CN103245685A - 一种菜用大豆鲜籽粒品质1h nmr评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种菜用大豆鲜籽粒品质¹H NMR评价方法，属于果蔬品质分析领域。它首先对不同品种、不同品质的菜用大豆样品进行低温液氮粉碎、50％甲醇超声快速浸提，然后在相同的参数条件下对样品提取液进行核磁共振信号采集，对采集得到的图谱进行反转卷积，通过Chenomx数据库匹配与DSS内标定量，确定可溶性糖、游离氨基酸、有机酸等系列代谢物的组成及含量，从而明确不同菜用大豆品种的特征，并根据相应的核磁共振氢谱指纹图谱数据库，进行模式识别多变量分析，以获取有效的品质区分与评价结果。本发明方法具有全面、准确、可靠、高效等优点。

Description

一种菜用大豆鲜籽粒品质1H NMR评价方法

技术领域

本发明涉及一种菜用大豆鲜籽粒品质¹HNMR评价方法。 

背景技术

菜用大豆(Glycine max L.)俗称毛豆，是指在鼓粒期至完熟初期收获鲜荚食用的专用型大豆品种，其营养丰富，富含蛋白质、维生素、矿物质等多种营养元素，作为蔬菜食用，味道鲜美，深受广大消费者的喜爱。研究表明，不同品种菜用大豆品质差异显著，因此深入研究不同菜用大豆品种品质特性，系统研究不同品种的化学成分(代谢物)差异，这对于阐释菜用大豆营养差异及其合理利用都具有十分重要的意义。 

目前，菜用大豆的质量控制及评价，主要是运用现代分析技术(如HPLC、UPLC、HPLC-ESI-MS、CE-ESI-TOF-MS等)或某个营养成分为指标进行含量测定或DNA指纹图谱研究。然而，这些分析方法主要强调与营养、食味品质密切相关的少数内含物成分的重要性，而忽略了菜用大豆中其他小分子物质的影响；DNA指纹图谱主要用于菜用大豆品种/系和纯度的鉴定，却不直接能反映物质代谢差异。基于¹H-NMR的代谢组学从代谢物的组成上能够区分像引起甜、鲜、酸等口味的化合物成分，应用¹H-NMR能同时检测分析初生和次生代谢组分，因此更能体现方法的整体性和系统性，在果蔬品质评价中逐渐发挥着重要的作用，但是利用代谢组学整体性的方法研究菜用大豆品质目前还没有相关报道。 

发明内容

技术问题 

本发明的目的是提供一种菜用大豆鲜籽粒品质¹HNMR评价方法，通过高频核磁共振的代谢物组学技术，建立菜用大豆鲜籽粒的整体代谢指纹图谱，并结合化学计量学方法，系统评价不同品种品质差异，为菜用大豆质量控制与评价、品种鉴别等提供理论依据。 

技术方案 

本发明所提供的一种菜用大豆鲜籽粒品质¹HNMR评价方法，包括如下步骤： 

1)原料收集：采摘R6-R7期菜用大豆鲜籽粒，快速置于-80℃深冷冰箱低温冷冻2h～4h，经真空冷冻干燥24h～48h、低温液氮粉碎后，过0.25mm孔径筛处理作为供试原 料。 

2)样本制备： 

a.准确称取200mg～500mg粉碎样品加入体积比50％的甲醇溶液1000μL，进行冰水浴超声提取3s～5s，间歇4s，循环3次； 

b.浸提液经4℃、13000rpm高速离心10min～15min后，取上清液用氮气吹干，然后置于-80℃深冷冰箱冰冻12h； 

c.将冰冻样品离心抽真空后，加入450μLpH7.29的0.1mol/L磷酸缓冲溶液，再加入50μL的5mmol/L DSS重水标准溶液，涡旋10s； 

d.所得混匀液经低温离心后，取上清液过0.22μm滤膜，滤液供核磁共振波谱分析。 

3)¹HNMR测定条件：观察频率：600.13MHz；频率内锁：D₂O；测定温度T：279.93K；谱宽sw：12019.23Hz；采样时间at：4.0s；脉冲延迟时间dl：1.0s；采样次数nt：32；脉冲宽度pw：10μs；脉冲序列：¹H-NOESY；混合时间mixT：0.1s。每次样本采集时间约为4min。 

4)¹HNMR信号归属及代谢物鉴定：将测得的¹H-NMR自由感应衰减信号导入Chenomx NMR suit软件进行傅立叶转换，并输入DSS的浓度以及每个样本的pH值等信息。手动调整相位和基线，以DSS峰(0.00ppm)为基准校正谱图的化学位移，并进行反转卷积调整谱图峰形，数据积分后利用Chenomx数据库比对分析，获得代谢物种类及相应浓度。 

5)基于化学计量学方法的代谢组分比较与分析：使用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，主成分分析使用中心化换算的数据标度换算方式，并通过得分图的形式进行菜用大豆物质组成区分。 

6)根据步骤4)图谱库检索的结果，挑选出70％以上样品共有峰，建立¹HNMR指纹图谱共有峰数据库，对菜用大豆核磁共振图谱共有峰数据库进行聚类分析，判定菜用大豆品质类别。 

本发明方法涉及在菜用大豆品质分类、质量区别及品质评价中的应用。 

有益效果 

1)与现有技术比较，本发明采用高通量、高分辨率的¹HNMR代谢组学技术，利用不同品种菜用大豆化学组成差异对菜用大豆品质进行评价。该方法表明，不同品种菜用大豆鲜籽粒初级与次级代谢产物组成与含量都有显著的差异。特别是采用本发明方法可进行育种、新品种筛选及品质评价，建立菜用大豆的核磁共振指纹图谱数据库。本发明 方法具有系统、准确、可靠、高效的特点，结合代谢组学技术对于完善目前的菜用大豆品质评价技术体系具有重要意义。 

2)本发明方法从根本上解决了依靠人为感官评定与主要化学成分分析所带来的问题：人为感官评定工作量大，且结果受许多环境因紊、人的心理因素等制约，有很大的主观性和随机性，以及化学分析虽是菜用大豆品质评价的基本方法，但是化学分析的指标有限，菜用大豆作为特色蔬菜佳品，成分十分复杂，单纯的某些化学组分并不足以反映菜用大豆的内在品质，在应用中有严重的局限性。 

3)本发明提供的菜用大豆鲜籽粒品质¹HNMR评价方法，是一种对成分复杂样品也能进行很好的分析的手段，它的整体性和模糊性，既能反映样本的整体信息，且工作量并不大。更为重要的是它能达到区分不同品种，甚至不同产地、不同采收期的菜用大豆。因此，如果采用科学的方法对菜用大豆指纹图谱进行表征，就可以实现对菜用大豆品质的科学分类。 

附图说明

图1为菜用大豆鲜籽粒的核磁共振氢谱图。 

图2为不同品种菜用大豆代谢体系差异分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但不因此而限制本发明。 

实施例 

1)原料采集：2012年7月于江苏省农科院六合动物科学基地试验田采摘鼓粒末期(R6-R7期)八个不同品种菜用大豆(表1)，取其鲜籽粒快速置于-80℃深冷冰箱低温冷冻2h，真空冷冻干燥24h，并进行低温粉碎、过0.25mm孔径筛处理，获得原料样本备用。 

表1参试材料 

2)样本制备： 

a)准确称取250mg均一的菜用大豆冻干粉置于2mL的离心管中，加入体积比为50％的甲醇溶液1000μL，涡旋30s，然后置于冰水浴超声浸提4s，间歇4s，循环3次； 

b)浸提液于4℃条件下，13000rpm高速离心15min，取上清液用氮气吹干40min，并于-80℃深冷冰箱冰冻12h； 

c)将冰冻样离心抽真空2h，加入450μL磷酸缓冲溶液(pH7.29，0.1mol/L)，涡旋1min，再加入50μL的5mmol/LANACHRO标准溶液(内含DSS用于NMR内标，内含D₂O用于锁场)，涡旋10s； 

d)所得混匀液在4℃条件下，13000rpm高速离心10min，过0.22μm滤膜后取480μL滤液于NMR管中，采集NMR谱图。 

3)¹HNMR测定条件：NMR谱仪厂商：Bruker；观察频率：600.13MHz；频率内锁：D₂O；测定温度T：279.93K；谱宽sw：12019.23Hz；采样时间at：4.0s；脉冲延迟时间dl：1.0s；采样次数nt：32；脉冲宽度pw：10μs；脉冲序列：¹H-NOESY；混合时间mixT：0.1s。每次样本采集时间约为4min。 

4)¹HNMR信号归属及代谢物鉴定：将测得的¹H-NMR自由感应衰减(free induction decay，FID)信号导入Chenomx NMR suit(version7.5，Chenomx，Edmonton，Canada)软件进行傅立叶转换，并输入DSS的浓度以及每个样本的pH值等信息。手动调整相位和基线，以DSS峰(0.00ppm)为基准校正谱图的化学位移，并进行反转卷积调整谱图峰形。利用自带Chenomx数据库匹配分析，获得60种代谢物及相应浓度(表2)，主要为糖类、氨基酸类、有机酸类等与菜用大豆品质相关的特征性物质。 

表2代谢物种类 

5)基于化学计量学方法的不同菜用大豆品种代谢成分的比较与分析：使用SIMCA-P+软件(V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，主成分分析使用中心化换算的数据标度换算方式，并通过得分图的形式进行菜用大豆物质组成区分(图2)。 

6)根据步骤4)图谱库检索的结果，挑选出80％的样品共有峰，建立¹HNMR指纹图谱共有峰数据库，对菜用大豆核磁共振图谱共有峰数据库进行聚类分析，判定菜用大豆品质类别。从¹H-NMR谱分析中获悉，代谢物组成差异较小而代谢物含量差异较大。多变量分析结果与对核磁共振图谱的观察基本符合。通过PCA分析，蔗糖、精氨酸、谷氨酸、苹果酸、丙氨酸等多个代谢物在PC1方向上对样本的区分做出了重要贡献。聚类图分析结果中，被列为第一类的有：XD17、SC254和SD8，第二类为XDL1和HD8，第三类为SD6、TD6和ND4。这表明三类品种菜用大豆鲜籽粒在代谢品质上的差异明显。 

Claims (2)

1.一种菜用大豆鲜籽粒品质¹H NMR评价方法，其特征在于包括如下步骤：

1)原料采集：采摘R6-R7期菜用大豆鲜籽粒，快速置于-80℃深冷冰箱低温冷冻2h～4h，经真空冷冻干燥24h～48h、低温液氮粉碎后，过0.25mm孔径筛处理作为供试原料。

2)样本制备：

a.准确称取200mg～500mg粉碎样品加入体积比50％的甲醇溶液1000μL，进行冰水浴超声提取3s～5s，间歇4s，循环3次；

b.浸提液经4℃、13000rpm高速离心10min～１5min后，取上清液用氮气吹干，然后置于-80℃深冷冰箱冰冻12h；

c.将冰冻样品离心抽真空后，加入450μL pH7.29的0.1mol/L磷酸缓冲溶液，再加入50μL的5mmol/L DSS重水标准溶液，涡旋10s；

d.所得混匀液经低温离心后，取上清液过0.22μm滤膜，滤液供核磁共振波谱分析。

3)¹H NMR测定条件：观察频率：600.13MHz；频率内锁：D₂O；测定温度T：279.93K；谱宽sw：12019.23Hz；采样时间at：4.0s；脉冲延迟时间dl：1.0s；采样次数nt：32；脉冲宽度pw：10μs；脉冲序列：¹H-NOESY；混合时间mixT：0.1s。每次样本采集时间4mmin。

4)¹H NMR信号归属及代谢物鉴定：将测得的¹H-NMR自由感应衰减信号导入Chenomx NMR suit软件进行傅立叶转换，并输入DSS的浓度以及每个样本的pH值等信息。手动调整相位和基线，以DSS峰(0.00ppm)为基准校正谱图的化学位移，并进行反转卷积调整谱图峰形，数据积分后利用Chenomx数据库比对分析，获得代谢物种类及相应浓度。

5)基于化学计量学方法的代谢组分比较与分析：使用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，主成分分析使用中心化换算的数据标度换算方式，并通过得分图的形式进行菜用大豆物质组成区分。

6)根据步骤4)图谱库检索的结果，挑选出70％以上样品共有峰，建立¹HNMR指纹图谱共有峰数据库，对菜用大豆核磁共振图谱共有峰数据库进行聚类分析，判定菜用大豆品质类别。

2.一种如权利要求1所述的方法在菜用大豆品质分类、质量区别及品质评价中的应用。

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