CN103234934A - 一种测定脂溶性茶多酚含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定脂溶性茶多酚含量的方法，属于化学定量检测领域。所述方法包括：将对照品和供试品分别制备成对照品溶液和供试品溶液；通过分别绘制所述对照品溶液和所述供试品溶液的紫外波长扫描图确定检测波长；绘制所述对照品溶液的标准曲线并计算所述标准曲线的回归方程；测定所述供试品溶液的吸光度；将所述吸光度带入所述标准曲线回归方程计算所述供试品中脂溶性茶多酚的含量。本发明通过对脂溶性茶多酚以及含有脂溶性茶多酚的制剂进行含量测定，避免通过测定酚羟基的含量间接反映脂溶性茶多酚含量，这样就无需加入显色剂或氧化剂，避免了使用昂贵的标准品和昂贵的仪器设备条件，降低了成本，而且测定方法简便、准确。
Description
技术领域
本发明涉及化学定量检测领域，特别涉及一种测定脂溶性茶多酚含量的方法。
背景技术
茶多酚（Green Tea Polyphenols，GTP）是茶叶中30多种多羟基酚类化合物的总称，儿茶素类化合物约占茶多酚含量的65％～80％左右，主要包括：（+）儿茶素[（+）Catechin,C]，（-）表儿茶素[（-）Epicatechin,EC]，（-）没食子儿茶素[（-）Gallocatechin,GC]，（-）表儿茶素没食子酸酯[（-）Epicatechin Gallate,ECG]，（-）表没食子儿茶素[（-）Epigallocatechin,EGC]，（-）表没食子儿茶素没食子酸酯[（-）Epigallocatechin Gallate）,EGCG]六种物质，均为黄烷-3醇衍生物。其中EGCG占儿茶素类化合物的50％～60％，在结构、组成、生物活性等方面均为茶多酚的代表性成分。
茶多酚是一种性能十分优异的纯天然抗氧化剂，无毒副作用，具抑制细菌、抗氧化等性能，但茶多酚易溶于水而难溶于脂，因而直接将其用于抗油脂及高脂食品的氧化变质便受到很大限制，所以，研究者为了克服茶多酚容易被氧化且脂溶性差等缺点，通过对其化学改性，即在茶多酚上连接脂肪酸，研制出的茶多酚组成中相应结构的长链脂肪酸酯，该长链脂肪酸酯可能是其一酯化、二酯化或多酯化产物，因此脂溶性茶多酚的组成比茶多酚更加复杂。
现有技术中有一种在植物油中检测微量脂溶性茶多酚的方法，该方法首先以没食子酸乙酯为标准品，采用酒石酸亚铁比色法，以亚铁离子为显色剂，通过茶多酚类能与亚铁离子形成紫蓝色络合物，测定脂溶性茶多酚的含量，然后用已知含量的脂溶性茶多酚作为对照品，采用福林酚试剂氧化法，测定植物油中微量脂溶性茶多酚的含量。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
相对于茶多酚的理化性质，脂溶性茶多酚在组成、结构、平均分子量、分子中邻二酚羟基或连三酚羟基的数量和与亚铁离子显色的强度等均发生了较大的变化，在这种情况下，上述方法仍然采用没食子酸乙酯与表没食子儿茶素没食子酸酯在相同质量下与亚铁离子显色物吸光度的比值1.5，而且，上述方法是通过测定酚羟基的含量间接反映脂溶性茶多酚的含量，导致其测定结果偏低，不能直接得到脂溶性茶多酚的含量，而且该方法较为繁琐，只适用于微量脂溶性茶多酚的检测。
发明内容
为了解决现有技术中不能准确测定脂溶性茶多酚的含量的问题，本发明实施例提供了一种测定脂溶性茶多酚含量的方法。所述技术方案如下：
本发明提供了一种测定脂溶性茶多酚含量的方法，所述方法包括以下步骤：
将对照品和供试品分别制备成对照品溶液和供试品溶液，所述供试品为脂溶性茶多酚或含有脂溶性茶多酚的制剂，所述供试品溶液的溶剂为有机溶剂，所述对照品为脂溶性茶多酚，所述对照品溶液的溶剂为有机溶剂；
通过分别绘制所述对照品溶液和所述供试品溶液的紫外波长扫描图，获得所述对照品溶液和所述供试品溶液的最大吸收波长，并根据所述最大吸收波长确定检测波长；
绘制所述对照品溶液的标准曲线并计算所述标准曲线的回归方程；
采用紫外分光光度法测定所述供试品溶液的吸光度；
将所述供试品溶液的吸光度带入所述标准曲线回归方程计算所述供试品中脂溶性茶多酚的含量。
具体地，所述脂溶性茶多酚为茶多酚与所述8碳以上的有机脂肪酸的酰卤或酸酐反应得到的产物、或者为所述茶多酚中含有的黄烷-3醇衍生物与所述8碳以上的有机脂肪酸的酰卤或酸酐反应得到的产物。
具体地，通过所述供试品溶液的紫外波长扫描图确定所述供试品溶液的最大吸收波长的方法为：所述供试品为所述脂溶性茶多酚时，将所述脂溶性茶多酚配制成每毫升含有所述脂溶性茶多酚为0.04mg的所述供试品溶液，以所述有机溶剂为参比，在200-400nm波长范围内扫描，得到所述供试品溶液的紫外波长扫描图，由所述紫外波长扫描图确定所述供试品溶液的最大吸收波长为275nm。
具体地，通过所述供试品溶液的紫外波长扫描图确定所述供试品溶液的最大吸收波长的方法为：所述供试品为所述含有脂溶性茶多酚的制剂时，取所述制剂适量，精密称定，置于容器中，加适量所述有机溶剂，充分搅拌，于离心机3600rpm离心30min，分取上清液，并重复提取3次，合并所述上清液并过滤，将滤液移入容量瓶，用所述有机溶剂定容，配制成每毫升含有所述脂溶性茶多酚为0.04mg的所述供试品溶液，以制备所述供试品溶液的方法制备等质量空白制剂提取液作为参比，在200-400nm波长范围内扫描，得到所述供试品溶液的紫外波长扫描图，由所述紫外波长扫描图确定所述供试品溶液的最大吸收波长为275nm。
具体地，通过所述对照品溶液的紫外波长扫描图确定所述对照品溶液的最大吸收波长的方法为：取所述对照品，用所述有机溶剂溶解，配制成每毫升含有所述对照品为0.04mg的所述对照品溶液，以所述有机溶剂为参比，在200-400nm波长范围内扫描，得到所述对照品溶液的紫外波长扫描图，由所述紫外波长扫描图确定所述对照品溶液的最大吸收波长为275nm。
具体地，根据所述对照品溶液与所述供试品溶液的最大吸收波长均为275nm，确定所述检测波长为275nm误差为±2nm。
具体地，绘制所述对照品溶液的标准曲线并计算所述标准曲线的回归方程的方法为：取干燥的所述对照品，用所述有机溶剂溶解，配制成每毫升含有所述对照品分别为0，20，40，60，80和100μg的所述对照品溶液，以所述有机溶剂为参比，于275nm波长处测定吸光度，并绘制所述对照品溶液的标准曲线，由所述标准曲线经计算得所述线性回归方程。
具体地，测定所述供试品溶液的吸光度的方法为：所述供试品溶液的浓度在线性回归方程的线性范围以内，当所述供试品为所述脂溶性茶多酚时，以所述有机溶剂为参比；当所述供试品为所述含有所述脂溶性茶多酚的制剂时，以所述空白制剂提取液为参比，于275nm波长处测定所述供试品溶液的吸光度。
具体地，所述含所述茶多酚硬脂酸酯的制剂为以所述茶多酚硬脂酸酯为主药的凝胶剂、霜剂、软膏剂、涂剂、涂膜剂、膜剂和贴剂中的至少一种的药物制剂。
具体地，所述有机溶剂为无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、卤仿、正已烷、环己烷、石油醚和二甲基亚砜中的至少一种。
优选地，所述有机溶剂为无水乙醇、乙酸乙酯。
可选地，所述茶多酚中含有的黄烷-3醇衍生物为：儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素或表没食子儿茶素没食子酸酯。
可选地，所述8碳以上的有机脂肪酸为：癸酸、羊蜡酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、珠光脂酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、桐酸、油酸或亚油酸。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明通过对脂溶性茶多酚以及含有脂溶性茶多酚的制剂进行含量测定，避免通过测定酚羟基的含量间接反映脂溶性茶多酚含量，这样就无需加入显色剂，避免了使用昂贵的标准品和昂贵的仪器设备条件，降低了成本，而且本发明测定方法简单可行，测定结果准确，易于推广应用，而且，本发明的测定方法也适用于含有脂溶性茶多酚的制剂中有复杂共存成分存在时脂溶性茶多酚的含量测定，其测定结果准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一提供的茶多酚硬脂酸酯在275nm波长处的标准曲线图；
图2是本发明实施例一提供的茶多酚硬脂酸酯的紫外波长扫描图；
图3是本发明实施例二提供的表没食子儿茶素没食子酸酯硬脂酸酯的紫外波长扫描图；
图4是本发明实施例二提供的表没食子儿茶素没食子酸酯硬脂酸酯在275nm波长处的标准曲线图；
图5是本发明实施例三提供的表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯在275nm波长处的标准曲线图；
图6是本发明实施例三提供的含茶多酚棕榈酸酯凝胶剂的紫外波长扫描图；
图7是本发明实施例三提供的空白凝胶剂的紫外波长扫描图；
图8是本发明实施例四提供的茶多酚棕榈酸酯在274nm波长处的标准曲线图；
图9是本发明实施例五提供的茶多酚月桂酸酯的紫外波长扫描图；
图10是本发明实施例五提供的茶多酚月桂酸酯在275nm波长处的标准曲线；
图11是本发明实施例六提供的茶多酚肉豆蔻酸酯的紫外波长扫描图；
图12是本发明实施例六提供的茶多酚肉豆蔻酸酯在275nm波长处的标准曲线；
图13是本发明实施例七提供的茶多酚葵酸酯的紫外波长扫描图；
图14是本发明实施例七提供的茶多酚葵酸酯在275nm波长处的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明所用试剂均为分析纯市售试剂。
本发明提供的方法包括以下步骤：
将对照品和供试品分别制备成对照品溶液和供试品溶液，供试品为脂溶性茶多酚或含有脂溶性茶多酚的制剂，供试品溶液的溶剂为有机溶剂，对照品为脂溶性茶多酚，对照品溶液的溶剂为有机溶剂。
通过分别绘制对照品溶液和供试品溶液的紫外波长扫描图，获得对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长，用于确定检测波长。
绘制对照品溶液的标准曲线并计算该标准曲线的回归方程。
采用紫外分光光度法测定供试品溶液的吸光度。
将供试品溶液的吸光度带入上述标准曲线回归方程计算供试品中脂溶性茶多酚的含量。
具体地，有机溶剂为无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、正已烷、环己烷、石油醚和二甲基亚砜中的至少一种。
具体如下：
本发明提供的供试品为茶多酚硬脂酸酯时，将脂溶性茶多酚配制成每毫升含有脂溶性茶多酚为0.04mg的供试品溶液，具体地，取脂溶性茶多酚4mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，以有机溶剂无水乙醇为参比，在200-400nm波长范围内扫描，得到供试品溶液的紫外波长扫描图，由该紫外波长扫描图确定供试品溶液在275nm或274nm波长处有最大吸收峰。
本发明提供的供试品为含有脂溶性茶多酚的制剂时，取该制剂适量，精密称定，置于容器中，加适量有机溶剂无水乙醇，充分搅拌，于离心机3600rpm离心30min，分取上清液，并重复提取3次，合并上清液并过滤，将滤液移入容量瓶，用无水乙醇定容，配制成每毫升含有脂溶性茶多酚为0.04mg的供试品溶液，以制备该供试品溶液的方法制备空白制剂提取液作为参比，在200-400nm波长范围内扫描，得到供试品溶液的紫外波长扫描图，由该紫外波长扫描图确定供试品溶液在波长275nm或274nm处有最大吸收峰。
具体地，对照品为脂溶性茶多酚，对照品溶液的溶剂为有机溶剂。
具体地，通过对照品溶液的紫外波长扫描图确定对照品溶液的最大吸收波长的方法为：取对照品，用有机溶剂溶解，配制成每毫升含有对照品为0.04mg的对照品溶液，以有机溶剂为参比，在200-400nm波长范围内扫描，得到对照品溶液的紫外波长扫描图，由紫外波长扫描图确定对照品溶液的最大吸收波长为275nm或274nm。
根据对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为275nm，则确定检测波长为275nm误差为±2nm，即在275nm误差为±2nm范围内检测有效。
根据对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为274nm，则确定检测波长为274nm误差为±2nm，即在274nm误差为±2nm范围内检测有效。
具体地，含脂溶性茶多酚的制剂为以脂溶性茶多酚为主药的凝胶剂、霜剂、软膏剂、涂剂、涂膜剂、膜剂和贴剂中的至少一种的药物制剂。
绘制对照品溶液的标准曲线并计算标准曲线的回归方程的方法为：取干燥的对照品，用有机溶剂溶解，配制成每毫升含有对照品分别为0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以有机溶剂为参比。具体地，取干燥的对照品50mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，分别取该溶液0，2，4，6，8和10mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含对照品0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以无水乙醇为参比，于275nm或274nm波长处测定吸光度，并绘制对照品溶液的标准曲线，由该标准曲线经计算得线性回归方程。
测定供试品溶液的吸光度的方法为：供试品溶液的浓度在线性回归方程的线性范围以内，当供试品为茶多酚硬脂酸酯时，以有机溶剂为参比；当供试品为含有脂溶性茶多酚的制剂时，以空白制剂提取液为参比，于275nm波长处测定供试品溶液的吸光度。
可选地，茶多酚中含有的黄烷-3醇衍生物为：儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素或表没食子儿茶素没食子酸酯。
可选地，8碳以上的有机脂肪酸为：癸酸、羊蜡酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、珠光脂酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、桐酸、油酸或亚油酸。
对照例
茶多酚硬脂酸酯原料的含量测定
茶多酚硬脂酸酯原料是以茶多酚为原料，酰化剂为硬脂酸酰卤或硬脂酸酸酐时，制备的茶多酚硬脂酸酯。
取干燥的茶多酚硬脂酸酯200mg，精密称定，用无水乙醇溶解并定容至100mL，作为供试品溶液，取经过100℃干燥lh的没食子酸乙酯100mg，精密称定，用水溶解并定容至100mL，作为标准品溶液；分别吸取100mg/100mL的标准品溶液2，4，6，8和10mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，制备成每100mL含没食子酸乙酯20，40，60，80和100mg的溶液。
测定：分别准确吸取供试品溶液及各种浓度的标准品溶液各1mL，于10mL比色管中，各加入三乙醇胺水溶液1mL，混匀，加入酒石酸铁溶液5mL，加水定容至25mL，以空白试剂作为参比，于540nm波长下，在1cm比色杯中比色。
结果计算：茶多酚硬脂酸酯（%）=样品相当于标准品含量×1.5×100÷样品质量。按式计算，茶多酚硬脂酸酯含量为41.63%。
该法不足之处是：相对于茶多酚，在茶多酚硬脂酸酯的组成、结构、平均分子量、分子中邻二酚羟基或连三酚羟基的数量、与亚铁离子显色的强度等理化性质均发生了较大变化的情况下，该对照例仍然采用没食子酸乙酯与表没食子儿茶素没食子酸酯在相同质量下与亚铁离子显色物吸光度的经验比值即1.5，而且是通过测定酚羟基的含量间接反映茶多酚硬脂酸酯的含量，其测定结果偏低，不能直接测定茶多酚硬脂酸酯的含量。
实施例一
当以茶多酚为原料，酰化剂为硬脂酸酰卤或硬脂酸酸酐时，脂溶性茶多酚为茶多酚硬脂酸酯，测定茶多酚硬脂酸酯的含量。
对照品为茶多酚硬脂酸酯，其茶多酚硬脂酸酯的紫外波长扫描图如2所示。
根据对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为275nm，则确定检测波长为275nm误差为±2nm，即在275nm误差为±2nm范围内检测有效。
取干燥的茶多酚硬脂酸酯50mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，分别取该溶液0，2，4，6，8和10mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚硬脂酸酯0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以无水乙醇为参比，于275nm波长处测定吸光度，并绘制对照品溶液的标准曲线，由该标准曲线经计算得线性回归方程为：Y=0.0085X+0.0142，如图1所示，其中，线性范围为0-100μg/mL，线性范围为X的取值范围，R2=0.9992，R2为确定系数，该R2值越接近1表示该线性回归方程越可靠，Y为对照品溶液的吸光度，X为对照品溶液的浓度。
取茶多酚硬脂酸酯200mg，该样品与对照例的样品相同，精密称定，置于50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，精密量取该溶液1mL置于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容，其紫外光谱扫描图见附图2，以无水乙醇为参比，按紫外分光光度法，在样品配制2小时内，于275nm波长处测定吸光度，其吸光度为0.3558，将吸光度代入上述线性回归方程并计算含量。
结果测得茶多酚硬脂酸酯含量为100.47%，本发明实施例提供的方法测得含量值与茶多酚硬脂酸酯的实际含量接近。
实施例二
当以茶多酚为原料，酰化剂为硬脂酸酰卤或硬脂酸酸酐时，脂溶性茶多酚为茶多酚硬脂酸酯，测定茶多酚硬脂酸酯原料的含量。
根据对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为275nm，则确定检测波长为275nm误差为±2nm，即在275nm误差为±2nm范围内检测有效。
对照品为表没食子儿茶素没食子酸酯硬脂酸酯，为茶多酚含有的表没食子儿茶素没食子酸酯与硬脂酸酰卤或硬脂酸酸酐反应的产物，其表没食子儿茶素没食子酸酯硬脂酸酯的紫外波长扫描图如图3所示。
取干燥的表没食子儿茶素没食子酸酯硬脂酸酯，用有机溶剂溶解，配制成每毫升含有表没食子儿茶素没食子酸酯硬脂酸酯分别为0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以有机溶剂为参比。具体地，取干燥的表没食子儿茶素没食子酸酯硬脂酸酯50mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，分别取该溶液0，2，4，6，8和10mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含表没食子儿茶素没食子酸酯硬脂酸酯0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以无水乙醇为参比，于275nm波长处测定吸光度，并绘制对照品溶液的标准曲线，如图4所示，由该标准曲线经计算得线性回归方程为：Y=0.0091X，其中，线性范围为0-100μg/mL，线性范围为X的取值范围，R2=0.9993，R2为确定系数，该R2值越接近1表示该线性回归方程越可靠，Y为对照品溶液的吸光度，X为对照品溶液的浓度。
取茶多酚硬脂酸酯200mg，该样品与对照例的样品相同，精密称定，置于50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，精密量取该溶液1mL置于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容，以无水乙醇为参比，按紫外分光光度法，在样品配制2小时内，于275nm波长处测定吸光度，其吸光度为0.3716，将吸光度代入上述线性回归方程并计算含量。
结果测得茶多酚硬脂酸酯含量为102.09%，本发明实施例提供的方法测得含量值与茶多酚硬脂酸酯的实际含量接近。
实施例三
当以茶多酚为原料，酰化剂为棕榈酸酰卤或棕榈酸酸酐时，脂溶性茶多酚为茶多酚棕榈酸酯，测定茶多酚棕榈酸酯的制剂的含量，具体为测定茶多酚棕榈酸酯凝胶剂的含量。
对照品为表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯，为茶多酚含有的表没食子儿茶素没食子酸酯与棕榈酸酰卤或棕榈酸酸酐反应的产物。
根据对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为275nm，则确定检测波长为275nm误差为±2nm，即在275nm误差为±2nm波长范围内检测有效。
取干燥的表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯，用有机溶剂溶解，配制成每毫升含有表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯分别为0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以有机溶剂为参比。具体地，取干燥的表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯50mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，分别取该溶液0，2，4，6，8和10mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以无水乙醇为参比，于275nm波长处测定吸光度，并绘制对照品溶液的标准曲线，如图5所示，由该标准曲线经计算得线性回归方程为：Y=0.0101X+0.0159，其中，线性范围为0-100μg/mL，线性范围为X的取值范围，R2=0.9991，R2为确定系数，该R2值越接近1表示该线性回归方程越可靠，Y为对照品溶液的吸光度，X为对照品溶液的浓度。
取标示量为0.5%的茶多酚棕榈酸酯凝胶剂5g，精密称定，置于烧杯中，加适量正已烷，充分搅拌，混合物于离心机3600rpm离心30min，分取上清液，重复提取3次，合并上清液，过滤，滤液移入100mL容量瓶中，用正已烷定容，即得供试品溶液；取等质量空白凝胶剂，并按照制备供试品溶液的方法制备空白凝胶剂提取液，并作为参比；取供试品溶液，以制备的空白凝胶剂提取液作参比，按紫外分光光度法，在凝胶剂提取液配制2小时内，于275nm波长处测定吸光度，其中，含茶多酚棕榈酸酯的凝胶剂的紫外波长扫描图如图6所示，处理过的空白凝胶剂的紫外波长扫描图如图7所示，其吸光度为0.5198，将吸光度代入上述线性回归方程并计算茶多酚棕榈酸酯含量，该凝胶剂中茶多酚棕榈酸酯的含量为0.4989%，本发明实施例提供的方法测得含量值与茶多酚棕榈酸酯的实际含量接近。
实施例四
当以茶多酚为原料，酰化剂为棕榈酸酰卤或棕榈酸酸酐时，脂溶性茶多酚为茶多酚棕榈酸酯，测定茶多酚棕榈酸酯的制剂的含量，具体为茶多酚棕榈酸酯软膏剂的含量。
对照品为茶多酚棕榈酸酯。
根据对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为274nm，则确定检测波长为274nm误差为±2nm，即在274nm误差为±2nm范围内检测有效。
取干燥的茶多酚棕榈酸酯，用有机溶剂溶解，配制成每毫升含有茶多酚棕榈酸酯分别为0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以有机溶剂为参比。具体地，取干燥的茶多酚棕榈酸酯50mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，分别取该溶液0，2，4，6，8和10mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚棕榈酸酯0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以无水乙醇为参比，于274nm波长处测定吸光度，并绘制对照品溶液的标准曲线，如图8所示，由该标准曲线经计算得线性回归方程为：Y=0.0101X+0.0042，其中，线性范围为0-100μg/mL，线性范围为X的取值范围，R2=0.9992，R2为确定系数，该R2值越接近1表示该线性回归方程越可靠，Y为对照品溶液的吸光度，X为对照品溶液的浓度。
取标示量为2%的茶多酚棕榈酸酯软膏剂10g，精密称定，置于烧杯中，加适量乙酸乙酯，充分搅拌，混合物于离心机3600rpm离心30min，分取上清液，重复提取3次，合并上清液，过滤，滤液移入100mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，精密量取该溶液1mL置于50mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，即得供试品溶液；取等质量空白软膏剂，并按照制备供试品溶液的方法制备空白软膏剂提取液，并作为参比；取供试品溶液，以制备的空白软膏剂提取液作参比，按紫外分光光度法，在供试品溶液配制2小时内，于274nm波长处测定吸光度，其吸光度为0.4084，将吸光度代入上述线性回归方程并计算茶多酚棕榈酸酯含量，该凝胶剂中茶多酚棕榈酸酯的含量为2.0012%，本发明实施例提供的方法测得含量值与茶多酚棕榈酸酯的实际含量接近。
实施例五
当以茶多酚为原料，酰化剂为月桂酸酰卤或月桂酸酸酐时，脂溶性茶多酚为茶多酚月桂酸酯，测定茶多酚月桂酸酯的含量。
对照品为茶多酚月桂酸酯，其茶多酚月桂酸酯的紫外波长扫描图如图9所示。
根据对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为275nm，则确定检测波长为275nm误差为±2nm，即在275nm误差为±2nm范围内检测有效。
取干燥的茶多酚月桂酸酯50mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，分别取该溶液0，2，4，6，8和10mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚月桂酸酯0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以无水乙醇为参比，于275nm波长处测定吸光度，并绘制对照品溶液的标准曲线，由该标准曲线经计算得线性回归方程为：Y=0.0101X+0.0019，如图10所示，其中，线性范围为0-100μg/mL，线性范围为X的取值范围，R2=0.9992，R2为确定系数，该R2值越接近1表示该线性回归方程越可靠，Y为对照品溶液的吸光度，X为对照品溶液的浓度。
取茶多酚月桂酸酯200mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，精密量取该溶液1mL置于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容，以无水乙醇为参比，按紫外分光光度法，在样品配制2小时内，于275nm波长处测定吸光度，其吸光度为0.4017，将吸光度代入上述线性回归方程并计算含量。
结果测得茶多酚月桂酸酯含量为98.96%，本发明实施例提供的方法测得含量值与茶多酚月桂酸酯的实际含量接近。
实施例六
当以茶多酚为原料，酰化剂为肉豆蔻酸酰卤或肉豆蔻酸酸酐时，脂溶性茶多酚为茶多酚肉豆蔻酸酯，测定茶多酚肉豆蔻酸酯的含量。
对照品为茶多酚肉豆蔻酸酯，其茶多酚肉豆蔻酸酯的紫外波长扫描图如图11所示。
根据对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为275nm，则确定检测波长为275nm误差为±2nm，即在275nm误差为±2nm范围内检测有效。
取干燥的茶多酚肉豆蔻酸酯50mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，分别取该溶液0，2，4，6，8和10mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚肉豆蔻酸酯0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以无水乙醇为参比，于275nm波长处测定吸光度，并绘制对照品溶液的标准曲线，由该标准曲线经计算得线性回归方程为：Y=0.0103X+0.0091，如图12所示，其中，线性范围为0-100μg/mL，线性范围为X的取值范围，R2=0.9992，R2为确定系数，该R2值越接近1表示该线性回归方程越可靠，Y为对照品溶液的吸光度，X为对照品溶液的浓度。
取茶多酚肉豆蔻酸酯200mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，精密量取该溶液1mL置于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容，以无水乙醇为参比，按紫外分光光度法，在样品配制2小时内，于275nm波长处测定吸光度，其吸光度为0.4255，将吸光度代入上述线性回归方程并计算含量。
结果测得茶多酚肉豆蔻酸酯含量为101.08%，本发明实施例提供的方法测得含量值与茶多酚肉豆蔻酸酯的实际含量接近。
实施例七
当以茶多酚为原料，酰化剂为癸酸酰卤或癸酸酸酐时，脂溶性茶多酚为茶多酚癸酸酯，测定茶多酚癸酸酯的含量。
对照品为茶多酚癸酸酯，其茶多酚癸酸酯的紫外波长扫描图如图13所示。
根据对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为275nm，则确定检测波长为275nm误差为±2nm，即在275nm误差为±2nm范围内检测有效。
取干燥的茶多酚癸酸酯50mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL，分别取该溶液0，2，4，6，8和10mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇定容，即得每毫升定容后的溶液含茶多酚月桂酸酯0，20，40，60，80和100μg的对照品溶液，以无水乙醇为参比，于275nm波长处测定吸光度，并绘制对照品溶液的标准曲线，由该标准曲线经计算得线性回归方程为：Y=0.0099X+0.0036，如图14所示，其中，线性范围为0-100μg/mL，线性范围为X的取值范围，R2=0.9998，R2为确定系数，该R2值越接近1表示该线性回归方程越可靠，Y为对照品溶液的吸光度，X为对照品溶液的浓度。
取茶多酚癸酸酯200mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，精密量取该溶液1mL置于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容，以无水乙醇为参比，按紫外分光光度法，在样品配制2小时内，于275nm波长处测定吸光度，其吸光度为0.3911，将吸光度代入上述线性回归方程并计算含量。
结果测得茶多酚癸酸酯含量为97.86%，本发明实施例提供的方法测得含量值与茶多酚癸酸酯的实际含量接近。
经研究发现，脂溶性茶多酚组分虽然较多，但其结构中的母核以黄烷-3醇衍生物为主，其它组分也主要为多羟基酚，本发明采用紫外分光光度法，通过测定脂溶性茶多酚母核的含量来间接得知脂溶性茶多酚的含量，经过大量实验研究发现，以茶多酚或茶多酚中含有的黄烷-3醇衍生物为反应物制备的脂溶性茶多酚的有机溶剂溶液，以及由脂溶性茶多酚制备的所述制剂的有机溶剂提取液，紫外吸收峰位稳定，均在275nm误差为±2nm，而且其浓度在一定范围内与吸收度呈现良好的线性关系，此结果为本发明技术的基础。
需要说明的是，在本发明提供的实施例中，有机溶剂采用无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和正已烷，但是在其它实施例中，也可以采用环己烷、石油醚或二甲基亚砜，由实验可知，当有机溶剂采用无水乙醇、正丁醇、氯仿、正已烷、环己烷、石油醚或二甲基亚砜时，获得的实验结果数据与前述实施例基本相同；同样地，在本发明提供的实施例中采用茶多酚棕榈酸酯为主药的凝胶剂和软膏剂，但是在其他实施例中，采用茶多酚棕榈酸酯为主药的霜剂、涂剂、涂膜剂、膜剂或贴剂作为供试品，获得的实验结果数据与前述实施例基本相同。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种测定脂溶性茶多酚含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将对照品和供试品分别制备成对照品溶液和供试品溶液，所述供试品为脂溶性茶多酚或含有所述脂溶性茶多酚的制剂，所述供试品溶液的溶剂为有机溶剂，所述对照品为脂溶性茶多酚，所述对照品溶液的溶剂为有机溶剂；
通过分别绘制所述对照品溶液和所述供试品溶液的紫外波长扫描图，获得所述对照品溶液和所述供试品溶液的最大吸收波长，并根据所述最大吸收波长确定检测波长；
绘制所述对照品溶液的标准曲线并计算所述标准曲线的回归方程；
采用紫外分光光度法测定所述供试品溶液的吸光度；
将所述供试品溶液的吸光度带入所述标准曲线回归方程计算所述供试品中脂溶性茶多酚的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂溶性茶多酚为茶多酚与8碳以上的有机脂肪酸的酰卤或酸酐反应得到的产物、或者为所述茶多酚中含有的黄烷-3醇衍生物与所述8碳以上的有机脂肪酸的酰卤或酸酐反应得到的产物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过所述供试品溶液的紫外波长扫描图确定所述供试品溶液的最大吸收波长的方法为：所述供试品为所述脂溶性茶多酚时，将所述脂溶性茶多酚配制成每毫升含有所述脂溶性茶多酚为0.04mg的所述供试品溶液，以所述有机溶剂为参比，在200-400nm波长范围内扫描，得到所述供试品溶液的紫外波长扫描图，由所述紫外波长扫描图确定所述供试品溶液的最大吸收波长为275nm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过所述供试品溶液的紫外波长扫描图确定所述供试品溶液的最大吸收波长的方法为：所述供试品为所述含有所述脂溶性茶多酚的制剂时，取所述制剂适量，精密称定，置于容器中，加适量所述有机溶剂，充分搅拌，于离心机3600rpm离心30min，分取上清液，并重复提取3次，合并所述上清液并过滤，将滤液移入容量瓶，用所述有机溶剂定容，配制成每毫升含有所述脂溶性茶多酚为0.04mg的所述供试品溶液，以制备所述供试品溶液的方法制备等质量空白制剂提取液作为参比，在200-400nm波长范围内扫描，得到所述供试品溶液的紫外波长扫描图，由所述紫外波长扫描图确定所述供试品溶液的最大吸收波长为275nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过所述对照品溶液的紫外波长扫描图确定所述对照品溶液的最大吸收波长的方法为：取所述对照品，用所述有机溶剂溶解，配制成每毫升含有所述对照品为0.04mg的所述对照品溶液，以所述有机溶剂为参比，在200-400nm波长范围内扫描，得到所述对照品溶液的紫外波长扫描图，由所述紫外波长扫描图确定所述对照品溶液的最大吸收波长为275nm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，根据所述对照品溶液与所述供试品溶液的最大吸收波长均为275nm，确定所述检测波长为275nm误差为±2nm。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，绘制所述对照品溶液的标准曲线并计算所述标准曲线的回归方程的方法为：取干燥的所述对照品，用所述有机溶剂溶解，配制成每毫升含有所述对照品分别为0，20，40，60，80和100μg的所述对照品溶液，以所述有机溶剂为参比，于275nm波长处测定吸光度，并绘制所述对照品溶液的标准曲线，由所述标准曲线经计算得所述线性回归方程。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，测定所述供试品溶液的吸光度的方法为：所述供试品溶液的浓度在线性回归方程的线性范围以内，当所述供试品为所述脂溶性茶多酚时，以所述有机溶剂为参比；当所述供试品为所述含有脂溶性茶多酚的制剂时，以所述空白制剂提取液为参比，于275nm波长处测定所述供试品溶液的吸光度。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含所述茶多酚硬脂酸酯的制剂为以所述茶多酚硬脂酸酯为主药的凝胶剂、霜剂、软膏剂、涂剂、涂膜剂、膜剂和贴剂中的至少一种的药物制剂。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、正已烷、环己烷、石油醚和二甲基亚砜中的至少一种。
11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述茶多酚中含有的黄烷-3醇衍生物为：儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素或表没食子儿茶素没食子酸酯。
12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述8碳以上的有机脂肪酸为：癸酸、羊蜡酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、珠光脂酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、桐酸、油酸或亚油酸。
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