CN103272266A - 一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法。包括构建多孔支架三维结构的数字模型，利用数字模型设计三维陈列多孔结构，通过布尔运算得到其负型。利用三维快速成型技术制得三维阵列多孔支架的石蜡负型。选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，将种子醪液均匀滴加在经灭菌处理的石蜡负型上，加入发酵培养基培养6～14d。发酵产物经石蜡脱除、纯化处理得到细菌纤维素三维陈列多孔支架。本发明工艺简单，操作方便，可制备具有复杂形状的三维阵列多孔支架，且通过改变设计方案、工艺参数等方法能够调控支架的外观形貌、微孔尺寸和三维陈列孔的结构，制备的三维陈列多孔支架可应用于构建皮肤、骨、软骨、血管等组织工程领域。

Description

一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法

技术领域

本发明涉及生物支架材料的制备加工技术领域。特别涉及一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法。

背景技术

组织工程支架材料是组织工程三大要素之一，由于人体组织均具有特定的宏观形貌，需要用于组织工程修复的支架材料也具备相应的宏观形貌。并且由于大量研究表明用于组织工程修复的支架材料微观（纳米级、微米级）结构可以影响细胞的生长及蛋白表达。因此，组织工程支架材料制备过程中，在控制宏观形貌的同时，还需控制微观结构。理想的组织工程支架材料应具有良好的组织相容性、生物可降解性、降解无毒性、良好的机械强度以及高孔隙率的三维立体结构。

细菌纤维素是由葡萄糖以β-1,4-糖苷链连接而成的高分子化合物，作为一种优良的生物材料，具有其独特的物理、化学性能：BC具有天然的三维纳米网络结构；良好的力学性能；高亲水性，良好的透气、吸水、透水性能。同时，细菌纤维素还具有良好的体内、体外生物相容性和良好的生物可降解性，这使得细菌纤维素本身可以应用于组织工程支架材料。但细菌纤维素的纳米纤维直径为3-10nm，在正常培养下呈三维网络结构，其网络的孔径为1-10μm左右。在组织工程构建中，细胞只能在其表面粘附和增殖，不能进入材料内部，在材料内部生长。因此，为了使细菌纤维素能够作为理想的组织工程支架材料，必须制备具有大孔（150-500μm）的细菌纤维素多孔支架。

有研究报道，可使用淀粉、石蜡作为致孔剂在细菌纤维素发酵时制备出具有一定孔径的三维组织工程支架材料，材料孔径、厚度、连通性均可通过改变致孔剂的尺寸和发酵条件来控制。中国专利CN101288778A和中国专利CN102274549A分别公布了采用冰晶和氯化钠晶体作为致孔剂对发酵后的细菌纤维素进行处理制备出含有大孔的细菌纤维素组织工程支架材料的方法。但以上这些方法，所得到的组织工程支架缺乏力学强度、容易形成封闭的大孔使材料孔隙的相互贯通程度低、孔隙率与孔分布的可控性差。且在制备过程中很难控制细菌纤维素的宏观形貌。

本发明采用计算机模拟技术、三维快速成型技术以及菌株/石蜡混合发酵技术，制备了一种细菌纤维素三维阵列多孔支架。在制备过程中可以同时控制支架材料的宏观形貌和微观结构，制备具有复杂形状的细菌纤维素三维阵列多孔支架，且通过改变设计方案、工艺参数等方法能够调控支架的外观形貌、微孔尺寸和三维陈列孔的结构。制备的细菌纤维素三维陈列多孔支架具有良好的力学强度、良好的结构稳定性、高孔隙率并且孔隙的相互贯通程度高，可有利于细胞进入支架内部，方便蛋白质等营养成分通过，并且便于微血管的重建，可作为组织工程支架材料，应用于皮肤、骨、软骨、血管等组织修复和重建。

发明内容

本发明公开了一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法。涉及一种支架材料的制备加工技术领域。本发明工艺简单，操作方便，可制备具有复杂形状的三维阵列多孔支架，且通过改变设计方案、工艺参数等方法能够调控支架的外观形貌、微孔尺寸和三维陈列孔的结构，制备的三维陈列多孔支架可应用于构建皮肤、骨、软骨、血管等组织工程领域。

本发明公开了一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法。包括：

（1）    采用计算机模拟技术构建多孔支架的宏观三维数字模型，利用数字模型设计三维陈列多孔结构，通过布尔运算得到三维负型模型。

（2）    利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末作为成型材料，制得三维阵列多孔支架的石蜡负型。

（3）    选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将种子醪液均匀滴加在经灭菌处理的石蜡负型上，加入发酵培养基培养6～14d。发酵产物经石蜡脱除、纯化处理，冷冻干燥得到得到细菌纤维素三维陈列多孔支架。

作为优选的技术方案：

其中，如上所述的一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，所述的多孔支架的宏观三维数字模型为：圆柱体、正方体、长方体、膜状、管状或人体组织所具有的不规则体。细菌纤维素多孔支架作为组织工程支架材料，在修复、构建目标组织时，需要具有与目标组织相匹配的宏观相貌。如：构建皮肤组织时，通常所需的组织工程支架材料为膜状；构建血管组织时，通常所需的组织工程支架材料为管状；小型的圆柱体、正方体和长方体支架材料可用于构建骨组织缺损；一些特殊的组织（半月板、耳朵、角膜等）则需要支架材料具有相应的不规则体。

如上所述的一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，所述的数字模型设计的三维陈列多孔结构：每5mm×5mm的加工平面上呈n×n阵列式的微孔，微孔直径为150～500μm，微孔间距不小于200μm。计算机模拟技术设计的三维阵列多孔结构，通过石蜡负型、发酵培养将最终影响得到的细菌纤维素多孔支架内的三维阵列微孔。在组织工程培养过程中，提高孔隙间的相互贯通程度可有利于细胞进入支架内部，方便蛋白质等营养成分通过，并且便于微血管的重建。因此在支架材料微孔结构设计时可以通过调节三维陈列孔的数量和位置，使三个加工平面的孔道两两相交或者三个加工平面的孔道同时相交。

如上所述的一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，所述的能分泌细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。

如上所述的一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，所述的菌株/石蜡混合培养方法为：将菌株浓度为10～95%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，5～10min后加入发酵培养基，发酵培养温度为20～30℃，时间为6～14d。

如上所述的一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，所述的石蜡脱除、纯化处理方法为，在50～100℃的温度下，发酵产物分别在蒸馏水、异丙醇、无水乙醇和重量百分比为1～8%的NaOH水溶液中洗涤，再用蒸馏水反复冲洗至中性。以除去石蜡、细菌纤维素上的菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。所述的冷冻干燥温度为：-40～-10℃条件下。细菌纤维素是由三维纳米网络结构的纤维素纳米纤维构成，只有采用冷冻干燥法才能在干燥过程中保持其原有的三维网络结构。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用计算机模拟技术、三维快速成型技术以及菌株/石蜡混合培养技术，制备了一种细菌纤维素三维阵列多孔支架。在制备过程中可以同时控制支架材料的宏观形貌和微观结构，制备具有复杂形状的细菌纤维素三维阵列多孔支架，且通过改变设计方案、工艺参数等方法能够调控支架的外观形貌、微孔尺寸和三维陈列孔的结构。制备的细菌纤维素三维陈列多孔支架具有良好的力学强度、良好的结构稳定性、高孔隙率并且孔隙的相互贯通程度高，可有利于细胞进入支架内部，方便蛋白质等营养成分通过，并且便于微血管的重建，可作为组织工程支架材料，应用于皮肤、骨、软骨、血管等组织修复和重建。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

1、  采用计算机模拟技术构建直径为1cm，高2cm的细菌纤维素圆柱体宏观三维数字模型。利用数字模型设计三维陈列多孔结构，每5mm×5mm的加工平面上呈9×9阵列式的微孔，微孔直径为500μm，微孔间距不小于200μm。细菌纤维素三维阵列多孔支架，通过布尔运算得到其三维负型模型。

2、  将细菌纤维素三维阵列多孔支架负型的数字模型数据导入三维快速打印机中，利用三维快速成型技术，以石蜡粉末作为成型材料，制得三维阵列多孔支架的石蜡负型。

3、  选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌，将菌株活化制备成种子醪液，将菌株浓度为10%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，10min后加入发酵培养基，发酵培养温度为30℃，时间为14d。发酵产物在50℃下，分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5min。然后在重量百分比为4%的NaOH水溶液中，在60℃的温度下加热5h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。在-40℃条件下冷冻干燥，得到细菌纤维素三维陈列多孔支架。

实施例2：

1、  采用计算机模拟技术构建2cm×2cm×2cm的细菌纤维素正方体宏观三维数字模型。利用数字模型设计三维陈列多孔结构，每5mm×5mm的加工平面上呈12×12阵列式的微孔，微孔直径为150μm，微孔间距不小于200μm。细菌纤维素三维阵列多孔支架，通过布尔运算得到其三维负型模型。

2、  将细菌纤维素三维阵列多孔支架负型的数字模型数据导入三维快速打印机中，利用三维快速成型技术，以石蜡粉末作为成型材料，制得三维阵列多孔支架的石蜡负型。

3、  选取能分泌细菌纤维素的根瘤菌属，将菌株活化制备成种子醪液，将菌株浓度为45%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，5min后加入发酵培养基，发酵培养温度为20℃，时间为12d。发酵产物在70℃下，分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5min。然后在重量百分比为8%的NaOH水溶液中，在100℃的温度下加热3h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。在-10℃条件下冷冻干燥，得到细菌纤维素三维陈列多孔支架。

实施例3：

1、采用计算机模拟技术构建5cm×5cm×1cm的细菌纤维素膜状宏观三维数字模型。利用数字模型设计三维陈列多孔结构，每5mm×5mm的加工平面上呈6×6阵列式的微孔，微孔直径为200μm，微孔间距不小于200μm。细菌纤维素三维阵列多孔支架，通过布尔运算得到其三维负型模型。

2、将细菌纤维素三维阵列多孔支架负型的数字模型数据导入三维快速打印机中，利用三维快速成型技术，以石蜡粉末作为成型材料，制得三维阵列多孔支架的石蜡负型。

3、选取能分泌细菌纤维素的无色杆菌属，将菌株活化制备成种子醪液，将菌株浓度为95%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，7min后加入发酵培养基，发酵培养温度为25℃，时间为6d。发酵产物在60℃下，分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5min。然后在重量百分比为1%的NaOH水溶液中，在80℃的温度下加热6h，再用蒸馏水反复冲洗至中性。在-20℃条件下冷冻干燥，得到细菌纤维素三维陈列多孔支架。

Claims (6)

1.一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，其特征是：

（1）采用计算机模拟技术构建多孔支架的宏观三维数字模型，利用数字模型设计三维陈列多孔结构，通过布尔运算得到三维负型模型；

（2）利用三维快速成型技术，采用三维快速打印机，以石蜡粉末作为成型材料，制得三维阵列多孔支架的石蜡负型；

（3）选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将种子醪液均匀滴加在经灭菌处理的石蜡负型上，加入发酵培养基培养，发酵产物经石蜡脱除、纯化处理，冷冻干燥得到得到细菌纤维素三维陈列多孔支架。

2.如权利要求1，一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，其特征是：所述的多孔支架的宏观三维数字模型为：圆柱体、正方体、长方体、膜状、管状或人体组织所具有的不规则体。

3.如权利要求1，一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，其特征是：所述的数字模型设计的三维陈列多孔结构：每5mm×5mm的加工平面上呈n×n阵列式的微孔，微孔直径为150～500μm，微孔间距不小于200μm。

4.如权利要求1，一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，其特征是：所述的能分泌细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。

5.如权利要求1，一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，其特征是：将菌株浓度为10～95%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上，5～10min后加入发酵培养基，发酵培养温度为20～30℃，时间为6～14d。

6.如权利要求1，一种细菌纤维素三维陈列多孔支架的制备方法，其特征是：石蜡脱除、纯化处理方法为，在50～100℃的温度下，发酵产物分别在蒸馏水、异丙醇、无水乙醇和重量百分比为1～8%的NaOH水溶液中洗涤，再用蒸馏水反复冲洗至中性。