CN103268432A

CN103268432A - 一种基于串联质谱鉴定蛋白质磷酸化修饰位点的方法

Info

Publication number: CN103268432A
Application number: CN2013101672374A
Authority: CN
Inventors: 张珈; 杨明坤; 葛峰; 熊倩; 郑鹏; 李重阳
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2013-08-28

Abstract

本发明提供了一种基于串联质谱鉴定蛋白质磷酸化修饰位点的方法。本发明结合串联质谱mgf格式数据（mascotgenericfile）与Mascot以及pFind数据库搜索程序结果数据，采用Perl语言程序编程，对鉴定的蛋白质磷酸化修饰位点进行快速的重新定位，重新定位后的蛋白质磷酸化修饰位点采用新的得分算法，具有更高的可信度。本发明还实现了蛋白质磷酸化修饰位点相关质谱图的快速自动化的批量导出。本发明具有操作简单，修饰位点定位信息可信度高以及提取的质谱图分辨率高等优点，在蛋白质组学研究领域具有良好的应用前景。

Description

一种基于串联质谱鉴定蛋白质磷酸化修饰位点的方法

技术领域

本发明涉及生物信息领域，具体涉及一种基于串联质谱鉴定蛋白质磷酸化修饰位点的方法。

背景技术

蛋白质磷酸化是生物界最普遍，也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰。在细胞中，大约有1/3的蛋白质被认为是经过磷酸化修饰的。蛋白质磷酸化和去磷酸化这一可逆过程，是原核和真核生物细胞表达调控的关键环节，几乎调节着包括细胞增殖，发育，分化信号转导，细胞凋亡，神经活动，肌肉收缩以及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动，并且可逆的蛋白质磷酸化是目前所知道的的最主要的信号转到方式。因此，蛋白质磷酸化的分析以及磷酸化位点的鉴定已成为目前众多生物化学家以及蛋白质组学家所关心的内容。

运用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态以及蛋白质中磷酸化修饰位点。随着生物质谱的灵敏度、精确度，以及高通量的不断发展，其在蛋白质组学研究中扮演着越来越重要的角色，它在蛋白质鉴定及翻译后修饰位点鉴定等方面已得到了较广泛的应用。在液相-质谱仪中，磷酸化肽段经碰撞诱导解离（Collision Induced dissociation，CID）产生特异性片段，丢失80Da（HPO₃）和98Da（H₃PO₄）的子离子，检测所产生的全部碎片离子，并根据其质量数通过数据库检索来推断肽段序列和磷酸化位点。

运用质谱鉴定蛋白磷酸化修饰位点具有高选择性，高灵敏度的特点。但是，在进行数据库检索时，由于将磷酸化修饰选择为可变修饰，数据库匹配过程时理论肽段中磷酸化肽段的数目要远高于非磷酸化肽段，导致磷酸化肽段的错误鉴定数目要远高于非磷酸化肽段，即磷酸化肽段鉴定的假阳性概率较高，蛋白质磷酸化位点鉴定的准确性和通量都受到了很大的限制。因此，数据库检索得到的蛋白质磷酸化修饰位点的数据需要再进行评估。目前，针对蛋白磷酸化位点修饰位点评估的软件包括MaxQuant中PTMScore，Ascore以及PhosphoRS等，而这些软件局限性比较高，仅适用于特定的质谱仪器产生的数据以及特定的数据库检索程序，比如MaxQuant中PTMScore与PhosphoRS仅试用于Thermo公司的一系列质谱，Ascore仅兼容Sequest数据库检索结果；此外，基于MaxQuant中的PTMScore算法，也开发了一些修饰位点定位方法，如文献Ming-kun Yang,Zhi-xian Qiao,Wan-yi Zhang,Qian Xiong,JiaZhang,Tao Li,Feng Ge and Jin-dong Zhao,“Global Phosphoproteomic Analysis Reveals DiverseFunctions of Serine/Threonine/Tyrosine Phosphorylation in the Model CyanobacteriumSynechococcus sp.Strain PCC7002”,J.Proteome.Res,2013,12(4),1909-1923.中使用的PTMScore算法，对磷酸化位点进行了评估，但该方法仅兼容Bruker公司质谱数据。本发明提出一种基于串联质谱鉴定蛋白磷酸化修饰位点的方法，实现了蛋白质磷酸化位点的重新定位及可信度评估，并且本方法可自动导出重新定位的蛋白质磷酸化位点对应的高分辨质谱图。由于不同类型质谱仪器产生的原始数据，都可以通过现有的开源免费软件ProteoWizard，将质谱原始数据转化为mgf格式数据，而本方法主要基于mgf格式数据（mascot generic file），并利用文献Jesper V.Olsen,Blagoy Blagoev,Florian Gnad,Boris Macek,Chanchal Kumar,PeterMortensen,and Matthias Mann,“Global,In Vivo,and Site-Specific Phosphorylation Dynamics inSignaling Networks”,2006,127(3),635-48.中的打分算法公式：

p_value=(k!/(n!(n-k)!)*p^k*(1-p)^(n-k)=(k!/(n!(n-k)!)*0.04^k*0.96^(n-k)

Score=-10*Log₁₀(p)

对磷酸化修饰位点进行重新定位、可信度评估以及谱图自动导出，因此，本发明方法兼容所有质谱的数据分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于串联质谱鉴定蛋白质磷酸化修饰位点的方法，对蛋白质磷酸化修饰位点重新定位以及可信度评估，从而提高磷酸化修饰鉴定的准确性和可信度；并且能够自动导出磷酸化修饰可信位点的质谱图。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种基于串联质谱鉴定蛋白质磷酸化修饰位点的方法，步骤如下：

1)磷酸肽的数据库检索：

步骤1、利用开源免费软件ProteoWizard将质谱采集的原始数据转化为可视化的mgf格式的数据（mascot generic file）；

步骤2、利用本地MASCOT数据库以及pFind数据库进行检索，筛选FDR(FalseDiscovery Rate)值小于1%的磷酸化修饰肽段。

2)蛋白质磷酸化修饰位点重新定位及评估：

步骤1、数据的预处理：使用perl语言程序编写的数据处理程序，处理质谱mgf格式数据（mascot generic file）；在二级质谱数据（MS2）中，采取每100个质荷比（m/z）区间，选取四个最高的二级质谱峰策略，过滤数据（过滤后数据含有质荷比与峰强度）。

步骤2、蛋白质磷酸化修饰位点重新定位及可信度评估：使用perl语言程序编写的蛋白质磷酸化修饰位点重新定位与可信度评估程序，处理MASCOT以及pFind数据库检索结果文件，通过解析MASCOT以及pFind数据库检索结果文件，获取所有磷酸化肽段信息，包括磷酸化肽段谱图名称，磷酸化肽段序列及分子量，磷酸化修饰位点数，磷酸化肽段价态等。根据文献中报道的评估磷酸化修饰位点方法（Jesper V.Olsen,Blagoy Blagoev,Florian Gnad,Boris Macek,Chanchal Kumar,Peter Mortensen,and Matthias Mann,“Global,In Vivo,andSite-Specific Phosphorylation Dynamics in Signaling Networks”,2006,127(3),635-48.），利用上一步过滤的数据以及磷酸化肽段信息，重新计算匹配的b或y系列离子，并采用以下公式对修饰位点进行新的打分计算：

p_value=(k!/(n!(n-k)!)*p^k*(1-p)^(n-k)=(k!/(n!(n-k)!)*0.04^k*0.96^(n-k)

Score=-10*Log₁₀(p)

其中n为磷酸化肽段所有匹配的b或y系列离子数，k为所有匹配的有磷酸化修饰的b或y系列离子数，p_value为重新定位后的磷酸化修饰位点可信度值，Score即为重新定位后磷酸化修饰位点对应的得分；对数据库鉴定到的蛋白质磷酸化修饰位点（FDR值小于1%的磷酸化修饰肽段）进行重新定位和可信度评估。

3)蛋白质磷酸化修饰位点谱图提取：

步骤1、与步骤2）数据预处理方法一样：使用perl语言程序编写的数据处理程序，处理质谱mgf格式数据（mascot generic file）；在二级质谱数据（MS2）中，采取每100个质荷比（m/z）区间，选取四个最高的二级质谱峰策略，过滤数据（过滤后数据含有质荷比与峰强度）。

步骤2、蛋白质磷酸化修饰位点谱图提取：使用perl语言程序编写的蛋白质磷酸化修饰位点谱图提取程序，利用磷酸化修饰位点定位方法，将重新匹配的b或y系列离子以及重新定位的磷酸化修饰位点注释谱图，并自动提取重新定位的蛋白质磷酸化修饰位点对应的谱图。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1)本发明中所需质谱数据为mgf格式，所有质谱产生的原始数据，均可通过开源软件ProteoWizard转化为mgf格式数据，并适用于本发明中。

2)本发明中采用的算法是基于公共数据库检索程序MASCOT以及pFind的检索结果，其中MASCOT是目前使用最广泛的数据库检索程序之一，pFind是最新开发的数据库检索程序，也具有很好的鉴定效果，本发明可极大地提高两种数据库检索结果可信度。

3)相对于数据库检索鉴定到的磷酸化修饰位点，本发明通过对磷酸化修饰位点重新定位与评估，使磷酸化修饰位点的鉴定更准确、更可信。

4)本发明基于重新定位的磷酸化修饰位点，能够自动提取高分辨的质谱图。

附图说明

图1为一种基于串联质谱鉴定蛋白质磷酸化修饰位点的方法的流程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。

实施例1：基于Bruker公司离子阱质谱（amazon）数据的蛋白磷酸化修饰位点的鉴定，步骤如下：

1)磷酸肽数据库检索：

本发明的是基于MASCOT以及pFind数据库检索结果，因此，需要先进行数据库检索。本实施例使用的质谱数据来自Bruker公司的离子阱质谱amazon ETD。质谱采集到的原始数据为“*.yep”格式数据，使用该公司的软件DataAnalysis4.0软件，进行标峰转化，导出结果并保存为mgf格式文件，再使用开源免费软件ProteoWizard将数据转化为标准的mgf格式文件。

打开本地数据库检索软件MASCOT或pFind，导入mgf格式数据文件，并设定相关检索参数：胰蛋白酶消化（trypsin），半胱氨酸烷基化（carbamidomethylation(Cys)），甲硫氨酸氧化（oxidation(M)），丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化（phospho(ST)，phospho(Y)），胰蛋白酶漏切位点为2个（two missed cleavages），母离子质量偏差为±0.4Da，子离子质量偏差为±0.6Da。

MASCOT以及pFind检索结果通过FDR值计算，获取FDR小于1%的磷酸化肽段，选取磷酸化肽段对应的谱图名称，保存为文本文档，为下一步位点评估以及谱图自动导出做准备。MASCOT对应的谱图名称为“qn”，n为阿拉伯数字；pFind对应的谱图名称为单一的阿拉伯数字，为了便于区别，我们将pFind对应的谱图名称改为“pn”，即在pFind导出的谱图名称前加上字母p。

2)磷酸化修饰位点重新定位及评估：

首先，需要对质谱mgf格式数据进行预处理。mgf格式数据包含二级质谱图信息，在二级质谱数据（MS2）中，采取每100个质荷比（m/z）区间，选取四个最高的二级质谱峰策略，过滤数据。

然后对修饰位点进行重新定位与可信度评估：

a)通过MASCOT以及pFind数据库检索，获得相应的检索结果文件，比如MASCOT的“F001001.dat”或是pFind的“001001.txt”检索结果文件；

b)解析MASCOT与pFind检索结果文件，根据FDR值小于1%的磷酸化肽段谱图名称，提取每个磷酸化肽段对应的二级谱图鉴定的结果信息，包括磷酸化肽段谱图名称，磷酸化肽段序列及分子量，磷酸化修饰位点数，磷酸化肽段价态等；

c)根据鉴定到的磷酸化肽段信息，重新计算每张谱图理论碎片离子（b离子、b-H₂O离子、b-NH₃离子、y离子、y-H₂O离子、y-NH₃离子）；

d)计算得到的理论碎片离子与本步骤中预处理过的mgf数据进行匹配：由于磷酸化肽段含有可能的磷酸化修饰位点不止一个（含有多个丝氨酸，苏氨酸及酪氨酸），因此，每个位点都可能是磷酸化位点，需要考虑每种可能的情况；

e)针对上述磷酸化肽段每种可能的修饰位点，在0.6Da的误差范围内，进行b、y离子匹配，并考虑中性丢失（即丢失98Da的子离子），统计每种可能的磷酸化位点对应的匹配的全部b、y离子数（n）以及含有磷酸化修饰的b、y离子数（k）；

f)通过公式计算修饰位点得分：

p_value=(k!/(n!(n-k)!)*p^k*(1-p)^(n-k)=(k!/(n!(n-k)!)*0.04^k*0.96^(n-k)

Score=-10*Log₁₀(p)

g)上述磷酸化肽段每种可能的修饰位点均可得到重新计算的得分，最低的分比最高得分小于5，则认为其可能性较小，舍弃该种可能性，剩下每种可能的修饰位点都有对应的评估得分以及可信值p_value。

h)通过位点重新定位与评估，磷酸化修饰位点具有更高的可信度得分。

3)蛋白质磷酸化修饰位点谱图提取：

首先，需要对质谱mgf格式数据进行预处理。本领域技术人员应当了解，mgf格式数据包含二级质谱图信息，在二级质谱数据（MS2）中，采取每100个质荷比（m/z）区间，选取四个最高的二级质谱峰策略，过滤数据。

采用上一步中修饰位点重新定位相同算法，首先对每种可能修饰位点进行评估，选择可信度较高的磷酸化肽段对应的修饰位点，将匹配的一系列b或y离子注释到谱图中，并利用perl语言编程中GD语言包，进行谱图绘制，批量导出注释的含有磷酸化修饰位点的高分辨谱图。

应用本实施例，在Bruker离子阱质谱（amazon）上采集的质谱数据采用MASCOT与pFind软件检索，共鉴定到991个磷酸化肽段（含冗余磷酸化肽段），采用本发明对鉴定结果进行处理，通过位点重新定位与评估以及高分辨质谱图的筛选，最终得到561个高可信度的磷酸化肽段（含冗余磷酸化肽段）。经过本方法处理后，有效的去除了数据库检索软件带来的假阳性概率，使鉴定到的磷酸化肽段以及位点可信度更高。

实施例2：基于AB Sciex公司TripleTOF4600质谱数据的蛋白磷酸化修饰位点的鉴定

在该实施例中，TripleTOF质谱采集的数据格式为“.wiff”，可直接使用开源免费软件ProteoWizard将数据转化为标准的mgf格式文件。再进行MASCOT以及pFind数据库检索，并对磷酸化修饰位点进行重新定位，可信度评估以及谱图批量自动导出，具体实施方法同实施例1。

应用本实施例，对AB Sciex公司TripleTOF4600质谱采集的数据进行磷酸化位点评估，同样得到高可信度的磷酸化肽段及位点，有效的去除了数据库检索软件带来的假阳性概率。最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当了解，本发明适用于所有类型质谱数据，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims

1.一种基于串联质谱鉴定蛋白质翻译后修饰位点的方法，其步骤是：

磷酸肽的数据库检索：

步骤1、利用开源免费软件ProteoWizard将质谱采集的原始数据转化为可视化的mgf格式的数据；

步骤2、利用MASCOT数据库以及pFind数据库进行检索，筛选FDR 值小于1%的磷酸化修饰肽段；

蛋白质磷酸化修饰位点重新定位及评估：

步骤1、数据的预处理：使用perl语言程序编写的数据处理程序，处理质谱mgf格式数据；

步骤2、蛋白质磷酸化修饰位点重新定位及评估：使用perl语言程序编写的蛋白质磷酸化修饰位点重新定位与评估程序，处理MASCOT以及pFind数据库检索结果文件，通过解析MASCOT以及pFind数据库检索结果文件，获取所有磷酸化肽段信息，包括磷酸化肽段谱图名称，磷酸化肽段序列及分子量，磷酸化修饰位点数，磷酸化肽段价态，根据文献中报道的评估磷酸化修饰位点方法，利用上一步过滤的数据以及磷酸化肽段信息，重新计算匹配的b或y系列离子，采用以下公式对修饰位点进行新的打分计算：

p_value = (k!/(n!(n-k)!) * p^k * (1-p)^(n-k) = (k!/(n!(n-k)!) * 0.04^k * 0.96^(n-k)

Score = -10*Log₁₀(p)；

其中n为磷酸化肽段所有匹配的b或y系列离子数，k为所有匹配的有磷酸化修饰的b或y系列离子数；，p_value为重新定位后的磷酸化修饰位点可信度值，Score即为重新定位后磷酸化修饰位点对应的得分，对数据库鉴定到的蛋白质磷酸化修饰位点进行重新定位和评估；

蛋白质磷酸化修饰位点谱图提取：

步骤1、与步骤2）中数据预处理方法一样：使用perl语言程序编写的数据处理程序，处理质谱mgf格式数据；

步骤2、蛋白质磷酸化修饰位点谱图提取：使用perl语言程序编写的蛋白质磷酸化修饰位点谱图提取程序，利用磷酸化修饰位点定位方法，将重新匹配的b或y系列离子以及重新定位的磷酸化修饰位点注释谱图，自动提取重新定位的蛋白质磷酸化修饰位点对应的谱图。

2.根据权利要求1所述的一种基于串联质谱鉴定蛋白质翻译后修饰位点的方法，其特征在于：所述步骤2）和3）中将质谱采集的原始数据转化为可视化的mgf格式数据，并对数据进行预处理，在二级质谱数据中（MS2），采取每100个质荷比区间，选取四个最高的二级质谱峰策略，过滤数据,过滤后数据含有质荷比与峰强度。