CN103260693B - 基于丝素蛋白的微针及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
微针或微针装置包括微针针体,所述微针针体由底部延伸至穿透顶端,所述微针或微针装置由易于制造并具有高度生物相容性的、基于丝素蛋白的材料形成。所述微针装置可包括设置于基底的一个或多个微针。所述丝素蛋白可包含待运输进入或穿过生物屏障(如皮肤、组织和细胞膜)的活性试剂。丝素蛋白微针可为完全或部分可生物降解的和/或可生物蚀解的。所述丝素蛋白高度稳定,能承受室温储存、并且是可植入的。可对丝素蛋白结构进行调节,以控制活性试剂的递送速率。
Description
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e),本申请要求2010年10月19日提交的美国临时申请No.61/394,479的优先权,以引用的方式将其内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在由美国围立卫生研究院授予的基金号EB002520、由美国空军科研办公室(Air Force Office of Scientific Research)授予的基金号FA9550-10-1-0172、以及由美国国防高级研究计划局(Defence Advanced Research Projects Agency)授予的基金号W911-NF-07-1-0618的联邦政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明大体上涉及微针(microneedle)和微针装置、以及制造和使用所述微针和微针装置的方法。
背景技术
经皮给药由于使用方便并能避免高分子在胃肠道内降解,可作为用于药物和疫苗递送的有效途径[1]。对于经皮药物递送,微针已经成为皮下注射针的安全且相对无痛的替代品。然而,制造微针中使用的传统材料(金属和合成聚合物)伴随有多种限制,这影响了其生产和性能。
一种现有的微针技术利用可溶性聚-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)聚合物微针针体(microneedle body),所述针体装载有微颗粒(PLGA或羧甲基纤维素)(该微颗粒装填有感兴趣的药物)以提供药物缓释[2]。然而,这一微针系统的制造方法构成了限制,因为聚合物熔融温度高于135℃并且处理过程需要真空,而这些条件可能对多种温度敏感性药物不利,特别是多肽和蛋白质。
最近开发的微针系统通过用包含流感疫苗的聚合物(羧甲基纤维素、Lutrol F-68NF和D-(+)-海藻糖脱水物(dehydrate)的混合物)涂覆固体金属微针结构的方式[3],而得以使用室温处理。虽然引入的疫苗的活性可在处理期间部分保留[4,5],然而与大容量负载型(bulk loaded)结构相比,微针药物装载的涂覆方法仅提供了小的体积来包容(entrap)治疗物质。此外,基于金属的微针系统具有影响其功能的限制,例如,如果应用不当,存在破裂的风险[6],而如果细小金属结构残留在皮肤内,则存在炎性响应或感染的可能。
已经由生物相容且可溶的物质(例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和碳水化合物)制造出了大容量负载型微针[3,7]。由于这一可溶性系统的大容量负载,可给予相对较大的剂量。所述聚合物可在室温下固化。然而,虽然在处理期间可避免由高温引起的药物降解,由紫外线引起的固化可影响引入的药物的活性。另外,使用这些聚合物微针系统时,对药物释放动力学的控制有限。由于聚合物微针迅速溶解,目前已实现了相对短期的爆发递送。因此,对于生物相容性的、坚固的(robust)且有效的药物递送微针以及制造此类微针的改进方法,仍存在着强烈需求。
发明内容
微针可以是高效、使用简便且相对无痛的,但目前受困于多种限制:如不能精确控制药物的释放动力学、受限的载药量、在处理条件下药物活性降低或失活、以及在针-皮肤界面上局部感染的发作。为了这一目的,本发明人已经开发了生物相容性的、基于丝素蛋白(silk fibroin)的微针,所述微针在机械上坚固、在微针中使活性试剂的活性稳定、并针对受控药物释放行为而使得所述微针能够程序化降解。此外,由于活性试剂(如抗生素)可在基于丝素蛋白的微针中稳定,因此也能有利于对注射位点处的感染进行控制。
因此,本发明的方面提供了基于丝素蛋白的微针和微针装置,所述基于丝素蛋白的微针和微针装置用于穿过生物屏障(例如皮肤、组织或细胞膜)运输或递送活性试剂,所述活性试剂包括药物和生物分子;以及制造和使用所述基于丝素蛋白的微针和微针装置的方法。在一方面,本文提供的是包含丝素蛋白的微针,其中,所述微针包含例如按照预先确定的距离由底部(base)延伸(extending)至穿透顶端(penetrating tip)的微针针体。基于生物屏障的类型和/或用户的需求或应用,穿透顶端的直径可为任意大小。在一些实施方式中,穿透顶端的尺寸(dimension)(例如直径)可为约50nm-约50μm,例如,包括约200nm-约40μm、或约300nm-约30μm。在一些实施方式中,穿透顶端的尺寸(例如直径)可为小于500nm-约2μm。在一些实施方式中,穿透顶端的尺寸(例如直径)可为约300nm-约30μm。在一些实施方式中,穿透顶端的尺寸(例如直径)可为大于50μm或小于50nm。可选择微针针体的长度以将穿透顶端置于与底部相距预先确定的距离处,从而提供达到预先确定的深度的组织穿透,以递送活性试剂。在一些实施方式中,丝素蛋白微针的针体长度可为约15μm-约1500μm、或约200μm-约800μm。
在多个实施方式中,基于丝素蛋白的微针可进一步包含至少一种附加物质,其中,所述附加物质可分散于整个微针或者形成微针的一部分。所述附加物质可为造孔剂(pore-forming agent)、结构组件、生物传感器、或用于释放的活性试剂(任选地具有附加的赋形剂或佐剂)。
在某些实施方式中,基于丝素蛋白的微针可进一步包含活性试剂,例如,疫苗、抗生素、激素、肽、抗体和抗体样片段。在此类实施方式中,在储存或运输时,当将所述微针在高于0℃的温度下(例如,约为室温下)保存至少约24小时或更久时,所述活性试剂可维持其初始生物活性的至少约30%。因此,本文还提供了用于储存和递送至少一种活性试剂的微针。此类微针包含至少一种活性试剂和丝素蛋白,其中,所述微针具有底部和穿透顶端(其顶端直径为约50nm-约40μm);其中,当将所述微针在高于0℃的温度下保存至少约24小时时,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少约30%。在一些实施方式中,所述活性试剂为免疫原,例如疫苗。
在某些实施方式中,在至少约24小时或更久的时间内,可由给药将至少约10%或更多的分散于微针中的活性试剂释放入生物屏障中。
本文提供的另一方面为包含基底(substrate)和一个或多个本文所述的丝素蛋白微针的微针装置,其中,所述丝素蛋白微针整合至或附着至所述基底,并从所述基底延伸出;并且每一丝素蛋白微针包含底部和穿透顶端。微针的底部可安装在基底上或形成基底的一部分(可为刚性或柔性),例如,处于薄膜的形式,以与治疗位点处的表面相顺应(conform to)。在一些实施方式中,本发明的微针装置可包含基底和一个或多个丝素蛋白微针,所述丝素蛋白微针优选以预先确定的距离从所述基底中突出(projecting)。
在一些实施方式中,每一微针可从基底延伸出相同距离或不同距离,因此可在单个装置中提供具有恒定或变化的微针穿透深度的预先确定的分布(predefined profile)。可选择各微针针体的长度以将穿透顶端置于与底部相距预先确定的距离处,从而提供达到预先确定的深度的组织穿透,以递送至少一种活性试剂。
可将多个微针以随机图案(pattern)或预先确定的图案(如阵列)排列。可根据所需的治疗模式和治疗位点的特征选择微针之间的距离和多个微针的排列方式。微针可以是可生物降解的、可生物蚀解的(bioerodibel),或者也可被设计成微针的至少一部分被留在所穿透的组织中。一般来说,微针的底部和针体具有与顶端相同的直径或大于顶端的直径。可根据所需的治疗模式和治疗位点的特征选择微针针体的形状和直径。
本文还提供了用于制造基于丝素蛋白的微针和基于丝素蛋白的微针装置的方法。在一些实施方式中,此类制造方法涉及温和的处理条件,因此保持了分散于本文所述的微针中的活性试剂的生物活性。
本发明的另一方面涉及用于递送至少一种活性试剂穿过或进入生物屏障的方法。所述方法包括提供含有丝素蛋白和活性试剂的微针;使得所述微针穿透进入生物屏障,并允许由所述微针释放所述活性试剂。
在本文所述的任何方面的一些实施方式中,用于制造微针的丝素蛋白可以是再生的丝素蛋白。在一些实施方式中,丝素蛋白可以是无丝胶的(sericin-depleted)。
附图说明
图1为根据本发明的一个或多个实施方式的示例性微针的简图。
图2为根据本发明的一个或多个实施方式的微针装置的简图,所述微针装置包含从基底突出的多个丝素蛋白微针。
图3A-图3K显示了用于制造本发明的包含丝素蛋白的微针的一个或多个实施方式的示意性过程的示例步骤。图3A显示了作为用于制造微针模塑母模(molding master)的基底的硅(Si)晶片(wafer),所述硅晶片具有200nm厚的低应力氮化硅(Si3N4)层。图3B显示该晶片涂覆有1μm正性光刻胶(positive tone photoresist)(S1813,Rohm&Haas)。图3C显示进行光刻(photolithography),留下在后续刻蚀步骤中起到掩模(mask)作用的圆形光刻胶图案(patterns)。图3D显示用SF6气体进行各向异性反应离子刻蚀(RIE),刻蚀出图案化的Si3N4薄膜并暴露出下面的Si材料。图3E显示以氢氟酸、硝酸和乙酸混合物(HNA)进行的定时(timed)各向同性(isotropic)湿刻蚀,以根切(undercut)Si3N4掩模。图3F显示短暂的超声波浴移除残留的Si3N4圆形掩模,并暴露出下面的Si微针模具。图3G显示浇注于Si微针阳模(positive Si microneedle mold)上并固化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)聚合物。图3H显示从Si母模移除后的PDMS阴模(negative PDMS mold)。图3I显示将丝素蛋白水溶液与所需药物混合。图3J显示将装载有药物的丝素蛋白溶液浇注至所述PDMS模具上,并使所述溶液干燥以形成装载有药物的丝素蛋白薄膜。图3K显示从PDMS模具移除后的、装载有药物的、基于丝素蛋白的微针装置的一个实施方式。
图4A-图4C显示根据本发明的一个实施方式的示例性微针阳模塑母模及所得微针的照片。图4A显示Si微针模塑母模的一个实施方式,底部直径150μm、高60μm、顶端半径<500nm。图4B显示以高精度复制原始Si母模(例如,图4A中显示的Si母模)的丝微针结构。图4C显示图4B的丝微针顶端的放大视图,测得直径<2μm。
图5比较了来自甲醇处理的丝素蛋白薄膜与来自未处理薄膜的靛蓝(indigo)染料的释放情况。未处理的薄膜(上方)在接触组织时部分溶解,从而释放出靛蓝染料;而甲醇处理的薄膜(下方)则经扩散释放靛蓝染料。
图6A-图6C显示了甲醇处理对丝素蛋白薄膜的溶胀行为和药物释放行为的影响。图6A显示装载有活性红120(reactive red-120)染料(模型染料,MW=~1500)的水合(hydrated)丝素蛋白薄膜的一系列照片。图6B显示了多种甲醇处理(在数个浓度下、不同的处理持续时间)的装载有活性红120染料的丝素蛋白薄膜的累积释放行为。图6C显示甲醇处理(在指示浓度下、两个不同的处理时间)对装载有活性红120染料的丝素蛋白薄膜的薄膜渗透性的影响。
图7A-图7F显示了用于制造本发明的包含丝素蛋白的微针的一个或多个实施方式的示意性过程的示例步骤。图7A显示由高速铣削和化学湿法刻蚀制造的铝(A1)母模。图7B显示将PDMS浇铸至A1母模上以生产出PDMS阴模。图7C显示从A1母模中移开的PDMS阴模。图7D显示将装载有药物的丝素蛋白溶液浇铸至PDMS模具上。图7E显示使装载有药物的丝素蛋白溶液干燥,从而形成装载有药物的丝素蛋白微针。图7F示出了本文描述的装载有药物的丝微针的一个或多个实施方式(从PDMS模具移开后)。
图8A-图8F显示A1模塑母模和示例性的丝素蛋白微针的图片。图8A显示了机械铣削后的A1针模板的实例。图8B示出了化学刻蚀20分钟后的A1微针母模的实例。图8C示出了示例性A1微针母模的宏观视图。图8D示出了化学刻蚀2小时后的A1微针母模的实例。图8E示出了示例性丝微针贴片(patch)的宏观视图,例如出于可视的目的,在一个实施方式中,向所述贴片中加入活性红120染料。图8F显示丝素蛋白微针的一个或多个实施方式。出于可视的目的,所述丝素蛋白微针装载有活性红120染料。
图9A-图9C示出了从根据本发明的一个或多个实施方式的丝素蛋白微针中的分子释放(例如药物)的示例性研究模型和结果。图9A示出了描述对体外水凝胶皮肤模型中的载药丝素蛋白微针进行评价的示例性实验设置的示意方案。丝素蛋白微针穿透了聚合物膜和胶原水凝胶,随后以可控的方式释放模型药物。图9B显示通过显色底物检测5分钟释放及2小时释放后微针释放入胶原板(slab)的辣根过氧化物酶(HRP)的生物活性。图9C示出了在一段时间内(例如超过40小时),丝素蛋白微针在胶原水凝胶中总的模型药物释放,这通过胶原酶消化和吸收光谱法进行测定。图9C的插图描述了由丝素蛋白微针释放模型药物进入胶原水凝胶的早期事件(N=3,误差棒表示标准差)。
图10A-图10B显示装载有或未装载用于控制细菌生长的四环素抗生素的示例性丝素蛋白微针的结果。图10A示出了在暴露于装载有四环素的丝素蛋白微针和对照丝素蛋白微针的金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌苔(lawn)中,被清除区域的代表性照片。图10B示出了暴露于装载有四环素的丝素蛋白微针和对照丝微针的金黄色葡萄球菌的平均菌落形成单位(CFU)计数(以每10mm直径的琼脂活检样本(agar biopsy sample)中106个CFU计)。N=3,误差棒表示标准差。
具体实施方式
应当理解的是,本发明并不限于本文所描述的特定的方法学、方案和试剂等,并且上述这些都可以改变。本文所使用的术语其目的仅在于描述特定的实施方式,并非用来限定本发明的范围,而本发明的范围仅由权利要求进行限定。
除非上下文另有明确指示,在本文及权利要求中使用的单数形式也包含复数含义,反之亦然。除了在操作实施例中或另有指示的情况外,本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为由术语“约”修饰。
出于描述和公开的目的,在此以引用的方式清楚地将本发明指明的所有专利和其它出版物并入,例如,在此类出版物中描述的可用于本发明的方法学。提供此类出版物仅仅是因为它们的公开早于本申请的申请日。在这点上,不应将任何事物视为发明人无权根据在先发明或因任何其它原因使本发明的内容早于这些公开内容的认定。所有关于日期的陈述或关于此类文件内容的表达都是基于申请人可得的信息,并不构成对此类文件的日期或内容的正确性的任何认定。
除非另有定义,本文使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然本发明的实施操作或测试中可使用任何已知的方法、装置和材料,在这方面,本文仍对所述方法、装置和材料进行了描述。
用于制造微针的传统材料(金属和合成聚合物)伴有多种限制,因此使其性能受到了影响。理想情况下,微针系统要求由机械坚固的、生物相容性材料和/或如果植入则可在患者体内溶解的可生物降解材料制造(Davis等,37J.Biomech.1155(2004);Sullivan等,20Adv.Mats.933(2008))。丝素蛋白由于多种材料特性(包括优异的机械性能、生物相容性和可生物降解性),已证明其为出色的用于生物医学应用的生物聚合材料(Altman等,24Biomats.401(2003);Jiang等,17Adv.Functional Mats.2229(2007))。
活性试剂可由全水处理(all-aqueous processing)被引入丝素蛋白基质,所述活性试剂包括但不限于蛋白质、抗生素、酶、药物、核酸(例如DNA、RNA)、疫苗、抗体和抗体样片段。丝素蛋白提供了生物有利的微环境,所述微环境使得能够包含多种生物掺杂物(dopants)和/或化学掺杂物并保持其功能性。为了各种生化功能,已将蛋白质(Bini等,335J.Mol.Bio.27(2004))、酶(Lu等,Stabilization of Enzymes in Silk Films,10Macromol.Biosci.359(2009))、以及小分子有机物(Lawrence等,9Biomacromol.1214(2008))引入丝(silk)基质。另外,这些试剂能够以可控的方式从这些丝材料中释放。此外,生物活性种类能够以干燥形式保存更长时间,而无需顾虑冷链(cold-chain)(Lu等,Biomacromol.217(2009))。由于这些潜在特性,将丝作为制造用于药物递送的经皮微针和微针装置的有用材料来研究。在这方面,丝素蛋白为生物活性试剂所提供的稳定性可用于在微针装置自身中提供多种重要试剂(如疫苗、胰岛素和应急药物)的稳定储存和有效递送。
为了成功地经皮递送药物,微针必须在最小化或避免疼痛的同时转移活性试剂穿过皮肤外层(角质层)。长15μm-500μm的玻璃、金属和PLGA共聚物微针对药物递送有效,并几乎不产生疼痛或不产生疼痛(Henry等,87J.Pharm.Sci.922(1998);Arora等,364Intl.J.Pharm.227(2008))。已描述了多种微针设计(Reed&Lye,92IEEE56(2005))。通常,这些微针是空心的或表面涂覆有待给予的试剂(McAllister等,100PNAS13755(2003))。最近,将由羧甲基纤维素制造的溶解微针(高600μm、底部300μm、中心-中心间距600μm)或支链淀粉制造的溶解微针用于对蛋白质进行封装并穿过猪尸体皮肤进行递送。然而,需要对针模具(needle mold)进行离心来克服这些微针中的临界压曲荷载(critical bucklingload)问题(Lee等,Dissolving Microneedles for Transdermal Drug Delivery,29Biomats.2113(2008))。本发明的实施方式提供了基于丝素蛋白的简洁而巧妙的设计方法,其中,试剂可装载于微针基质内或微针基质上,这使得能够方便地调整微针尺寸、活性试剂负载以及释放曲线,从而适应不同的应用。在一些实施方式中,本发明的丝素蛋白微针比其它聚合物微针更锐利、更硬。在一些实施方式中,分布于本文所述的微针中的活性试剂可在更长时间内稳定。在一些实施方式中,本文所述的微针和/或微针装置中活性试剂的释放可通过例如调整丝素蛋白基质内β-折叠(β-sheet)结构的量进行控制。
微针
本文提供的一个方面涉及包含丝素蛋白的微针。此类微针各自具有底部和穿透顶端,其中,所述穿透顶端的尺寸为约50nm-约50μm。仅作举例之用,本发明示例性实施方式的微针110、120、130、140、150、160在图1中示出,其中,各微针包含从底部114、124、134、144、154、164延伸至穿透顶端112、122、132、142、152、162的丝素蛋白微针针体110、120、130、140、150、160。
本文所使用的术语“穿透顶端”是指适于最先接触并穿透表面(如生物屏障的表面)的微针末端。穿透顶端可为任何形状和/或尺寸。穿透顶端可具有各种几何形状,例如但不限于圆形、矩形、正方形、三角形、多边形和不规则形状。在一些实施方式中,例如,由于光学仪器(例如显微镜)和/或人眼的分辨率有限,导致所述穿透顶端可显示为点。在一些实施方式中,穿透顶端的形状可与微针针体横截面的形状相同或不同。
本文所使用的术语“尺寸”通常是指物体平面内大小的测量值。就本文所述的微针的穿透顶端而言,在一些实施方式中,穿透顶端的尺寸可由穿透顶端的形状的最宽测量值表示。例如,圆形顶端的尺寸可由圆形顶端的直径表示。根据本发明,所述穿透顶端的尺寸(例如直径)可为约50nm-约50μm,所述尺寸包括约100nm-约40μm、约200nm-约40μm、约300nm-约30μm、约500nm-约10μm、或约1μm-约10μm。在一些实施方式中,所述穿透顶端的尺寸(例如直径)可为约50nm-约10μm,例如,约50nm-约8μm、约100nm-约5μm、或约100nm-约2μm。在其它实施方式中,穿透顶端的尺寸(例如直径)可为小于50nm或大于50μm。与以前的基于聚合物的可溶微针设计(通常具有尺寸大于10μm的穿透顶端[9])相比,本文所述的微针的一些实施方式可具有更锐利的顶端(例如小于10μm、小于5μm或小于2μm),因此提高了各微针穿透组织(例如皮肤)的可能性,进而使所给予的活性试剂进入组织的总量增加。
本文所述的微针的底部通常是与穿透顶端相对的末端。微针底部可附着或固定至固体基底或装置,以促进微针穿透入生物屏障中。微针的底部可为任何大小和/或形状。所述底部可具有各种几何形状,例如但不限于圆形、矩形、正方形、三角形、多边形和不规则形状。在多个实施方式中,底部的形状可遵循微针针体横截面的形状。
通常,本文所述的微针底部是微针最宽的部分,例如,底部114和底部124是微针110和微针120最宽的部分。然而,在一些实施方式中,微针的底部和针体可具有大体上相同的宽度,例如,微针130、140的底部134、144与针体130、140具有大体上相同的宽度。在一些实施方式中,微针的底部、针体和穿透顶端可具有大体上相同的宽度,如在微针140中所示,所述微针140沿整个微针针体从底部144到穿透顶端142具有均一的宽度。本领域技术人员可基于许多因素确定适当的底部尺寸,所述因素包括但不限于微针针体的长宽比、待穿透的表面的类型、以及丝素蛋白的机械性能。在一些实施方式中,微针底部的尺寸(例如直径)可为约50nm-约1500μm、约50nm-约1000μm、约100nm-约750μm、约250nm-约500μm、或约500nm-约500μm。
在使受试者疼痛最小的情况下,本文所述的微针可为适合于在组织穿刺中使用的任何细长形状。例如,不受限制地,所述微针可大体上为圆柱形、楔形、圆锥形、棱锥形(pyramid-shaped)、不规则形状或上述形状的任意组合。
本文所述微针的横截面的形状和/或面积沿微针针体的长度可以是均一的和/或变化的。微针的横截面形状可采取各种形状,包括但不限于矩形、正方形、卵形、圆形、菱形、三角形、椭圆形、多边形、U形、或星形。在一些实施方式中,微针的横截面沿微针针体的长度可具有均一的形状和面积,例如,如具有沿其针体长度的横截面均一(具有均一的形状和面积)的笔直针体的微针140所示。在一些实施方式中,微针的横截面可具有相同的形状,而其面积沿微针针体的长度变化。例如,如图1所示,微针110、120或150可以包含逐渐变细的(tapered)针体,所述逐渐变细的针体具有面积向着穿透顶端112、122或152减少的形状相同的横截面;或微针160可具有面积沿微针针体长度变化的形状相同的横截面。在一些微针为不规则形状的实施方式中,其横截面的形状与面积均可沿微针针体长度变化,或其横截面(具有恒定面积)的形状可沿微针针体长度变化。在一个实施方式中,本文所述的微针包含逐渐变细的针体,该针体沿微针针体长度具有大体上为圆形的横截面。微针针体横截面的尺寸可为50nm-约1500μm、约50nm-约1000μm、约100nm-约750μm、约250nm-约500μm、或约500nm-约500μm。
微针针体的长度可在微米至厘米范围内变化,这取决于许多因素,所述因素例如但不限于:给药所靶向的组织类型、所需的穿透深度、微针未插入部分的长度、以及应用微针穿过或进入生物屏障的方法。仅作为举例而言,在手术中,如果需要微针伸进器官组织(例如心脏组织)数厘米之深,则所述微针可为数厘米长。在此类实施方式中,可将微针进一步固定至施放器(applicator)或装置,以促进所述微针穿透进入器官组织(例如心脏组织)。因此,本文所述微针的一些实施方式的长度可为约0.5cm-约10cm、约1cm-约8cm、或约2cm-约6cm。
在一些实施方式中,微针针体的长度可在如下范围内变化:约10μm-约5000μm、约50μm-约2500μm、约100μm-约1500μm、约150μm-约1000μm、或约200μm-约800μm。在一些实施方式中,微针针体的长度可在约200μm-约800μm的范围内变化。举例来说,本文所述的微针的一些实施方式可用于皮肤穿透。皮肤的最外层屏障(角质层)通常厚约10μm-20μm,并覆盖了厚约50μm-100μm的活性表皮(viable epidermis)。表皮是无血管的,但其具有Langerhan’s细胞(未成熟骨髓树突状细胞),所述细胞例如可与诱导免疫响应(例如免疫作用)相关。在这些皮肤层下方,真皮厚约1mm-2mm并具有丰富的毛细血管床,所述毛细血管床可为用于活性试剂全身递送的有用靶标。丝素蛋白的坚固机械特性使得能穿透皮肤至任何合适深度的微针得以构建。例如,可将微针长度构建成足够长,以将活性试剂递送至活性表皮(皮肤表面下约10μm-120μm),例如来诱导免疫响应。在一些实施方式中,可将微针长度构建成足够长,以将活性试剂递送至真皮(皮肤表面下约60μm-2.1mm)。本领域普通技术人员可根据许多因素调整微针长度,所述因素包括但不限于:组织厚度(例如皮肤厚度,与年龄、性别、位于身体的位置、物种(动物)有关)、药物递送方案(例如,快速-长针相对于慢速-短针,快速-最少β折叠结构相对于慢速-最多β折叠结构)、活性试剂的扩散特性(例如,离子电荷、分子量、形状),或上述因素的任意组合。取决于给药所靶向的组织,微针长度可在约50μm-约700μm的范围内变化。在一些实施方式中,可用丝素蛋白制造具有大小为15μm-300μm的个体微针的装置。
因此,可根据每一特定应用选择和构建微针针体的长度。在一些实施方式中,微针针体的长度可进一步包含未插入的部分,即,微针中通常不参与组织穿透的部分。在此类实施方式中,微针针体的长度可包含插入部分的长度(微针中能够穿透进入或穿过生物屏障的部分)和未插入部分的长度。未插入部分的长度可取决于应用、和/或特定的装置设计和构造(例如,容纳微针的微针适配器(adaptor)或注射器)。
基于丝的微针或微针装置可优选为完全生物相容的、以及全部或部分可生物降解的和/或可生物蚀解的。术语“生物相容的”通常涉及对环境或受试者无害的物质:所述环境可以是体内环境或机体之外的环境(例如玉米田中),且环境化学可因自然出现的环境而异。术语“可生物降解的”通常涉及具有如下化学结构的物质:所述化学结构能被常见的环境化学(例如酶、pH、以及天然化合物)改变,从而产生可被环境(包括受试者(例如人)体内的环境)再吸收且对其无危害的元素或简单化学结构。可生物降解的物质还可以是可生物蚀解的,对此,所述物质既经历了物理损耗、又经历了化学变化。例如,可生物降解的物质可被分解为元素或化学结构;而可生物蚀解的物质可在宏观水平上被分解(例如断链(chainscission))、但其化学结构基本上保持不变。因此,本发明的基于丝的微针由于是生物相容的、且能够降解或蚀解成对受试者无害的物质或组分,因此不必从受试者中移除。另外,丝素蛋白可在全水处理中制备,进一步扩展了其与生物制品(biologics)和环境的相容性。
活性试剂及其稳定化
在一些实施方式中,本发明的丝素蛋白微针可包含至少一种活性试剂。取决于微针大小和/或包封效率,分布于本文所述的微针中的活性试剂的量可在皮克水平至毫克水平的范围内变化。活性试剂的非限制性实例包括有机物质如辣根过氧化物酶、酚磺酞(phenolsulfonphthalein)、核苷酸、核酸(例如,寡核苷酸、多核苷酸、siRNA、shRNA)、适配子、抗体或其一部分(例如,抗体样分子)、激素(例如,胰岛素、睾酮)、生长因子、酶(例如,过氧化物酶、脂肪酶、淀粉酶、有机磷酸盐/酯脱氢酶、连接酶、限制性核酸内切酶、核糖核酸酶、RNA或DNA聚合酶、葡萄糖氧化酶、乳糖酶)、细胞(例如,血红细胞、干细胞)、细菌或病毒、其它蛋白质或多肽、小分子(例如,药物、染料、氨基酸、维生素、抗氧化剂)、脂类、碳水化合物、发色团、发光有机化合物(如荧光素(1uciferin)、胡萝卜素(carotenes))和发光无机化合物(例如,化学染料和/或造影增强剂(contrast enhancing agent),如吲哚菁绿(indocyanine green))、免疫原性物质如疫苗、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、治疗剂、诊断剂或前药,以及上述任何物质的类似物或组合。参见:例如,WO2011/006133,BioengineeredSilk Protein-Based Nucleic Acid Delivery Systems;WO2010/141133,Silk FibroinSystems for Antibiotic Delivery;WO2009/140588,Silk Polymer-Based AdenosineRelease:Therapeutic Potential for Epilepsy;WO2008/118133,Silk Microspheresfor Encapsulation&Controlled Release;WO2005/123114,Silk-Based Drug DeliverySystem;US61/477,737,Compositions and Methods for Stabilization ofActiveAgents,以引用的方式将上述文献的内容整体并入本文。
本文所使用的术语“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用,表示通过相邻残基的α-氨基基团和羧基基团之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。不考虑其大小或功能,在本文中可互换使用的术语“蛋白质”和“肽”指的是蛋白质氨基酸的聚合物,所述氨基酸包括修饰氨基酸(例如,磷酸化、糖基化等)和氨基酸类似物。虽然“蛋白质”经常用于指相对较大的多肽,而“肽”经常用于指小的多肽,这些术语在本领域中的使用是相互重叠并可变的。除非另有注明,本文所使用的术语“肽”指的是肽、多肽、蛋白质和蛋白质片段。当涉及基因产物及其片段时,术语“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用。因此,示例性的肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同系物(homologs)、直系同源物(orthologs)、旁系同源物(paralogs)、片段,以及上述物质的其它等同物、变体、片段和类似物。
本文所使用的术语“核酸”指的是多核苷酸,例如脱氧核糖核酸(DNA)、以及核糖核酸(RNA)(在适当情况下)、上述物质的单链或双链形式的聚合物。除非特别限定,所述术语涵盖包含已知的天然核苷酸类似物的核酸,所述类似物具有与参比核酸类似的结合特性,并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另有说明,特定的核酸序列还隐含包括其保守修饰的变体(例如,简并密码子替换)和互补序列,以及明确表明的序列。具体来说,简并密码子替换可通过如下方式实现:生成序列中的一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷(deoxyinosine)残基替换的序列(Batzer等,NucleicAcid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);以及Rossolini等,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。术语“核酸”还应被理解为包括如由核苷酸类似物而得的RNA或DNA的等同物、衍生物、变体以及类似物,以及单链(正义或反义)和双链多核苷酸。
术语“短干扰RNA”(siRNA)(在本文中还称为“小干扰RNA”)被定义为(例如通过RNAi)发挥抑制靶基因表达作用的试剂。siRNA可由化学合成、可通过体外转录制造、或可在宿主细胞内制造。siRNA分子还可通过切割双链RNA而产生,其中一条链与待失活的信使RNA相同。术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小抑制性RNA双链。这些分子可在长度上有所差异(通常为18-30个碱基对),并在其反义链中具有与其靶mRNA不同程度的互补性。一些(但并非全部)siRNA在正义链和/或反义链的5′或3′末端具有未配对的垂悬碱基(overhanging bases)。术语“siRNA”包括由两条独立链而来的双链、以及可形成包含双链区域的发夹结构的单链。
本文所使用的术语“shRNA”指的是发挥如RNAi和/或siRNA种类的作用的短发卡RNA,但不同之处在于shRNA种类为稳定性提高的双链发夹状结构。本文所使用的术语“RNAi”涉及干扰RNA或RNA干扰分子(为抑制基因表达的核酸分子或其类似物,如基于RNA的分子)。RNAi是指选择性转录后基因沉默的一种手段。RNAi可导致特定mRNA的破坏,或阻止RNA(如mRNA)的加工或翻译。
本文所使用的术语“酶”指的是如下蛋白质分子:催化其它物质的化学反应、但其自身在反应结束时不被破坏或不被实质上改变。该术语可包括天然存在的酶和生物工程酶或它们的混合物。酶家族的实例包括激酶、脱氢酶、氧化还原酶、GTP酶、羧基转移酶、酰基转移酶、脱羧酶、转氨酶、消旋酶、甲基转移酶、甲酰基转移酶、以及α-酮酸脱羧酶(α-ketodecarboxylases)。
本文所使用的术语“疫苗”指的是被杀死的微生物、活的减毒生物体、亚单位抗原、类毒素抗原、缀合抗原或其它类型的抗原性分子的任何制品,当将所述制品引入受试者体内时,其通过使免疫系统活化、抗体形成、和/或产生T细胞和/或B细胞应答而产生对特定疾病的免疫力。针对微生物的疫苗通常针对病毒、细菌、寄生虫、支原体、或其它感染原的至少一部分。
可包含于本文所述的微针中的疫苗产品的实例包括但不限于:(炭疽吸附型疫苗,Emergent Biosolutions,Rockville,MD);BCG Live(膀胱内用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin),Organon Tekina Corp.LLC,Durham,NC);BCG Live(Sanofi Pasteur Inc);(白喉和破伤风类毒素以及无细胞百日咳(DTaP)吸附型疫苗,Sanofi Pasteur Inc.);(吸附DTaP疫苗,GlaxoSmithKline);(DTaP疫苗,Sanofi Pasteur);(DTaP/Hib#,sanofi pasteur);(白喉和破伤风类毒素、无细胞百日咳吸附型以及灭活脊髓灰质炎病毒疫苗,GlaxoSmithKline);(DTaP-HepB-IPV,GlaxoSmithKline);(白喉和破伤风类毒素以及无细胞百日咳吸附型、灭活脊髓灰质炎病毒以及嗜血杆菌b缀合[破伤风类毒素缀合]疫苗,sanofi pasteur);白喉和破伤风类毒素吸附型(小儿用,Sanofi Pasteur);(白喉和破伤风类毒素吸附型,成人用,Sanofi Pasteur);(嗜血杆菌b破伤风类毒素缀合疫苗,SanofiPasteur);(Hib疫苗,Merck);Hiberix(嗜血杆菌b破伤风类毒素缀合疫苗,加强剂量(booster dose),GlaxoSmithKline);(乙型肝炎-Hib疫苗,Merck);(甲型肝炎疫苗,小儿用,GlaxoSmithKline);(甲型肝炎疫苗,小儿用,Merck);(Hep B,小儿用,青少年用,GlaxoSmithKline);RECOMBIVAX(乙型肝炎疫苗,Merck);(HepA/HepB疫苗,18岁以上,GlaxoSmithKline);(人乳头瘤病毒二价(16型和18型)重组疫苗,GlaxoSmithKline);(人乳头瘤病毒二价(6型、11型、16型和18型)重组疫苗,Merck);(流感疫苗,18岁以上,CSL);AGRIFLUTM(肌内注射用流感病毒疫苗,Novartis Vaccines);(流感疫苗,18岁以上,GaxoSmithKline);(流感疫苗,18岁以上,GlaxoSmithKline);(流感疫苗,4岁以上,Novartis Vaccine);(流感疫苗,6个月以上,Sanofi Pasteur);(流感疫苗,2岁以上,MedImmune);(e-IPV脊髓灰质炎疫苗,sanofiPasteur);JE(日本脑炎病毒灭活型疫苗,BIKEN,Japan);(日本脑炎病毒灭活型疫苗,Novarits);(脑膜炎球菌(A群、C群、Y群和W-135群)和白喉疫苗,Sanofi Pasteur);-A/C/Y/W-135(脑膜炎球菌多糖疫苗,sanofipasteur);(MMR疫苗,Merck);(脑膜炎球菌(A群、C群、Y群和W-135群)寡糖白喉CRM197缀合疫苗,Novartis Vaccines);(MMR和水痘疫苗,Merck);PNEUMOVAX(肺炎球菌多糖疫苗,Merck);(7价肺炎球菌疫苗,Wyeth/Lederle);(13价肺炎球菌疫苗,Wyeth/Lederle);POLIOVAXTM(灭活脊髓灰质炎病毒,sanofi pasteur);(狂犬疫苗,Sanofi Pasteur);RABAVERTTM(狂犬疫苗,Chiron);(口服五价轮状病毒活疫苗,Merck);(口服轮状病毒活疫苗,GlaxoSmithKline);DECAVACTM(破伤风和白喉类毒素疫苗,sanofi pasteur);Td(通用)(破伤风和白喉类毒素,吸附型,MassachusettsBiol.Labs);(伤寒VI多糖疫苗,Sanofi Pasteur);(破伤风类毒素、减弱的白喉类毒素和无细胞百日咳,sanofi pasteur);(破伤风类毒素、减弱的白喉类毒素和无细胞百日咳,GlaxoSmithKline);(口服活Ty21a伤寒疫苗(typhoid vaccine live oral Ty21a),Berna Biotech);ACAM2000TM(天花(牛痘)活疫苗,Acambis,Inc.);(天花(牛痘)疫苗);(水痘[活]疫苗,Merck);(黄热病疫苗,Sanofi Pasteur);(水痘带状疱疹病毒,Merck);或上述疫苗的组合。本文所述的组合物中也可包括列入疾病控制和预防中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)数据库中的任何疫苗产品。
在一些实施方式中,本文所述的微针中也可包含动物疫苗,如犬科动物疫苗和猫科动物疫苗。动物疫苗的实例包括但不限于:MAX5(五联疫苗(5-wayvaccine):犬瘟热、传染性犬肝炎、2型腺病毒、副流感病毒和细小病毒,Fort Dodge);NEO(细小病毒,Neo Tech);PLUS5(犬瘟热、1型和2型腺病毒、副流感病毒和细小病毒;Pfizer);III(犬副流感病毒;Fort Dodge);以及4(猫鼻气管炎(feline rhinotracheitis)、杯状病毒(calici)、以及猫泛白细胞减少症病毒(panleukopenia viruses)和鹦鹉热衣原体,Schering-Plough/Intervet)。本文所述的微针中可包含任何市售的动物疫苗。
本文所使用的术语“适配子”指的是能特异性识别选定的非寡核苷酸分子或分子组的单链、部分单链、部分双链或双链的核苷酸序列。在一些实施方式中,适配子通过不同于Watson-Crick碱基配对机制或三链体形成的机制来识别非寡核苷酸分子或分子组。不受限制地,适配子可包括确定的序列区段和序列,所述序列区段和序列包含核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物、修饰核苷酸和包含骨架修饰的核苷酸、分支点(branchpoints)以及非核苷酸残基、基团或桥接(bridges)。用于选择结合至分子的适配子的方法在本领域是众所周知的,并且容易为本领域普通技术人员获取。
本文所使用的术语“抗体(antibody/antibodies)”指的是具有Fc(可结晶片段)区域或Fc区域的FcRn结合片段的单克隆/多克隆抗原结合片段或完整的免疫球蛋白。术语“抗体”还包括“抗体样分子”,如抗体片段(例如抗原结合片段)。抗原结合片段可通过重组DNA技术制造,或通过完整抗体的酶解或化学裂解来制造。“抗原结合片段”特别包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb、以及互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单域抗体、嵌合抗体、双功能抗体(diabodies)、以及含有免疫球蛋白的至少一部分的多肽(所述免疫球蛋白的一部分足以使抗原结合至所述多肽)。为了本文所述的目的,还包括线性抗体(linearantibodies)。术语Fab、Fc、pFc′、F(ab′)2和Fv使用其标准免疫学含义(Klein,Immunology(John Wiley,New York,N.Y.,1982);Clark,W.R.(1986)The Experimental Foundationsof Modern Immunology(Wiley&Sons,Inc.,New York);以及Roitt,I.(1991)EssentialImmunology,第7版(Blackwell Scientific Publications,Oxford))。多种抗原的特异性抗体或抗原结合片段可从供应商(如R&D Systems、BD Biosciences、e-Biosciences和Miltenyi)处商购,或可通过本领域技术人员已知的方法针对这些细胞表面标记而产生。
本文所使用的术语“互补决定区”(CDR;即:CDR1、CDR2和CDR3)指的是其存在为抗体结合所必需的抗体可变域的氨基酸残基。各可变域通常具有三个CDR区,称为CDR1、CDR2和CDR3。各互补决定区可包含来自Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即,大致为在轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及在重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991));和/或来自“高变环(hypervariable loop)”的残基(即,大致为在轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及在重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在某些情况下,互补决定区可同时包含来自根据Kabat定义的CDR区中的氨基酸和来自高变环中的氨基酸。
表述“线性抗体”指的是在Zapata等,Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简言之,这些抗体包含成对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1),所述Fd区段与互补的轻链多肽一起形成成对的抗原结合区域。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
本文所使用的表述“单链Fv”或“scFv”抗体片段意思是指包含抗体VH域和VL域的抗体片段,其中,这些结构域存在于单个多肽链中。Fv多肽优选在VH域和VL域之间进一步包含多肽接头,这能使scFv形成用于抗原结合的期望结构(,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,269-315页(1994))。
本文所使用的术语“双功能抗体”指的是具有两个抗原结合位点的小抗体片段,该片段在同一多肽链上包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)(VH-VL)。通过利用因过短而不能使同一链上的所述两个结构域之间进行配对的接头,所述结构域不得不与另一链的互补域配对,从而产生两个抗原结合位点(EP404,097;WO93/11161;Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sd.USA,P0:6444-6448(1993))。
本文所使用的术语“小分子”指的是天然分子或合成分子,包括但不限于:肽、模拟肽(peptidomimetics)、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、适配子、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000g/mol的有机化合物或无机化合物(即,包括杂有机化合物(heteroorganic compounds)和有机金属化合物)、分子量小于约5,000g/mol的有机化合物或无机化合物、分子量小于约1,000g/mol的有机化合物或无机化合物、分子量小于约500g/mol的有机化合物或无机化合物,以及这些化合物的盐类、酯类和其它药学上可接受的形式。
本文所使用的术语“细菌”意在涵盖细菌的全部变体,例如:原核生物和蓝细菌(cyanobacteria)。细菌很小(典型的线性尺寸为1μm左右),是无区隔化的(non-compartmentalized),具有环状DNA和70S核糖体。
术语“抗生素”在本文中用于描述降低微生物生存能力的化合物或组合物、或者抑制微生物生长或繁殖的化合物或组合物。本公开所使用的抗生素进一步旨在包括抗微生物(antimicrobial)剂、制菌(bacteriostatic)剂或杀菌(bactericidal)剂。示例性的抗生素包括但并不局限于:青霉素类、头孢霉素类、青霉烯类(penems)、碳青霉烯类、单环内酰胺类(monobactams)、氨基糖苷类、磺酰胺类、大环内酯类、四环素类、林可酰胺类(lincosides)、喹诺酮类、氯霉素、万古霉素、甲硝唑(metronidazole)、利福平(rifampin)、异烟肼(isoniazid)、大观霉素(spectinomycin)、三甲氧苄啶(trimethoprim)、以及磺胺甲噁唑。
本文所使用的术语“细胞”指的是任何细胞,原核的或真核的,包括植物、酵母、蠕虫(worm)、昆虫和哺乳动物。哺乳动物细胞不受限制地包括:灵长类细胞、人类细胞以及来自于任何感兴趣的动物的细胞,所述感兴趣的动物不受限制地包括:小鼠、仓鼠、兔、狗、猫、家养动物,如马科动物、牛科动物、鼠科动物、羊科动物(ovine)、犬科动物、猫科动物等。细胞可不受限制地为各种组织类型,如:造血细胞、神经细胞、间充质(mesenchymal)细胞、皮肤(cutaneous)细胞、粘膜细胞、基质(stromal)细胞、肌肉细胞、脾细胞、网状内皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、肾细胞、胃肠细胞、肺细胞、T细胞等。还包括干细胞、胚胎干(ES)细胞、ES衍生细胞和干细胞祖细胞(progenitors)(不受限制地包括:造血干细胞、神经干细胞、基质干细胞、肌肉干细胞、心血管干细胞、肝干细胞、肺干细胞、胃肠干细胞等)。酵母细胞也可用作本发明中的细胞。在一些实施方式中,细胞可以是离体(ex vivo)细胞或培养的细胞(例如在体外)。例如,对于离体细胞,细胞可以从受试者中获得,其中,所述受试者是健康受试者和/或患有疾病的受试者。作为非限制性实例,细胞可通过活组织切片或本领域技术人员知晓的其它外科手术手段获得。
本文所使用的术语“病毒”是指由蛋白质壳体包裹核酸组成的感染原(infectiousagent)。此类感染原不能自主复制(即,复制需要利用宿主细胞的机制)。病毒基因组可以是单链(ss)或双链(ds)的RNA或DNA,并且能或不能使用逆转录酶(RT)。另外,ssRNA病毒可以是正义的(+)或反义的(-)。示例性的病毒包括但并不限于:dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssDNA病毒(例如细小病毒)、dsRNA病毒(例如呼肠孤病毒)、(+)ssRNA病毒(例如小RNA病毒(Picornaviruses)、披膜病毒)、(-)ssRNA病毒(例如正黏病毒(Orthomyxoviruses)、弹状病毒(Rhabdoviruses))、ssRNA-RT病毒(即,在生命周期中具有DNA中间体的(+)正义RNA(例如逆转录病毒))、和dsDNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒(Hepadnaviruses))。在一些实施方式中,病毒还可包括野生型(天然)病毒、杀灭的病毒、活的减毒病毒、修饰病毒、重组病毒或上述病毒的任意组合。病毒的其它实例包括但并不限于:包膜病毒(enveloped viruses)、呼吸道合胞病毒、非包膜病毒、噬菌体、重组病毒和病毒载体。本文所使用的术语“噬菌体”指的是感染细菌的病毒。
术语“治疗剂”是本领域公认的,并且是指任何化学部分,所述化学部分为在受试者中局部或全身起效的生物活性物质、生理活性物质或药理活性物质。治疗剂(也称为“药物”)的实例在为人熟知的参考文献(如Merck Index、the Physicians Desk Reference和The Pharmacological Basis of Therapeutics)中有所描述,所述治疗剂不受限制地包括药剂(medicaments);维生素;矿物质补充剂;用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病或病症(illness)的物质;影响机体结构或功能的物质;或前药,其在被置于生理环境中之后变得具有生物活性或活性更高。可使用在给予受试者后能够从主题组合物中释放进入邻近组织或流体的各种形式的治疗剂。实例包括类固醇和类固醇酯(例如雌激素、孕酮、睾酮、雄酮、胆固醇、炔诺酮、地高辛(digoxigenin)、胆酸、去氧胆酸和鹅去氧胆酸)、含硼化合物(例如碳硼烷)、化学治疗性核苷酸、药物(例如抗生素、抗病毒药、抗真菌药)、烯二炔类(例如,卡奇霉素(calicheamicins)、埃斯培拉霉素(esperamicins)、达内霉素(dynemicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和可达菌素(kedarcidin)发色团)、重金属配合物(例如顺铂)、激素拮抗剂(例如三苯氧胺(tamoxifen))、非特异性(非抗体)蛋白(例如寡聚糖)、寡核苷酸(例如与靶核酸序列(例如mRNA序列)结合的反义寡核苷酸)、肽、蛋白质、抗体、光动力剂(photodynamic agents)(例如罗丹明123)、放射性核素(例如,I-131、Re-186、Re-188、Y-90、Bi-212、At-211、Sr-89、Ho-166、Sm-153、Cu-67和Cu-64)、毒素(例如蓖麻毒素(ricin))、以及基于转录的药剂。
在一些实施方式中,治疗剂可包括止痛药物。止痛药物的实例包括但并不限于:对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药(NSAID)、皮质类固醇(不受限制地,例如,或可的松)、麻醉剂(narcotics)、抗惊厥剂(anti-convulsan)(不受限制地,例如,(加巴喷丁(Gabapentin))、(普瑞巴林(Pregabalin))、局部麻醉剂(例如,),以及上述止痛药物的任意组合。
可包含于本文提供的微针的一些实施方式中的示例性NSAID包括但并不限于:布洛芬、萘普生、阿司匹林、非诺洛芬(NALFON)、氟比洛芬酮洛芬奥沙普秦(oxaprozin)双氯芬酸钠 依托度酸吲哚美辛 酮咯酸(ketorolac)舒林酸托美汀甲氯灭酸盐/酯(meclofenamate,)、甲灭酸(mefenamic acid,)、萘丁美酮吡罗昔康以及COX-2抑制剂(如)。
在一些实施方式中,止痛药物可包括对乙酰氨基酚联用物(例如,含麻醉剂的对乙酰氨基酚),如含可待因的对乙酰氨基酚(例如但不限于:含可待因的含可待因的含可待因的Phenaphen)、含氢可酮的对乙酰氨基酚(例如但不限于: BANCAP DUOCETTM; PLUS;H;MEDIPAIN ES;HP;)、以及含氧可酮的对乙酰氨基酚
“诊断剂”是可用于诊断的任何化学部分。例如,诊断剂包括含有放射性同位素(如铟或锝)的成像剂;含有碘、钆或花菁的造影剂(contrast agents)或染料;酶,如辣根过氧化物酶、GFP、碱性磷酸酶、或β-半乳糖苷酶;荧光物质,如铕衍生物;发光物质,如N-甲基吖啶(N-methylacrydium)衍生物等。
本文使用的术语“抗真菌剂”指的是能抑制或阻止真菌细胞生长、生存和/或繁殖的物质。在一些实施方式中,抗真菌剂包括能防止或治疗动物或植物中的真菌感染的试剂。抗真菌剂可以是广谱抗真菌剂或特异性针对一种或多种特定种类的真菌的抗真菌剂。抗真菌剂的非限制性实例包括:麦角甾醇(ergosterol)合成抑制剂如唑类(例如,咪唑类和三唑类)和phenpropimorph、特比萘芬、酮康唑、伊曲康唑(itroconazole)、氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、雷夫康唑(ravuconazole)和咪康唑(miconazole)。
本文所使用的术语“抗病毒剂”包括通过以下方式用于治疗病毒感染、破坏或阻滞病毒生长和繁殖、和/或阻滞病毒感染的任何试剂:例如,通过对病毒进入宿主细胞并用宿主细胞DNA复制其自身的能力进行干扰;通过降低病毒附着或进入细胞;通过阻滞复制;和/或通过阻止病毒脱去(shedding)包围病毒DNA的蛋白质外壳。不受限制地,示例性的抗病毒剂包括利巴韦林(ribavirin)、阿昔洛韦(acyclovir)、奥司他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
本文所使用的术语“激素”通常是指天然存在的或非天然存在的激素、它们的类似物和模拟物。在某些实施方式中,术语“激素”指的是用于治疗处理(例如生长激素处理)中的任何激素。本文所使用的“生长激素”或“GH”指的是来自任何来源(无论是天然、合成、或重组)的、处于天然序列或变体形式的生长激素。实例包括人生长激素(hGH),其为具有人天然序列的天然或重组GH(促生长激素或生长激素);以及重组生长激素(rGH),其是指借助于重组DNA技术制造的任何GH或变体(包括人蛋氨生长素(somatrem)、促生长激素和生长激素)。在一个实施方式中,激素包括胰岛素。
在某些实施方式中,术语“活性试剂”用来指任何分子、化合物或组合物,当将此类分子、化合物或组合物在抑制或降低所述活性试剂的生物活性的特定条件下经历一段时间时,期望所述分子、化合物或组合物的生物活性稳定。此类条件可包括但并不限于:状态变化循环(state-changing cycle)、温度、气压、湿度和光照。在一个实施方式中,状态变化循环为冻融循环。根据本发明,至少一种活性试剂的生物活性可在包含所述活性试剂的、基于丝素蛋白的微针中得以保持。
当使装载有至少一种活性试剂的、基于丝素蛋白的微针(称为“装载有活性试剂的微针”)经受状态变化循环和/或在特定条件下保存一段时间时,所述活性试剂可维持其至少约30%的初始生物活性,例如,至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%的初始生物活性或更高的初始生物活性。换句话说,相对于非基于丝素蛋白的微针中的活性试剂的稳定性而言,基于丝素蛋白的微针中的活性试剂的稳定性(即,基于丝素蛋白的微针中的活性试剂维持其生物活性(例如,至少约30%的初始生物活性)的能力)可提高至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%。
本文所述的装载有活性试剂的微针可保存于任何温度下或制造商推荐的专门用于活性试剂的温度下。在一些实施方式中,所述装载有活性试剂的微针可保存于液氮中或干冰中。在一些实施方式中,所述装载有活性试剂的微针可保存于例如约-80℃至约-20℃下,包括-80℃和-20℃;或保存于约-20℃至约0℃下,包括-20℃和0℃。在一些实施方式中,所述装载有活性试剂的微针可在高于0℃的温度下保存。在此类实施方式中,所述装载有活性试剂的微针可在约0℃至约为环境温度的温度下保存。本文所使用的术语“环境温度”用于描述保存本文所述的装载有活性试剂的微针的周围温度,其包括0℃-60℃、0℃-50℃或0℃-40℃之间的温度。在一些实施方式中,环境温度为冰箱温度(例如0℃-15℃,包括0℃和15℃)。在一些实施方式中,环境温度约为受试者的体温(例如,对于人类受试者为36℃-38℃,包括36℃和38℃;或者对于其它动物为更高或更低的体温范围)。在一些实施方式中,环境温度为室温,例如20℃-35℃,其可随地理条件而变化。例如,温暖气候区域(如非洲)的室温通常会比寒冷气候区域(如美国和英国)的室温更暖和。
本文所述的装载有活性试剂的微针可保存任意时间,例如:数小时、数天、数周、数月或数年。在一些实施方式中,本文所述的装载有活性试剂的微针可保存至少约3小时、至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时、至少约24小时或更久。在一些实施方式中,本文所述的装载有活性试剂的微针可保存至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天或更久。在一些实施方式中,本文所述的装载有活性试剂的微针可保存至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周或更久。在一些实施方式中,本文所述的装载有活性试剂的微针可保存至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月或更久。
微针装置
本文提供的另一方面为包含基底和一个或多个本文所述的丝素蛋白微针的微针装置,所述丝素蛋白微针整合至或附着至所述基底并从所述基底中延伸;其中每一丝素蛋白微针包含底部和穿透顶端。在一些实施方式中,所述微针装置可包含基底和1个丝素蛋白微针。在一些实施方式中,所述微针装置可包含基底和至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个或更多个微针。
图2示出了根据本发明一个或多个实施方式的微针装置200的至少一部分的图。本发明的微针装置200可由高度生物相容并易于制造的丝素蛋白材料形成。微针装置200包含基底204和从基底204突出的多个丝素蛋白微针210。微针的基本几何要求(包括长宽比、底部直径和逐渐变细的轮廓)可由微针功能来决定,即穿透生物屏障、在穿透期间维持几何形状、以及达到要求的穿透深度。在一些实施方式中,丝素蛋白微针210可一体形成并从基底204延伸。在一些实施方式中,丝素蛋白微针210可预先形成,然后附着于独立的基底204。丝素蛋白微针可包含一种或多种待施加进入或穿过治疗位点处的生物屏障的活性试剂。本文所述的各微针包含从底部214延伸例如预先确定的距离(由微针针体的长度表示)至穿透顶端212的微针针体210。本文所述的穿透顶端212可具有任意大小的尺寸(例如直径),这取决于多种因素,例如待穿透的生物屏障的类型、微针的设计要求(例如长宽比)、制造过程的条件、和/或使用偏好或应用。在多种实施方式中,穿透顶端212可具有任意大小的尺寸(例如直径),例如在纳米量级或微米量级。在一些实施方式中,穿透顶端212的尺寸(例如直径)可为约50nm-约50μm。在其它实施方式中,穿透顶端212的尺寸(例如直径)可大于50μm。可对微针针体210的长度进行选择,以将穿透顶端212置于与底部214相距预先确定的距离处,从而提供到达预先确定的深度的组织穿透和活性试剂施用。底部214可被安装至基底204,或作为基底204的一部分形成(例如薄膜形式)。可根据期望的治疗方式和治疗位点的特征对微针针体的形状和直径进行选择。
存在于微针装置上的各微针不必具有同样的微针长度。在一些实施方式中,微针装置上的各微针可具有同样的微针针体长度。在替代的实施方式中,微针装置上的微针可具有不同的微针针体长度。因此,可在单个微针装置中提供具有恒定或变化的微针穿透深度的预先确定的分布。在一些实施方式中,可对各微针的针体长度进行调整以适应表面的曲率。
可将多个微针以随机图案、伪随机图案或预先确定的图案(如图8E中所示阵列)进行排列。可根据期望的治疗方式和治疗位点的特征对微针之间的距离和多个微针的排列方式进行选择。例如,在一些实施方式中,可将微针亚群相互紧密排列作为组(group),例如,以增加递送至靶点的活性试剂的量。
微针的方向可垂直于基底或与基底成一定角度。在一些实施方式中,微针的方向可垂直于基底。在此类实施方式中,可在每单位面积基底上提供较高密度的微针。
基底:微针装置的基底可由各种材料构建,所述材料包括金属、陶瓷、半导体、有机物、聚合物以及上述材料的任意复合物。基底包括微针附着于其上或与其一体形成的基座(base substrate)。随后可调整基底来安装Luer-Lock注射器或其它常规使用的药物递送装置(目前使用皮下针作为屏障穿透方法)。
在所述装置的一些实施方式中,基底可包含一种或多种生物相容性聚合物。术语“生物相容性聚合物”意思是指当其与人体接触时不在受试者体内引发不良反应的聚合材料。生物相容性聚合物的实例包括但并不局限于:硅酮和基于硅酮的聚合物;聚四氟乙烯(PTFE);天然或合成水凝胶;聚氨酯;聚砜;纤维素;聚乙烯;聚丙烯;聚酰胺;聚酯;聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、任何本领域认可的生物相容性聚合物,以及上述聚合物的任意组合。
在所述装置的一些实施方式中,基底可包含一种或多种可生物降解的聚合物,例如但不限于:聚(丙交酯)类、聚(乙交酯)类、聚(丙交酯-共-乙交酯)类、聚酸酐类、聚原酸酯类(polyorthoesters)、聚醚酯类、聚己内酯类(polycarpolactones)、聚酯酰胺类(polyesteramides)、聚丁酸类、聚戊酸类、聚羟基脂肪酸酯类、可降解聚氨酯类,上述聚合物的任何共聚物、以及上述聚合物的任何共混物(blends)。
在所述装置的一些实施方式中,基底可由任何柔性材料形成。在此类实施方式中,基底可具有足够的柔性,以在接触表面时适合所述表面(例如组织或器官表面),并允许所述微针穿透组织至期望的深度。在一个实施方式中,柔性基底包含与丝素蛋白微针整合在一起的丝素蛋白薄膜。在替代的实施方式中,基底可以是任何刚性材料。
从中延伸出微针的基底表面可大体上为平表面、弯曲表面、波形表面或上述表面的任意组合。在一些实施方式中,可将从中延伸出微针的基底表面配置成具有与待穿透的靶表面类似的弯曲轮廓。
基底可为由如下因素决定的任意形状和/或任意尺寸:微针装置的设计、待治疗的靶位点的面积/形状、和/或微针施放器的大小。在一些实施方式中,可对基底的形状和尺寸进行配置,以安装任何施放器(目前使用皮下针作为屏障穿透方法)(例如注射器)、任何显微注射设备、任何微针夹持器、任何微针给药装置或施放器装置、任何微针阵列施放器装置、和/或微针阵列药筒系统(cartridge systems)。微针或微针阵列注射器或施放器的非限制性实例包括如下文献中所述的实例:美国专利申请号:US2008/0183144、US2003/0208167、US2010/0256597;以及美国专利号:US6743211和US7842008。
在一些实施方式中,基底可包含至少一种分布于所述基底中的活性试剂。在一些实施方式中,基底可不包含本文所述的活性试剂。
生产本文所述的微针和微针装置的方法
在制造本文所述的微针和/或微针装置的任何实施方式中所使用的方法可随所用的材料而变化,所述方法包括软刻印法(soft lithography methods)、微装配(microassembly)、微成型(microshaping)、体微加工法(bulk micromachining methods)、表面微加工法(surface micro-machining methods)、标准刻印法、湿法刻蚀、反应离子刻蚀、等离子刻蚀、立体刻印和激光化学三维写入法(stereolithography and laserchemical three-dimensional writing methods)、固体印刷法(solid-objectprinting)、机械加工、模块式组装法(modular assembly methods)、微模塑(micromolding)、复制模塑法(replica molding methods)、注射模塑法(injectionmolding methods)、热模塑法、激光消融法、任何微加工(microfabrication)法、上述方法的组合、以及本领域已知的用于制造微针的其它方法,所述方法包括但不仅限于下列文献中所述的方法:美国专利号US6503231;美国专利申请号:US2003/0208167和US2009/0182306;以及Henry等,“Micromachined Needled for the Transdermal Delivery ofDrugs”,Micro Electro Mechanical Systems,Heidelberg,Germany,494-498页(Jan.26-29,1998)。
图3A-图3K和图7A-图7F显示通过模塑对本文所述的微针的一个或多个实施方式进行制造的实例。在一个实施方式中,所述方法包括如下步骤:提供具有一个或多个微型凹部(microdepression)的模具,所述微型凹部各自限定了微针的表面(例如,PDMS模具300、700的微型凹部302、702);用丝素蛋白溶液填充至少一个微型凹部;然后对所述丝素蛋白进行模塑,从而形成微针。与其它聚合物相比,丝素蛋白的性质使得所模塑的微针更精细(finer)且还容易重现。
丝素蛋白:由于丝素蛋白具有如下特点:例如全水处理(Sofia等,54J.Biomed.Mater.Res.139(2001);Perry等,20Adv.Mater.3070-72(2008))、相对容易功能化(Murphy等,29Biomat.2829-38(2008))、以及生物相容性(Santin等,46J.Biomed.Mater.Res.382-9(1999)),因而是用于本发明实施方式的特别吸引人的候选生物聚合物。例如,美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration)已经批准将丝类作为人体植入物中的组织工程支架(参见Altman等,24Biomaterials:401(2003))。
本文所使用的术语“丝素蛋白”包括蚕丝素蛋白(silkworm fibroin)和昆虫丝蛋白或蜘蛛丝蛋白(参见例如,Lucas等,13Adv.Protein Chem.107(1958))。根据本发明的方面,可使用任何类型的丝素蛋白。由蚕(例如家蚕(Bombyx mori))产生的丝素蛋白是最普遍的,并表现为环保的、可再生的资源。例如,丝薄膜中使用的丝素蛋白可通过从家蚕(B.mori)的蚕茧中提取丝胶而获得。有机蚕茧还是可商购的。然而,存在许多可使用的不同的丝,包括蜘蛛丝(例如,由Nephila clavipes获得)、转基因丝、基因工程丝(如来自细菌、酵母、哺乳动物细胞、转基因动物或转基因植物的丝(参见例如,WO97/08315、美国专利号5,245,012)),以及上述丝的变体。在本文所述的任何方面的一些实施方式中,用于制造微针的丝素蛋白可以是再生丝素蛋白。在一些实施方式中,丝素蛋白可以是无丝胶的,例如使用实施例中所述的方法。
用于制造本文所述的微针和/或微针装置的丝素蛋白水溶液可使用本领域已知的任何技术制备。用于包埋或携带活性试剂的溶液中的丝素蛋白浓度可适合于特定活性试剂和/或预先确定的释放曲线。在一些实施方式中,用于制造本文所述的微针和/或微针装置的丝素蛋白溶液可从约4%(w/v)变化至约20%(w/v),包括端点在内。在一些实施方式中,丝素蛋白溶液可从约6%(w/v)变化至约8%(w/v)。制备丝素蛋白溶液的合适工序在例如美国专利申请序列号11/247,358、WO/2005/012606、以及WO/2008/127401中得以公开。本发明可使用微滤步骤。例如,在将制备的丝素蛋白溶液进一步加工成为本文所述的基于丝基质的微针和/或微针装置之前,例如可通过基于离心作用和/或基于注射器的微滤,对所述丝素蛋白溶液进行进一步加工。
在多个实施方式中,可就不同的应用和期望的性能(例如,调节分子释放曲线、微针的机械性能以及活性试剂的稳定化)对丝素蛋白进行修饰。本领域技术人员例如可根据丝素蛋白的侧基、丝素蛋白的期望反应性和/或丝素蛋白上的期望电荷密度选择适当的方法,来对丝素蛋白进行修饰。在一个实施方式中,丝素蛋白的修饰可使用氨基酸侧链化学,例如经共价键进行的化学修饰、或经电荷-电荷相互作用进行的修饰。示例性的化学修饰方法包括但不限于:碳二亚胺偶联反应(参见例如,美国专利申请号US2007/0212730)、重氮偶联反应(参见例如,美国专利申请号US2009/0232963)、亲和素-生物素相互作用(参见例如,国际申请号:WO2011/011347)以及利用PEG聚合物的化学活性衍生物或活化衍生物的聚乙二醇化(参见例如,国际申请号WO2010/057142)。还可通过基因修饰来对丝素蛋白进行修饰,以改变所述丝素蛋白的功能性(参见例如,国际申请号WO2011/006133)。举例来说,丝素蛋白可以是基因修饰的,这可提供对丝的进一步修饰,例如包含含有纤维蛋白结构域和矿化结构域的融合多肽,从而可用于形成有机-无机复合物(参见WO2006/076711)。另外,丝素蛋白基质可与化学品(如甘油)相联合,所述化学品例如对所述基质的柔性(flexibility)产生影响(参见例如,WO2010/042798,Modified Silk films Containing Glycerol)。
在一些实施方式中,丝素蛋白还可与其它生物相容性和/或可生物降解聚合物相混合,从而形成包含丝素蛋白的混合聚合物微针。可将一种或多种生物相容性和/或可生物降解聚合物(例如,两种以上生物相容性聚合物)与丝素蛋白一起添加至水溶液。本文可使用的生物相容性聚合物包括但不限于:聚氧化乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、胶原、纤连蛋白、角蛋白、聚天冬氨酸、聚赖氨酸、藻酸盐/酯、壳聚糖(chitosan)、壳多糖(chitin)、透明质酸、果胶(pectin)、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基脂肪酸酯类、葡聚糖、聚酸酐类、聚合物、PLA-PGA、聚酸酐、聚原酸酯、聚己内酯、聚富马酸酯(polyfumarate)、胶原、壳聚糖、藻酸盐/酯、透明质酸,以及其它生物相容性和/或可生物降解聚合物(参见例如:国际申请号:WO04/062697、WO05/012606)。微针可以是可生物降解的、可生物蚀解的、或者可被设计成将微针的至少一部分留在所穿透的组织中。
在一些实施方式中,在形成本文所述的丝素蛋白微针或微针装置之前,可将本文所述的至少一种活性试剂添加至丝素蛋白溶液。在此类实施方式中,可在填充模具之前、之中或之后,将活性试剂添加至丝素蛋白溶液中,以便使活性试剂分散在微针中。
可将大容量负载型丝素蛋白用于制备此类装载有活性试剂的丝素蛋白微针的直接方法中。可将丝溶液与感兴趣的活性试剂混合;可对具有期望厚度和表面积的微针进行浇铸(cast)、干燥、然后处理以产生期望的材料性质。装载有活性试剂的微针或微针装置可用作整体的(monolithic)、活性试剂递送植入物或诊断装置。例如,基于丝素蛋白的微针和/或微针装置中所装载的造影剂(如GFP分子)可维持其非线性光学性质(Putthanarat等,45Polymer8451(2004))。另外,已经研究了小分子药品(5-氟尿嘧啶、维生素C、间苯二酚、苯酚磺酸钠和苄基三甲基氯化铵)穿透丝素蛋白薄膜的扩散,并发现渗透性取决于pH和药物性质(Chen等,35Polymer2853(1994))。另外,由含有不同分子量(4kDa、10kDa、20kDa和40kDa)的葡聚糖和和辣根过氧化物酶(HRP)以及溶菌酶(Lys)(作为模型蛋白质)的丝水溶液制备出了整体的、大容量负载型薄膜。由薄膜的释放持续了约4周,并且释放行为与薄膜结晶度和药物性质(包括分子量和对于丝的吸附)相关(Hofmann等,111J.Contr.Release219(2006))。装载有肝素的混合聚氨酯-丝薄膜显示出超过24小时的肝素持久释放,并表现出高可控性:释放速度和所释放肝素的累积量的百分数可通过调整下列参数而进行控制:(a)薄膜中装载的肝素的量、(b)丝素蛋白与聚氨酯的组成比、以及(c)薄膜厚度(Liu等,63Mats.Lett.263(2009))。因此,活性试剂能够以均相或多相的方式分散于丝素蛋白中,以梯度的方式分散,例如使用在美国专利申请号US2007/0212730中所述的碳二亚胺介导的修饰法。
在替代的实施方式中,可先形成微针,然后将其与至少一种活性试剂接触(例如,浸入),从而使得微针的外表面可涂覆有至少一种活性试剂。
由丝蛋白制造的微针阵列在之前已被公开,然而它们表现出迅速且不受控制的突释(burst release)[8]。根据本发明的实施方式,可使用丝加工来影响丝素蛋白的性能,所述性能包括β-折叠含量、溶解性、活性试剂负载能力、降解时间和药物渗透性。丝加工的选择包括可控的缓慢干燥(Lu等,10Biomacromolecules1032(2009))、水韧处理(waterannealing)(Jin等,Water-Stable Silk Films with Reducedβ-Sheet Content,15Adv.Funct.Mats.1241(2005))、拉伸(stretching)(Demura&Asakura,Immobilizationof glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatmentand its application to glucose sensor,33Biotech&Bioengin.598(1989))、压缩(compressing)、以及溶剂浸渍,所述溶剂包括甲醇(Hofmann等,2006)、乙醇(Miyairi等,1978)、戊二醛(Acharya等,2008)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(Bayraktar等,2005)。根据本发明的一个实施方式,可使用丝加工来控制活性试剂从丝素蛋白微针结构和装置中的释放。根据本发明的其它实施方式,通过一种或多种加工选项的加工而赋予其它特征。
因此,影响丝素蛋白结构发生变化的能力不仅可用于控制本文所述的微针的机械特性,也可用于控制微针的溶解速率和/或经微针递送的活性试剂的持续释放曲线。例如,可对本文所述的丝素蛋白微针和/或微针装置的一些实施方式进行进一步加工以调整丝素蛋白微针和/或微针装置的溶解性。在一些实施方式中,本文所述的丝素蛋白微针和/或微针装置的溶解性可通过影响三级结构(例如β-折叠结构)的期望水平来进行调整。例如,可根据本文的指导制备丝素蛋白微针,然后对其进行处理以调整丝素蛋白中的无规卷曲、β-转角和β-折叠结构。在此类实施方式中,丝素蛋白在水溶液中的不溶性和/或其β-折叠结构可通过本领域已知的许多方法引起,例如,热处理(例如,水韧处理)、拉伸、甲醇或乙醇浸渍,以及上述方法的任意组合。例如,在一些实施方式中,空气干燥的丝素蛋白微针可含有约10%的β-折叠结构。甲醇处理可将β-折叠含量提高至高于50%或更高。不考虑治疗的话,丝素蛋白膜结构可在环境温度下稳定许多个月。在一些实施方式中,可将各种酶以不同的浓度装载入丝素蛋白,而不影响所述丝素蛋白的结构。另外,提供高含量的β-折叠结构可用来使丝素蛋白不溶于水。
在一些实施方式中,本文所述的微针和/或微针装置可包含多孔结构,例如来调整活性试剂进入生物屏障的释放曲线。在丝素蛋白基质中生成多孔结构的方法(例如冻干法、盐浸法(salt-leaching)和气体发泡法(gas foaming method)),为本领域所广泛知晓,并在下列文献中有所描述:例如,美国专利号US7842780;以及美国专利申请号US2010/0279112和US2010/0279112,将上述文献的内容以引用的方式整体并入本文。
因此,在一些实施方式中,多孔丝素蛋白微针可通过盐浸法制造(参见:例如,US7842780以及US2010/0279112)。可将丝素蛋白溶液置入微针模具中(含有不溶于有机溶剂的致孔剂或水溶性颗粒)。或者,可在置入模具之前,将致孔剂与丝聚合物溶液混合。所述颗粒(致孔剂)的直径可根据预先确定的孔径大小而变化。可用于本文的水溶性致孔剂包括:NaCl;碱金属、碱土金属的卤化物、磷酸盐和硫酸盐;糖晶体;水溶性微球;多糖和蛋白质微球。然后可将干燥的丝素蛋白微针或微针装置浸于颗粒或致孔剂可溶但丝素蛋白不可溶的水或其它溶剂中,以移除所述颗粒(致孔剂),从而产生本文所述的多孔丝素蛋白微针或微针装置。
在替代的实施方式中,多孔丝素蛋白微针可通过冻干法进行生产(参见:例如,US7842780和US2010/0279112)。在此类实施方式中,可将放置入微针模具的丝素蛋白溶液在零度以下的温度下(例如,约-80℃至约-20℃)冷冻至少约12小时、至少约24小时或更久,随后冷冻干燥。在一个实施方式中,可从一个方向冷冻丝素蛋白溶液。在一些实施方式中,丝素蛋白溶液可不包含盐。在一些实施方式中,可将醇(例如15%-25%的甲醇或丙醇)添加至丝素蛋白溶液。
在一些实施方式中,微针中可含有流体微通道(fluidic microchannel)。流体微通道可由穿透顶端延伸至微针底部。在微针附着于本文所述的微针装置的基底的一些实施方式中,流体微通道可由微针的穿透顶端延伸至基底另一侧的表面。流体微通道可允许递送或运输活性试剂,例如用于快速释放和/或将大剂量(bolus dose)的活性试剂给予至靶位点。在一些实施方式中,流体微通道可与例如含有待给予的活性试剂的单独容器连接。本文所述的制造微针的任何方法均可适于在本文所述的微针中创建流体微通道。例如,可以将流体微通道刻蚀入预先形成的微针中,或可将阳模构建为包含流体通道。制造具有流体通道的微针的其它方法包括但不限于美国专利号US6,503,231中所述的方法。
在一些实施方式中,本文所述的微针可涂覆有至少一层本文所述的生物相容性聚合物和/或可生物降解的聚合物,例如以调整从微针中释放活性试剂的速率。在此类实施方式中,所述生物相容性聚合物和/或可生物降解的聚合物可包含至少一种活性试剂。
对于通过模塑生产本文所述的微针和/或微针装置的一些实施方式,可用丝素蛋白溶液填充微针模具的微型凹部。在一些实施方式中,可用丝素蛋白溶液部分填充所述微型凹部。在一些实施方式中,可用丝素蛋白溶液完全填充所述微型凹部。在一些实施方式中,可用不同的丝素蛋白溶液(例如,不同的丝素蛋白浓度和/或组成)逐层填充所述微型凹部。在一些实施方式中,可用丝素蛋白溶液和不同的生物相容性聚合物和/或可生物降解的聚合物以及它们的任意混合物逐层填充所述微型凹部。
为了生产具有基底的微针装置(例如通过模塑),所述基底可在微针模塑时同时形成,例如,可让丝素蛋白溶液填满并溢出(overfilled)微针模具,以使得在微针模具上方形成丝素蛋白溶液层,随后使其干燥形成附着至微针并支持微针的基底。在此类实施方式中,基底和微针是整体相连的(integrally connected)。在替代的实施方式中,首先可形成全部或部分的微针,然后将其附着至或整合至单独的基底上。例如,在一些实施方式中,可将预先形成的微针附着至单独的基底(例如用胶或通过焊接)。在一些实施方式中,可先在微针模具中形成全部或部分微针,随后在所述微针顶部使第二材料形成或成型。在一些实施方式中,可在未附着微针的基底表面上形成至少一种额外的基底(例如,具有相同或不同材料),例如通过在仍存在于微针模具内的干燥的基于丝素蛋白的微针装置上沉积生物聚合物溶液,并将所述生物聚合物溶液干燥以形成额外基底。
在一些实施方式中,附着有微针的基底表面可包含生物相容性聚合物膜和/或可生物降解的聚合物膜。在此类实施方式中,附着有微针的基底表面可涂覆有生物相容性聚合物膜和/或可生物降解的聚合物膜,例如通过在基底表面上沉积生物相容性聚合物膜和/或可生物降解的聚合物膜、或通过使微针装置的微针穿透生物相容性聚合物膜和/或可生物降解的聚合物膜,从而使得所述聚合物膜附着于基底表面。
模塑是制造本文所述的微针和/或微针装置的一种方法。可通过本领域已知的任何方法生产微针模具或微针微模具。在一个实施方式中,如图3A-图3F所示,可通过包括如下步骤的方法来制备微针微模具:提供模具基底,图3A;用保护层涂覆所述模具基底,图3A;用光刻胶层涂覆所述保护层,图3B;对所述光刻胶层进行图案化以形成第一微图案化掩模,图3C;使用第一微图案化掩模对保护层进行刻蚀,以形成第二微图案化掩模,图3D;使用第二微图案化掩模对基底进行刻蚀,以移除部分基底,以逐渐根切第二微图案化掩模,从而由基底形成包含一个或多个微针的微针微阳模,所述微针包含底部末端,所述底部末端逐渐变细至穿透顶端,其中所述穿透顶端与第二微图案化掩模相接触,图3E;以及移除第二微图案化掩模,从而释放微针微阳模,图3F。可通过各向同性刻蚀由Si制造阳模。在替代的实施方式中,例如如图7A和图8A-图8D所示,可通过高速铣削(milling)和化学湿刻蚀由铝制造阳模。
在其它实施方式中,可使用加成法(additive processes)或减成法(subtractiveprocesses)通过微机械加工形成微针模具,从而制造限定微针形状的微型凹部。在一个实施方式中,所述模具可以为通过包括如下步骤的过程制得的阴模:(a)对整块的第一材料进行微成型,以形成具有多个微型凸部(microprotrusions)的模具插入件(mold insert);以及(b)将第二材料沉积至所述微型凸部上,从而形成具有多个由所述微型凸部限定的微型凹部的微模具。
可使用本领域已知的各种方法来制造本发明的微针和/或微针装置的各种实施方式。除了先前所述的模塑法,也可使用各向同性刻蚀来将丝素蛋白制成根据本发明一个或多个实施方式的微针和/或微针装置。在其它实施方式中,可应用反应性刻蚀来生产丝素蛋白微针和/或微针装置。在一些实施方式中,可将铣削和刻蚀(例如化学湿刻蚀)用于将丝素蛋白制成根据本发明一个或多个实施方式的微针和/或微针装置。
在一些实施方式中,可对本文所述的微针或微针装置进行灭菌。用于生物医学装置的灭菌方法在本领域是周知的,所述方法包括但不限于:γ射线或紫外线照射、高压灭菌(例如,热/蒸汽)、醇灭菌(例如乙醇和甲醇)、以及气体灭菌(例如,环氧乙烷灭菌)。
本文提供的方法可用于产生尺寸为约50nm-约50μm间任意尺寸的基于丝素蛋白的微针顶端。在一些实施方式中,可将基于丝素蛋白的微针顶端构造成具有10μm以下的直径,例如,所述顶端的直径包括但不限于2μm以下、或甚至100nm以下。并不存在阻止顶端具有甚至更小直径的基本限制(已经证明丝复制品浇铸(silk replica casting)的极限是数十nm的分辨率。Perry等,20Adv.Mat.3070(2008))。
另外,本发明的微针可利用许多开发用于使丝素蛋白功能化的技术(例如,活性试剂如染料和传感器)。参见:例如,美国专利号6,287,340,Bioengineered anteriorcruciate ligament;WO2004/000915,Silk Biomaterials&Methods of Use Thereof;WO2004/001103,Silk Biomaterials&Methods of Use Thereof;WO2004/062697,SilkFibroin Materials&Use Thereof;WO2005/000483,Method for Forming inorganicCoatings;WO2005/012606,Concentrated Aqueous Silk Fibroin Solution&UseThereof;WO2011/005381,Vortex-Induced Silk fibroin Gelation for Encapsulation&Delivery;WO2005/123114,Silk-Based Drug Delivery System;WO2006/076711,FibrousProtein Fusions&Uses Thereof in the Formation of Advanced Organic/InorganicComposite Materials;美国申请公开号2007/0212730,Covalently immobilized proteingradients in three-dimensional porous scaffolds;WO2006/042287,Method forProducing Biomaterial Scaffolds;WO2007/016524,Method for Stepwise Depositionof Silk Fibroin Coatings;WO2008/085904,Biodegradable Electronic Devices;WO2008/118133,Silk Microspheres for Encapsulation&Controlled Release;WO2008/108838,Microfluidic Devices&Methods for Fabricating Same;WO2008/127404,Nanopatterned Biopolymer Device&Method of Manufacturing Same;WO2008/118211,Biopolymer Photonic Crystals&Method of Manufacturing Same;WO2008/127402,Biopolymer Sensor&Method of Manufacturing Same;WO2008/127403,BiopolymerOptofluidic Device&Method of Manufacturing the Same;WO2008/127401,BiopolymerOptical Wave Guide&Method of Manufacturing Same;WO2008/140562,BiopolymerSensor&Method of Manufacturing Same;WO2008/127405,Microfluidic Device withCylindrical Microchannel&Method for Fabricating Same;WO2008/106485,Tissue-Engineered Silk Organs;WO2008/140562,Electroactive Biopolymer Optical&Electro-Optical Devices&Method of Manufacturing Same;WO2008/150861,Method forSilk Fibroin Gelation Using Sonication;WO2007/103442,Biocompatible Scaffolds&Adipose-Derived Stem Cells;WO2009/155397,Edible Holographic Silk Products;WO2009/100280,3-Dimensional Silk Hydroxyapatite Compositions;WO2009/061823,Fabrication of Silk Fibroin Photonic Structures by Nanocontact Imprinting;WO2009/126689,System&Method for Making Biomaterial Structures。
也可将基于丝素蛋白的微针与传感器(例如,检测活性试剂递送的传感器)联合(甚至以一体的形式);或可包含用于生物环境或其它环境的传感器。参见:例如,WO2010/126640,Nanoimprinting of Silk Fibroin Structures for Biomedical&BiophotonicApplications;WO2008/127401;WO2008/118211;WO2008/127402;WO2008/140562。还可将本发明的基于丝素蛋白的微针或微针装置与丝光子结构(silk photonic structure)(包括全息成像(holograms)和丝光学纤维)联合。参见:例如,WO2009/061823;PCT/US10/50565,Drawn Silk E-Gel Fibers&Methods of Making Same;PCT/US2010/042585,All-ProteinImplantable,Resorbable Reflectors;PCT/US10/47307,Silk Transistor Devices&Method of Making Transistor Devices from Silk。
在替代的实施方式中,丝素蛋白微针可包含等离子纳米颗粒(plasmonicnanoparticle),所述纳米颗粒在针内或针贴片的底部形成光热元件(photothermalelement)。这一方法利用了丝素蛋白优异的掺杂特性。已证明热疗法有助于多种试剂的经皮递送,参见Park等,Effect of Heat on Skin Permeability,359Intl.J.Pharm.94(2008)。在一个实施方式中,在非常有限的区域上进行的短时热量爆发可用于使渗透性最大化,同时使对周围组织产生的有害影响最小化。因此,掺杂有等离子颗粒的微针不仅可通过使用微小的针、还可通过使光聚焦而使得产生的热量仅经由针本身而不是周围组织,从而提高热疗法的特异性。
本发明的一个实施方式包括用于运输至少一种活性试剂穿过或进入生物屏障的微针装置。所述微针装置可包含丝素蛋白基底和多个丝素蛋白微针,所述微针与所述基底成为一体或附着至所述基底并从基底延伸,其中,所述丝素蛋白微针包含至少一种活性试剂。可在装置的基底和/或微针中或装置的基底和/或微针上含有活性试剂。因此,例如,因为试剂扩散穿过基底到达微针,然后从微针扩散至与所述微针相接触的组织,处于贴片形式的微针装置可用于以缓释形式递送试剂。
本文所述的微针或微针装置的示例性应用
本文提供的其它方面涉及用于递送活性试剂穿过生物屏障的方法。此类方法包括:提供本文所述的至少一种微针或至少一种微针装置,其中,所述微针或微针装置包含至少一种活性试剂;使所述微针或微针装置穿透入生物屏障;以及允许所述活性试剂由所述微针释放。在一些实施方式中,通过降解或溶解所述微针而将活性试剂释放入生物屏障中。
在一些实施方式中,微针或微针装置可附着至施放器上以促进微针穿过或进入生物屏障的给药。仅作为举例而言,为了应用的目的,可将微针或微针装置附着至例如注射器(syringe)或本文所述的任何注入器(injecors)或微针给药装置。对于内部组织,微针或微针装置的应用可在例如导管的辅助下实现。在一些实施方式中,可通过手术植入微针或微针装置。
生物屏障可以是需要活性试剂的受试者的任何生物组织。生物屏障的实例可包括但不限于:任何细胞、组织或器官,包括皮肤或其一部分(例如,角质层、表皮组织和真皮组织)、粘膜组织、血管组织、淋巴管、眼组织(例如角膜、结膜、巩膜)以及细胞膜。在一些实施方式中,生物屏障为皮肤。
术语“受试者”包括但不限于:哺乳动物、人、非人灵长类动物(如黑猩猩以及其它猿类和猴类);农场动物(farm animal),如牛、绵羊、猪、山羊和马;家养动物,如狗和猫;实验动物,包括啮齿类动物,如小鼠、大鼠和豚鼠。所述术语并不表示特定的年龄或性别。因此,意为涵盖了无论是雄性还是雌性的成年受试者和初生受试者以及胎儿。在一个实施方式中,受试者是哺乳动物。在一个实施方式中,受试者是人类受试者。
在一些实施方式中,本文所述的微针或微针装置可不包含活性试剂,并用来在生物屏障中制造微孔(例如,来使皮肤具有渗透性)。在此类实施方式中,在插入微针或给予微针装置后,可移除所述微针或微针装置,随后经由微孔给予活性试剂(例如使用包含活性试剂的透皮贴片)。
在一些实施方式中,微针或微针装置可设置为用于活性试剂的经皮给药。仅举例而言,本文所述的微针或微针装置可以是透皮贴片的一部分。在此类实施方式中,进一步包含粘合剂以及任选包含容器(例如,与微针相连通)。所述容器可含有用于通过微针递送的活性试剂。目前,存在多种可用的透皮贴片形式的药物制剂,包括但不限于:用于帮助戒烟的尼古丁贴片;用于减轻疼痛的阿片类药物,如芬太尼(Fentanyl,作为Duragesic市售)和丁丙诺啡(Buprenorphine,作为BuTrans市售);雌激素贴片,例如,用于治疗更年期症状和更年期后骨质疏松症;用于例如递送激素的男性(Androde)和女性(Intrinsa)的避孕药贴片(作为Ortho Evra或Evra市售)和睾酮贴片;硝化甘油贴片,例如用于治疗心绞痛(angina);用于治疗运动病(motion sickness)的东莨菪碱(scopolamine)贴片;抗高血压药可乐定(Clonidine,Catapres-TTS);抗抑郁药贴片,如Emsam(MAOI司来吉兰(selegiline)的经皮形式);Daytrana,用于注意力缺陷多动障碍(ADHD)药物哌甲酯(methylphenidate)的经皮递送药剂(也称为Ritalin或Concerta);维生素B12(例如氰钴胺,维生素B12的高度稳定形式);卡巴拉汀(Rivastigmine,阿尔兹海默病的治疗药物),对于商标名Exelon为贴片形式;胰岛素贴片;以及抗生素贴片。
在一些实施方式中,微针或微针装置可设置为用于经皮递送生长激素,例如但不限于本文所述的生长激素。
在一些实施方式中,微针或微针装置可设置为用于经皮递送止痛药物,例如但不限于本文所述的止痛药物。
在一些实施方式中,微针或微针装置可设置为用于经皮递送疫苗或疫苗产品,例如但不限于本文所述的疫苗或疫苗产品。
在微针或微针装置包含至少一种活性试剂的一些实施方式中,活性试剂从微针中释放的速率可根据下列因素变化:例如,微针的性能和/或设计、和/或活性试剂在本文所述的微针内的分布。在一些实施方式中,微针或微针装置的特征可在于活性试剂进入生物屏障的一条释放曲线。在一些实施方式中,微针或微针装置的特征可在于活性试剂进入生物屏障的两条或多条释放曲线。例如,当活性试剂经由流体通道给药至生物屏障时,其中包含流体通道的微针可提供活性试剂的迅速释放。同时,也可通过微针的降解或溶解,由微针主体(bulk)中以相对较慢的速率将活性试剂释放入生物屏障中。
在一些实施方式中,可在预先确定的时间内从本文所述的微针中释放期望量的至少一种活性试剂。在一些实施方式中,可在预先确定的时间内从微针中释放至少约5%的活性试剂,包括至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、或至少约97%、约98%、或约99%的活性试剂,或100%的活性试剂。在此类实施方式中,期望量的活性试剂可以在数秒、数分钟、数小时、数月或数年内从微针中释放出。在一些实施方式中,期望量的活性试剂可在微针插进组织后即刻从微针中释放出,例如,在5秒之内、10秒之内、30秒之内、1分钟或更久。在一些实施方式中,可以在至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约1周、至少约2周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约6个月或更久的时间内从微针中释放出期望量的活性试剂。在一些实施方式中,可以在约1年、约2年、约3年、约4年或更久的时间内从微针中释放出期望量的活性试剂。
在一些实施方式中,可由基于丝素蛋白的微针的溶解速率和/或溶解性来控制所述微针和/或微针装置对活性试剂的释放。在此类实施方式中,至少约5%的基于丝素蛋白的微针,包括至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、或至少约97%、约98%、或约99%的基于丝素蛋白的微针,或100%的基于丝素蛋白的微针可在预先确定的时间内溶解或降解。在此类实施方式中,降解或溶解可在数秒、数分钟、数小时、数月或数年内发生。在一些实施方式中,微针的降解或溶解可在插进组织后即刻发生,例如在5秒内、10秒内、30秒内、1分钟或更久。在一些实施方式中,溶解或降解可以在至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约1周、至少约2周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约6个月或更久的时间内发生。在一些实施方式中,溶解或降解可以在约1年、约2年、约3年、约4年或更久的时间内发生。确定活性试剂进入生物屏障的适当释放速率的方法是本领域周知的,例如,使用在实施例中所述的方法。
在另一方面,微针或微针装置可用于从生物屏障中提取生物分子(例如生物标记分子)。例如,微针可涂覆有例如但不限于:肽、蛋白质、抗体、生物标记结合分子和/或配体结合分子,然后被插入受试者的生物屏障中。然后可对结合在微针表面上的生物分子或生物标记分子进行分析(例如,为了诊断目的)。
若干选定的定义
除非另有说明或在上下文中有所暗示,下列术语和短语包括下文提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出,下列术语和短语不排除在其所属领域已具有的含义。提供所述定义以辅助描述本文描述的方面的具体实施方式,而由于本发明的范围仅受权利要求所限,因此并不意味着限制所请求保护的发明。另外,除非上下文另有要求,单数术语涵盖复数,并且复数术语涵盖单数。
本文所使用的术语“包含/包括(comprising或comprises)”表示对本发明必要的组合物、方法及其各自的组成部分,并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。另外,术语“包含/包括”包括“基本上由…组成”和“由…组成”。
本文所使用的术语“基本上由…组成”涉及给定的实施方式所需的那些元素。该术语允许存在实质上不影响本发明实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的额外成分。
术语“由…组成”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分,排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。
除了在操作实施例中或另有指示的地方,本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1%。
除非文中明确地另有所指,单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地,除非文中明确地另有所指,单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。
尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本文公开的实践或测试中,合适的方法和材料在下文有所描述。术语“包含/包括(comprises)”意思是“含有(includes)”。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempli gratia),并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此,缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
本文所使用的短语“基于丝素蛋白的微针”和“丝素蛋白微针”通常是指包含丝素蛋白的微针。在一些实施方式中,短语“基于丝素蛋白的微针”是指如下各微针:微针中丝素蛋白占总组成的至少约30%,包括总组成的至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或更高。在某些实施方式中,基于丝素蛋白的微针可大体上由丝素蛋白形成。在多个实施方式中,基于丝素蛋白的微针可大体上由包含至少一种活性试剂的丝素蛋白形成。
本文所使用的术语“大体上(substantially)”指的是比例为至少约60%,或优选为至少约70%或至少约80%、或至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99%或更高,或70%-100%间的任何整数。在一些实施方式中,术语“大体上”指的是比例为至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或更高,或90%-100%间的任何整数。在一些实施方式中,术语“大体上”可包括100%。
术语“稳定/稳定化(stabilize/stabilization)”在此处是指保持或维持基于丝素蛋白的微针中的至少一种活性试剂的生物活性。本文所使用的术语“活性试剂的稳定”是指分布、分散或包埋于基于丝素蛋白的微针中的一种或多种活性试剂维持其至少约30%的初始生物活性,包括至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%的初始生物活性或更高的初始生物活性。关于活性试剂的生物活性的术语“稳定”和“维持”在本文中可互换使用。
当涉及包含活性试剂的微针时,本文所使用的术语“保存(maintaining/maintain)”是指当使活性试剂经历特定条件时,保留、保持或维持本文所述的基于丝素蛋白的微针中的至少一种活性试剂的生物活性。在一些实施方式中,分布于基于丝素蛋白的微针中的一种或多种活性试剂维持其至少约30%的初始生物活性,包括至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%的初始生物活性或更高的初始生物活性。
本文所使用的关于活性试剂的术语“生物活性”,通常是指活性试剂与生物靶标相互作用的能力和/或对生物靶标产生影响的能力。例如,生物活性可不受限制地包括在生物靶标中诱发刺激、抑制、调节、毒性或致死响应。所述生物靶标可以是分子或细胞。例如,生物活性可以指活性试剂的以下能力:调节酶的作用/活性、阻断受体、刺激受体、调节一种或多种基因的表达水平、调节细胞增殖、调节细胞分裂、调节细胞形态,或上述能力的任意组合。在某些情况下,生物活性可以指化合物在细胞中产生毒性效应的能力。
生物活性可以通过分析细胞响应而测定。示例性的细胞响应包括但不限于:裂解、细胞凋亡、生长抑制和生长促进;细胞对蛋白质或其它感兴趣的分子的制造、分泌和表面暴露;膜表面分子活化,包括受体活化;跨膜离子转运;转录调控;细胞存活力的变化;细胞形态的变化;细胞内部组件的存在或表达的变化;细胞内生产的核酸的存在或表达的变化;细胞内生产的酶的活性的变化;以及受体的存在或表达的变化。用于分析不同细胞响应的方法对于本领域技术人员来说是周知的,例如,用于对细胞内源性蛋白质的存在或表达的变化进行测定的蛋白质印迹法、或用于监测细胞形态对活性试剂的响应的显微镜检查。
对于抗体,术语“生物活性”包括但不限于:表位或抗原结合亲和力、抗体的体内和/或体外稳定性、抗体的免疫原性(例如当给予人类受试者时)、和/或在体内或体外中和或拮抗靶分子生物活性的能力。可使用本领域认可的技术观测或测量上述特性或特征,所述技术包括但不限于:邻近闪烁分析法(scintillation proximity assays)、ELISA、ORIGEN免疫分析(IGEN)、荧光猝灭、荧光ELISA、竞争性ELISA、SPR分析(包括但不限于:使用BIAcore生物传感器的SPR分析)、体内和体外中和分析(参见,例如,国际公开号WO2006/062685)、受体结合、以及利用来自所需要的不同来源(包括人类、灵长类或其它任何来源)的组织切片的免疫组织化学。对于免疫原性物质,“生物活性”包括免疫原性,其定义在下文有详细论述。对于病毒,“生物活性”包括感染性,其定义在下文有详细论述。对于造影剂(例如染料),“生物活性”是指当给予受试者时,造影剂增强受试者体内结构或流体的对比度的能力。造影剂的生物活性还包括但不限于其在特定条件下与生物环境相互作用的能力和/或影响另一分子的响应的能力。
对于活性试剂的“初始生物活性”,通常是指将活性试剂引入基于丝素蛋白的微针之前立即测量出的或引入之后立即测量出的活性试剂的生物活性。即,可在将活性试剂引入基于丝素蛋白的微针前后(例如约20分钟内)对活性试剂的初始生物活性进行测量。在某些情况下,可在将活性试剂引入基于丝素蛋白的微针前后约10秒、约15秒、约20秒、约25秒、约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟或约20分钟时对活性试剂的初始生物活性进行测量。在另一实施方式中,本文所使用的术语“初始生物活性”可用于描述活性试剂被引入基于丝素蛋白的微针之前的生物活性。在一些实施方式中,术语“初始生物活性”是指活性试剂的最大生物活性,例如,活性试剂活化(例如,通过复水或通过提高温度)之后立即测得的生物活性。例如,如果活性试剂最初为粉末形式,则可在复水之后立即对该活性试剂的初始生物活性进行测量。在一些实施方式中,术语“初始生物活性”是指当在制造商指定的条件下储存或运输时,分散在非基于丝素蛋白的微针中的活性试剂的生物活性。在一些实施方式中,术语“初始生物活性”是指当在制造商指定的条件下在本文描述的基于丝素蛋白的微针中储存或运输时,活性试剂的生物活性。
术语“免疫原性”是指物质(如抗原或表位)在受试者中引发体液和/或细胞介导的免疫响应的能力。本领域技术人员可以容易地对物质的免疫原性进行测量。可通过本领域公认的任何方法对细胞介导的免疫响应的存在进行测定,例如:增殖分析(CD4+T细胞)、CTL(细胞毒性T淋巴细胞)分析(参见Burke,supra;Tigges,supra)、或受试者的组织切片的免疫组织化学,从而对给予免疫原后活化细胞(如单核细胞和巨噬细胞)的存在进行测定。本领域技术人员可通过任何完善的方法容易地对受试者中体液介导的免疫响应的存在进行测定。例如,生物样品(如血液)中产生的抗体水平可通过蛋白质印迹、ELISA或其它已知的抗体检测方法进行测量。
对于病毒,本文所使用的术语“感染性”是指病毒具有如下能力的特征:进入易感宿主、在易感宿主中生存和繁殖、或致使易感宿主产生免疫响应的能力。本领域技术人员知晓的用于测定病毒感染性的任何方法都可用于本文所述的目的。
本发明可由以下编号的段落中的任一项定义:
1.一种含有丝素蛋白的微针,其中,所述微针具有底部和穿透顶端,所述顶端的尺寸为约50nm-约50μm。
2.如段1所述的微针,其中,所述顶端的尺寸为约200nm-约40μm。
3.如段1或2所述的微针,该微针进一步包含至少一种活性试剂。
4.如段3所述的微针,其中,所述活性试剂选自于由下列试剂组成的组:蛋白质、肽、抗原、免疫原、疫苗、抗体或抗体的部分、抗体样分子、酶、核酸、siRNA、shRNA、适配子、病毒、细菌、小分子、细胞、激素、抗生素、治疗剂、诊断剂,以及上述试剂的任意组合。
5.如段1-4中任一项所述的微针,其中,所述活性试剂为抗生素。
6.如段1-5中任一项所述的微针,其中,当将所述微针在高于0℃的温度下保存至少约24小时时,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少约30%。
7.如段1-6中任一项所述的微针,其中,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少约50%。
8.如段6或7所述的微针,其中,将所述微针保存至少约1个月。
9.如段6-8中任一项所述的微针,其中,在约0℃-室温以上的温度下保存所述微针。
10.如段6-9中任一项所述的微针,其中,在约室温-约37℃的温度下保存所述微针。
11.如段1-10中任一项所述的微针,该微针进一步包含一种或多种可生物降解的聚合物。
12.如段1-11中任一项所述的微针,其中,所述微针一经接触生物环境后即以受控的速率降解。
13.如段12所述的微针,其中,所述微针的降解对分布于所述微针中的所述活性试剂的释放进行控制。
14.一种微针装置,所述装置包含:
基底以及一个或多个丝素蛋白微针,所述丝素蛋白微针整合至所述基底或附着至所述基底、并从所述基底延伸;
其中,各微针包含底部和穿透顶端。
15.如段14所述的装置,其中,所述微针进一步包含至少一种活性试剂。
16.如段15所述的装置,其中,所述活性试剂选自于由下列试剂组成的组:蛋白质、肽、抗原、免疫原、疫苗、抗体或抗体的部分、抗体样分子、酶、核酸、siRNA、shRNA、适配子、病毒、细菌、小分子、细胞、激素、抗生素、治疗剂、诊断剂,以及上述试剂的任意组合。
17.如段14-16中任一项所述的装置,其中,当将所述装置在高于0℃的温度下保存至少约24小时时,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少约30%。
18.如段14-17中任一项所述的装置,其中,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少约50%。
19.如段17或18所述的装置,其中,将所述装置保存至少约1个月。
20.如段17-19中任一项所述的装置,其中,在约0℃-室温以上的温度下保存所述装置。
21.如段17-20中任一项所述的装置,其中,在约室温-约37℃的温度下保存所述装置。
22.如段14-21中任一项所述的装置,其中,所述丝素蛋白微针的长度为约15μm-约1500μm。
23.如段22所述的装置,其中,所述丝素蛋白微针的长度为约150μm-约1000μm。
24.如段14-23中任一项所述的装置,其中,至少一个所述丝素蛋白微针的长度与其它丝素蛋白微针不同。
25.如段14-24中任一项所述的装置,其中,所述丝素蛋白微针进一步包含一种或多种可生物降解的聚合物。
26.如段14-25中任一项所述的装置,其中,所述丝素蛋白微针一经接触生物环境后即以受控的速率降解。
27.如段14-26中任一项所述的装置,其中,所述基底包含一种或多种生物相容性聚合物。
28.如段14-27中任一项所述的装置,其中,所述基底一经与表面接触后即与所述表面相顺应。
29.如段14-28中任一项所述的装置,其中,所述基底包含丝素蛋白并与所述丝素蛋白微针整合。
30.一种用于储存和递送活性试剂的微针,所述微针包含至少一种活性试剂和丝素蛋白,其中,所述微针具有底部和穿透顶端,所述顶端的尺寸为约50nm-约50μm;其中,当将所述微针在高于0℃的温度下保存至少约24小时时,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少约30%。
31.如段30所述的微针,其中,所述顶端的尺寸为约200nm-约40μm。
32.如段30或31所述的微针,其中,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少约50%。
33.如段30-32中任一项所述的微针,其中,将所述微针保存至少约1个月。
34.如段30-33中任一项所述的微针,其中,在约0℃-室温以上的温度下保存所述微针。
35.如段34所述的微针,其中,在约室温-约37℃的温度下保存所述微针。
36.如段30-35中任一项所述的微针,其中,通过所述微针的可控降解,将所述活性试剂释放入生物屏障中。
37.一种递送活性试剂穿过或进入生物屏障的方法,所述方法包括:
提供包含丝素蛋白和所述活性试剂的微针;
使所述微针穿透进入所述生物屏障;以及
允许所述活性试剂从所述微针中释放。
38.如段37所述的方法,其中,所述生物屏障为受试者的组织。
39.如段38所述的方法,其中,所述组织为皮肤。
40.如段37-39中任一项所述的方法,其中,通过所述微针在所述受试者组织中的降解,将所述活性试剂释放。
41.一种制造基于丝素蛋白的微针装置的方法,所述微针装置包含一个或多个丝素蛋白微针,所述方法包括:
提供微针微模具,所述微针微模具包含微模具基底以及所述微模具基底中的一个或多个孔,其中,所述微模具基底中的孔的内表面限定了所述微针的外表面;
用丝素蛋白溶液填充所述微针微模具;
将所述丝素蛋白溶液干燥,以形成基于丝的微针,所述微针具有由所述微针微模具的孔的内表面所限定的外表面;以及
将所述基于丝的微针装置与所述微针微模具分离。
42.如段41所述的方法,该方法进一步包括在所述干燥步骤前,将所述丝素蛋白溶液与至少一种活性试剂混合。
43.如段41或42所述的方法,该方法进一步包括用至少一层活性试剂涂覆至少一个丝素蛋白微针。
44.如段41-43中任一项所述的方法,该方法进一步包括在所述干燥步骤前,将所述丝素蛋白溶液与至少一种可生物降解的聚合物混合。
45.如段41-44中任一项所述的方法,其中,使丝素蛋白溶液填满并溢出所述微针微模具,以使在所述微针微模具上形成丝素蛋白溶液层;随后将其干燥以形成基底,所述基底附着至所述微针并支持所述微针。
46.如段45所述的方法,其中,所述丝素蛋白基底一经与表面接触后即与所述表面相顺应。
47.如段41-46中任一项所述的方法,该方法进一步包括在所述分离步骤前:将生物聚合物溶液沉积于所述干燥的、基于丝的微针装置上;以及干燥所述生物聚合物溶液,从而形成基底,所述基底附着至所述微针并支持所述微针。
48.如段47所述的方法,其中,所述生物聚合物基底一经与表面接触后即与所述表面相顺应。
49.如段41-48中任一项所述的方法,该方法进一步包括调节所述丝素蛋白微针的溶解度的步骤。
50.如段49所述的方法,其中,所述调节步骤包括水退火处理或甲醇处理,以延长所述丝素蛋白微针的溶解持续时间。
51.如段41-50中任一项所述的方法,该方法进一步包括在所述丝素蛋白微针中产生多孔结构。
52.如段41-51中任一项所述的方法,其中,所述微针微模具通过包括下列步骤的步骤制备:
提供模具基底;
用保护层涂覆所述模具基底;
用光刻胶层涂覆所述保护层;
使所述光刻胶层图案化,以形成第一微图案化掩模;
使用所述第一微图案化掩模刻蚀所述保护层,以形成第二微图案化掩模;
使用所述第二微图案化掩模刻蚀所述模具基底,以去除所述模具基底的一部分,以使所述第二微图案化掩模被逐渐根切,从而由所述模具基底形成微针微阳模,所述微针微阳模包含一个或多个微针;所述微针包含底部末端,所述底部末端逐渐变细至穿透顶端;其中,所述穿透顶端接触所述第二微图案化掩模;以及
去除所述第二微图案化掩模,从而释放所述微针微阳模。
53.如段52所述的方法,其中,所述刻蚀包括各向异性刻蚀、各向同性干法刻蚀或各向同性湿法刻蚀中的一种或多种。
54.如段52或53所述的方法,其中,所述经各向同性刻蚀而形成所述微针阳模的材料为玻璃、金属、半导体、聚合物、陶瓷、或上述任何材料的混合材料。
55.如段52-54中任一项所述的方法,其中,所述保护层的材料包括Si3N4、氧化物、氮化物、金属、聚合物、半导体或其它有机材料。
56.如段52-55中任一项所述的方法,其中,所述使光刻胶层图案化的步骤包括光刻。
57.如段52-56中任一项所述的方法,其中,刻蚀控制所述微针的几何形状。
58.如段54-57中任一项所述的方法,其中,刻蚀产生微针微阳模,所述微针微阳模具有直径不超过1μm的穿透顶端。
下列实施例阐明了本发明的一些实施方式和一些方面。对相关领域技术人员来说显而易见的是,在不改变本发明的精神或范围的情况下可进行各种修改、增加、替换等,并且这些修改和变化都落入所附权利要求书所限定的本发明的范围之内。下述实施例不以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1.使用硅微针模塑母模制造微针的示例性方法
图3A-图3K中示出了用于制造本发明的包含丝素蛋白的微针的实施方式的方案。(图3A)制造所用的基底为具有200nm厚的低应力氮化硅(Si3N4)层的硅(Si)晶片;(图3B)该晶片涂覆有1μm正性光刻胶(S1813,Rohm&Haas);(图3C)进行光刻,留下在后续刻蚀步骤中起到掩模作用的圆形光刻胶图案;(图3D)以SF6气体进行各向异性反应离子刻蚀(RIE),刻蚀出图案化的Si3N4薄膜并暴露出下面的Si材料;(图3E)以氢氟酸、硝酸和乙酸混合物(HNA)进行定时各向同性湿刻蚀,以根切Si3N4掩模;(图3F)短暂的超声波浴移除残留的Si3N4圆形掩模并暴露出下面的Si微针模具;(图3G)将聚二甲基硅氧烷(PDMS)聚合物浇注于Si微针阳模上并固化;(图3H)从Si母模中移除PDMS阴模;(图3I)将丝素蛋白水溶液与所需药物混合;(图3J)将装载有药物的丝溶液浇注至所述PDMS模具上,并使所述溶液干燥以形成薄膜;以及(图3K)将微针图案化的并装载有药物的丝薄膜从母模中移除。
通过放大来对所得微针的结构进行分析。图4A示出了底部直径150μm、高60μm、顶端半径<500nm的Si微针模塑母模。图4B示出了根据本发明的一个实施方式,以高精度复制原始Si母模的丝素蛋白微针结构。图4C显示丝微针顶端的放大视图,测得直径小于2μm。与先前的基于聚合物的可溶性微针设计(Sullivan等,16Nature Med.915(2010))相比,本发明的制造方法生成了更锐利的顶端(<2μm相对于>10μm),因此提高了各针穿透皮肤的概率并因此提高了给予至受试者的试剂总量。
实施例2.丝薄膜的药物装载、丝加工和药物释放动力学
图5显示试剂从基于丝素蛋白薄膜中的释放可通过厚度、β-折叠含量和分子量进行控制。在一个实施方式中,增加薄膜厚度、增加β-折叠含量和增加脱胶(degumming)时间(相当于降低平均分子量)均使得释放持续时间增加、平均释放速率降低。每膜含有0.25mgGFP的薄的、甲醇交联的丝薄膜在24小时内释放了总药物载药量的92.8%±7%,但可容易地改变这一释放速率,来控制目标应用的释放行为。图5显示与未处理的薄膜相比,甲醇处理过的装载有靛蓝染料的丝薄膜在释放进入鸡胸组织时较慢。如图5所示,当开始接触组织时,未处理的薄膜(上方)部分溶解,而甲醇处理过的薄膜(下方)仅依赖扩散作用。
对于甲醇处理,其处理的浓度和持续时间均对溶胀和由丝素蛋白材料的试剂释放有影响。图6A示出了装载有活性红120染料(模型染料,MW=~1500;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的水合丝素蛋白薄膜的照片,所述照片反映出比较不同浓度的甲醇、以及甲醇处理30秒/甲醇处理5min时,多种薄膜的累计释放行为,以及D/L2(对膜渗透性的衡量)。在图6B和图6C中也以图形方式描述了所述数据,并显示出可对丝素蛋白的三级结构进行操纵,从而对给定试剂的释放速率进行控制。应当注意到,作为甲醇的替代物,可在丝素蛋白微针上使用乙醇,来影响丝素蛋白结构和试剂释放曲线。
实施例3.使用铝微针模塑母模制造微针的另一示例性方法
图7A-图7F说明了根据本发明的一个或多个实施方式制造丝微针的示例性过程的示意图。此类技术的效果由在环境压力和环境温度下进行丝素蛋白微针的微模塑而得以证明。水源性(aqueous-derived)丝素蛋白微针通常可重现A1模塑母模。在一些实施方式中,水源性丝素蛋白微针的高度可以为约500微米、顶端半径<10微米。在一些实施方式中,丝素蛋白微针可掺杂有至少一种活性试剂。如随后的实施例所示,丝素蛋白微针的一些实施方式可掺杂有辣根过氧化物酶(HRP)作为大分子模型药物。在其它实施方式中,丝素蛋白微针可装载有抗生素四环素。如图8E-图8F所示,为了可视化目的,在一些实施方式中,将活性红120染料掺入丝素蛋白微针。
以高速微铣削法、继以各向同性湿刻蚀制造铝(A1)微针模塑母模(图7A和图8A)。铣削步骤提供了尺寸近似于期望拓扑结构(topology)的微针模板(图8A),而对铝模板进行的定时化学刻蚀则使所述结构精细化(图8B和图8D),产生针高约500微米、顶端半径<10微米的针阵列(图8C)。这些A1微针母模被用于通过使用完善的软刻印技术[25],使用软弹性体(elastomer)材料(例如,聚二甲基硅氧烷(PDMS))来制造基于弹性体的微针阴模(图7B-图7C)。使用这一软弹性体材料可提供可重现的微米量级特征,并易于从所述软弹性体材料中分离丝素蛋白结构,进而使破坏所得装置的概率最小化[19]。此外,通过例如将弹性体表面短暂暴露于氧等离子体[26]或通过其它本领域已知的方法,可将PDMS的表面性质由疏水性改性为部分亲水性。另外,PDMS的多孔网络可允许经由所述弹性体除去水分[27]。这些是在模塑过程中获得具有高长宽比的丝结构所必不可少的特征的一些实例。
将丝素蛋白水溶液(6%-8%wt/vol)浇铸于PDMS模板上(图7D)。在一些实施方式中,丝素蛋白水溶液可进一步包含至少一种药物。在一些实施方式中,可通过例如将PDMS表面短暂暴露于氧等离子体来对PDMS模板进行处理。在丝素蛋白溶液转变至固态后(图7E)(例如通过过夜干燥[28]),然后可将丝素蛋白微针阵列从PDMS模具中分离(图7F、图8E-图8F)。可通过后处理对产生的丝素蛋白微针进行进一步修饰,例如以对丝素蛋白微针的降解速率和/或对其中包埋的活性试剂的扩散性能进行调节。这一控制程度可通过例如对蛋白质的二级结构进行调节而实现。不希望受理论限制,高含量的β折叠二级结构可致使丝素蛋白薄膜不溶于水。可通过多种方法对β折叠含量进行控制,所述方法包括但不限于:通过丝类材料[28]的干燥速率对其水合状态进行调节[29]、暴露至甲醇或高湿度(例如水蒸气退火(annealing))、或暴露至各种温度、机械和电[28-31]。调节β折叠的含量可产生具有可控的结晶度、溶解度和释放动力学的丝素蛋白材料[30-33]。在一些实施方式中,可使用各种水蒸气退火时间来对丝素蛋白针的药物释放性能进行调节。这些后处理步骤可允许对丝微针的扩散性进行控制,最终提供对药物释放动力学的控制。
实施例4.丝素蛋白微针释放动力学的测定
为了证明对丝素蛋白微针释放动力学的控制,使用了明胶或胶原水凝胶与聚合物薄膜膜构造(图9A-图9C)。由于其在冲击测试(ballistic testing)中通常作为组织类似物使用,选择10%-20%的明胶水凝胶或胶原水凝胶[34]。另外,胶原水凝胶是光学透明的,因此允许对释放动力学进行评估。此外,也可对胶原水凝胶的含水量、扩散和机械性能进行调节。聚合物膜具有双重目的:(1)模拟皮肤外层以证明微针提供足够的机械韧度来成功刺穿所述膜;以及(2)发挥扩散屏障的作用,以阻止丝素蛋白微针阵列的大块丝素蛋白基底将模型药物释放入下面的胶原水凝胶中(即,确保所监测的释放仅来自于所述针)[35,36]。如图9A所示,首先将所述聚合物膜置于装载有HRP的微针贴片上方,随后施用至胶原水凝胶板。在一些实施方式中,哺乳动物的皮肤(例如,猪皮)可用作评估丝素蛋白微针释放动力学、和/或本文所述的微针的机械性能(例如,穿透能力)的模型。
图9B描述了HRP的酶活性,所述HRP在丝加工和胶原酶消化期间维持活性,并通过使用在活性HRP存在下变为蓝色的显色底物来对其进行检测。对HRP从丝素蛋白微针释放进入胶原水凝胶的释放动力学(N=3)进行光谱学测定。使用胶原酶选择性地消化胶原水凝胶。随后,根据下文在示例性的材料和方法中的描述,进行HRP酶活性比色分析(图9C)。图9C中的插图显示了胶原水凝胶中的初始HRP释放。在整个测试期间均观测到HRP的持续释放(图9C)。在未经处理的微针装置中,在48小时后观测到每微针50pg HRP的最大释放。与2小时和8小时水韧处理的装置相比,未经处理的丝微针在相同时间内释放各自多达约2.7±0.18倍和约5.6±0.99倍的HRP。例如通过红外光谱[31],对丝素蛋白微针样品中的β折叠含量进行测定,未经处理的、2小时退火的和8小时退火的丝素蛋白微针样品的结果各自为~14%、~18%和~21%。这一发现表明延长水蒸气退火时间提高了β折叠含量并降低了HRP释放。因此,仅作为举例而言,对于控制丝素蛋白微针内包埋的活性试剂的释放而言,水蒸气退火可以是处理丝素蛋白微针的示例性方法。在一些实施方式中,可使用其它后处理方法来调整丝素蛋白中β折叠的量,从而控制药物释放速率。
此外,在某些情况下,给予抗生素可理想地防止微针穿透位点处的感染(参见:例如,Donnelly等,(2009)Pharm Res.26:2513-2522)。为了对使用丝素蛋白微针降低感染的效力进行评价,制备并评价了装载有抗生素的丝素蛋白微针。根据本文所述,制备了装载有四环素的丝素蛋白微针和空白丝素蛋白微针(用作对照)。根据图9A中的描述使用丝素蛋白微针阵列(即,仅暴露微针),并使用PDMS将其贴附至细胞培养板底部。将胰蛋白酶大豆琼脂(Tryptic Soy Agar)添加至包含经装载的微针阵列或未经装载的微针阵列的各板中并允许其形成凝胶。随后,将金黄葡萄球菌(S.aureus)施加于各板、并在37℃下培养过夜以允许形成细菌菌苔。
在药物释放区域,释放四环素的微针使得细菌密度明显降低(图10A)。为了对细菌密度进行定量,切取微针阵列上方10mm直径区域的琼脂,使其均匀分布于培养肉汤中并铺成三板。将铺好的液体培养物在37℃下培养过夜以允许菌落生长。对于暴露于装载有药物的丝素蛋白微针的琼脂样品,测得其菌落形成单位(以每切除面积百万CFU计)与对照相比降低了10倍(图10B)。装载有抗生素的微针抑制了细菌生长。
本文提供了制造高长宽比的丝素蛋白微针的一种或多种实施方式。在丝素蛋白微针制造期间温和的加工条件以及丝素蛋白生物材料的性质可允许在微针中引入并储存敏感的活性试剂(例如,药物如抗生素,以及不稳定的酶)。例如,本文所描述的内容表明全部在温和环境条件下进行丝素蛋白微针的制造和后处理,可保留微针中大分子的功能,并控制其释放。此外,丝素蛋白微针可装载有抗生素,以抑制病原体的生长,这可以为防止局部感染提供有吸引力的策略。本文提供的基于丝素蛋白的微针系统概括了形式与功能,成功地解决了当前关于其它聚合物微针系统或金属微针系统的局限,并为药物和治疗剂的储存和递送提供了有效途径。
本文所述的丝素蛋白微针或微针装置可用于满足一系列临床需求,包括对具有短半寿期的肽治疗剂和疫苗的持续递送[22]。在一些实施方式中,人生长激素治疗[22,38]和需要长期接触的疫苗[24]均可从本文所述的微针或微针装置的一些实施方式中受益。可将丝素蛋白对引入的活性试剂(如蛋白质)的稳定效应与微针的便利性和自给药相结合,以产生安全并易于自给药、同时能在提升的温度下储存的药物递送平台。
示例性的材料和方法
母模的制造:通过具有0.5mm、15deg立铣刀(end mill)的计算机数控CNC机床、在定制的70K rpm工具中,制造铝(A1)母模。所述铝模板在50℃下通过A1刻蚀剂中的定时(1.5小时)化学湿刻蚀进一步加工(A型A1刻蚀剂,80%磷酸、5%硝酸、5%乙酸和10%蒸馏水)。
丝提取:在本领域中,从家蚕蚕茧中获取丝素蛋白水溶液的过程以前已有描述,例如[37]。简单来说,通过在碳酸钠水溶液中将蚕茧煮沸约40分钟而去除丝胶。在干燥之后,将丝素蛋白纤维溶解于溴化锂溶液中。随后通过对去离子(DI)水透析将盐分除去,直至溶液达到约6%-8%wt/v的浓度。
HRP释放模型:以1mg/ml的HRP(Sigma Aldrich)装载丝素蛋白微针。通过水蒸气退火处理丝素蛋白微针贴片约2小时及约8小时,以改变释放特性。明胶水凝胶或胶原水凝胶通过如下步骤制备:通过将40ml的DI水煮沸并将其与4.5g的KNOXTM初始无味明胶粉相混合而获得浓度约为0.112g/ml的水凝胶。将溶液倒入直径100mm的培养皿(Petri dish)并使其冷却。测得胶原或明胶板高约2.5mm。将所述板切割成10mm×5mm的块。将丝微针贴片切成(diced)2个针阵列。使所述针穿通Parafilm(Parafilm M,Pechiney Plastic Packaging)薄膜(图8A中的聚合物膜),随后施加于水凝胶板,以对HRP释放进行定量。所有构造均保持在湿润环境中,以避免水凝胶脱水。为了对由丝素蛋白微针释放的HRP总量进行定量,在多个时间点对多个堆叠体(stacks)(各堆叠体包括丝素蛋白微针阵列、聚合物膜和胶原水凝胶)进行了制备与评价。在各个指定的时间点,将所述微针从水凝胶板处移除以停止HRP进一步释放。然后,在36℃下将所述水凝胶板在400μl的1mg/ml胶原酶(Sigma Aldrich)中消化约2h。随后,根据本领域公知的方案使用TMB过氧化物酶底物(Bethyl LaboratoriesInc)对HRP含量进行定量。简单来说,使两种底物组分(处于柠檬酸中的0.02%H2O2溶液和0.4g/L3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液)达到室温,以等体积混合,然后加至含有HRP的样品(包括标准品和试验样品)。将样品在室温下孵育约5-10分钟,直至观测到足够的颜色变化。然后加入等体积的H2SO4以停止显色。使用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度。在同一条件下平行制备具有已知量HRP的浓度标准品。
傅里叶变换红外光谱(FTIR):使用本领域已知的任何方法(例如在[31]中描述的方法)进行FTIR测量(FT/IR-6200光谱仪,Jasco)和分析。通过OPUS5.0软件(BrukerOptics)对酰胺I区域的红外光谱进行了傅里叶自去卷积(self-deconvolution)。以27cm-1的谱带半宽度和0.3的降噪系数(noise reduction factor)进行自去卷积。
装载有抗生素的丝素蛋白微针和细菌生长:根据本文的描述制造了装载有2mg/ml四环素的丝素蛋白微针贴片。根据制造商的说明制备胰蛋白酶大豆琼脂,并将其等分至直径100mm的培养皿中(每板15-20ml)。依照制造商的说明,对冻干的金黄色葡萄球菌ATCC25923(美国典型培养物保藏中心,American Type Culture Collection)细菌培养物进行了复水和扩增。为了测试细菌对所接触的装载有抗生素的丝素蛋白微针的敏感性,使液体培养物生长18-24小时,直至光密度(OD600)为1-1.2(相当于活菌数约为106CFU/mL)。从微针阵列上方切取直径10mm的琼脂检查(总面积=约78.5mm2)。将阵列样品浸入10mL的胰蛋白酶大豆肉汤中,并使其均质化5-10秒。将匀浆稀释并铺于胰蛋白酶大豆琼脂板上(每板0.5mL液体培养物)。在对液体培养物进行孵育之后,选择可辨认出单个菌落的最低稀释液并对菌落进行计数(每一样品3板,每一处理类型3份样品)。
其它实施方式也包含于本发明的范围和精神之内。此外,虽然上述描述涉及本发明,然而所述描述也可包括一个以上的发明。
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在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可对所公开的实施方式进行多种改变和修饰,这对本领域技术人员来说将是显而易见的。另外,出于描述和公开的目的,在此以引用的方式将在本文中标明的所有专利与其它出版物明确地并入本文,例如在此类出版物中描述的可用于本发明的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息,并且不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
Claims (59)
1.一种丝素蛋白微针,其中,所述微针具有底部和穿透顶端,所述穿透顶端的形状的最宽测量值为50nm-50μm。
2.如权利要求1所述的丝素蛋白微针,其中,所述穿透顶端的形状的最宽测量值为200nm-40μm。
3.如权利要求1所述的丝素蛋白微针,该微针进一步包含至少一种活性试剂。
4.如权利要求3所述的丝素蛋白微针,其中,所述活性试剂选自于由下列试剂组成的组:蛋白质、免疫原、酶、核酸、小分子、细胞、激素、治疗剂、诊断剂,以及上述试剂的任意组合。
5.如权利要求4所述的丝素蛋白微针,其中,所述免疫原为病毒、细菌或以上试剂的组合。
6.如权利要求4所述的丝素蛋白微针,其中,所述蛋白质为抗体、抗体样分子或以上试剂的组合。
7.如权利要求4所述的丝素蛋白微针,其中,所述小分子为肽。
8.如权利要求4所述的丝素蛋白微针,其中,所述治疗剂为疫苗、抗生素或以上试剂的组合。
9.如权利要求3-8中任一项所述的丝素蛋白微针,其中,所述活性试剂为抗生素。
10.如权利要求3-8中任一项所述的丝素蛋白微针,其特征在于,所述丝素蛋白微针稳定所述活性试剂,从而当将所述丝素蛋白微针在高于0℃的温度下保存至少24小时时,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少30%。
11.如权利要求3-8中任一项所述的丝素蛋白微针,其中,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少50%。
12.如权利要求10所述的丝素蛋白微针,其中,将所述微针保存至少1个月。
13.如权利要求10所述的丝素蛋白微针,其中,在0℃-室温的温度下保存所述微针。
14.如权利要求10所述的丝素蛋白微针,其中,在室温-37℃的温度下保存所述微针。
15.如权利要求1所述的丝素蛋白微针,该微针进一步包含一种或多种可生物降解的聚合物。
16.如权利要求1所述的丝素蛋白微针,其中,所述微针一经接触生物环境后即以受控的速率降解。
17.如权利要求16所述的丝素蛋白微针,该微针进一步包含至少一种活性试剂,其中,所述微针的降解对分布于所述微针中的所述活性试剂的释放进行控制。
18.一种微针装置,所述装置包含:
基底以及一个或多个丝素蛋白微针,所述丝素蛋白微针整合至所述基底或附着至所述基底、并从所述基底延伸;
其中,各微针包含底部和穿透顶端。
19.如权利要求18所述的装置,其中,所述微针进一步包含至少一种活性试剂。
20.如权利要求19所述的装置,其中,所述活性试剂选自于由下列试剂组成的组:蛋白质、免疫原、酶、核酸、小分子、细胞、激素、治疗剂、诊断剂,以及上述试剂的任意组合。
21.如权利要求20所述的装置,其中,所述免疫原为病毒、细菌或以上试剂的组合。
22.如权利要求20所述的装置,其中,所述蛋白质为抗体、抗体样分子或以上试剂的组合。
23.如权利要求20所述的装置,其中,所述小分子为肽。
24.如权利要求20所述的装置,其中,所述治疗剂为疫苗、抗生素或以上试剂的组合。
25.如权利要求19-24中任一项所述的装置,其中,当将所述装置在高于0℃的温度下保存至少24小时时,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少30%。
26.如权利要求19-24中任一项所述的装置,其中,所述活性试剂维持其初始生物活性的至少50%。
27.如权利要求18-24中任一项所述的装置,其中,将所述装置保存至少1个月。
28.如权利要求18-24中任一项所述的装置,其中,在0℃-室温的温度下保存所述装置。
29.如权利要求18-24中任一项所述的装置,其中,在室温-37℃的温度下保存所述装置。
30.如权利要求18-24中任一项所述的装置,其中,所述丝素蛋白微针的长度为15μm-1500μm。
31.如权利要求30所述的装置,其中,所述丝素蛋白微针的长度为150μm-1000μm。
32.如权利要求18所述的装置,其中,至少一个所述丝素蛋白微针的长度与其它丝素蛋白微针不同。
33.如权利要求18所述的装置,其中,所述丝素蛋白微针进一步包含一种或多种可生物降解的聚合物。
34.如权利要求18所述的装置,其中,所述丝素蛋白微针一经接触生物环境后即以受控的速率降解。
35.如权利要求18所述的装置,其中,所述基底包含一种或多种生物相容性聚合物。
36.如权利要求18所述的装置,其中,所述基底一经与待穿透的表面接触后即与所述表面相顺应。
37.如权利要求18所述的装置,其中,所述基底包含丝素蛋白并与所述丝素蛋白微针整合。
38.丝素蛋白溶液在制造用于递送活性试剂穿过或进入生物屏障的微针方面的用途,其中:
所述微针包含丝素蛋白和所述活性试剂;
所述微针用于穿透进入所述生物屏障;以及
所述活性试剂能够从所述微针中释放。
39.如权利要求38所述的用途,其中,所述生物屏障为受试者的组织。
40.如权利要求39所述的用途,其中,所述组织为皮肤。
41.如权利要求39或40所述的用途,其中,通过所述微针在所述受试者组织中的降解,将所述活性试剂释放。
42.一种制造干燥的、基于丝素蛋白的微针装置的方法,所述微针装置包含一个或多个基于丝素蛋白的微针,所述方法包括:
提供微针微模具,所述微针微模具包含微模具基底以及所述微模具基底中的一个或多个孔,其中,所述微模具基底中的孔的内表面限定了所述微针的外表面;
用丝素蛋白溶液填充所述微针微模具;
将所述丝素蛋白溶液干燥,以形成干燥的、基于丝素蛋白的微针,所述微针具有由所述微针微模具的孔的内表面所限定的外表面;以及
将所述干燥的、基于丝素蛋白的微针与所述微针微模具分离。
43.如权利要求42所述的方法,该方法进一步包括在所述干燥步骤前,将所述丝素蛋白溶液与至少一种活性试剂混合。
44.如权利要求42或43所述的方法,该方法进一步包括用至少一层活性试剂涂覆至少一个基于丝素蛋白的微针。
45.如权利要求42或43所述的方法,该方法进一步包括在所述干燥步骤前,将所述丝素蛋白溶液与至少一种可生物降解的聚合物混合。
46.如权利要求42或43所述的方法,其中,使丝素蛋白溶液填满并溢出所述微针微模具,以使在所述微针微模具上形成丝素蛋白溶液层;随后将所述丝素蛋白溶液层干燥以形成基底,所述基底附着至所述微针并支持所述微针。
47.如权利要求46所述的方法,其中,所述丝素蛋白基底一经与待穿透的表面接触后即与所述表面相顺应。
48.如权利要求42或43所述的方法,该方法进一步包括在所述分离步骤前:将生物聚合物溶液沉积于所述干燥的、基于丝素蛋白的微针装置上;以及干燥所述生物聚合物溶液,从而形成基底,所述基底附着至所述微针并支持所述微针。
49.如权利要求48所述的方法,其中,所述生物聚合物基底一经与待穿透的表面接触后即与所述表面相顺应。
50.如权利要求42或43所述的方法,该方法进一步包括调节所述基于丝素蛋白的微针的溶解度的步骤。
51.如权利要求50所述的方法,其中,所述调节步骤包括水退火处理或甲醇处理,以延长所述基于丝素蛋白的微针的溶解持续时间。
52.如权利要求42或43所述的方法,该方法进一步包括在所述基于丝素蛋白的微针中产生多孔结构。
53.如权利要求42或43所述的方法,其中,所述微针微模具通过包括下列步骤的步骤制备:
提供模具基底;
用保护层涂覆所述模具基底;
用光刻胶层涂覆所述保护层;
使所述光刻胶层图案化,以形成第一微图案化掩模;
使用所述第一微图案化掩模刻蚀所述保护层,以形成第二微图案化掩模;
使用所述第二微图案化掩模刻蚀所述模具基底,以去除所述模具基底的一部分,以使所述第二微图案化掩模被逐渐根切,从而由所述模具基底形成微针微阳模,所述微针微阳模包含一个或多个微针;所述微针包含底部末端,所述底部末端逐渐变细至穿透顶端;其中,所述穿透顶端接触所述第二微图案化掩模;以及
去除所述第二微图案化掩模,从而释放所述微针微阳模。
54.如权利要求53所述的方法,其中,所述刻蚀包括各向异性刻蚀、各向同性干法刻蚀或各向同性湿法刻蚀中的一种或多种。
55.如权利要求54所述的方法,其中,经各向同性干法刻蚀或各向同性湿法刻蚀而形成所述微针微阳模的材料为玻璃、金属、半导体、聚合物、陶瓷、或上述任何材料的混合材料。
56.如权利要求53所述的方法,其中,所述保护层的材料包括氧化物、氮化物、金属、聚合物、半导体或其它有机材料。
57.如权利要求53所述的方法,其中,所述使光刻胶层图案化的步骤包括光刻。
58.如权利要求53所述的方法,其中,刻蚀控制所述微针的几何形状。
59.如权利要求53所述的方法,其中,刻蚀产生微针微阳模,所述微针微阳模具有直径不超过1μm的穿透顶端。
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Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |