CN103270938B - 一种美国玉兰与紫玉兰杂交制种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种美国玉兰与紫玉兰杂交制种的方法，为父本的紫玉兰花期早于美国玉兰2个月，首先对父本的紫玉兰花期的花粉保存，获得维持紫玉兰花粉活力的条件：采集微开紫玉兰花朵，取出雄蕊，均匀平铺在硫酸纸上，室温自然干燥；待雄蕊的花药开裂、花粉散出后，用80目孔径的铁筛收集花粉；用滤纸袋在干燥硅皿内干燥，干燥后锡箔纸包裹严密，放置于-70°C冰柜条件下保存；使用时自冰柜内取出，采用逐步升温解冻的方式，根据母本美国玉兰花最佳可授期的确定，杂交授粉生殖生物学基础研究，杂交果实及杂交种发育情况观察，以及制种保存的方法。本发明杂交技术易于操作，可有效获得美国玉兰与紫玉兰杂交种子。

Description

一种美国玉兰与紫玉兰杂交制种方法

一、技术领域

本发明涉及林业中杂交种优势利用领域，具体涉及一种美国玉兰(母本)与紫玉兰(父本)杂交制种的方法。

二、背景技术

随着我国经济的飞速发展，人民生活的不断提高，人们对环境绿化植物种类和质量的需求越来越高，因此园林植物的繁育已成为农林经济发展的首选产业之一。但是与发达国家相比，我国园林植物资源的应用种类甚少，园林植物优良观赏品种的数量已无法满足我国经济飞速发展的需要。因此，有必要大力加强园林栽培植物新品系的培育工作，不仅可以高效、优质、可持续地繁育观赏植物的新种质，为环境绿化和美化服务，而且在增强园林植物多样性，维持生活环境的生态平衡方面做出巨大的贡献。杂交育种作为创造新物种和改良作物品质的重要手段，促进了高等植物基因组的交流和进化。

作为木兰科（Magnoliaceae）木兰属（Magnolia）落叶乔木，玉兰是我国重要的资源植物，其分布广泛，在常绿阔叶林和常绿落叶混交林中常为建群树种。我国对木兰科观赏树种资源的开发利用历史悠久，多用于园林绿化和用材开发，还有一些具有较高的药用和香用价值，而这仅仅是对原种的利用层面。随着社会的发展，花卉产业升温，园林绿化、环保事业对玉兰的需求量日益增大。但目前栽培种类少，花型、花色单一，繁殖率低，价值高，严重影响其推广范围和发展速度。另外，木兰科中有不少树种天然种源量匮乏，如厚叶木莲（Manglietiapachyphylla）、观光木（Tsoongiodendron odorum）。除了毁灭性的砍伐对自然生境造成破坏外，其自然繁殖能力的衰退是种群自然更新不良、种群数量减少的主要原因。

早期，人们对玉兰的品种选育大都集中在自然变异和自然杂交的筛选基础之上。在自然条件下，选出颜色、形态、物候期等性状发生变异的植株，通过嫁接、扦插等技术手段，对变异品系进行无性扩繁，得到一些优良人工栽培品种。美国和日本对木兰科植物的开发利用多集中在木兰属植物的开发利用方面，成功地把荷花玉兰（Magnolia grandiflora）、日本辛夷（Magnolia kobus）、日本厚朴（Magnolia hypoleuca）应用在园林上，培育出数百个木兰属内的杂交种，其中以玉兰亚属内的落叶杂交种最多，同时新品种以每年1～2个的速度增加。我国木兰科植物育种工作起步较迟，大量的工作集中在种质资源调查、品种资源搜集等方面。西安植物园、浙江嵊县等地分别筹建了木兰科植物种质资源圃。现有的研究资料表明，木兰科植物一般以有性生殖为主，但是在生产实践中存在一定的制种困难问题。利用远缘杂交技术，可以实现不同品种植物优良性状特性的综合利用。远缘杂交，能够打破种属间的隔离，把两个或多个物种经过自然界长期选择而积累起来的优良特性，在试验条件下进行重新组合，以期获得更加丰富的变异类型（Chen et al.,2003）。利用杂种优势使杂交后代表现出较强的生活力，提高玉兰品系的抗病性和抗逆性。通过杂交育种可以创造现有玉兰中所没有的特异的新类型。对杂种形成过程中某些中间阶段的研究，有利于我们制定控制新种形成过程的方法，从而获得具有良好综合性状的杂种。

美国玉兰原产北美洲，在美国广泛分布，叶色嫩绿，叶片宽大，长宽可达21×30cm，花朵硕大，黄绿色，南京地区5月初开始开花，花期连续1月左右，观赏性较强，而且美国玉兰生长速度较快，材质优良，抗逆性也较强。紫玉兰原产中国，是木兰科木兰属落叶灌木，地栽高3至5m，盆栽高1至1．5m，常丛生，叶倒卵形或椭圆形，花单生于枝顶，钟状，花被9片，3片排成一轮，紫色或紫红色，春季先花后叶或花叶同放，南京地区花期为2-3月。Gary W Knox（2002）报道美国玉兰与美国本土生长的玉兰亚属的植物可以有效地亲和，但是生长在佛罗里达州地区的美国玉兰明显表现出雄蕊发育不良的现象。利用美国玉兰作为母本，通过传统育种手段培育出优良的观赏品系‘Yellow Bird’、‘Elizabelth’和‘Butterflies’。前期研究结果表明，南京地区生长的美国玉兰与紫玉兰也具有明显的花期不遇的现象，而且紫玉兰自然条件下结实率较低，但新鲜花粉萌发率较高（徐棉芬，2010）。所以，以美国玉兰为母本，紫玉兰为父本进行杂交育种研究，以期培育具有较高观赏价值的新品系，对于丰富园林植物多样性，维持生活环境的生态平衡方面具有重要的发展前景和应用价值。

三、发明内容

本发明的目的：通过杂交育种手段，以美国玉兰为母本，紫玉兰为父本培育出玉兰杂交新品种的方法。尤其是较低成本的方式获得维持紫玉兰花粉活力条件，确定美国玉兰最佳可授期，阐明杂交种制种与储存程序。

本发明的技术解决方案是：以美国玉兰为母本、紫玉兰为父本培育出玉兰杂交种的方法，紫玉兰花期早于美国玉兰2个月，首先对父本的紫玉兰花期的花粉保存，获得维持紫玉兰花粉活力简单易行的最佳条件：采集微开紫玉兰花朵，取出雄蕊，均匀平铺在硫酸纸上，室温自然干燥；待雄蕊的花药开裂、花粉散出后，用80目孔径的铁筛收集花粉；用滤纸袋在干燥硅皿内干燥，干燥后锡箔纸包裹严密，放置于-70±1°C冰柜条件下保存；使用时自冰柜内取出，采用逐步升温解冻的方式：-70±1°C经10±1min至-20±1°C经10±1min至4±0.5°C再经10±1min至室温。

同时对美国玉兰开花动态及最佳可授期进行观察确定，去雄后采用人工授粉的方式完成美国玉兰和紫玉兰的杂交，培育出杂交种：

从形态上将美国玉兰的开花进程区分为4个阶段：花苞阶段、微开阶段、半开阶段、全开阶段。不同开花阶段柱头分泌物的量有所不同。美国玉兰花在微开阶段柱头分泌物的量达到最大值，柱头上紫玉兰花粉萌发量最多，为最佳授粉花期。授粉时选择美国玉兰树冠中部处于微开阶段的花朵，去除雄蕊，将上述得到的紫玉兰花粉用毛笔轻轻地涂抹在柱头上，迅速套袋；5d后去除套袋，这时柱头已经变成黄褐色，柱头萎焉脱落，40d后子房明显膨大，80d聚合果果皮逐渐变红，120-150d果实基本发育成熟，直到杂交聚合果部分蓇葖果果皮逐渐开裂，并露出红色种子，此时采摘杂交聚合果；将采回的成熟果实摊于阴凉通风处，使大多数聚合蓇葖果自然开裂；收集从果实上脱落下来的种粒，浸泡于清水中，使种粒从其肉质外皮中挤出，然后用温和的洗涤液将种子上油膜清洗干净后，获得可储存种子。

处理后的种子在4±0.5℃低温沙藏保存。

本发明的有益效果是，将异种的紫玉兰与美国玉兰杂交，其中美国玉兰为母本，紫玉兰为父本。本发明所提供的杂交育种的方法，利用花粉最佳保存条件与解冻条件的筛选，有效提高了储存2个月后紫玉兰花粉的生活力，花粉的萌发率可达60%左右，解决了两种植物间花期不遇的问题，使美国玉兰与紫玉兰花期不遇时仍能够顺利杂交。本发明采用最合适的低温保存条件，即-70±1°C冰柜条件下保存；保存条件简单且效果好。本发明同时利用有效的生物学研究手段，明确最佳可授期，验证了两种植物亲和性程度的高低。明确授粉母本花朵位置与杂交种发育的相关性，优化了制种程序，阐明了杂交果及种子发育的时空特征及采种制种方法。该杂交组合结果率高，并制种成功，培育具有较高观赏价值的新品系，对于丰富园林植物多样性，维持生活环境的生态平衡方面具有重要的发展前景和应用价值。制种成功后进行播种的种子萌发率高，并已经表明苗木兼具美国玉兰性状和本地紫玉兰的优点。

四、附图说明

图1为不同开花阶段美国玉兰花与柱头形态照片:

图中（1）花苞阶段前期美国玉兰柱头；（2）微开阶段美国玉兰柱头；（3）半开阶段美国玉兰柱头；（4,5）全开阶段美国玉兰柱头;（6）美国玉兰花开放状态。

图2为紫玉兰花粉在美国玉兰柱头上萌发与花粉管生长动态照片:

（1）授粉2h美国玉兰柱头，紫玉兰花粉开始萌发；

（2）授粉4h美国玉兰柱头，紫玉兰花粉大量萌发；

（3）授粉6h紫玉兰花粉进入花柱；

（4）授粉8～12h美国玉兰花柱；

（5）授粉40h，紫玉兰花粉管束到达美国玉兰柱头基部；

（6）授粉50h，紫玉兰花粉管束进入子房并接近胚珠。

图3为美国玉兰与紫玉兰杂交聚合果的发育与种子形态：

（1）授粉7d后的杂交美紫聚合果；

（2）授粉40d后的杂交美紫聚合果；

（3）授粉80d的杂交美紫聚合果；

（4）授粉120～150d的杂交美紫聚合果；

（5）成熟的杂交美紫聚合果；

（6）成熟的杂交美紫种子形态。

图4为低温储存条件下紫玉兰花粉生活力动态变化曲线。

图5为不同解冻方式对花粉活力的影响。

五、具体实施方式

种间杂交获得杂交种的关键因素不仅在于种与种之间亲和性程度的高低，还在于雌雄配子体生活力的大小。在美国玉兰×紫玉兰杂交制种过程中，保持花粉活力，捕捉最佳可授期是制种过程的主要实施措施。

（一）、紫玉兰花粉最佳保存条件的优化

1.不同干燥时间紫玉兰花粉相对含水量的变化

以不干燥的新鲜花粉为对照，不同干燥时间处理下的花粉相对含水量的变化如表1所示。随着干燥时间的延长，花粉的相对含水量逐渐降低。干燥2h的花粉水分损失速度最快，相对含水量减少了8.50%。与2h相比，4h相对含水量减少了4.68%，相对含水量减少较慢；6h相对含水量减少了13.17%，与干燥前2h含水量减少的速度相当。

表1不同干燥时间内花粉相对含水量的变化

2.低温储存条件下不同含水量紫玉兰花粉生活力的动态

将0、2、4、6h干燥处理后的紫玉兰花粉置于-70°C和液氮中保存，分别于0、30、60d后测定花粉生活力。花粉生活力测定利用离体培养方法进行，培养基成分为5%的蔗糖+0.1%硼酸+0.01%CaCl₂，测定结果如图4显示。不同相对含水量的花粉在-70°C和液氮中保存后花粉生活力变化趋势相似，其中-70°C保存的花粉生活力随着保存时间的延长下降速度略高于液氮，尤其是新鲜花粉-70°C保存条件下，花粉生活力的下降速度最快，干燥2h花粉次之，干燥4h花粉下降速度最慢，几乎与液氮储存相当，在保存60d后花粉生活力可达59.37%，与液氮储存的63.81%花粉生活力差异极小。干燥6h紫玉兰花粉生活力相对较低，随着保存时间的延长，虽然花粉生活力下降缓慢，但在60d后依然维持较低水平。

以上紫玉兰花粉在离体条件下，紫玉兰花粉的最佳实践操作方法为对花粉进行4h的干燥处理后-70℃保存，保存2个月（再进行播种）后采取-70℃经10min→-20℃再经10min→4℃再经10min到室温逐步解冻方式，花粉维持的活力较高。

3.解冻方式与花粉萌发率的相关性

将干燥4h的紫玉兰花粉在-70°C保存60d后按照表2设置解冻方式。

表2紫玉兰花粉解冻方式的筛选

Table2Thawing methods filtrated of Magnolia liliflora pollen

四种解冻方式中，美国玉兰花粉采用逐步升温的解冻方法解冻效果最佳，花粉存活率最高，达到62.03%，4h后花粉管的平均生长长度为369.86μm；其次为冰水浴的解冻方式，花粉萌发率降低了将近52.59%，花粉管的生长速度也明显减慢；自来水浴和37℃水浴的解冻效果较为相近，花粉萌发率均接近50%，速率分别约56.38、58.48μm/h(图5)。因此可以得出结论，对于超低温保存的美国玉兰花粉，解冻效果：逐步升温＞冰水浴＞37°C水浴＞自来水。图5给出了不同解冻方式对花粉活力的影响。

（二）、美国玉兰最佳可授期的确定

定点、定时观察美国玉兰开花物候进程，记录其从花芽期到开花期的动态变化及各发育时期雌蕊群、雄蕊群的形态特征，用OLYMPUS–SZX7体式显微镜观察记录柱头发育的形态特征，明确可授粉的最佳时段。

观察结果表明，美国玉兰的开花动态过程可分为4个阶段：花苞阶段、微开阶段、半开阶段及全开阶段。根据各阶段花器官形态及柱头分泌物的分泌情况，可确定美国玉兰的柱头从花苞—半开阶段一直保持可授性，但微开阶段柱头上的透明分泌物量达到最大值，里面的雌蕊已经发育成熟，花柱挺立，柱头向四周弯曲伸展开，为柱头的最佳可授期。

（三）、杂交授粉及花粉在美国玉兰柱头上的萌发与生长

1.杂交授粉及花粉在美国玉兰柱头上的萌发与生长

选择5年生美国玉兰植株作为母本，树冠空间高度大约1-2m。以树冠0.5m处为分界线，分为树冠中上部与下部。授粉时选择树冠中上部位的花朵，轻轻掰开花瓣，用镊子轻轻夹断雄蕊花丝，避免碰触雌蕊。迅速去雄后，用毛刷蘸取紫玉兰的花粉，轻柔地涂抹在柱头部位，随后进行套袋处理，并做好标记。

2.紫玉兰花粉在柱头上萌发与花粉管生长的生物学基础观察

人工控制授粉后，分别在0、2、4、6、8、10、14、20、30、40、50、60、70h后采集雌蕊3～5个，50%FAA固定，24h后转移至70%酒精中，4℃冰箱沙储保存备用。观察前从酒精液中取出雌蕊，用50%、30%和10%系列酒精溶液逐级复水，每级5min，然后放入2mol L^-1NaOH溶液中，60℃条件下软化15min左右，蒸馏水冲洗3～5次后，取出柱头于0.1%脱色苯胺蓝溶液染色12h以上。观察时将花柱连同子房取出，用解剖针将花柱和子房纵向剖开平铺于载玻片上，盖玻片轻轻压平。在Olympus荧光显微镜下观察花粉粒在柱头上萌发、花粉管在花柱中生长及伸向胚珠的情况并拍照。

观察结果如图2所示，刚刚着落于柱头时，紫玉兰花粉未萌发，多数只处于萌动状态；授粉4h后，有大量花粉萌发，并且花粉管长度明显伸长；6h后紫玉兰花粉管穿过美国玉兰柱头组织，向花柱内生长，长度超过花粉直径的12倍；8～12h后大部分花粉都已萌发，并且花粉管在花柱内形成集束状；14h后花粉管生长至花柱的1/3处；16h花粉管生长至花柱的1/2处；20h花粉管生长至花柱的2/3处；30h花粉管生长至花柱的3/4处；40h花粉管逐渐接近花柱底部；50h花粉管生长至花柱底部，成功进入子房。初期花粉管的生长速度较慢，中期花粉管在花柱组织中极度伸长，后期花粉束向子房内的胚珠生长，速度又减慢。但在受精前不存在亲和性障碍，花粉和柱头可以互相识别并亲和。柱头上的分泌物能够有效促进花粉管的萌发和生长。

（四）、杂交果实及杂交种发育情况观察

在杂交试验中，美国玉兰（♀）×紫玉兰（♂）组合授粉546朵。在5d后解开套袋，授粉的美国玉兰子房发育情况良好，花瓣全部脱落，柱头部分干枯脱落；授粉后40d的美国玉兰（♀）×紫玉兰（♂）杂交聚合果（下简称“美紫聚合果”）子房开始膨大；80d后杂交果果皮逐渐变红；120～150d果实基本发育成熟，果皮为粉红色或者鲜红色。成熟后的果实，果皮开裂，露出红色的外种皮。9月底，美紫聚合果逐渐发育成熟，对果皮开裂并露出红色外种皮的聚合果进行采摘，总计收获了26个杂交聚合蓇葖果，结实率为4.76%。成熟的美紫聚合果呈粉红色，近圆柱形，顶端具短喙，平均果长3.95cm，宽2.18cm。单果结籽率低，一般一个杂交果中只有4～5粒种子，1个子房中有1～2枚种子，大部分子房中的胚珠发生了败育，不能形成饱满的种子。每颗种子的最外层有一层红色的肉质外种皮包裹，平均每粒种子鲜重可达0.21g/粒。剥除外种皮，可以看见心形的种子，中种皮坚硬，呈棕黑色至黑色，内种皮膜质，包裹在胚乳最外层（如图3）。

表3美×紫杂交成熟果实发育情况

Table3The developmental situation of M.acuminate×M.liliflora

（五）、杂交果实采摘与制种储藏方法

当果实转为鲜红色且稍绽裂时，采摘时期最佳。成熟果实果皮为粉红色或者鲜红色；成熟后的果实，果皮开裂，收集从果实上脱落下来的种子，在通风处摊晾，待鲜红的外种皮变黑、变软后浸泡于清水中一昼夜，轻轻揉搓种粒，去除外种皮，然后用温和的肥皂液将种子上油膜清洗干净，4℃低温沙藏保存直到播种。

Claims (1)

1.一种美国玉兰与紫玉兰杂交制种方法，其特征是以美国玉兰为母本、紫玉兰为父本培育出玉兰杂交种，为父本的紫玉兰花期早于美国玉兰2个月，首先对父本的紫玉兰花期的花粉保存，维持紫玉兰花粉活力的条件：采集微开紫玉兰花朵，取出雄蕊，均匀平铺在硫酸纸上，室温自然干燥；待雄蕊的花药开裂、花粉散出后，用80目孔径的铁筛收集花粉；花粉装入滤纸袋在干燥硅皿内干燥，干燥后用锡箔纸将花粉包裹严密，放置于-（70±1）℃冰柜条件下保存；使用时自冰柜内取出，采用逐步升温解冻的方式：-（70±1）℃ 经（10±1）min ，然后-（20±1）℃经（10±1）min，（4±0.5）℃再经（10±1）min ，然后至室温；对美国玉兰的开花动态及最佳可授期进行观察确定，去雄后采用人工授粉的方式完成美国玉兰和紫玉兰的杂交，培育出杂交种：从形态上将美国玉兰的开花进程区分为4个阶段：花苞阶段、微开阶段、半开阶段、全开阶段；不同开花阶段柱头分泌物的量有所不同；当美国玉兰花在微开阶段时柱头分泌物的量达到最大值，柱头上紫玉兰花粉萌发量最多，为最佳授花期；选择美国玉兰树冠中部处于微开阶段的花朵，去除雄蕊，将上述得到的紫玉兰花粉用毛笔轻轻地涂抹在柱头上，迅速套袋；5d后去除套袋，这时柱头已经变成黄褐色，柱头萎焉脱落，40d后子房明显膨大，80d聚合果果皮逐渐变红，120-150d果实基本发育成熟，直到杂交聚合蓇葖果中有部分果实的果皮逐渐开裂，并露出红色种子，此时采摘杂交聚合蓇葖果；将采回的成熟果实摊于阴凉通风处，使大多数杂交聚合蓇葖果自然开裂；收集从果实上脱落下来的种粒，浸泡于清水中，使种粒从其肉质外皮中挤出，然后用温和的洗涤液将种子上油膜清洗干净后，获得可储存种子。

2. 如权利要求1所述的美国玉兰与紫玉兰杂交制种方法，其特征在于：在离体条件下，对紫玉兰花粉进行4h的干燥处理后-70℃保存，保存2个月后采取-70℃经10min，然后-20℃经10min，4℃再经10min，然后到室温的逐步解冻方式。