CN103271352A - 一种马兰降血脂提取物的制备及应用 - Google Patents

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刘跃钧
吕丽爽
刘昱廷
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Abstract

一种马兰降血脂提取物，功能性食品和植物化学领域，本发明提供了从马兰头中提取、制备降血脂组分的方法，及该法所得提取物的降血脂功能和用途。具体包括：（1）马兰头中降血脂提取物制备方法：马兰全株为原料，采用80%乙醇回流提取，或者浸渍提取，或者渗漉提取，过滤，滤液减压浓缩，用石油醚萃取，大孔吸附树脂脱色精制，减压浓缩真空干燥，得到马兰提取物；（2）马兰提取物甾醇类总含量不低于13%，皂苷类含量1%；（3）马兰提取物具有显著的降血脂功效。

Description

一种马兰降血脂提取物的制备及应用
技术领域
本发明专利涉及功能性食品和植物化学领域，天然活性因子的分离制备及功能性食品的应用。
背景技术
随着经济飞速发展，生活节奏日益加快。人们工作压力增大，体育锻炼缺乏，生活不规律性，饮食习惯不合理尤其是高能量、高胆固醇、高饱和脂肪酸食物在人们膳食结构中的比例越来越高等因素，使高血脂症的发病率逐年递增，发病年龄日益低龄化，我国18岁以上血脂异常人群已经达到1.6亿。而高血脂引起动脉粥硬化与冠心病最重要的因素之一，它作为导致动脉硬化、心脑血管疾病的主要独立危险因素越来越受到人们的关注。目前的降血脂药物往往是对某一种类型的高脂血症疗效显著，而且降血脂药物的副作用，如胃肠道反应，对肝脏和肾脏的损伤等，另外单一作用点的药物一般很难取得满意的治疗效果，尤其是对于那些处于高血脂边缘尚未需要药物治疗的亚健康人群。而天然植物提取物，具有多靶点和多成分协同作用的优点，而且安全性高，无毒副作用，易于被消费者接受，尤其适宜那些血脂偏高但尚未达到用药程度的亚健康群体。因此，开发天然食源性降血脂组分成为当前研究的热点。
据《本草纲目》载：马兰可“破宿血、养新血，止鼻吐血、合金疮、断血痢、解酒疸、诸菌毒、盍毒及腹中急痛，痔疮”等病症。现代医学研究表明马兰全草对保护视力、防止动脉硬化、防癌等均有重要作用，同时对治扁桃体炎、急性咽喉炎、蛇咬伤、疟疾等症有一定疗效。关于马兰的报道均为选用不同种层析担体，通过多次反复柱层析鉴定所得单体化合物及部分物质的功能活性，包括抑菌、保护CCl4诱导的肝损伤等。而其降血脂活性及其提取的文尚未见报道，本课题组前不久研究发现马兰中等及较强极性组分的降血脂活性，并申请了专利。
例如：2006年，林材报道了马兰中分离得到三萜类化合物。采用马兰干燥全草,用体积分数为95%乙醇冷浸3次，每次2 d，合并滤液，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取并浓缩。石油醚部分经硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，得到6个单体化合物。
2010年，王刚采用80%乙醇提取马兰，分别用石油醚、水饱和的正丁醇萃取，石油醚萃取部分分别采用硅胶柱色谱和凝胶柱色谱Sephadex LH-20进行分离纯化，结构鉴定了9个化合物。实验表明化合物大黄酚和香草醛对CCl4诱导的肝损伤有一定的保护作用。
2010年，刘劲松采用80%乙醇提取马兰，分别用石油醚、水饱和的正丁醇萃取，石油醚萃取部分采用硅胶柱色谱和凝胶柱色谱Sephadex LH-20进行纯化，鉴定了 5 个三萜类化合物。活性表明化合物Ⅴ对 CCl4诱导的肝损伤有一定的保护作用。
2010年，许文清采用80%工业乙醇回流提取，分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇进行萃取。对石油醚萃取部分进行硅胶柱色谱分离得到14个脂肪类化合物。 
2008年，许文清采用 80%工业乙醇回流提取马兰，分别用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取。对乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱色谱分离，对正丁醇萃取部分先用硅胶柱色谱分离, 再用Sephadex LH-20柱子分离，最终鉴定得到8个化合物抑菌活性筛选表明：琥珀酸(1)和丁香酸(5)对枯草芽孢杆菌有抑制作用。
2008年，林彬彬采用80%乙醇提取马兰，分别用石油醚、水饱和的正丁醇萃取，对正丁醇萃取部分进行硅胶柱色谱和Sephadex LH-20色谱柱分离，得β-谷甾醇。
2010年，龚小见报道80%乙醇分别提取3次，分别用别石油醚、醋酸乙酯和正丁醇进行萃取，并对醋酸乙酯萃取部分进行柱色谱分离从马兰中分离得到11个化合物。
以上提取方法均为化合物精制手段，目的明晰马兰中存在的活性化合物。而这些方法过程过于繁琐，样品损失也较大（造成产量过低）；另外大量的溶剂洗脱也会大幅度提高成本；且硅胶柱色谱和Sephadex LH-20色谱柱分离纯化难以工业化生产。本发明通过非极性溶剂萃取结合大孔吸附树脂精制得到非极性组分、高活性的降血脂植物提取物，工艺简单，可操控性强。    
发明内容
为了有效利用马兰中活性成分，本发明提供一种简单、快速，能有效工业化生产的马兰提取物制备方法，并对分析测定了提取物的组成，确定了其降血脂生物活性。
本发明采取的技术路线：本发明的一种方案具体为：马兰全株干燥、粉碎，过20目筛分，80%乙醇提取，料液比1:10，65℃水浴，搅拌提取2 次，过滤，残渣以同样方法重复提取1 次，将合并的提取液减压浓缩除去乙醇，用3倍体积的石油醚（正己烷）萃取两次，合并萃取部分，减压浓缩，浓缩液采用大孔吸附树脂进行脱色处理，去除叶绿素等色素杂质，真空干燥，得马兰提取物。
通过动物模型对比试验测定，本发明中降血脂马兰提取物与高血脂小鼠模型组相比：血清总胆固醇含量平均下降了22.4%以上，血清甘油三酯含量下降最高达56.6%，高密度脂蛋白含量升高最高达34.3%，低密度脂蛋白含量降低最高达50.2%，综上表明具有较为显著的降血脂功效。
通过动物模型对比试验测定，本发明降血脂马兰提取物可有效调控血浆甘油三酯(TG)的两种酶，脂蛋白脂酶(LPL)和肝脂酶(HL)的活性，从而有效降低了血清中甘油三酯的含量。
通过动物模型对比试验测定，本发明降血脂马兰提取物可有效调控血浆中胆固醇代谢的关键酶(HMG-CoA、CYP7a1、ACAT)的活性，减少胆固醇的自体合成，同时阻止胆固醇酯化，并能够促使更多的胆固醇转化为胆汁酸，从而达到降低血胆固醇的目的。
通过动物模型对比试验测定，本发明降血脂马兰提取物可以有效调控小鼠体内（血清和肝脏）MDA、SOD、GSH-PX等浓度的变化，减少高血脂小鼠体内活性氧的堆积，能迅速分解脂质过氧化物，防御自由基损伤作用。
以上试验结果表明，本发明马兰的提取物可以通过不同多种途径，达到降血脂功效。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种以马兰为原料具有良好降血脂功效的植物提取物。该提取物与国内现有产品血脂康比较，对需求预防高血脂和恢复正常血脂效果更理想。 
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
    图1是马兰组分对高脂血症小鼠血清TC 、TG、HDLC、LDLC的影响
图2是马兰组分对小鼠HL的影响
图3是马兰组分对小鼠LPL的影响
图4是马兰组分对粪便中甾醇和胆汁酸含量的影响
图5是马兰组分对小鼠MDA的影响
图6是马兰组分对小鼠SOD的影响
图7是马兰组分对小鼠GSH-PX的影响。
具体实施方式
实施方案一：马兰全株干燥、粉碎，过20目筛分，称取500g于反应器中，加入80％乙醇6000ml，水浴加热65℃，搅拌提取（回流提取，或者浸渍提取，或者渗漉提取）60min，过滤，收集提取液，残渣同样条件下再提取一次，合并两次提取液，减压浓缩除去乙醇。用3倍体积的石油醚（正己烷）萃取两次，合并萃取部分，减压浓缩，浓缩液采用大孔吸附树脂进行脱色处理，去除叶绿素等色素杂质，产物减压浓缩干燥，得到马兰提取物S。
提取物含量测定：以齐墩果酸为标准品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色方法测定，产物皂苷类物质含量1.18%。
以β-谷甾醇为标准品，采用乙酸酐-硫酸显色法测定，产物中甾醇含量不低于13.7% 。
 实施方案二：降血脂功效试验
取体重为18～22g健康清洁级雄性小鼠40只（南京医科大学试验动物中心提供），分5组，每组8只，分别为正常组，高血脂模型组，阳性对照组（血脂康药物），试验组，除正常组外，其余组均喂含高脂配方饲料，质量分数分别为：7.4%蛋黄粉、1%胆固醇、10%猪油、0.2%牛胆盐，试验组中，低剂量组小鼠每天每千克喂50毫克的提取物，高剂量组小鼠每天每千克喂100毫克的提取物。
表1 小鼠分组及剂量
小鼠分组 只数 剂量选择
正常对照组 8 基础饲料+50mg/Kg/d
高脂模型组 8 高脂饲料+50mg/Kg/d
阳性对照组 8 高脂饲料+150mg/Kg/d
S组分低剂量组 8 高脂饲料+50mg/Kg/d
S组分高剂量组 8 高脂饲料+100mg/Kg/d
实验期30 天，摘眼球取血于抗凝管中，再分别取肝脏，肾脏，脾，心脏，胸腺称重按组分装，于液氮罐中储存。少许肝脏于石蜡上切片分别置于戊二醛及福尔马林溶液中，备用（电镜、光镜）。
实验结果表明：与正常组比较，小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C指标及动脉粥硬化指数（AI）如图1所示，马兰提取物对总胆固醇（TC）、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDLC)浓度均有不同程度的降低（P<0.05），高密度脂蛋白(HDL-C)浓度有所升高。
对小鼠脂蛋白酶肝酯酶(HL)、脂蛋白酶(LPL)的影响如图2、图3所示，马兰提取物对高血脂小鼠能够通过激发酶活路径促进脂蛋白代谢，从而降低甘油三酯，且对甘油三酯的限速酶有一定的良性作用。
对小鼠体内胆固醇形成的关键酶活力的影响如下表1及图4所示，马兰提取物均抑制HMG-CoA还原酶和ACAT的活性，减少胆固醇的自体合成，同时阻止胆固醇酯化。同时，通过测定CYP7a1的活性以及测定小鼠粪便中甾醇及胆汁酸的含量变化，结果发现，马兰提取物均可增强CYP7a1的活性，促使更多的胆固醇转化为胆汁酸，达到降低血胆固醇的目的。
表2 马兰组分对小鼠HMG-CoA、CYP7a1、ACAT的影响
组别 HMG-CoA（U/L）   CYP7a1（U/L） ACAT（U/L）
正常组 180.1士9.7a,b 13.87士1.4a,b 80.13士5.6b,c
模型组 185.1士8.6a 10.56士1.3c 84.22士8.6a,b
阳性对照组 178.2士11.3a,b 12.47士1.8b,c 75.58士10.7b,c
低剂量S组 172.4士7.7b,c 13.60士1.9a,b 74.96士10.4c
高剂量S组 163.0士9.5c 15.23士1.8a 67.45士6.1c
对高脂血症小鼠MDA、SOD、GSH-PX酶活力的影响如图5、图6、图7所示，马兰提取物均能减少活性氧的堆积和迅速分解脂质过氧化物，具有重要的防御自由基损伤作用。 

Claims (7)

1.一种马兰降血脂提取物，其特征在于该提取物是通过以下方法制备而成：马兰干燥、粉碎，粉碎，80%（体积分数）乙醇溶液，料液比1:10，65℃水浴，搅拌提取2 次，过滤，残渣以同样方法重复提取1 次，将合并的提取液减压浓缩除去乙醇，用3倍体积的石油醚或正己烷萃取两次，合并萃取部分，减压浓缩，浓缩液采用大孔吸附树脂进行脱色处理后，真空干燥，得到提取物。
2.根据权利要求1所述的一种马兰降血脂提取物在制备降血脂功能性食品中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种马兰降血脂提取物在降低总胆固醇（TC）、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDLC)上的应用。
4.根据权利要求1所述的一种马兰降血脂提取物在抑制HMG-CoA还原酶和ACAT的活性的应用。
5.根据权利要求1所述的一种马兰降血脂提取物在阻止胆固醇酯化的应用。
6.根据权利要求1所述的一种马兰降血脂提取物在增强CYP7a1的活性，促使胆固醇转化为胆汁酸的应用。
7.根据权利要求1所述的一种马兰降血脂提取物在减少活性氧的堆积和分解脂质过氧化物的应用。
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