都能很强的结合重组表达的CD146蛋白胞外区：His-rhCD146和sCD146-AP，然而却不结合6xHis-tag融合的硫氧还蛋白(Trx-His)和6xHis-tag融合的甘露糖结合蛋白(MBP-His)。这证实了这六株抗体均特异性识别CD146蛋白而不是His-tag。其中使用的AA6作为实验的阴性对照。

实施例2：单克隆抗体AA1-AA5和AA7的抗原表位鉴定。

运用分别重组表达的人源CD146胞外区五个结构域蛋白以及免疫印迹的方法，鉴定了本发明中所述的六株抗体的抗原表位。

如图2所示，结构域1-5分别表示CD146从胞外到跨膜区的V-V-C2-C2-C2五个结构域。重叠的序列被设计来防止可能的表位丢失。结构域1(序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置24-145的氨基酸，如SEQ ID NO：9所示)克隆在pET30a(Novagen)上，表达出来的是His6-S tag融合His6-S-D1蛋白。结构域2(序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置128-248的氨基酸，如SEQ ID NO：10所示)、结构域3(序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置233-335的氨基酸，如SEQ ID NO：11所示)、结构域4(序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置313-442的氨基酸，如SEQ ID NO：12所示)以及结构域5(序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置400-560的氨基酸，如SEQ ID NO：13所示)分别克隆在pET32a(Novagen)上，表达出来的分别是Trx-His6-S tag融合的Trx-His6-S-D2，Trx-His6-S-D3，Trx-His6-S-D4和Trx-His6-S-D5。

克隆过程简述如下：用相应的一对引物D1S和D1A(用于结构域1)，D2S和D2A(用于结构域2)，D3S和D3A(用于结构域3)，D4S和D4A(用于结构域4)，D5S和D5A(用于结构域5)，及模板pcDNA3.1(-)b-CD146(通过将序列如SEQ ID NO：2所示来源于Johnson，J.P.实验室的CD146cDNA利用限制性内切酶EcoR I和BamH I(NEB)克隆至pcDNA3.1(-)b载体(Invitrogen)而获得)作PCR反应，条件为95℃5分钟；95℃45秒，56℃40秒，72℃50秒，30个循环；72℃5分钟。分别扩增出编码结构域1-5的核苷酸序列。

引物列表如下，正义链引物带有Nco I酶切位点(如下划线所示)，反义链引物带有Hind III酶切位点(如下划线所示)：

PCR产物用2％琼脂糖凝胶(Biowest Agarose)分离，用Tiangen公司提供的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(产品编号：DP209-03)回收PCR产物，然后用Takara公司提供的pMD18T-simple kit将片段连接到T载体(试剂盒内提供了载体和酶)上，并转化Top10感受态细胞(Tiangen提供)。加有氨苄青霉素的LB培养板上长出来的单克隆D1-T(插入了结构域1的核苷酸序列)，D2-T(插入了结构域2的核苷酸序列)，D3-T(插入了结构域3的核苷酸序列)，D4-T(插入了结构域4的核苷酸序列)和D5-T(插入了结构域5的核苷酸序列)，用带有氨苄青霉素的LB培养基培养37℃过夜，并用Tiangen提供的质粒小提试剂盒(产品编号：DP103-03)抽提质粒，用Nco I和Hind III(NEB)双酶切pET30a、pET32a、提取的质粒(即分别插入了结构域1-5的核苷酸序列的T载体)。之后用2％琼脂糖凝胶(Biowest Agarose)分离，用Tiangen公司提供的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(产品编号：DP209-03)回收T载体的酶切小片段(即结构域1-5的核苷酸序列)及pET30a和pET32a酶切开的质粒片段。D1-T的酶切小片段与pET30a酶切开的质粒片段连接，D2-T，D3-T，D4-T及D5-T的酶切小片段与pET32a酶切开的质粒片段连接，用NEB公司提供的T4DNA连接酶建立连接反应，16℃连接过夜。转化Top10感受态细胞(Tiangen)，pET30a-D1用含卡那霉素(50ng/ml)的半固体LB培养板筛选，pET32a-D2，pET32a-D3，pET32a-D4，和pET32a-D5用含氨苄霉素(100ng/ml)的半固体LB培养板筛选。过夜培养获得的单克隆分别用含有抗生素的LB培养基培养，并抽提质粒，获得的质粒用于转化B121(DE3)感受态细胞(Tiangen)。

重组蛋白His6-S-D1，Trx-His6-S-D2，Trx-His6-S-D3，Trx-His6-S-D4和Trx-His6-S-D5的诱导表达：转化了pET30a-D1，pET32a-D2，pET32a-D3，pET32a-D4，和pET32a-D5的B121(DE3)单克隆，在含有相应抗生素的5ml LB培养液中37℃培养过夜。过夜菌1：100接种至相应新鲜的培养基中37℃培养，待细菌生长至OD600为0.6时，加入1mM IPTG(Ameresco)37℃诱导表达6小时或者0.2mM IPTG16℃诱导过夜。

D1，D2和D4由IPTG诱导表达之后，呈现包涵体状态，不可溶。包涵体纯化和洗涤方法如下：菌体重悬于25mM Tris-HCl(pH7.4)，300W超声2x99个循环，每个循环超声4秒，暂停8秒，共12秒。4℃12000g离心30分钟。包涵体沉淀重悬于溶液1(2.5MNaCl)中，4℃搅拌30分钟，4℃12000g离心30分钟。包涵体沉淀重悬于溶液2(0.5％Triton X-100，10mMEDTA，pH8.0)中，4℃搅拌30分钟，4℃12000g离心30分钟。包涵体沉淀重悬于溶液3(2M Urea，50mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)中，4℃搅拌30分钟，4℃12000g离心30分钟。随后，包涵体溶解在溶液4(8M Urea，25mM Tris，150mM NaCl，25mM DTT，pH8.0)中。

D3和D5由IPTG诱导表达之后，呈现可溶状态，用Ni柱纯化。具体方法如下：菌体重悬于25mM Tris-HCl(pH7.4)，300W超声2x99个循环，每个循环超声4秒，暂停8秒，共12秒。4℃12000g离心30分钟，收集上清，过0.45mm滤膜去除杂质。Ni-NTA sepharose6Fast Flow(GE Health Care)填柱，用超纯水洗涤后，在50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl的平衡溶液中平衡。然后将含有His6-tag的蛋白的离心可溶上清上样挂柱，用洗涤溶液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，50mM咪唑)洗柱。最后洗脱溶液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，300mM咪唑)洗脱柱上的蛋白。

利用免疫印迹实验鉴定AA1-AA5及AA7所识别的抗原表位。简单过程如下：用15％SDS-PAGE分离原核表达纯化的D1-D5蛋白，然后用Bio-rad半干转印仪将胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用溶解在PBST中的5％脱脂牛奶室温封闭2小时，然后用上述5％脱脂牛奶/PBST稀释(1∶2000)的一抗溶液(AA1-AA5及AA7)4℃孵育过夜。接着PBST洗5遍，用上述5％脱脂牛奶/PBST稀释(1∶2000)的二抗(辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体，Pierce)溶液室温孵育1小时。PBST洗5遍之后，用Pierce公司的显色底物(产品编号：34076，400μl3％H₂O₂+400μl Luminol溶液/miniblot)显色。实验中，分别利用AA1，AA2，AA3，AA4，AA5和AA7作为一抗，辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG(Pierce)作为二抗，检测不同抗体与重组表达的CD146胞外区五个结构域D1-5的结合活性。如图3所示，AA1和AA2只结合D1，不结合相邻的D2，证实了其抗原表位处于序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置24-128之间，具体序列如SEQ ID NO：24所示。AA3-5和AA7只结合D4，不结合相邻的D3和D5，证实了其抗原表位处于序列为SEQ ID NO：1的人CD146序列中的位置335-400之间，具体序列如SEQ ID NO：25所示。

基于不同的抗原表位把这六株抗体分成两类，V1类和C2-2类。因为AA1和AA2的抗原表位位于第一个IgV样结构域，归为V1类，而AA3，AA4，AA5和AA7的抗原表位位于第二个IgC2样结构域，所以归为C2-2类。

实施例3：利用单克隆抗体AA1-AA5和AA7检测人CD146

本发明所述抗人CD146鼠单克隆抗体可以在分子、细胞以及组织水平检测人CD146蛋白。

在全细胞蛋白免疫印迹实验中，AA1-AA5和AA7均能够识别还原和非还原两种状态的CD146蛋白。具体的实验方法如下：收集高表达CD146的人源黑色素瘤细胞A375(ATCC)，用预冷的PBS洗涤细胞两遍，4℃800rpm离心5分钟，细胞沉淀用裂解液(Tris-HCl50mM pH8.0，NaCl150mM，EDTA1mM，NP-401％，Glycerol10％，PMSF100μg/ml)裂解细胞，4℃12000g离心15分钟，收集上清，分别加入含有DTT(终浓度100mM)(二硫苏糖醇)和不含有DTT的上样缓冲液(5x上样缓冲液：0.313M Tris-HCl，pH6.8，10％SDS，0.05％溴酚蓝，50％甘油)，100℃煮样。10％SDS-PAGE分离全细胞蛋白，之后半干电转移至硝酸纤维素膜。5％脱脂牛奶封闭后，分别用AA1-AA5和AA7作为一抗(1∶10000用封闭液5％脱脂牛奶/TBST稀释)4℃孵育膜过夜，然后用辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG二抗(Pierce，1∶2000封闭液5％脱脂牛奶/TBST稀释)室温孵育1小时，用Pierce公司提供的显色底物(产品编号：34076，400μl3％H₂O₂+400μl Luminol溶液/miniblot)检测。如图4所示，AA1-AA5和AA7能够在分子水平结合A375表达的CD146蛋白分子。

运用流式细胞术检测手段，证实V1类抗体能够识别活细胞水平中细胞膜表面的CD146蛋白，C2-2类抗体不能识别。具体的实验方法如下：收集高表达CD146的人源黑色素瘤细胞A375(同上)，用预冷的含有0.3％BSA的PBS洗涤细胞两遍，每遍洗涤之后4℃800rpm离心5分钟。用羊血清稀释液(1∶20用PBS稀释)封闭细胞，之后加入AA1-AA5和AA7，以及阳性对照AA98作为一抗(1∶2000PBS稀释)，冰上孵育40分钟。用预冷的含有0.3％BSA的PBS洗涤细胞两遍，加入FITC偶联的羊抗鼠IgG作为二抗(Sigma，1∶300PBS稀释)，室温孵育20分钟，用BD FACS Calibur flow cytometry系统检测(BD Bioscience)。结果如图5所示，AA1和AA2即V1类抗体能够结合A375表达的CD146分子，与阴性对照mIgG(用小鼠IgG作为一抗使用，Sigma提供)有明显区别。而AA3-5和AA7即C2-2类抗体，不能结合活细胞A375膜上的天然状态的CD146分子，可能的原因是C2-2类识别的抗原表位在天然状态下并不暴露在CD146蛋白分子的表面。

同样，利用免疫荧光技术实验，也只有V1类抗体能够识别细胞水平的CD146分子，而C2-2类抗体不能，AA98作为实验的阳性对照，mIgG作为阴性对照，如图6所示。实验也证实了CD146分子主要分布在细胞膜表面。实验过程简述如下：用预冷1∶1丙酮/甲醇固定长于24孔板的A375细胞1分钟，之后PBS洗涤两次。用2％羊血清(北京中杉金桥)于37℃封闭细胞30分钟，PBS洗两遍。然后加入100μl1∶2000PBS稀释的一抗(AA1-AA5及AA7，AA98和mIgG)，37℃孵育2小时。PBS洗涤之后，用1∶300PBS稀释的FITC偶联的羊抗鼠IgG(Sigma)作为二抗和细胞37℃孵育1小时。PBS洗，镜检。

V1类抗体可以用于富集溶液中的天然CD146分子。利用免疫沉淀的技术，V1类抗体可以结合并富集细胞裂解液中的CD146蛋白。具体的方法如下：1×10⁷A375(同上)细胞在0.6mL冰预冷的上述裂解液中裂解30分钟，4℃12000g离心15分钟，收集上清。先加入20μl50％slurry(50％与PBS或TE混合)的protein A-Agarose(Santa Cruz)，进行预清除。然后分别加入2μgAA1-AA5和AA7，4℃孵育过夜。之后加入20μl50％slurry的protein A-Agarose捕获抗原-抗体复合物，用PBS洗涤沉淀三次，加入40μl1x上样缓冲液(将上述5x上样缓冲液稀释5倍)，100℃加热煮样10分钟。蛋白沉淀用免疫印迹的方法检测(实验方法同上所述)，AA98作为检测一抗。如图7所示，AA1和AA2能够沉淀富集A375裂解液中的CD146蛋白，而C2-2类抗体不能。

利用免疫组织化学技术，V1类抗体可以检测组织水平的CD146蛋白分子。具体做法如下：人脐带组织用OCT(冰冻组织包埋液，Sakura提供)包埋，进行冰冻切片。切片在预冷的丙酮里固定5分钟，然后在含有0.3％H₂O₂的甲醇中室温闭光孵育30分钟去除内源性过氧化物酶的干扰。PBS洗涤三次之后，用5％马血清(北京中杉金桥，PBS稀释马血清)封闭切片，然后分别在含有AA1-AA5，AA7，AA98以及抗CD31抗体(Santa Cruz)的一抗稀释液(1∶2000封闭液稀释)中4℃孵育过夜。之后用生物素标记的二抗(生物素偶联的羊抗鼠IgG，Vector公司，1∶1000封闭液稀释)和辣根过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白作为三抗(Vector，1∶1000PBS稀释)，37℃孵育组织切片，最后用新鲜配置的DAB显色试剂盒(北京中杉金桥，产品编号：ZLI-9033)显色。显色完毕之后用苏木素复染细胞核。如图8所示，抗CD31抗体标记了血管内皮细胞(如箭头所示)，AA1和AA2能够在组织水平识别脐带静脉内皮细胞以及血管平滑肌细胞分布的CD146分子(如箭头所示)，而C2-2类抗体不能。AA98作为实验的阳性对照(如箭头所示)。

实施例4：高灵敏度双抗夹心ELISA检测人可溶性CD146方法

利用本发明中所述抗人CD146抗体AA1以及发明专利ZL991075862中所述AA98，本发明开发出了一种高灵敏度的双抗夹心ELISA方法，检测血清中的可溶性CD146。主要方法是用AA1(关于AA2的实验相同，故省略)作为捕获抗原，生物素(Biotin)标记的AA98作为检测抗原，真核表达的sCD146-AP作为标准品，检测正常人和自身免疫病患者血清中的可溶性CD146蛋白。实验证实了，本发明开发的夹心ELISA具有较高的灵敏度和较宽的线性范围。利用此方法还证实了，自身免疫病如系统性血管炎患者血清中的CD146蛋白含量，较健康志愿者有显著升高。

具体实验方法如下：

1.样品来源及临床资料：健康志愿者血浆来自北京红十字血液中心，血管炎患者血浆来自安贞医院。

2.具体步骤：

1)ELISA板包被抗体：将抗体AA1以0.02M PB(pH7.25)稀释至1μg/ml，50μl/孔4℃包被过夜。

2)封闭非特异结合位点：200μl/孔2％BSA/PBS，室温孵育2小时。

3)样品孵育：将已知浓度的sCD146-AP梯度以封闭液(2％BSA/PBS)稀释用来绘制标准曲线，稀释后的浓度分别为5、10、20、40、80、160、320ng/ml。待测血清稀释20倍，上样量50μl，封闭液取代样品作为阴性对照。每个样品设两次重复。室温孵育2小时。

4)PBST5次，PBS1次洗去非特异性结合。

5)检测抗体孵育：检测抗体AA98-生物素(用于标记AA98的生物素由Pierce公司提供)以2％BSA/PB稀释至0.5μg/ml，50μl/孔室温孵育2小时。

6)PBST5次，PBS1次洗去非特异性结合。

7)酶标二抗放大信号：加入合适浓度的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(Vector，1∶3000)，50μl/孔，室温孵育1小时。

8)PBST5次，PBS1次洗去非特异性结合。

9)颜色反应：加入底物(200ng/ml TMB(Ameresco)，0.03％H₂O₂(北京化学试剂公司)，pH4.5)显色，100μl/孔，37℃15分钟，加入50μl/孔2M H₂SO₄终止反应，酶标仪450nm读数。

10)软件统计结果：软件分析吸光值，根据标准sCD146-AP浓度绘制标准曲线。

11)根据标准曲线计算出待测样品的浓度。

3.结果分析：

1)利用已知sCD146-AP的浓度制作标准曲线。稀释后sCD146-AP的浓度为5～320ng/ml，绘制标准曲线如图9示。经计算得出该方法检测范围在5～80ng/ml内符合线性。取sCD146-AP浓度5～80ng/ml作图所得到的标准曲线(R²＝0.9981)，如图10所示。

2)分析健康志愿者及系统性血管炎患者血浆中sCD146含量。健康志愿者血浆中sCD146含量为154.7ng/ml，而血管炎患者血浆sCD146含量达到383.9ng/ml，二者差异明显，如表2所示。

表2：利用夹心ELISA检测的健康志愿者和系统性血管炎患者血清中可溶性CD146含量。

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Claims

1.一种抗人CD146抗体，其中所述抗体重链包括作为CDR的由SEQID NO:34的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的CDR3，

所述抗体轻链包括作为CDR的由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的CDR3。

2.权利要求1的抗人CD146抗体，其特征在于所述抗体的重链由SEQID NO:40的氨基酸序列组成，轻链由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成。

3.权利要求1或2的抗人CD146的抗体在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其中所述肿瘤是黑色素瘤、肝癌，胰腺癌。

4.权利要求1或2的抗人CD146的抗体在制备用于靶向CD146的人体肿瘤的成像定位诊断的诊断剂中的应用。

5.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含权利要求1或2的抗人CD146抗体和药用载体。

6.一种编码权利要求1或2所述抗人CD146抗体的核酸。

7.一种包括按照权利要求6的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。

8.一种原核或真核宿主细胞，其包括按照权利要求7的载体。

9.一种制备结合人CD146的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达按照权利要求6的编码抗体重链的核酸和编码抗体轻链的核酸，并且从所述细胞中回收所述多肽。

10.权利要求1或2的抗人CD146抗体在制备用于检测人CD146的诊断剂中的应用，其中所述检测是通过酶联免疫吸附法进行的。

11.权利要求10的应用，其中所述酶联免疫吸附法是夹心酶联免疫吸附法，其中将权利要求1或2的抗人CD146抗体作为捕获抗体，将中国专利ZL 991075862中的鼠单克隆抗体AA98作为检测抗体。

12.权利要求10或11的应用，其中所述人CD146存在于人体液中。

13.权利要求11的应用，其中所述体液是组织液，血清，淋巴液或脑脊液。

14.权利要求1或2的抗人CD146的抗体的衍生物，其中所述衍生物为所述抗体与生物标记物、抗肿瘤药物、毒素、放射活性剂结合的产物，其中所述生物标记物是生物素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，异硫氰酸荧光素，藻红素，Cy3，Cy5或纳米磁珠，所述抗肿瘤药物是卡铂，顺铂或五氟尿嘧啶，毒素是蓖麻毒素或淋巴毒素，放射活性剂是¹³¹碘，⁹⁰钇或放射性铜。