CN103255107B - 一种卵巢癌细胞株trp14-a2780及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的卵巢癌细胞株，该卵巢癌细胞株TRP14-A2780保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC C201339。本发明的有益效果是：通过脂质体瞬转的方法，将TRP14高表达的质粒转导入卵巢癌A2780细胞中，经过G418抗生素稳转筛选以及单克隆的挑选及验证，从而建立了TRP14稳定高表达的细胞株TRP14-A2780。本发明的细胞株可为研究卵巢癌紫杉醇化疗耐药机制的进一步深入研究搭建了一个良好的基础。

Description

一种卵巢癌细胞株TRP14-A2780及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新的卵巢癌细胞株TRP14-A2780，通过脂质体的转导和稳筛，在该细胞株中实现了对TRP14基因的稳定高表达。

背景技术

卵巢癌仍然是迄今致死率最高的妇科恶性肿瘤，根据美国国家健康统计中心2012年公布的数据，美国卵巢癌总的5年生存率为44％，其中晚期病例仅为27％（Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2012.CA CancerJ Clin.2012Jan;62(1):10-29.）。目前卵巢癌的主要治疗方式为肿瘤细胞减灭术和以铂类、紫杉醇为一线药物的联合化疗。大多数患者在治疗后2～3年内复发，几乎所有复发性卵巢癌对再次化疗耐药（Agarwal R,Kaye SB.Ovariancancer:strategies for overcoming resistance to chemotherapy.Nat RevCancer2003;3:502-16.），导致卵巢癌高致死率的主要原因是由于多数患者在首次就诊时已经处于肿瘤的晚期以及初次治疗后复发、耐药。因此研究卵巢癌化疗耐药的机制对改善卵巢癌患者的远期疗效具有重要意义。

紫杉醇是一种促微管聚合和稳定，抗有丝分裂的细胞周期特异性药物。研究表明，与紫杉醇耐药相关的机制主要包括：P-糖蛋白等药物泵出蛋白表达增加，微管动态变化和tubulin同型分子表达改变，微管相关和细胞骨架调节相关蛋白阻碍紫杉醇和微管结合，纺锤体检查点蛋白BubR1及凋亡相关分子改变等（Kavallaris M.Microtubules and resistance to tubulin-bindingagents.Nat Rev Cancer.2010Mar;10(3):194-204.）。但根据已有报道，各种针对这些靶点的阻遏方法仅能部分逆转卵巢癌耐药，事实上迄今尚没有一种基于上述机制建立的逆转耐药方法应用于临床。卵巢癌耐药的关键机制尚有待阐明。

申请人在前期研究中，通过药物浓度逐渐递增的紫杉醇的持续、长期作用，成功建立了紫杉醇耐药的卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30，其耐药指数较亲代SKOV3细胞增加27倍(Fu Y,Ye D,Chen H.et al.Weakened spindle checkpoint withreduced BubR1expression in paclitaxel-resistant ovarian carcinoma cellline SKOV3-TR30.Gynecol Oncol.2007Apr;105(1):66-73.)。研究显示紫杉醇耐药的细胞株与其亲代细胞相比，除了耐药性增加之外，其他多种表型也可发生改变。为了进一步研究耐药细胞和亲代细胞间差异表达的蛋白，我们采用LC-MS/MS-based label-free定量蛋白质组学技术进行筛选，共发现356个差异蛋白，涉及细胞代谢、生化过程调控、物质运输、组织发生、细胞分化、死亡和信号转导等多个方面。其中部分差异蛋白可能参与了卵巢癌侵袭转移和细胞增殖、死亡等其他生物学行为的调控。进一步通过定量RT-PCR和Western Blot验证我们发现硫氧还蛋白相关蛋白14（TRP14）在耐药细胞中表达显著上调。

TRP14是一种广泛表达的可溶性的胞浆蛋白，最早从Hela细胞cDNA文库中成功克隆，相对分子质量为14KD，属于Trx蛋白家族新发现的一种二硫还原酶。但目前对于TRP14的功能所知甚少。仅有的研究提示TRP14参与肿瘤坏死因子α（TNF-α）信号途径的调控。采用RNA干扰部分下调TRP14的表达，可导致Hela细胞TNF-α诱导的核因子κB（NF-κB）活化，丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）途径激活，和细胞凋亡增加(Jeong WJ,Chang TS,Boja ES,et a1.Roles ofTRPl4,a thioredoxin-related protein in tumor necrosis factor-alphasignaling pathways.J Biol Chem,2004,279(5):3151-3159.)。虽然TRP14对TNF-α的效应具有调控作用，但TRP14是否可改变卵巢癌细胞的化疗耐药性，目前未有报道。但一般瞬时质粒转染的短效性，在研究中需要多次转染，这无疑增加了人力投入及研究成本。构建该稳转细胞株可以直接用于检测实验研究中的指标，可避免多次重复转染，简化实验操作，节约实验时间和成本。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新的卵巢癌细胞株，该卵巢癌细胞株可直接用于研究中各项相关指标的检测，省时省力。本发明的第二个目的是提供上述卵巢癌细胞株的建立方法。本发明的第三个目的是提供上述卵巢癌细胞株的应用。

为了实现上述第一个目的，本发明采用了以下技术方案：

一种新的卵巢癌细胞株，该卵巢癌细胞株TRP14-A2780保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC C201339。

为了试验上述第二个目的，本发明采用以下的技术方案：

一种如所述的卵巢癌细胞株的建立方法，该方法包括以下步骤：

1）合成可以有效高表达TRP14的质粒。

2）转染卵巢癌A2780细胞，通过抗生素筛选获得稳转细胞。

载体选用GV141载体，即合成可以有效高表达TRP14的质粒的时候选用GV141载体。

所述抗生素为G418抗生素。

为了实现上述第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

上述的卵巢癌细胞株TRP14-A2780用于作为卵巢癌紫杉醇耐药机制的探讨及相关信号通路的研究的细胞模型。

本发明的有益效果是：通过脂质体瞬转的方法，将TRP14高表达的质粒转导入卵巢癌A2780细胞中，经过G418抗生素稳转筛选以及单克隆的挑选及验证，从而建立了TRP14稳定高表达的细胞株TRP14-A2780。本发明的细胞株可为研究卵巢癌紫杉醇化疗耐药机制的进一步深入研究搭建了一个良好的基础。

附图说明

图1为质粒抽提，质粒电泳图。

图2为双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定图。

图3为质粒测序图

图4为实验组、阴性对照组提取RNA，通过Realtime PCR方法检测TRP14基因mRNA水平的表达图。

图5为实验组、阴性对照组提取蛋白质，通过Western blot方法检测TRP14基因蛋白水平的表达图。

保藏说明

卵巢癌细胞株TRP14-A2780保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCC C201339，保藏日为：2013年4月10日。

具体实施方式

一、TRP14过表达质粒构建

TRP14过表达质粒是GV141，插入的序列如SEQ ID NO:1所示。

阳性克隆PCR鉴定。引物序列是：

ID	Seq
		TRP14-P1	TCCGCTCGAGATGGCCCGCTATGAGGAG
TRP14-P2	ATCGGGATCCACATCTTCAGAGAACAACATTTCC

TRP14反应体系：

PCR反应条件是：

即在PCR机器里面，反应物在94℃下孵育3分钟，然后进入30个循环，每个循环包括94℃下孵育30秒，60℃下孵育30秒，72℃下孵育40秒，30个循环结束以后72℃下孵育5分钟，然后冷却到4℃。

抽提质粒，电泳结果如图1所示；电泳图说明如下：

1号泳道：阴性对照（ddH2O）

2号泳道：阴性对照（空载自连对照组）

3号泳道：阳性对照（GAPDH）

4号泳道：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp

5-12号泳道：TXNDC171-8号转化子

双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示；测序结果如图3所示。

二、具体实验步骤：

1.瞬时转染质粒：

TRP14质粒及阴性对照序列按上述步骤合成

实验分组：

分为阳性组（TRP14质粒+转染试剂），阴性对照组（阴性对照质粒+转染试剂），空白对照组（仅加转染试剂）

细胞种板：将细胞以1.5×105/孔的密度种植于12孔板中，每孔含完全培养基1ml,每组设3个重复。

转染：细胞贴壁过夜，生长密度达到80%左右。将孔内培养基更换为新鲜完全血清培养基。将适量转染试剂与质粒分别逐滴加入到含无血清培养基的无核酸酶离心管中，轻轻震荡混匀后，室温孵育5min，再将混好的转染试剂分别与TRP14质粒以及阴性对照质粒混合，轻弹管底混匀，室温孵育20min，将转染复合物再悬空逐滴加入到孔中。前后轻摇细胞培养板，使转染复合物均匀溶于培养基中。培养箱中继续培养，6小时更换新鲜完全培养基。

继续培养24后进行后续操作。

2.G418对A2780细胞最低致死浓度摸索：

模拟细胞稳筛时的细胞密度进行铺板，以一个六孔板细胞数为5×10⁴铺八个孔，以备加入浓度梯度的药物用。

第二天，细胞换液，每孔加入2ml新鲜培养基。

加药：每孔加入不同量的G418，使其在培养基的终浓度为（0，100，200，400，500，800，,1000）μg/ml。

隔天换液，换成新鲜含药物的培养基。

每天观察，认真记录细胞死亡情况，连续培养两周。

取达到第5天细胞大部分死亡，两周内全部死亡效果的最小药物浓度为G418对A2780细胞最低致死浓度，即后续稳筛药物浓度。

3.A2780转染质粒后的抗生素稳筛：

瞬时转染24小时后，取1/20细胞重新接种至新的12孔板，各组备三个复孔，37℃过夜。

等细胞贴壁后加入400μg/ml G418。

之后每3-4日更换一次含400μg/ml G418浓度的新鲜培养基。

转导后第14日左右，同时严格设转染空载体及不转染组做对照，观察两周，观察细胞加药后的死亡情况。直至不转染组的细胞完全死亡，转染组出现单克隆。

4.单克隆细胞的筛选步骤：

将稳筛的细胞用不含EDTA的胰酶消化，制备细胞悬液。

细胞计数，根据得出的数据，用含有400μg/ml G418的新鲜1640培养基倍比稀释细胞悬液。

在96孔板中，每孔中加入100ul细胞悬液，使各孔含有0.5-1个细胞。

隔日细胞贴壁后，观察单克隆孔的个数，并标记。

优势单克隆的选取：

经过30天的生长，各孔单克隆细胞数已长至6次方级，1:2传代，一部分长满后冻存，另一部分提取RNA和蛋白，用Realtime PCR以及Western blot分别检测TRP14基因mRNA水平和蛋白水平的表达情况。

	TRP14mRNA	TRP14蛋白
			实验组	0.25793	1.52477
阴性对照组	0.06480	0.27361

上述实施序列及步骤用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种卵巢癌细胞株TRP14-A2780，其特征在于：该卵巢癌细胞株TRP14-A2780保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC C201339。

2.如权利要求1所述的卵巢癌细胞株TRP14-A2780作为卵巢癌紫杉醇化疗耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途。