CN103232542A - 一种双靶标嵌合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及融合蛋白领域，特别是涉及一种双靶标嵌合蛋白。本发明提供一种双靶标嵌合蛋白，所述双靶标嵌合蛋白包括三个结构功能区域，第一结构功能区域是CTLA-4的部分细胞外区域，第二结构功能区域是TACI的部分细胞外区域，第三结构功能区域是免疫球蛋白IgG的Fc片段。本发明发明人发现，含有本发明所提供的融合蛋白的药物组合能减少B淋巴细胞数量和抑制T淋巴细胞的数量，降低免疫球蛋白水平，减轻炎症引起的组织结构破坏，缓解临床体征，用于治疗自身免疫性疾病，如RA，移植物抗宿主病，系统性红斑狼疮，哮喘和牛皮癣,炎性肠道疾病和动脉粥样硬化症等与T淋巴细胞异常和BlyS异常增多引起的疾病。

Description

一种双靶标嵌合蛋白

技术领域

本发明涉及融合蛋白领域，特别是涉及一种双靶标嵌合蛋白。

背景技术

自身免疫性疾病,通常是由T淋巴细胞和B淋巴细胞的介入,炎性因子的参与,机体免疫系统对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的局部或全身性的慢性疾病。如类风湿关节炎(RA)，系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化症（MS），干燥综合症（

syndrome），1型糖尿病（Type1Diabetes mellitus）等。

T淋巴细胞和B淋巴细胞是机体免疫防御和免疫应答的两个主要功能细胞。它们分别参与机体细胞免疫和体液免疫功能。它们的异常,可以引起免疫功能亢进,如自身免疫性疾病;或引起免疫功能低下,如HIV感染或慢性疾病和肿瘤放疗或化疗后。

T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫防御和免疫应答功能需要被激活后才能发挥。

B淋巴细胞的活化分T淋巴细胞依赖性和T淋巴细胞非依赖性。T淋巴细胞依赖性B淋巴细胞的活化，需要B淋巴细胞受体（BCR）与抗原结合，内嗜和外表，呈递并参与活化协助T（Th）淋巴细胞，借助T淋巴细胞膜上的CD40L与B淋巴细胞膜上CD40的结合作为B淋巴细胞激活的第二信号。B淋巴细胞生长、发育、成熟、和分化则需要B淋巴细胞表面受体(BAFF-R、跨膜激活物和钙调制器和亲环素配体相互作用分子（TACI）和B淋巴细胞成熟抗原（BCMA)）与B淋巴细胞刺激因子BAFF（BLYS）和患者增殖诱导配体（APRIL）相互作用来维持。任何异常情况所致BLYS长时间过高，将导致自身免疫功能紊乱。BLYS和BAFF-R互动是决定B淋巴细胞生存或淘汰的关键。除与BAFF-R相互作用外，BAFF还能与TACI和BCMA结合。TACI和BCMA对成熟活化后的B淋巴细胞，对记忆B淋巴细胞和长寿浆细胞的生存和功能起重要作用。除产生抗体和作为抗原提呈细胞功能外，Ｂ淋巴细胞也是细胞因子包括IL-6和IL-10的主要分泌者。

T淋巴细胞的活化需要俩个信号，第一信号来自T淋巴细胞表面受体（TCR）与抗原呈递细胞（APC）表面抗原的主要组织相容性复合体分子相互作用。第二信号，也称共刺激信号，来自T淋巴细胞膜上相应受体与APC表面对应配体的相互作用来实现。其中，以T淋巴细胞膜上受体CD28与APC的配体CD80和CD86分子间的相互作用最为重要。CD28和CD80/86之间的相互作用,参与T淋巴细胞活化和细胞增殖,促进细胞因子的产生和T淋巴细胞的存活，触发T淋巴细胞免疫应答反应。然而，表达在T淋巴细胞膜上的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的作用与CD28的作用相反。CTLA-4和CD80/86之间的相互作用使T淋巴细胞发生免疫沉默/免疫耐受，抑制T淋巴细胞增殖和活化，引起活化T淋巴细胞凋亡。CTLA-4与CD28共同构成了调控T淋巴细胞功能的一对正负共刺激因子。而且，CTLA-4与CD80/86的结合比CD28与CD80/86结合更强。机体正是利用CD28/CTLA-4与CD80/86作用的正负调节机制，维持T淋巴细胞参与的机体免疫防御和免疫应答功能的平衡。

T淋巴细胞除直接参与细胞免疫外，还参与B淋巴细胞活化和促进B淋巴细胞（浆细胞）抗体产生。作为体液免疫的B淋巴细胞，也以抗原提呈细胞参与T淋巴细胞的激活。部分T淋巴细胞也表达TACI和低浓度的BAFF；BAFF除主要参与B淋巴细胞的生长、发育和成熟外，也参与T淋巴细胞的功能。所以，T淋巴细胞介导的细胞免疫和B淋巴细胞介导的体液免疫即有区别又相互联系。

通过阻断CD28：CD80/86通路，下调T淋巴细胞活性，下调炎性因子所引起炎症反应，还可以降低B淋巴细胞（浆细胞）自身抗体的产生，达到控制自身免疫性疾病，和抑制同种异体移植排斥反应。通过阻止B淋巴细胞因子BAFF/APRIL与BAFF-R,TACI和BCMA的作用，可以抑制B淋巴细胞的生长、增殖和分化，减少自身反应性B淋巴细胞存活数量和自身抗体的产生，减少免疫反应沉积物和减轻免疫反应引起的组织损伤；减少记忆B淋巴细胞数量，有助于防止自身免疫性疾病的复发。

用于自身免疫性疾病的制疗方法经历了免疫抑制剂,类固醇激素抗炎剂,非固醇类抗炎剂过程。目前分子特异性靶向疗法是治疗自身免疫性疾病的一种较好的选择，特别是在减少免疫反应沉积物和减轻免疫反应引起的组织损伤方面效果显著。临床上用于治疗RA的肿瘤坏死因子(TNFa)拮抗剂(etanercept),B淋巴细胞耗竭剂(rituximab),抗白介素-6受体单抗(tocilizumab),以及共激活阻断剂阿巴普西(abatacept)；用于治疗红斑狼疮的抗B淋巴细胞因子BAFF单抗(belimumab)和抗器官移植排斥的共激活阻断剂(belatacept)。

由于自身免疫性疾病是由多因素参与的复杂性疾病。阻止其中一个环节或因素，很难完全消除自身免疫性反应，特别是难以阻止免疫复合物沉积所导致的组织/器官破坏。多数情况下，自身免疫性疾病复发需要重复治疗。这有可能与耗竭B淋巴细胞治疗幸存下来的长寿记忆B淋巴细胞或/和浆细胞或自身反应性B淋巴细胞有关。未被枯竭的自身免疫反应性记忆T淋巴细胞，也可能会对自身反应性B淋巴细胞的活化起重要作用。多数具有自身免疫反应性记忆B淋巴细胞及后代都会得到T淋巴细胞的协助。在次级淋巴组织中，T淋巴细胞依赖性浆细胞存活则提示，联合应用针对T淋巴细胞和B淋巴细胞的特异性靶向疗法，可以加强抑制浆细胞自身抗体的产生，可能是治疗自身免疫性疾病的更佳选择。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明将细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4细胞外片断和跨膜激活物和钙调制器和亲环素配体相互作用分子细胞外半胱胺酸富有区与免疫球蛋白IgG恒定区相融合，通过筛选和优化，构建成的双靶向分子，该分子具有协同阻断异常情况下T淋巴细胞和B淋巴细胞功能，减少致炎因子分泌，阻止或减少自身抗体的产生，减轻免疫反应对机体组织和器官的损害，增加对自身免疫性疾病的治疗功效，克服了目前单靶点生物药物在临床上治疗自身免疫性疾病的不足。

本发明是依据CD80或CD86和BlyS或APRIL能与其对应受体结合的结构功能区能以融合蛋白在真核细胞中表达，第一方面提供一种双靶标嵌合蛋白，所述双靶标嵌合蛋白包括三个结构功能区域，第一结构功能区域是CTLA-4的部分细胞外区域，第二结构功能区域是TACI的部分细胞外区域，第三结构功能区域是免疫球蛋白IgG的Fc片段。

所述第一结构功能区域能够结合两种不同的细胞因子，CD80和CD86。

所述第二结构功能区域是TACI的一个或者两个半胱氨酸区域，能够结合两种不同的细胞因子，BlyS和APRIL。

所述第三结构功能区域的作用一是增加该融合蛋白与相对应的因子的结合能力，二是增加融合蛋白的血液半衰期，从而减少临床用药次数。

更优选的，所述双靶标嵌合蛋白从N端到C端依次为第一、二和三结构功能区域，所述第一结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述第二结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.30或31所示，所述第三结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示。

更优选的，所述第一结构功能区域和第二结构功能区域之间还包括第一连接肽，所述第二结构功能区域和第三结构功能区域之间还包括第二连接肽。

所述第二连接肽能够使融合蛋白具有更佳的亲和力，这主要是由于连接肽增加了结构功能域之间的空间，消除或减小了相邻结构功能域之间的空间物理阻碍作用。

所述各连接肽的作用是增加所述融合蛋白各结构功能域的相对独立性，同时也增加所述融合蛋白各功能区的结构稳定及生物学功能。

更优选的，所述连接肽的长度为5-15个氨基酸序列。

更优选的，所述双靶标嵌合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO.14、16、18、20、22、24、26或28。

如上所述，本发明提供分离的核酸分子,该分子包含三个功能结构域部分；第一功能结构域和第二功能结构域是具有生物活性功能区域,第三功能结构域为免疫球蛋白IgG恒定区，免疫球蛋白IgG恒定区包括胶链区、CH2和CH3区，以及在这三个功能结构域之间分别添加的连接链。把该分离的核酸分子克隆到宿主表达载体，在宿主表达系统中表达的融合蛋白能同时结合CD80和BlyS，阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的信号传递，从而抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞介入的自身免疫性疾病。

本发明第二方面提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的双靶标嵌合蛋白。

本发明第三方面提供一种含有所述的多核苷酸的序列的表达载体。

本发明第四方面提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的表达载体、或者染色体中整合有所述的多核苷酸。

本发明第五方面提供所述的双靶标嵌合蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建含有能表达所述双靶标嵌合蛋白的核苷酸序列，将此核苷酸序列构建至表达载体中，然后将含有融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，即得所述双靶标嵌合蛋白。

优选的，所述双靶标嵌合蛋白的制备方法,具体包括以下步骤：

（1）分别合成第一、二和三结构功能区域所对应的片段基因及IgGκ分泌肽核酸片段；

（2）将IgGκ分泌肽核酸片段联接到质粒中，构建质粒p-κ；

（3）将第一、二和三结构功能区域所对应的片段编码基因分别通过重叠PCR融合，通过克隆到步骤（2）所得的质粒中，构建质粒p-κ-CT001；

（4）将所获得的质粒p-κ-CT001转化到宿主细胞中进行表达，得到所需要的融合蛋白CT001。

优选的，本发明提供所述核酸序列编码的表达载体及表达宿主载体系统;宿主载体系统可以是哺乳动物细胞,昆虫细胞和酵母细胞,例如CHO-K1﹑CHO-S﹑DG44细胞、COS细胞﹑BHK细胞﹑293细胞﹑NSO细胞﹑PerC6细胞，Sf9细胞﹑Sf21细胞等。

更优选的，所述表达载体为质粒pcDNA3.1(Invitrogen)，所述表达宿主载体系统为CHO-K1或CHO-S。

本发明第六方面提供一种药物组合物，含有所述的双靶标嵌合蛋白及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。

本发明第七方面提供所述的双靶标嵌合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病的药物或制剂中的应用。

本发明第八方面提供一种用于治疗自身免疫性疾病的方法，其中包括注射有效治疗剂量的所述的双靶标嵌合蛋白。

本发明发明人发现，含有本发明所提供的融合蛋白的药物组合能减少B淋巴细胞数量和抑制T淋巴细胞的数量，降低免疫球蛋白水平，减轻炎症引起的组织结构破坏，缓解临床体征，用于治疗自身免疫性疾病，如RA，移植物抗宿主病，系统性红斑狼疮，哮喘和牛皮癣,炎性肠道疾病(Inflammatory Bowel Diseases)和动脉粥样硬化症等与T淋巴细胞异常和BlyS异常增多引起的疾病。

附图说明

图1显示为本发明融合蛋白结构示意图。

图2显示为本发明各融合蛋白的Western Blot（左图）SDS-PAGE（右图）试验结果示意图。

图3显示为本发明融合蛋白(CT001Δ5、CT001Δ12、CT002Δ5、CT002Δ12或CT001Ψ0、CT002Ψ0、CT001、CT002)分别与CD80和BlyS体外结合实验示意图。

图4显示为本发明融合蛋白(k-T、k-C、TC001、TC002、CT001、CT001Ψ0、CT002和CT002Ψ0)与CD80和BlyS体外结合实验示意图。

图5-1显示为本发明动物试验后膝关节病理示意图。

图5-2显示为本发明融合蛋白药效试验膝关节病理指数示意图（对应图5-1）。

图5-3显示为本发明动物试验后踝足关节病理示意图。

图5-4显示为本发明融合蛋白药效试验踝足关节病理指数示意图（对应图5-3）。

图6-1显示为本发明融合蛋白对各试验组小鼠脾脏病理和脾脏B淋巴细胞CD20的影响示意图。

图6-2显示为本发明融合蛋白对各试验组小鼠脾脏病理和脾脏B淋巴细胞CD20的吸光度密度测定示意图。

图7显示为本发明各组动物试验后IgG、IgA和IgM在血中浓度测定结果示意图。

图8-1显示为融合蛋白对各试验组小鼠脾脏总B淋巴细胞数的作用。

图8-2显示为融合蛋白对各试验组小鼠脾脏总T淋巴细胞数的作用。

图9-1显示为各试验动物组关节炎指数变化图。

图9-2显示为各试验动物组足踝肿胀容积变化图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等

MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1.

融合蛋白的基因构建

1.表达质粒的构建：

CTLA-4和TACI细胞外区域的编码序列是依据基因(NM_005214.4/BC052683.1；NM_012452.2/BC028072)用基因合成法得到SEQ ID NO.1（CTLA模版）和SEQ ID NO.2（TACI模版）。

Fc模版(699bp)是以淋巴结cDNA（BD）为模版和下列引物PCR扩增所得(SEQ ID NO.3)：

引物1（正向）5’CTCATCGAGCCTAAGAGCAGCGACAAAACTCACACATGCCCAC3’

引物2（反向）5’AAGGGAATCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3’

IgG-k分泌肽（SEQ ID NO.4）用基因合成法得到，用限制性内切酶NheI和EcoRI(Invitrogen公司)切割、纯化,插入到事先用NheI和EcoRI切割、纯化后的pcDNA3载体（pcDNA3.1，Invitrogen),得到质粒pcDNA3-k。

κ-T由TACI的第1和第2个半胱氨酸结构域与人免疫球蛋白Fc构成。首先，用引物3和4PCR扩增TACI模版，得到taci_30-110，从aa30到aa110；引物5和引物6PCR扩增Fc模版获得fc片段；然后用引物3和引物6将PCR扩增的taci_30-110和PCR扩增的fc片段通过重叠PCR融合而成。所获得的κ-T编码DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

引物3（正向）5’AGCGAATTCGCTATGAGATCCTGCCCC

引物4（反向）5’CTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCAC

引物5（正向）5’AACAAGCTCAGGAGCGAGCCTAAGAGCAGCGAC

引物6（反向）5’ATAGTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG

κ-C由CTLA-4与人免疫球蛋白Fc构成。首先，用引物7和引物8以合成的CTLA-4为模板PCR扩增获得ctla-4片段；引物9和引物6以合成的Fc片段为模板PCR扩增获得fc片段,再用引物7和引物6通过重叠PCR将ctla-4和fc片段融合而成。所获得的κ-C编码DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.7和8。

引物7：5’GACGAATTCATGCACGTGGCCCAGC

引物8：5’CTCTTGGTCAGAATCTGGGCAC

引物9：5’CCAGATTCTGACCAAGAGCCTAAGAGCAGCGAC

TC001(k-taci30-110-gly12-ctla-4-gly12-fc)由taci的第1和第2个半胱氨酸结构域、ctla-4和人免疫球蛋白Fc构成。首先，引物3和引物10以合成的TACI为模板PCR扩增获得taci_30-110-gly12；引物11和引物12以合成的CTLA-4为模板PCR扩增获得gly12-ctla-4-gly12（注意：通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了Serine）。引物13和引物6PCR扩增Fc片段得到gly12-fc。引物3和引物12将taci_30-110-gly12和gly12-ctla-4-gly12用重叠PCR融合得到taci_30-110-gly12-ctla-4-glyc12。引物3和引物6将taci30-110-gly12-ctla-4-glyc12与gly12-fc用重叠PCR融合得到TC001(k-taci_30-110-gly12-ctla-4-gly12-fc)。所获得的TC001编码DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.9和10。

引物10：5’TCCGCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCTCCACCGCTCCTGAGCTTGTTCTCAC

引物11：5’AACAAGCTCAGGAGCGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGCAATGCACGTGGCCCAGC

引物12：5’TCCACCTCCGCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCTTGGTCAGAATCTGGGGACG

引物13：5’CCAGATTCTGACCAAGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGAGCCTAAGAGCAGCGACGACAAA

TC002(k-taci67-110-gly12-ctla-4-gly12-fc)由taci的第2个半胱氨酸结构域、ctla-4和人免疫球蛋白Fc构成。用引物14和引物10PCR扩增TACI模版获得taci_67-110；引物11和引物12PCR扩增CTLA-4模版获得gly12-ctla-4-gly12（注意：通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了Serine）。引物13和引物6PCR扩增Fc模版获得gly12-fc。引物14和引物12将taci_67-110和gly12-ctla-4-gly12通过重叠PCR得到taci_67-110-gly12-ctla-4-glyc12。引物14和引物6将taci_67-110-gly12-ctla-4-glyc12与gly12-fc用重叠PCR融合得到TC002

(k-taci_67-110-gly12-ctla-4-gly12-fc)。所获得的TC002编码DNA序列和氨基酸序列如SEQ IDNO.11和12。

引物14：5’-AGCGAATTCAGGTCACTCAGCTGCCG

CT001由ctla-4、taci的第1和第2个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fc构成。以合成基因CTLA-4为模版，分别用引物7和引物12PCR扩增，得到ctla-4-gly12（注意：通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了Serine）；引物15和引物16PCR扩增TACI模版获得taci_29-114-(GGS)₂；引物17和6PCR扩增Fc模版获得fc；用引物7和引物16将ctla-4-gly12和taci_29-114-(GGS)₂重叠PCR得到ctla-4-gly12-taci_29-114，再用引物7和引物6将ctla-4-gly12-taci29-114与fc通过重叠PCR融合而成（ctla-4-taci_29-114-fc）。所获得的CT001DNA编码序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.13和14。

引物15:5’CCAGATTCTGACCAGGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGTGGCTATGAGATCCTGCCCC

引物16：5’GCTTCCACCGCTTCCACCAAGGTTCACTGGGCTCCTGAG

引物17：5’AGCCCAGTGAACCTTGGTGGAAGCGGTGGAAGCGAGCCTAAGAGCAGCGACAAAAC

CT001Δ5和CT001Δ12均由ctla-4、taci的第1和第2个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fc构成。CT001Δ5的ctla4片段需用引物7和引物18扩增CTLA-4模版得到（注意：通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了Serine）。引物19和引物20PCR扩增CT001得到taci_29-114-gly12；引物21和引物6PCR扩增Fc模版得到fc；用引物7和引物20重叠PCR得到ctla-4-gly12-taci_29-114Δ5；再用引物7和引物6将ctla-4-gly12-taci_29-114Δ5与fc通过重叠PCR融合而成（ctla-4-taci_29-114-fc）。所获得的CT001Δ5DNA编码序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.15至16。

CT001Δ12的ctla4片段需用引物7和引物12扩增CTLA-4模版得到（注意：通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了Serine）。引物15和引物20PCR扩增CT001得到taci_29-114-gly12；引物21和引物6PCR扩增Fc模版得到fc；用引物7和引物20重叠PCR得到ctla-4-gly12-taci_29-114Δ12；再用引物7和引物6将ctla-4-gly12-taci_29-114Δ12与fc通过重叠PCR融合而成（ctla-4-taci_29-114-fc）。所获得的CT001Δ12DNA编码序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.17至18。

CT001Δ5和CT001Δ12与CT001区别是在taci和Fc之间，CT001Δ5和CT001Δ12都含有一个12个氨基酸的连接肽，CT001则含有6个氨基酸的连接肽。

引物18：5’ACCTCCGCCTCCACCTTGGTCAGAATCTGGGGACGG

引物19：5’CCAGATTCTGACCAGGGTGGCGGAGGTGGAGTGGCTATGAGATCCTGCCCC

引物20：5’TCCACCTCCGCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCAAGGTTCACTGGGCTCCTGAG

引物21：5’CCAGTGAACCTTGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGG TGGAGAGCCTAAGAGCAGCGACAAAAC

CT001Ψ0由ctla-4、taci的第1和第2个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fc构成。CT001Ψ0在taci和Fc之间没有添加连接肽。以CT001为模板，引物7和引物22PCR扩增ctla4-gly12-taci29-114-Ψ0；引物23和引物6PCR扩增Fc模版得fc；再用引物7和引物6将ctla-4-gly12-taci29-114与fc通过重叠PCR融合而成（ctla-4-taci29-114-fc）。所获得的CT001Ψ0的DNA编码序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.19和20。

引物22：5’AAGGTTCACTGG GCTCCTGAGCTTGTTCTCAC

引物23：5’AGCCCAGTGAACCTTGAGCCTAAGAGCAGCGACAAAACTCACAC

CT002由ctla-4、taci的第2个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fc三部分构成。以CT-001为模板，用引物7和引物12PCR扩增ctla-4，得到ctla-4-gly12；用引物24和引物6PCR扩增taci67-114-(GGS)₂-fc；用引物7和引物6将ctla-4-gly12和taci67-114-(GGS)₂-fc用重叠PCR融合得到CT-002。所获得的CT-002DNA和氨基酸序列如SEQ ID NO.21和22。

引物24：5’GATTCTGACCAAGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAAGGTCACTCAGCTGCCGCAAG

CT002Δ5、CT002Δ12和CT002Ψ0：由ctla-4、taci的第2个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fc三部分构成。分别以CT001Δ5、CT001Δ12和CT001Ψ0为模板，用引物7和引物18或引物7和引物12PCR扩增CTLA模版，得到ctla-4-gly5和ctla-4-gly12；用引物25与引物6PCR扩增CT001Δ5得5gly-taci_67-114-12gly-fc，用引物24分别与引物6PCR扩增CT001Δ12和CT001Ψ0分别得到12gly-taci_67-114-12gly-fc、12gly-taci_67-114-fc。用融合PCR将ctla-4-gly5和ctla-4-gly12片段分别与5gly-taci67-114-12gly-fc、12gly-taci67-114-12gly-fc、12gly-taci67-114-fc融合，得到CT002Δ5、CT002Δ12和CT002Ψ0。所获得的CT002Δ5的DNA和氨基酸序列如SEQ ID NO.23至24。CT002Δ12的DNA和氨基酸序列如SEQ ID NO.25至26。CT002Ψ0DNA和氨基酸序列如SEQ ID NO.27至28。

引物25：5’CCAGATTCTGACCAAGGTGGAGGCGGAGGTAGGTCACTCAGCTGCCGCAAG

通过PCR融合的目的基因片段，用限制性内切酶EcoRI和XhoI(Invitrogen公司)切割，纯化，插入到事先用EcoRI和XhoI切割、纯化后的pcDNA3-κ载体，最终得到表达质粒pκ-T、pκ-C、pCT001、pCT001Δ5、pCT001Δ12、pCT001Ψ0、pCT002、pCT002Δ5、pCT002Δ12、pCT002Ψ0、pTC001和pTC002。对每个表达质粒的核苷酸编码序列进行了序列测序分析，确认所有表达质粒的序列是正确的。pκ-T核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.5所示、pκ-C核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.7所示、pCT001核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.13所示、

pCT001Δ5核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.15所示、pCT001Δ12核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.17所示、pCT001Ψ0核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.19所示、

pCT002核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.21所示、pCT002Δ5核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.23所示、pCT002Δ12核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.25所示、

pCT002Ψ0核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.27所示、pTC001核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.9所示和pTC002核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID NO.11所示。

实施例2.CHO细胞的转染、重组克隆的筛选和融合蛋白的表达

本发明中多个融合蛋白质是在CHO-K1和CHO-S细胞中表达并分泌到培养液中，用葡萄球菌A蛋白亲和沉析法纯化所得。

当瞬时表达本发明中融合蛋白,重组质粒用DNA纯化试剂盒(Qiagen公司)提纯后，用脂质体2000(Invitrogen公司)转染到CHO-K1(ATCC^#CCL61)细胞。在无血清培养液OPTI-MII中培养3天后收集上清液。葡萄球菌A蛋白亲和沉析法纯化后的融合蛋白,经ELISA测定浓度后，用免疫印迹分析得到验证。

所述ELISA测定的具体方法为：用Bethyl公司的Fc夹心酶联免疫分析ELISA检测试剂盒来测定融合蛋白Fc。将稀释后的融合蛋白(CT001Δ5、CT001Δ12、CT002Δ5、CT002Δ12或CT001Ψ0、CT002Ψ0、CT001、CT002)加入到事先用抗Fc包被抗体（200ng/孔）包被的ELISA板，在室温孵育1.5小时，经过1小时封闭后，加入Fc检测抗体，在室温孵育30分钟后加人底物显色，检测被包被抗体结合的融合蛋白浓度。

所述免疫印迹法的具体条件为：将等量的不同融合蛋白3-5微克用SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上，经过封闭，加入抗Fc-HRP赘合抗体，加入底物TMB显色。

稳定表达本发明中k-T、k-C、TC001、CT001和CT002融合蛋白，用电穿孔法将纯化后的质粒转染到CHO-S细胞(Invitrogen公司)。48小时后,添加700ug/ml的G418(Invitrogen公司)到培养液中。2周后，用有限密度稀释法进行细胞克隆培养。第五周，用ELISA法测定各克隆细胞株蛋白表达量，挑选高产克隆细胞株,进行放大培养。

实施例3.重组融合蛋白的纯化、制剂的初步制备工艺和稳定性

稳定转染的CHO-S细胞能持久表达大量的融合蛋白,并分泌到细胞培养液中。细胞培养液上清经离心过滤，用超滤膜包(10kDa，Sartorius Stedim)浓缩，样本上到事先用缓冲液（30mMTris-HCl，0.15MNaCl，pH7.5）平衡好的蛋白A柱(GE Health Care)。用缓冲液洗涤至平衡,用洗脱液（20mM柠檬酸钠，pH3.4）洗脱目的蛋白，按洗脱峰收集，收集时在收集管事先放置10%体积的中和缓冲液（1M Tris,pH8.0）。用缓冲液(30mM Tris-HCl，pH7.5)稀释蛋白A柱洗脱下的目的蛋白，样本上到预先用缓冲液（30mM Tris-HCl，30mMNaCl，pH7.5）准备好的离子柱(GE health Care)，用缓冲液洗涤至平衡,用含盐缓冲液（30mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.5）以浓度梯度模式洗脱目的蛋白，收集目的蛋白，经脱盐、缓冲液置换、浓缩、蛋白定量、分装，进行初步蛋白稳定性实验，或储藏在-80℃用于下述实验

各融合蛋白的SDS-PAGE试验结果如图2所示。

各融合蛋白均经过N端测序，确认各融合蛋白读框无误。

蛋白初步稳定性实验：将纯化、脱盐、不同缓冲液置换后的蛋白用Centricon离心超滤管（Millipore）浓缩到2mg/ml的浓度，分装到美国安捷伦Agilent9301-1388Crimp cap micro vial瓶中，分别放置在4℃、25℃、37℃、-80℃，直接进行或在设定的时间点进行SEC-HPLC分析。CT001稳定性试验-SEC-HPLC分析如表1.1-表1.4所示：

表1.1

表1.2

表1.3

表1.4

实验结果表明融合蛋白CT001分别在缓冲液30mmTris加80mg/ml海藻糖（pH7.5）和缓冲液30mmTris加150mmNacl（pH7.5）中更稳定。

实施例4.重组融合蛋白的生物活性研究

1）融合蛋白结构功能域间的连接肽长度对融合蛋白的亲合力影响:

在构建CT001和CT002融合蛋白表达质粒时，对其结构域之间连接肽长度进行了优化实验。实验发现融合蛋白结构功能域间的连接肽长度影响融合蛋白与其对应的共刺激分子或因子的结合。在本发明中融合蛋白结构功能域间的连接肽长度在五个氨基酸序列至十五个氨基酸序列之间。下面所述实例中融合蛋白CT001、CT002和TC001是以在第一和第二结构功能域间含有十二个氨基酸的连接肽和在第二结构功能域与第三结构功能域间含有六个氨基酸序列连接肽为例，这并不意味增加或减少几个氨基酸序列就不在本发明之列。

2）融合蛋白(CT001Δ5、CT001Δ12、CT002Δ5、CT002Δ12或CT001Ψ0、CT002Ψ0、CT001、CT002)分别与CD80和BlyS体外结合实验：

应用R&D Systems公司的CD80和BlyS夹心酶联免疫分析ELISA检测试剂盒来测定融合蛋白分别与CD80和BlyS的结合力。将不同浓度(0到100nM)的融合蛋白(CT001Δ5、CT001Δ12、CT002Δ5、CT002Δ12或CT001Ψ0、CT002Ψ0、CT001、CT002)跟50pM人CD80-Fc或跟25pM人BlyS(R&D Systems公司)在室温下孵育过夜，然后加入到事先用抗CD80抗体或抗BlyS抗体（200ng/孔）包被的ELISA板，分别检测没有被融合蛋白结合的游离的CD80和游离的BlyS。CD80的检测结果如图3左所示，BlyS的检测结果如图3右所示。

3）融合蛋白(k-T、k-C、TC001、TC002、CT001、CT001Ψ0、CT002和CT002Ψ0)与CD80和BlyS体外结合实验：

用直接酶联免疫分析ELISA法测定融合蛋白与BlyS和CD80-Fc的结合。事先用BlyS或CD80-Fc（R&D Systems，200ng/孔）蛋白包被ELISA板，用含有3%BSA封闭液封闭后，加入不同浓度的融合蛋白(k-T、k-C、TC001、TC002、CT001、CT001Ψ0、CT002和CT002Ψ0)，经过孵育和洗涤，加入抗人Fc-HRP赘合抗体经过孵育洗涤，BlyS的显色和读数如图4左所示；或加入生物素标记的抗人TACI抗体，经过孵育洗涤，再加入Streptavidin-HRP，经过孵育洗涤，CD80的显色和读数如图4右所示。

ELISA实验结果用软件程序Prism5(GraphPad公司)非线性以合后得到相对亲和力。

在该实验条件下,融合蛋白TC001、TC002、CT001Ψ0、CT001Δ5、CT002Δ5、CT001Δ12、CT002Δ12、CT001和CT002与CD80都呈现有不同程度的亲和力。其中,CT001与CD80结合最好。融合蛋白k-T与CD80无结合。融合蛋白TC001、TC002、CT001Ψ0、CT002Ψ0、CT001、和CT002与BlyS都呈现有不同程度的亲和力。融合蛋白CT001与BlyS的亲和力最好。融合蛋白k-C与BlyS无结合。

结合动力学实验检测融合蛋白k-C、CT001和CT002分别与CD80和BlyS结合以及先后与CD80和BlyS或BlyS和CD80顺序结合，结果进一步支持CT001和CT002与CD80和BlyS结合最好。并且，与第一个因子的结合，可以增加融合蛋白与第二个因子结合力，呈现叠加效应，具体如表2所示。

表2

实施例5.重组融合蛋白的初步药动学和急毒实验

单次皮下给予雄性小鼠CT001，剂量5mg/kg体重，于不同时间点，用二氧化碳安乐死，采集血样，用ELISA测定给予CT001后小鼠血清中受试物的浓度并计算相关参数。皮下单次用药CT001的药代动力学研究，最大吸收（tmax）时间计算分别在6小时至9小时之间，其半衰期(t1/2)计算为大约50至60小时。

单次雄性小鼠尾静脉给药CT001(80mg/kg),给药后，观察小鼠的行为，摄食量，未见异常。48小时后用二氧化碳安乐死，作大体解剖，未见内脏器官异常。

实施例6.重组融合蛋白的初步药效研究

1）融合蛋白CT001和κ-C对CIA模型小鼠的预防治疗作用：

DBA/1小鼠于d0和d21，尾根部、背部多点皮肉注射100μgⅡ型胶原和完全弗式佐剂诱导CIA小鼠模型。DBA/1小鼠，随即分为10组，即正常组

模型组（Vehicle）、CT001三个剂量组（1、3、9mg/kg/次，皮下注射，每周两次，用药4周）、阳性对照组益赛普（TNFR-Fc,9mg/kg，皮下注射，每周两次，用药4周）、κ-C001（或κ-C）三个剂量组（1、3、9mg/kg/次，皮下注射，每周两次，用药4周），和IgG（9mg/kg，皮下注射，每周两次，用药4周）对照组。免疫后每周星期1、星期3和星期5进行小鼠体重称量、进食计量，进行小鼠踝关节足爪关节肿胀容积测定评分，进行小鼠踝关节足爪关节炎指数评分。D55用二氧化碳安乐死小鼠，取血用于ELISA法检测血清中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平；用10%复尔马林固定膝关节、足爪踝关节用于病理切片检测和评分、10%复尔马林固定每组前五只动物脾脏用于病理切片检测和免疫组化检测；每组后五只动物脾脏用于流式细胞术测定小鼠脾脏总B淋巴细胞（CD19⁺）百分含量；流式细胞术测定小鼠脾脏总T淋巴细胞(CD45+and CD3+)、Th细胞(CD45+,CD3+,CD4+,CD8-)和细胞毒性T淋巴细胞(CD45+,CD3+,CD4-,CD8+)的百分含量。评分计数方法：0，1，2，3四个级别：

1.关节腔及周围急性炎性细胞反应:“0”无浸润；“1”少量存在；“2”中量存在；“3”大量急性炎性细胞浸润。

2.关节腔内及周围纤维、毛细血管及滑膜组织增生反应：“0”未见；“1”少量；“2”中量；“3”大量。

3.关节软骨面破坏程度：“0”未见；“1”灶性及1/3左右关节面全层软骨面破坏、消失；“2”1/2左右关节面全层软骨面破坏，未见软骨覆盖或单层软骨细胞覆盖；“3”大于2/3左右或全部软骨面消失，有的由纤维结缔组织取代。

4.骨侵蚀、膜内及软骨骨化反应：“0”未见；“1”少量；“2”中量；“3”大量。提示破坏关节腔面后，反应性的膜内、软骨内化骨，结构发生改变，关节畸形形成的过程。

关节炎指数为以上4个评分结果之和。

CIA模型组从第29天开始与正常对照组比较体重显著降低，差异显著；阴性对照组（IgG9mg/kg）、阳性对照组(TNFR-Fc9mg/kg)、CT001(1mg/kg,3mg/kg,9mg/kg)、KC001(1mg/kg,3mg/kg,9mg/kg)与CIA模型对照组比较对小鼠体重的影响没有显著性差异。

各试验组小鼠从第24天到第27天开始出现足爪红肿，首先是前足红肿，以后延伸到后足，并伴有后足足容积增加，在第一次免疫后34天左右达到峰值。CIA模型组小鼠表现尤为突出，足爪及踝关节显示软组织肿胀，足爪关节变形。在第一次免疫后D27之后，阴性对照组（IgG）、KC001(1mg/kg,3mg/kg,9mg/kg)组和CIA模型对照组比较对后足容积的影响没有显著性差异（p>0.05）。阳性对照组（TNFR-Fc）在D29（P<0.01），D31（P<0.05）；CT0011mg/kg在D29-31（P<0.01），D34-38、D43（P<0.05）；CT0013mg/kg在D29（P<0.05），D31（P<0.01）；CT0019mg/kg在D29-43（P<0.01-0.005）与模型对照组比较小鼠后足容积显著减少。

各组小鼠从第27天开始至实验结束均表现出四肢关节炎指数（AI）增加，在第一次免疫后38天左右达到峰值。阴性对照组（IgG）与CIA模型对照组比较AI值增加；CT0011mg/kg、KC0011mg/kg、KC0013mg/kg、KC0019mg/kg与模型对照组比较AI值均有不同程度的降低但无显著性差异。阳性对照组（TNFR-Fc）在D29（P<0.05）、CT0013mg/kg在D29-31（P<0.05）、CT0019mg/kg在D27-43（P<0.05-0.005）与CIA模型对照组比较AI值显著降低。（如图9-1和9-2所示）

除了阴性对照组（IgG）未对AI表现出抑制作用以外，其他各组在D27-43与模型对照组比较均表现出对AI的抑制作用。CT0019mg/kg组AI抑制率最高，在D27时为最大值，达到93.75%。CT0011mg/kg；CT0013mg/kg组AI抑制率相对较高，约30-60%。阳性对照组（TNFR-Fc9mg/kg）；KC0011mg/kg；KC0013mg/kg组对AI同样有抑制作用，抑制率中等，大约10-30%。KC0019mg/kg组对AI抑制率较低，基本小于10%，在D34、45无抑制作用。

膝关节和踝足爪关节病理检测结果证明，各试验组小鼠均有程度不同的滑膜组织增生，炎细胞浸润，或伴有毛细血管增生或伴有骨赘生成和软骨破坏。其中，尤其以CIA模型组和阴性对照组（IgG）明显表现滑膜组织增生，衬覆多层滑膜细胞，炎细胞浸润，毛细血管增生，出现骨和软骨破坏，膜内成骨。κ-C(9mg/kg)组和TNFR-Fc组病变较轻；CT001(9mg/kg)组尤为轻。（如图5-1至5-4所示）

融合蛋白CT001、κ-C，以及rhTNFα拮抗剂益赛普都能明显改善小鼠关节炎指数；减轻关节腔及周围急性炎性细胞侵润反应，减轻关节腔内及周围纤维、毛细血管及滑膜组织增生反应，减少关节软骨面破坏程度和骨侵蚀、膜内及软骨骨化反应，以融合蛋白CT001的作用尤为突出。

2）融合蛋白对各CIA试验组小鼠脾脏病理和脾脏淋巴细胞的影响：

各试验动物组脾脏CD20免疫组化结果显示(如图6-1和图6-2所示)，CIA模型组（Vehicle），TNFR-Fc组和κ-C（1、3、9mg/kg）组脾脏B淋巴细胞CD20增多；而在CT001(1、3、9mg/kg)组和IgG组的脾脏B淋巴细胞CD20却降低，尤其以CT0019mg/kg减低最为明显。

而流式细胞计数结果显示，CIA诱导的模型小鼠，脾脏总B淋巴细胞数明显增加。与CIA模型组比较，其它各试验组在试验结束时小鼠脾脏总B淋巴细胞均有降低，尤以CT001组的B淋巴细胞数受影响最为明显。CT001对B淋巴细胞数的影响随用药剂量增加而增强。在试验结束时，CT001高剂量组（9mg/kg）的B淋巴细胞总数降至正常水平。（如图8-1所示）

与正常组对照，CIA模型组和其它用药试验组动物脾脏总T细胞数都呈现降低趋势；CT001不同剂量组和κ-C不同剂量组动物，脾脏的CD4+和CD8+淋巴细胞数均较正常组和CIA模型组有所减少；在CT001动物组，CD45＋细胞数随用药剂量增加有明显下降趋势；各组动物的CD3＋细胞都比正常组动物的细胞数低，但组间动物的CD3+细胞没有明显区别（图8-2所示）。Th细胞在模型组、用药试验组和正常组动物组之间没有明显变化。但是，在融合蛋白κ-C组细胞毒性T细胞数明显低于其它各组。

3）融合蛋白对各CIA试验组小鼠血液中免疫球蛋白的影响：

动物IgG，IgAandIgM血中浓度检测结果：（如图7所示）

IgA：CIA模型组（Vehicle）较正常组对照

轻度升高，KC组（1、3和9mg/kg）、TNFR-Fc组和IgG对照组较正常组对照明显增高，特别是IgG组升高更为显著；而CT001组（1和9mg/kg）呈下降趋势。

IgM：与正常组对照比较，Vehicle组、KC各组均有升高，特别是KC9mg/kg组血中IgM显著升高；TNFR-Fc组无明显改变，人IgG组和CT001组（1、3、9mg/kg）均降低。

IgG：除了KC-9mg/kg组外，各实验组的IgG水平均较正常组对照

明显升高，特别是IgG对照组、TNFR-Fc组和CT001-1mg/kg组。KC-9mg/kg组有降低的趋势。

综上所述，本发明描述了融合蛋白结构功能域之间连接肽的长度对融合蛋白CT001分别与CD80和BlyS的离体结合实验亲合力的影响。在第一和第二结构功能域之间，加有十二个氨基酸连接肽的融合蛋白(Δ12)比加有五个氨基酸连接肽的融合蛋白(Δ5)与CD80的结合力更好。在第二结构功能域和第三结构功能域（Fc）之间，加有连接肽的融合蛋白比不加连接肽的融合蛋白(Ψ0)亲和力更佳。这可能是由于连接肽增加了结构功能域之间的空间，消除或减小了相邻结构功能域之间的空间物理阻碍作用。

本发明另一方面描述了融合蛋白CT001、CT002、CT001Ψ0、CT002Ψ0、TC001、TC002分别与CD80和BlyS的离体结合实验。本实验证明，融合蛋白质CT001与CD80和与BlyS的结合最好。双重结合动力学分析（Forte Bio）表明，融合蛋白质CT001和融合蛋白质CT002分别与其第一配体/因子结合后，能增加融合蛋白质与其第二配体/因子的结合力（表2）。

进一步，本发明还描述了融合蛋白CT001在小鼠体内的初步药代动力学和急性毒理试验。实验结果表明CT001在小鼠体内的血液半衰期在54小时左右；急性毒理试验未见小鼠明显不良反应。

同时，本发明还描述了融合蛋白CT001、融合蛋白κ-C和TNFR-Fc在治疗由II型胶原蛋白诱导的小鼠关节炎模型上的预防治疗效果。实验结果证明，融合蛋白CT001、κ-C和TNFR-Fc都能明显改善小鼠关节炎指数和小鼠关节病理指数，改善脾脏病理。本发明提供的融合蛋白CT001在减轻动物关节炎模型的临床指标，改善关节、骨组织和脾脏的病理改变，明显优于现有技术的κ-C融合蛋白（Abatacept）和益赛普。融合蛋白CT001的这些作用，是由于它能同时结合CD80或CD86和结合BlyS或APRIL的机制。此外，本发明描述了融合蛋白质CT001的制备工艺及蛋白质稳定性的初步测试，在制备工艺及其稳定性方面明显优于现有技术的κ-T融合蛋白质（Atacicept）。

从以上几个方面证明了本发明的融合蛋白CT001在制备治疗由T淋巴细胞介入和BlyS异常增多所致的自身免疫性疾病的临床应用前景。可见，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (11)

1.一种双靶标嵌合蛋白，所述双靶标嵌合蛋白包括三个结构功能区域，第一结构功能区域是CTLA-4的部分细胞外区域，第二结构功能区域是TACI的部分细胞外区域，第三结构功能区域是免疫球蛋白IgG的Fc片段。

2.如权利要求1所述的一种双靶标嵌合蛋白，其特征在于，所述双靶标嵌合蛋白从N端到C端依次为第一、二和三结构功能区域，所述第一结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述第二结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.30或31所示，所述第三结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示。

3.如权利要求2所述的一种双靶标嵌合蛋白，其特征在于，所述第一结构功能区域和第二结构功能区域之间还包括第一连接肽，所述第二结构功能区域和第三结构功能区域之间还包括第二连接肽。

4.如权利要求3所述的一种双靶标嵌合蛋白，其特征在于，所述连接肽的长度为5-15个氨基酸序列。

5.如权利要求4所述的一种双靶标嵌合蛋白，其特征在于，所述双靶标嵌合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO.14、16、18、20、22、24、26或28。

6.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码如权利要求1-5任一权利要求所述的双靶标嵌合蛋白。

7.一种含有权利要求6所述的多核苷酸的序列的表达载体。

8.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体、或者染色体中整合有权利要求6所述的多核苷酸。

9.如权利要求1-5任一权利要求所述的双靶标嵌合蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建含有能表达所述双靶标嵌合蛋白的核苷酸序列，将此核苷酸序列构建至表达载体中，然后将含有融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，即得所述双靶标嵌合蛋白。

10.一种药物组合物，含有如权利要求1-5中任一权利要求所述的双靶标嵌合蛋白及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。

11.权利要求1-5中任一权利要求所述的双靶标嵌合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病的药物或制剂中的应用。

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