CN103242425A - 一种玻璃表面接枝用于蛋白质结晶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种玻璃表面接枝用于蛋白质结晶的方法，将用酒精或者丙酮超声处理后的玻璃片浸泡在浓硫酸和双氧水中；再用去离子水清洗玻璃表面至酸碱度为中性，用有机溶剂稀释的硅烷溶液浸泡后得到玻璃基底，制备蛋白质结晶溶液并滴在玻璃基底的表面上，呈液滴状，静置结晶；在显微镜下观察，统计出现蛋白质晶体的条件数目。本发明通过对结晶玻璃表面进行官能团接枝，使得蛋白质在玻璃表面浓缩，同时在该底面形成有序的结构，降低形核的表面能，从而提高了蛋白质结晶成功率。

Description

一种玻璃表面接枝用于蛋白质结晶的方法

技术领域

本发明涉及一种玻璃表面官能团接枝用于蛋白质结晶的方法，特别是通过对玻璃表面进行官能团接枝来筛选蛋白质结晶条件的方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的载体，阐明蛋白质相关功能是探索生命现象的关键。蛋白质的结构是功能研究的前提和基础，X-射线衍射技术是目前获取蛋白质结构最重要和最可靠的研究手段，高质量的蛋白质晶体是获得高分辨率结构信息的前提。筛选得到可结晶的条件是获得高质量蛋白质晶体的第一步，是目前制约蛋白质结构研究的重要瓶颈之一。

蛋白质晶体生长包括两个步骤：形核和生长。形核是晶体生长的第一步，也是最重要的一步。过饱和是蛋白质晶体形核的驱动力，只有在一定的过饱和条件下，蛋白质晶体才可能形核，这种情况下，就要求蛋白质和盐溶液的浓度达到一定阈值，所以降低阈值成为了克服结晶障碍的瓶颈。目前，在降低形核的阈值方面已有众多的尝试，主要表现在引入异相核来降低形核阈值驱动力，异相核包括凝胶玻璃珠、交联葡聚糖珠、碳粉、马毛、干枯的海草、沸石等。但是，这些异相核需要逐一添加到结晶体系中，比较耗时，不利于自动化结晶的实现。为了克服上述缺点，直接对结晶基底表面进行修饰是一种提高自动化筛选的有效手段，目前已经广泛应用的方法包括用云母、矿物、磷脂双分子层修饰的玻璃、多聚赖氨酸修饰的聚合物膜及对玻璃表面进行粗糙化处理等方法，这些方法都被证明显著提高了蛋白质结晶成功率。

硅烷化玻璃是目前蛋白质悬滴结晶中最常用的基底材料。文献“Sparse matrixsampling:a screening method for crystallization of proteins.1991,Vol.24:409-411”公开了一种利用硅烷化玻璃作为结晶基底筛选蛋白质结晶条件的方法，选择Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒构建结晶溶液体系。蛋白质晶体分别在恒温4℃和室温下生长，统计蛋白质在50种结晶缓冲液中长出晶体的成功率。实验结果得出溶菌酶结晶成功率为10%，胰岛素结晶成功率为4%，过氧化氢酶结晶成功率为10%，核糖核酸酶A结晶成功率为8%，胃蛋白酶结晶成功率为6%，可以看出利用硅烷化基底对蛋白质进行结晶成功率不高。

蛋白质结晶是蛋白质分子有序堆积的过程，有序的结晶装置基底将会显著促进这种有序过程的发生。如果能对这种结晶用玻璃表面进行有序化处理，将无疑有助于提高蛋白质结晶成功率，对玻璃表面进行官能团接枝就是一种显著提高结晶基底有序性的方法。根据文献“Investigation of the effects of surface chemistry and solutionconcentration on the conformation of adsorbed proteins using an improved circulardichroism method”报道，对镀金玻璃表面进行甲基化、羧基化、氨基化和羟基化修饰之后，玻璃表面所富集蛋白表面的二级结构发生显著变化，这种二级结构的变化有助于提高蛋白质分子稳定性，进而促进蛋白质分子的有序排布，同时玻璃表面的蛋白质吸附量会显著增加，增加了玻璃表面蛋白质浓度，促进其结晶。文献“Improved proteincrystallization by vapor diffusion from drops in contact with transparent,self-assembledmonolayers on gold-coated glass coverslip”在镀金玻璃表面进行官能团接枝后，提高了蛋白质的形核效率。但是，这种镀金玻璃成本昂贵，而且在显微镜下观察的时候，玻璃片表面金颗粒的光反射会增加晶体观察的难度。因此推测，对结晶用的玻璃表面直接进行官能团接枝会显著提高晶体的形核效率，促进蛋白质结晶，目前尚无文献报道。

发明内容

为了克服现有技术由于形核势能较高而导致蛋白质形核效率较低的不足，本发明提供一种通过对结晶用玻璃进行官能团接枝来促进蛋白质形核的方法。该方法通过对结晶玻璃表面进行官能团接枝，使得蛋白质在玻璃表面浓缩，同时在该底面形成有序的结构，降低形核的表面能，从而提高了蛋白质结晶成功率。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案包括以下步骤：

（a）将用酒精或者丙酮超声处理后的玻璃片浸泡在体积比为1:1～10:1的浓硫酸和双氧水中10～50h，所述的浓硫酸浓度为98%；用去离子水清洗玻璃表面至酸碱度为中性，用有机溶剂稀释50～500倍的硅烷溶液浸泡0.1～24h，然后用同样的有机溶剂清洗玻璃基底，烘干备用；

（b）配置pH值在3～10，浓度范围为0.05～0.5M的缓冲液，使用缓冲液溶解蛋白质，使蛋白质溶液中蛋白质的终浓度达到5～30mg/ml；

（c）将结晶试剂与蛋白质溶液按照（0.1～20）：1体积比混合，制备蛋白质结晶溶液；

（d）将制备的蛋白质结晶溶液滴在玻璃基底的表面上，呈液滴状，在0～60℃下静置结晶；在显微镜下观察，统计出现蛋白质晶体的条件数目。

所述的有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙三醇、丙二醇、二乙二醇、四氯化碳、丙酮、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、乙醚和石油醚。

所述的硅烷的结构式为

其中R₁、R₂、R₃均分别是甲基、甲氧基或乙氧基中的一种，n=1～20，R₄为-NH₂、-NHC₂H₄NH₂、-NHC₃H₆NH₂、-NHC₂H₄NHC₂H₄NH₂、-C_1-18F_3-37、-C_1-35H_3-71、-SH、1,2-环氧氧丙基、-OH、-Cl、-Br、-CN或-CNO。

本发明的有益效果是：通过对结晶玻璃表面进行官能团接枝，使得基底附近的蛋白质浓度增加，同时增加了基底的有序性，最终提高了蛋白质结晶成功率。通过本发明，可使蛋白质结晶成功率由过去的4-10%提高至10-52%。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。

本发明包括以下步骤：

（a）玻璃表面官能团接枝：将用酒精或者丙酮超声处理后的玻璃片浸泡在体积比为1:1～10:1的浓硫酸（浓度为98%）和双氧水中10～50h，用去离子水清洗玻璃表面至酸碱度为中性，用有机溶剂稀释50～500倍的硅烷溶液浸泡0.1～24h，然后用和前述一样的有机溶剂清洗玻璃基底，烘干备用，这样就制备了表面接有官能团（包括氨基、巯基、羟基、环氧基、羧基和烷基）的玻璃基底；

（b）配置蛋白质溶液：配置pH值在3～10，浓度范围为0.05～0.5M的缓冲液（指所有可以减少溶液体系内pH改变，维持体系酸碱度的溶液），缓冲液溶解蛋白质，使蛋白质的终浓度达到5～30mg/ml；

（c）建立蛋白质结晶体系：将结晶试剂（指所有用于蛋白质结晶的试剂，包括商业的结晶试剂盒和实验室自行配置的结晶试剂）与蛋白质溶液按照（0.1～20）：1体积比混合，制备蛋白质结晶溶液；

（d）蛋白质结晶：将制备的蛋白质结晶溶液滴在表面接枝的玻璃表面上呈液滴状，在0～60℃下静置结晶。在显微镜下观察，统计出现蛋白质晶体的条件数目。

所述的有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙三醇、丙二醇、二乙二醇、四氯化碳、丙酮、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、石油醚。

所述的硅烷的结构式为

其中R₁、R₂、R₃均分别可能是甲基、甲氧基或乙氧基中的一种，其中n=1～20，R₄为-NH₂、-NHC₂H₄NH₂、-NHC₃H₆NH₂、-NHC₂H₄NHC₂H₄NH₂、-C_1-18F_3-37、-C_1-35H_3-71、-SH、1,2-环氧氧丙基、-OH、-Cl、-Br、-CN或-CNO。

实施例1：核糖核酸酶A结晶条件的筛选。

第一步：将酒精超声处理后的玻璃浸泡在体积比为8:1的浓硫酸（浓度为98%）和双氧水中50h，然后用去离子水清洗玻璃表面至酸碱度为中性，再将其浸入甲苯稀释200倍的十六烷基三甲氧基硅烷溶液浸泡10h，甲苯清洗玻璃，制备了表面接有长链烷基的玻璃片。

第二步：将美国Sigma公司货号为R5500的核糖核酸酶A，溶于pH为7，0.025MHEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为20mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第三步：用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶试剂对核糖核酸酶A的结晶条件进行筛选，具体为将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比0.5：1混合，制备蛋白质结晶溶液。

第四步：将制备的蛋白质结晶溶液滴在表面接枝的玻璃表面上呈液滴状，在15℃下静置结晶。显微镜下观察统计出现核糖核酸酶A晶体的条件数目。

经过统计得到如下结果：有5种结晶条件出现了核糖核酸酶A晶体，结晶成功率为10%。与现有技术中用硅烷化玻璃筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了1.25倍。

实施例2：胰岛素结晶条件的筛选。

第一步：将酒精超声处理后的玻璃浸泡在体积比5:1的浓硫酸（浓度为98%）和双氧水中28h，然后用去离子水清洗结玻璃表面至酸碱度为中性，再将其浸入二甲苯稀释100倍的2,3-环氧氧丙基三甲氧基硅烷溶液浸泡10h，二甲苯清洗玻璃，烘干，制备了表面接有羟基的玻璃片。

第二步：将美国Sigma公司货号为I5500的胰岛素，溶于1M的氨水中，使其终浓度为30mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第三步：用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶试剂对胰岛素的结晶条件进行筛选，具体为将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比2：1混合，制备蛋白质结晶溶液。

第四步：将制备的蛋白质结晶溶液滴在表面接枝的玻璃表面上呈液滴状，在10℃下静置结晶。显微镜下观察统计出现胰岛素晶体的条件数目。

经过统计得到如下结果：有26种结晶条件出现了胰岛素酶晶体，结晶成功率为52%。与用硅化玻璃筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了13倍。

实施例3：胃蛋白酶结晶条件的筛选。

第一步：将酒精超声处理后的玻璃浸泡在体积比8:1的98%浓硫酸和双氧水中50h，然后用去离子水清洗结玻璃表面至酸碱度为中性，再将其浸入甲苯稀释50倍的十六烷基三甲氧基硅烷溶液浸泡10h，甲苯清洗玻璃，制备了表面接有甲基的玻璃片。

第二步：将美国Sigma公司货号为R5500的胃蛋白酶，溶于pH为7，0.025MHEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为35mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第三步：用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶试剂对胃蛋白酶的结晶条件进行筛选，具体为将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为0.05：1混合，制备蛋白质结晶溶液。

第四步：将制备的蛋白质结晶溶液滴在表面接枝的玻璃表面上呈液滴状，在27℃下静置结晶。显微镜下观察统计出现胃蛋白酶晶体的条件数目。

经过统计得到如下结果：有8种结晶条件出现了胃蛋白酶晶体，结晶成功率为16%。与现有技术中在硅化玻璃表面筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了2.7倍。

实施例4：溶菌酶结晶条件的筛选。

第一步：用酒精超声处理后的玻璃浸泡在体积比为3:1的98%的浓硫酸和双氧水中24h，用去离子水清洗玻璃表面至酸碱度为中性，用丙酮稀释100倍的γ-氨丙基三甲氧基硅烷溶液浸泡2h，丙酮清洗玻璃，烘干备用，这样玻璃表面就接枝上氨基。

第二步：将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶于pH为4.6，0.1M的醋酸钠缓冲液中，使其终浓度为20mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第三步：建立蛋白质结晶体系，本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的CrystalScreen试剂盒的50种结晶试剂筛选溶菌酶晶体，具体为将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为5：1混合，制备蛋白质结晶溶液。

第三步：将制备的蛋白质结晶溶液滴在表面接枝的玻璃表面上呈液滴状，在4℃下静置结晶。显微镜下观察统计出现溶菌酶晶体的条件数目。

经过统计得到如下结果：有22种结晶条件出现了溶菌酶晶体，结晶成功率为44%。与现有技术中在硅化玻璃表面筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了4.4倍。

实施例5：过氧化氢酶结晶条件的筛选。

第一步：将酒精超声处理后的玻璃浸泡在体积比4:1的98%浓硫酸和双氧水中40h，然后用去离子水清洗结玻璃表面至酸碱度为中性，再将其浸入甲苯稀释50倍的γ-巯丙基三甲氧基硅烷溶液浸泡8h，甲苯清洗玻璃，烘干，制备了表面接有巯基的玻璃片。

第二步：将美国Sigma公司货号为C0615的过氧化氢酶，溶于pH为7，0.025MHEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为40mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第三步：建立蛋白质结晶体系，本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的CrystalScreen试剂盒的50种结晶试剂筛选过氧化氢酶的晶体，具体为将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为10：1混合，制备蛋白质结晶溶液。

第四步：将制备的蛋白质结晶溶液滴在表面接枝的玻璃表面上呈液滴状，在20℃下静置结晶。显微镜下观察统计出现过氧化氢酶晶体的条件数目。

经过统计得到如下结果：有15种结晶条件出现了过氧化氢酶晶体，结晶成功率为30%。与现有技术中在硅化玻璃表面筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了3倍。

Claims (3)

1.一种玻璃表面接枝用于蛋白质结晶的方法，其特征在于包括下述步骤：

（a）将用酒精或者丙酮超声处理后的玻璃片浸泡在体积比为1:1～10:1的浓硫酸和双氧水中10～50h，所述的浓硫酸浓度为98%；用去离子水清洗玻璃表面至酸碱度为中性，用有机溶剂稀释50～500倍的硅烷溶液浸泡0.1～24h，然后用同样的有机溶剂清洗玻璃基底，烘干备用；

（b）配置pH值在3～10，浓度范围为0.05～0.5M的缓冲液，使用缓冲液溶解蛋白质，使蛋白质溶液中蛋白质的终浓度达到5～30mg/ml；

（c）将结晶试剂与蛋白质溶液按照（0.1～20）：1体积比混合，制备蛋白质结晶溶液；

（d）将制备的蛋白质结晶溶液滴在玻璃基底的表面上，呈液滴状，在0～60℃下静置结晶；在显微镜下观察，统计出现蛋白质晶体的条件数目。

2.根据权利要求1所述的玻璃表面接枝用于蛋白质结晶的方法，其特征在于：所述的有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙三醇、丙二醇、二乙二醇、四氯化碳、丙酮、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、乙醚和石油醚。

3.根据权利要求1所述的玻璃表面接枝用于蛋白质结晶的方法，其特征在于：所述的硅烷的结构式为

其中R₁、R₂、R₃均分别是甲基、甲氧基或乙氧基中的一种，n=1～20，R₄为-NH₂、-NHC₂H₄NH₂、-NHC₃H₆NH₂、-NHC₂H₄NHC₂H₄NH₂、-C_1-18F_3-37、-C_1-35H_3-71、-SH、1,2-环氧氧丙基、-OH、-Cl、-Br、-CN或-CNO。