CN103230414A

CN103230414A - 用于治疗和控制血管生成介导的疾病的材料和方法

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Publication number: CN103230414A
Application number: CN2013101094092A
Authority: CN
Inventors: 海伦·玛丽·纽金特; 埃拉扎尔·R·埃德尔曼; 罗伯特·M·特金·萨姆·斯金; 伍燕山
Original assignee: Pervasis Therapeutics Inc
Current assignee: Pervasis Therapeutics Inc
Priority date: 2006-11-07
Filing date: 2007-11-07
Publication date: 2013-08-07
Also published as: CN101583367A; JP2010509228A; CN101583367B; CA2668621A1; US20100092532A1; SG176460A1; WO2008057580A3; AU2007317789A1; JP2013048953A; AU2011202132A1; AU2007317789B2; WO2008057580A2; IL198535A0; EP2079478A2; AU2011202132B2; JP5372764B2

Abstract

在此公开的是适合于治疗病理性血管生成和异常新血管形成的位点的材料和方法。病理性血管生成或异常新血管形成的位点可以通过用可植入材料接触病理性血管生成或异常新血管形成的区域之处或邻近或附近的表面来治疗。可植入材料包含生物相容性基质和细胞，并且其用量是治疗所述受影响位点的有效量。所述组合物可以是柔性平面材料或可流动组合物。本发明能够治疗的疾病包括，例如，黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、全身性炎症性疾病，以及通过外科切除术、放射治疗或化学治疗的肿瘤治疗。

Description

用于治疗和控制血管生成介导的疾病的材料和方法

本申请是申请日为2007年11月7日、申请号为200780049307.9（对应国际申请号为PCT/US2007/023535）、发明名称为“用于治疗和控制血管生成介导的疾病的材料和方法”的发明专利申请的分案申请。

相关的申请数据

这个非临时专利申请基于35 U.S.C.Section 119（e）要求了以下专利申请的权益：2006年11月7日提及的临时专利申请U.S.S.N.60/857,458；2006年12月19日提交的临时专利申请U.S.S.N.60/875,626；2007年4月17日提交的临时专利申请U.S.S.N.60/923,836以及2007年8月30日提交的临时专利申请U.S.S.N.60/967,029；每一个前述申请的全部内容通过引用合并在此。

背景技术

血管生成是从现有的血管系统生长新的血管的过程，在由外伤和外科手术引起的天然痊愈过程中涉及血管生成，外科手术包括实体肿瘤性癌的切除术。不同于病理性的血管生成的异常新血管形成在多种急性和慢性疾病状态的发生和存续中涉及，包括黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎和其他关节炎性状况以及全身的炎症性疾病，如下文所描述的。

举例来说，年龄相关的黄斑变性的渗出性或新血管形成、角膜新血管形成和眼睛的其他新血管疾病，例如增殖性糖尿病性视网膜病、早熟性视网膜病、Steven’s-Johnson综合征、瘢痕性类天疱疮、角膜同种异体移植物排斥和源自感染或外伤的角膜损伤，特征在于响应于低氧环境和不受调节的炎症的新血管、不适当地调节的和渗漏的血管的异常生长。不治疗的话，这些疾病是所有年龄的人群中失明的主要原因。例如，在年龄相关的黄斑变性中，异常新血管形成产生了视网膜下出血、中心凹内光受体之下的液体积累以及外视网膜中神经细胞死亡。如果未治疗，异常的新血管过程通常引起中心凹下瘢痕形成和失明。

滑液的新血管形成被认为是类风湿性关节炎的发病和存续中重要的早期步骤。异常新血管形成对于炎症性血管翳的发生是必需的，没有它，白细胞进入就不会发生。此外，新血管的形成允许对增生的炎性细胞团供应营养物和氧，因此促进了滑膜炎的存续。

类风湿性关节炎通常被认为是慢性的、炎症性的自体免疫失调，其引起免疫系统攻击关节。这是一种令人丧失能力的且痛苦的炎症状况，其可以由于疼痛和关节破坏引起明显损失活动能力。类风湿性关节炎是全身性疾病，常常影响整个身体的关节外的组织，包括皮肤、血管、心脏、肺和肌肉。在疾病的发作后十年，约60%的类风湿性关节炎患者不能工作。

新血管形成看起来是银屑病和银屑病性关节炎中第一位的事件。已经观察到没有指甲疾病的银屑病患者的甲廓的血管形态学的异常，以及银屑病性关节炎关节组织中滑膜血管数量的增加。银屑病性关节炎或关节病性银屑病，是一种炎症性的关节炎。虽然银屑病和银屑病性关节炎是相关的失调，银屑病性关节炎是具有它自己的流行病学特征、临床特征和成因特征的不同的状况。它影响了患有慢性皮肤状况银屑病的约5-7%的人。除了引起关节炎症之外，银屑病性关节炎可能引起腱炎和指炎。此外，患有银屑病性关节炎的超过80%的患者将有银屑病性指甲病变，特征在于指甲的凹陷，或者更极端地，指甲本身的失去。银屑病性关节炎可以在任何年龄发生。然而，平均起来它倾向于在银屑病的首次病征之后约10年出现。对于大部分患者，这是在30和50岁之间，但它也可以影响儿童。银屑病性关节炎的当前的治疗类似于类风湿性关节炎的治疗。

重要的血管生成相关疾病是癌症。癌症是美国第二的主要死亡原因，占据了所有死亡的超过五分之一。虽然已知多种方法来治疗癌症，包括实体肿瘤的外科切除，以及放射、消融和化学治疗来杀死癌细胞，在切除的或治疗的位点的癌细胞的局部复发和局部损害或疾病，在癌症患者的治疗中仍然是很大的挑战。外科的切除术代表了治疗没有显示转移到身体其他位置的迹象的局部疾病的最大的可能性。不幸的是，外科切除术治疗的多达40%的癌症患者将发生疾病的复发。

对于血管生成相关状况和疾病以及新血管形成相关状况和疾病的当前的治疗是有限的。治疗选择随着年龄、健康状态和状况的严重度而变化。本发明的一个目的是提供用于异常新血管形成和病理性血管生成的位点的治疗的方法和材料，目的是受影响或受治疗位点的局部的定向痊愈。

发明内容

本发明利用了以下发现，即，当向异常新血管形成的位点或病理性血管生成的位点局部地提供包含细胞和生物相容性基质的可植入材料时，可以阻止、降低或抑制异常或病理性血管形成、炎症、细胞外基质降解和/或所述位点处的MMP表达和/或活化，来治疗受影响或受治疗的组织或基质，和/或来阻止在受影响或受治疗位点处病理性血管系统或其他组织的生长或再生。如在此公开的，包含细胞，优选内皮细胞、具有内皮样表型的细胞、上皮细胞、具有上皮样表型的细胞、非内皮细胞或其类似物的可植入材料可以在被置于受影响或受治疗结构的表面或之内时用于阻止、治愈、治疗和控制异常新血管形成或病理性血管生成的位点。这个发现允许临床医师干涉患病组织的治疗，对于所述患病组织迄今为止仅有有限的治疗选择。

本发明的一个方面是在有需要的个体中治疗病理性血管生成的位点的方法，所述方法包括使可植入材料与血管生成区域之处的或邻近或附近的表面接触，其中所述可植入材料包含生物相容性基质和细胞，以及进一步的，其中所述可植入材料的量是在所述个体中治疗所述病理性血管生成的位点的有效量。

根据其他的实施方式，所述生物相容性基质是柔性的平面材料或可流动组合物。所述细胞可以是内皮细胞、内皮样细胞、上皮细胞、上皮样细胞或非内皮细胞。

根据各种实施方式，所述可植入材料调节所述病理性血管生成的位点之处的细胞外基质降解，或者调节所述病理性血管生成的位点之处的MMP的表达和/或活化。根据一个实施方式，所述病理性血管生成的位点是肿瘤切除术的位点。

在另一个方面，本发明是适合于异常新血管形成的位点的治疗或控制的组合物，所述组合物包含生物相容性基质和细胞，其中所述组合物的量是治疗或控制所述异常新血管形成的位点的有效量。

根据其他的实施方式，所述生物相容性基质是柔性的平面材料或可流动组合物。所述可流动组合物可以进一步包括附着的肽，细胞能够移接到所述附着肽上。所述细胞可以是内皮细胞、内皮样细胞、上皮细胞、上皮样细胞或非内皮细胞。

根据各种实施方式，所述组合物调节所述病理性血管生成的位点之处的细胞外基质降解，或者调节所述病理性血管生成的位点之处的MMP的表达和/或活化。

本发明的另一个方面是在有需要的个体中治疗异常新血管形成的位点的方法，所述方法包括使可植入材料与异常新血管形成之处的或邻近或附近的表面接触，其中所述可植入材料包含生物相容性基质和细胞，以及进一步的，其中所述可植入材料的量是在所述个体中治疗所述异常新血管形成的位点的有效量。

根据各种实施方式，所述可植入材料调节所述异常新血管形成的位点之处的细胞外基质降解，或者调节所述异常新血管形成的位点之处的MMP的表达。

根据各种实施方式，所述异常新血管形成的位点是黄斑变性的位点、类风湿性关节炎的位点、银屑病的位点、银屑病性关节炎的位点、或其他全身性炎性疾病的位点。

根据各种实施方式，所述组合物调节所述异常新血管形成的位点之处的细胞外基质降解，或者调节所述异常新血管形成的位点之处的MMP的表达和/或活化。

附图说明

附图1A和1B是根据本发明的示例性实施方式的代表性细胞生长曲线。

附图2A描绘了在有和没有用本发明的可植入材料治疗的Matrigel基质中通过HUVEC的体外血管生成的照片。

附图2B是在施用条件培养基或可植入材料之后在Matrigel基质中HUVEC的血管生成水平或血管密度的图形表示。

附图3是在第3天和在1个月用可植入材料治疗的受试者和施用对照材料的受试者的染色组织切片中MMP-2表达的图形表示。

附图4是在第3天和在1个月用可植入材料治疗的受试者和施用对照材料的受试者的染色组织切片中MMP-9表达的图形表示。

具体实施方式

如在此说明的，本发明基于以下发现，即，基于细胞的疗法可以用于治疗、治愈、改善、控制和/或降低在包括肿瘤切除的位点的状况下病理性血管生成的影响。基于细胞的疗法还可以用于治疗、治愈、改善、控制和/或降低在包括黄斑变性、类风湿性关节炎、银屑病和银屑病性关节炎以及其他关节炎、以及全身性炎症状况的状况中在受影响位点处和周围组织和间质上的异常新血管形成的影响。

如在此使用的，术语血管生成是指在正常的痊愈过程中发生的、在损伤或疾病的位点处形成或生长新血管的过程。如在此使用的，术语病理性血管生成是指在损伤或疾病的位点处形成异常和/或不需要的血管的过程。因此，优选地在疾病发作、外科操作或介入之前或之时，或作为中断性介入施用所述可植入材料来阻止和/或治疗病理性血管生成。

如在此使用的，术语异常新血管形成是指在某些急性和慢性疾病和失调的发作时发生的、病理性的或异常的血管出现和生长的结果。这与病理性血管生成不同。本发明对于减少或阻止血管的异常向内生长的持久建立是有用的。期待的是本发明的组合物产生局部化的环境，所述环境不支持异常密度的血管。例如，虽然血管可以生长到特定位点中，但是本发明限制或调节最后永久地存在于特定位点处的那些血管。因此，优选地在疾病或失调的发生或发作、外科操作或介入之后施用可植入材料来治疗异常新血管形成。然而，本发明可以作为中断性介入有效地使用，和/或用于防止状况恶化。

以下呈现的教导提供了制造和使用本发明的材料和方法的足够指导，进一步提供了鉴定用于测试、测量和控制本发明的材料和方法的性能的指标和受试者的足够指导。

黄斑变性

异常新血管形成在许多眼睛疾病，包括年龄相关的黄斑变性、增殖性糖尿病性视网膜病和早熟性视网膜病中发生。不治疗的话，这些疾病是婴儿（早熟性视网膜病）、工作年龄的成年人（增殖性糖尿病性视网膜病）和老年人（年龄相关的黄斑变性）中失明的主要原因。新血管形成，特别是伴随着眼睛的不同疾病的那些，常常响应于低氧环境而被诱导。然而，这些疾病中的异常的新血管被不适当地调节并且是渗漏的，因而异常的新血管促进了疾病的基础性病理而不是纠正或补偿疾病过程。

在渗出性的或“湿的”形式的年龄相关黄斑变性中，异常新血管产生了视网膜下出血，中心凹内光受体下液体积累以及外视网膜中神经细胞死亡。如果未治疗，异常的新血管过程通常导致中心凹下瘢痕形成。在患有早熟性视网膜病的早产儿中，视网膜血管系统是不良发育的，异常的渗漏的新血管生长到视网膜的无血管的区域中。在严重的和未治疗的病例中，异常新血管生长到玻璃体，引起视网膜剥离和失明。在糖尿病中，过多葡萄糖对视网膜组织的直接效应和可能涉及缺血和缺氧的对视网膜组织的间接效应，被认为是诱导异常新血管形成的原因。因而，对于这些眼睛病理的每一种，合理的治疗策略是利用本发明的可植入材料调节病理性血管生成和异常新血管的形成。

本发明的可植入材料可以施用给眼睛和/或周围组织和间质，来治疗、改善、控制和/或降低与以下疾病相关的临床后遗症，并且可以控制或降低所述位点处的异常新血管形成：与年龄相关的黄斑变性、增殖性糖尿病性视网膜病、早熟性视网膜病、角膜新血管形成，包括Steven’s-Johnson综合征、瘢痕性类天疱疮、角膜同种异体移植物排斥和源自感染或外伤的角膜损伤。

类风湿性关节炎

类风湿性关节炎是特征在于炎症性的侵蚀性滑膜炎的慢性的全身疾病。滑膜中的早期变化的标志为异常新血管形成、炎性细胞浸润和相关的滑膜细胞增生，其产生了炎症性血管组织的血管翳。这种血管翳覆盖并腐蚀关节软骨，最终引起关节破坏。异常新血管形成被认为是类风湿性关节炎中血管翳发生的基础性部分，证据是病灶的内皮增殖和滑膜中的细胞凋亡。本发明的可植入材料可以施用到类风湿性关节炎和/或周围组织和基质的位点来治疗、改善、控制和/或降低与类风湿性关节炎相关的临床后遗症，并抑制或降低所述位点处的异常新血管形成。

银屑病和银屑病性关节炎

银屑病性关节炎或关节病性银屑病，是一种炎症性的关节炎。虽然银屑病和银屑病性关节炎是特征为新血管形成的相关的失调，银屑病性关节炎是具有它自己的流行病学特征、临床特征和成因特征的不同的状况。它影响了患有慢性皮肤状况银屑病的约5-7%的人。除了引起关节炎症之外，银屑病性关节炎可能引起腱炎和指炎。此外，患有银屑病性关节炎的超过80%的患者将有银屑病性指甲病变，特征在于指甲的凹陷，或者更极端地，指甲本身的失去。已经观察到没有指甲疾病的银屑病患者的甲廓的血管形态学的异常，以及银屑病性关节炎关节组织中滑膜血管数量的增加。

本发明的可植入材料可以施用到银屑病或银屑病性关节炎和/或周围组织和间质的位点来治疗、改善、控制和/或降低与银屑病和银屑病性关节炎相关的临床后遗症，并抑制或降低所述位点处的异常新血管形成。

全身性炎症状况

除了类风湿性关节炎、银屑病和银屑病性关节炎之外，全身的炎症性或自体免疫状况还包括，例如，全身性硬化（硬皮症）、全身性红斑狼疮、多肌炎/皮肌炎、

综合征、混合结缔组织病和全身性血管炎。在这些全身性炎症性疾病中，白细胞通过血管系统迁移到疾病组织中。这些炎症性疾病中存在的提高的异常新血管形成进一步维持了白细胞进入组织的外渗，这进一步发展了所述炎性疾病。

病理性血管生成以及特征在于异常新血管形成的疾病，包括全身的炎症性或自体免疫状况的疾病的后果，取决于新血管中介体和抑制物之间的平衡或不平衡。例如，在类风湿性关节炎中，存在着超过新血管抑制物的过量的新血管刺激物。为了重设这种平衡，异常新血管形成需要被抑制，例如，通过施用本发明的可植入材料。本发明的可植入材料可以施用到异常新血管形成和/或周围组织和间质的位点来治疗、改善、控制和/或降低与病理性血管生成、全身的炎症性或自体免疫疾病相关的临床后遗症，并抑制或降低所述位点处或附近的异常新血管形成。

肿瘤切除术

肿瘤切除术是从患者中外科去除实体肿瘤。取决于肿瘤的大小和它的位置，根据各种实施方式，肿瘤切除术可以在开放视野的外科操作中，或在最低限度侵入性的外科操作，例如腹腔镜外科操作中进行。根据其他的实施方式，肿瘤治疗过程包括放射治疗、加热或光消融疗法，或化学治疗来杀死肿瘤细胞。对于本发明来说，期待的是切除位点包括经历用于治疗或去除肿瘤或肿瘤细胞的局部疗法的任何和所有位点。因而，切除位点包括但不限于经历外科切除、放射治疗、消融疗法和/或化学治疗的位点。

对于外科切除术来说，在肿瘤的切除之后，先前围绕肿瘤的组织产生了口袋或切除位点。对于放射、消融或化学治疗来说，肿瘤细胞可以短暂地保留在切除位点。然而，放射、消融和化学治疗除了杀伤局部的肿瘤细胞之外，还损伤周围的组织和间质。因此，切除位点倾向于多种临床的后遗症，包括但不限于，炎症、细胞外基质降解、病理性血管生成，以及在某些肿瘤类型中，在切除的边缘的肿瘤细胞再生和/或肿瘤细胞的转移。

进一步的，肿瘤，以及切除位点，常常是高度血管化的。切除位点的外伤可以引起病理性血管生成、细胞外基质降解和其他与切除位点的破坏相关的临床后遗症。本发明的可植入材料可以施用到切除位点和/或周围组织和间质来治疗、改善、控制和/或降低与肿瘤切除位点的外伤相关的临床后遗症，并抑制或降低所述位点处的病理性血管生成。切除位点处的病理性血管生成是肿瘤细胞的再生和/或转移所必需的。因此，病理性血管生成的抑制将会抑制和/或限制肿瘤再生或转移。

另外，肿瘤小环境，包括间质，是控制肿瘤的再生和转移的重要因素。间质包含多种细胞，包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、胶质细胞、上皮细胞、免疫细胞（包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞和淋巴细胞），血管内皮细胞和平滑肌细胞，以及细胞外基质和细胞外分子。通常，由于它们接近肿瘤细胞和/或它们相互间的作用，在与肿瘤细胞接触期间或之后，间质的细胞获得了异常的表型或改变了功能。本发明的可植入材料可以施用给肿瘤间质和/或周围组织来治疗、改善、控制和/或降低与间质的破坏和/或异常表型相关的临床后遗症。

在外科或临床治疗的位点处或附近放置本发明的可植入材料，在降低与所述介入相关的轻度和急性炎症方面以及降低、延迟或抑制与病理性血管生成状况相关的炎症方面是有效的。此外，可植入材料还降低受影响或受治疗结构的MMP表达和/或活化、细胞外基质降解和病理性血管生成。

基质金属蛋白酶（MMP）是降解细胞外基质蛋白质受损之后细胞从周围组织迁移到损伤位点内所必需的。活化的肌成纤维细胞具有基质降解活性，其受到MMP和它们的内源抑制物，基质金属蛋白酶的组织抑制物（TIMP）之间的净平衡的调节。TIMP能够结合活化的MMP和它们的无活性的前体前-MMP（pro-MMP）。参见Nagase，H.，et al.″Matrix Metalloproteinases″J Biol Chem 274（31）:21491-21494（1999）。MMP的增量调节和TIMP的减量调节与组织损伤之后消极的组织重塑（tissue remodeling）相合。例如，MMP的外膜表达在AV移植模型中在血管损伤之后提高，并且促进成纤维细胞向新生内膜的迁移。参见Whatling，C.et al.，″Matrix Management:AssigningDifferent Roles for MMP-2 and MMP-9 in Vascular Remodeling″Arterioscler. Thromb.Vase.Biol.24:10-11（2004）以及Galis，Z.S.et al.，″MatrixMetalloproteinases in Vascular Remodeling and Atherogenesis:The Good，theBad，and the Ugly″Circ.Res.90:251-262（2002）。

本发明的可植入材料可以施用给受影响或受治疗的位点、间质和/或周围组织，来抑制MMP和/或恢复MMP和它们的抑制物TIMP的蛋白水解平衡，来抑制所述受影响或受治疗位点处的异常血管生长和/或再生。异常血管生长的抑制减少了初生肿瘤或癌症干细胞可获得的营养物供应，阻止了肿瘤的生长、任何剩余的肿瘤细胞的转移和/或癌症干细胞的成熟、分化和/或增殖。与施用对照材料相比，本发明的含有细胞的可植入材料的施用降低了受影响和被治疗结构中的MMP表达和病理性血管生成。

病理性血管生成是支持肿瘤切除术之后不注意地保留的肿瘤细胞的生长所必需的。本发明的可植入材料可以施用到切除位点、间质和/或周围组织来抑制所述切除位点处的病理性血管生成，从而抑制营养物向初生肿瘤或癌症干细胞的供应，并阻止肿瘤的生长、任何剩余肿瘤细胞的转移、以及癌症干细胞的成熟、分化和/或增殖。

汇合的（confluent）内皮细胞释放多种生物制剂，其组合地调节MMP表达、血管生成和新血管形成。被播种并容许在生物相容性基质材料内培养增殖到汇合的内皮细胞可以被植入需要治疗的受试者中，产生内皮抑制性化合物的全部物质。含有汇合的内皮细胞的本发明的可植入材料可以将多种生物学反应靶向到损伤。相比之下，单一化学试剂的施用仅响应于单一事件。可植入材料内的内皮细胞分泌硫酸乙酰肝素蛋白多糖、TGF-β和TIMP-2，而实际上所有的TIMP与MMP形成紧密的1:1抑制性复合物，同样已知它们本身抑制血管生成。可植入基质内的内皮细胞还分泌氧化氮（NO）。其他研究已经表明，在eNOS转染的大鼠平滑肌细胞中，NO也降低MMP活性并提高TIMP分泌。降低的MMP活性和提高的TIMP分泌与血管生成的抑制相关。内皮细胞能够递送所有的内皮衍生的化合物，包括硫酸乙酰肝素、TGF-β、TIMP-2和NO，一起来降低MMP表达和/或活化、细胞外基质降解、血管生成和新血管形成，并随后治疗、治愈和/或控制病理性血管生成或异常新血管形成的位点。

因此，已经开发了基于细胞的疗法，用于临床上控制受到病理性血管生成、异常新血管形成影响的位点，以及状况和/或治疗方法来消除或降低所述状况，包括控制炎症、MMP表达和/或活化以及细胞外基质降解。本发明的示范性的实施方式包含适用于在此描述的治疗范例的生物相容性基质和细胞。

如在此使用的，术语“抑制”当应用于MMP活性时，意图是定义在MMP酶的生物学活性水平方面的改变。因而，调节涵盖了使得MMP活性降低的生理改变。抑制可以直接地或间接地出现，可以通过任何机制、在任何生理学水平被介导，包括例如，在基因表达的水平（包括，例如转录、翻译和/或翻译后修饰）、在编码调节元件的基因的表达的水平，所述调节元件直接或间接地作用于MMP活性的水平，或在酶活性的水平（例如，通过变构机理、竞争性抑制、活性位点失活、反馈抑制途径的干扰，等等）。因而，MMP抑制可以意味着在转录水平上编码一种或多种MMP的基因的受抑制的表达或低表达，和/或在翻译水平上降低的表达。因而术语“抑制”和“抑制的”相对于MMP活性来解释。

如在此使用的，术语“介导”在任何生理过程（例如，组织重塑）、疾病、状态、状况、疗法或治疗的上下文中与MMP或TIMP相关地使用时，是指有限度地运作，从而所述各种过程、疾病、状态、状况、疗法或治疗是其中MMP或TIMP起到生物学作用的那一些。MMP或TIMP起到的生物学作用可以是直接的或间接的，可以是疾病、状态或状况的症状（或它的病因或发展）的显现所必需的和/或足够的。

本发明的可植入材料包含在生物相容性基质之上、之中和/或之内移植的细胞。移接是指经由细胞与细胞和/或细胞与基质相互作用牢固地连接，从而细胞经得起在此公开的准备性操作的苛刻条件。如在此其他地方说明的，可植入材料的操作性实施方式包括具有优选表型的近汇合、汇合或后汇合的细胞群体。要理解的是，可植入材料的实施方式可能在准备性操作期间脱落细胞，和/或某些细胞不是与其他细胞一样牢固地连接的。全部需要的是，可植入材料包含满足在此阐述的功能或表型指标的细胞。

本发明的可植入材料是在组织工程化的原则上发展的，代表了解决上述临床需求的新方法。本发明的可植入材料的独特之处在于在所述生物相容性基质之上、之中和/或之内移接的活细胞能够在生理学反馈控制之下以生理学比例供给受影响位点多种基于细胞的产物。如在此的其它地方描述的，适用于可植入材料的细胞是内皮的、内皮样的、上皮的、上皮样的、非内皮的细胞，或任何上述细胞类型的功能性类似物。通过这些细胞的多种化合物的局部递送以及生理上动态的给药，提供了对一些过程的更有效的调节，所述过程对于维持和治愈受影响位点、降低向所述位点的血管供应，从而降低病理性细胞的再生、病理性血管生成或病理征候的再现负责。本发明的可植入材料当与受影响位点、间质或周围组织接触时，用来重建稳态。也就是说，本发明的可植入材料可以提供一种环境，其模拟了支持性的生理机能，并有助于促进和维持理想的血管密度水平。

对于本发明来说，接触是指直接或间接地与在此其他地方定义的内表面或外表面相互作用。对于某些优选的实施方式来说，实际的物理接触不是有效性所需的。在其他实施方式中，实际的物理接触是优选的。实践本发明唯一所需的是，以有效治疗受影响位点或基质的数量，在受影响或受治疗的位点或间质之处、邻近或附近沉积可植入材料。

例如，内皮细胞可以释放各种试剂，其组合地可以抑制或减缓病理性血管生成、异常新血管形成以及与外科手术或病理性血管生成和异常新血管形成的其他治疗之后的急性并发症相关的有害生理学事件。如在此例示的，重现正常的生理机能和给药的所使用的组合物和方法，对于增强受影响或受治疗的结构的稳定性是有用的。一般地，治疗包括将本发明的可植入材料置于受影响或受治疗位点之处、邻近或附近，例如，眼睛内、关节炎的关节内、银屑病病变的表面上、或在切除操作期间产生的切除位点的内部空间内与间质接触。当沉积或者以其他方式与受影响或受治疗位点接触时，可植入材料的细胞可以向所述位点提供生长调节化合物，例如，向位点内的基础性基质细胞提供。期待的是，当置于邻近的位点时，可植入材料的细胞提供了多种调节化合物的持续供应，其可以穿透周围组织并到达所述位点。

使用本发明的优选实施方式治疗能够促进正常的或近正常的痊愈和正常的生理机能。相反地，在没有本发明的优选的实施方式的治疗时，正常的生理学的痊愈是受损害的，例如，MMP的表达和活化的提高可以引起有害的临床结果，例如，炎症、病理性血管生成、异常新血管形成、肿瘤再生和/或转移。因而，如在此预期的，使用本发明的可植入材料治疗将改善治疗位点处天然组织的痊愈。

根据一个实施方式，所述可植入材料被施加于眼睛附近的外表面上或眼睛内部的玻璃体内来支持和促进受影响位点处角膜斑翳的痊愈。黄斑变性和治疗黄斑变性的外科手术可以破坏角膜斑翳和眼睛之处或周围的细胞和组织，并诱导细胞的反应，包括但不限于，炎症、异常新血管形成和/或由黄斑变性和治疗黄斑变性的外科手术引起的其他临床后遗症。在治疗之时向黄斑变性位点、间质或周围组织施用可植入材料可以降低临床后遗症的发生率和促进受治疗位点的痊愈。

根据另一个实施方式，所述可植入材料被施加于关节炎关节的内部腔体或该关节附近的外表面，来支持和促进受影响位点处附着到骨骼的受影响的韧带、肌腱或包膜的痊愈。类风湿性和银屑病性关节炎和/或治疗关节炎结构的介入可能破坏围绕关节炎位点的细胞和组织，并诱导细胞反应，包括但不限于，炎症、异常新血管形成、细胞外基质降解和/或由关节炎或外科手术引起的其他临床后遗症。在治疗之时向关节炎位点、间质或周围组织施用可植入材料可以降低临床后遗症的发生率和促进受治疗位点的痊愈。

根据进一步的实施方式，所述可植入材料可以应用于银屑病病变的位点处或附近的皮肤表面来促进所述受影响位点处的受影响皮肤的痊愈。根据该实施方式，优选地在所述可植入材料上施加绷带或其他阻挡物来在治疗的过程期间维持材料的有效性。银屑病可以破坏银屑病病变之处或附近的表皮细胞和皮肤组织层，并可以诱导细胞反应，包括但不限于，炎症、异常新血管形成、细胞外基质降解和/或其他临床后遗症。在治疗之时向银屑病病变位点、间质或周围组织施用可植入材料可以降低临床后遗症的发生率和促进受治疗位点的痊愈。

根据另一个实施方式，在切除肿瘤之后将所述可植入材料施用给受影响或受治疗的位点来支撑所述切除空腔，并促进围绕切除位点以及在切除边缘处的组织的痊愈。切除肿瘤的外科手术能够破坏环绕肿瘤切除位点的细胞和组织，并诱导细胞反应，包括但不限于，炎症、病理性血管生成、细胞外基质降解和/或由外科切除术引起的其他临床后遗症。在切除术之时、在切除术之后立即地、或在切除术之后稍后的时间，向切除位点、基质或周围组织施用可植入材料可以降低临床后遗症的发生率并促进切除位点的痊愈。

根据一个实施方式，所述可植入材料可以促进和/或恢复血管组织的受控增殖和/或迁移。黄斑变性、类风湿性和银屑病性关节炎、银屑病以及肿瘤补充和/或促进受影响位点处的病理性血管生成或异常新血管形成来支持不受控制的细胞生长。因而，肿瘤位点和由此的切除位点是高度血管化的组织。血管化的肿瘤的切除必然地引起对支持所切下的肿瘤的血管系统的外伤和/或损害。血管的外伤包括但不限于，被破坏的血管结构的炎症、血栓形成、狭窄和/或纤维化。在接触或邻近于所述被破坏的血管结构的切除位点处施用可植入材料，可以降低与血管外伤相关的临床后遗症的发生率并抑制病理性血管生成。

根据本发明的进一步的实施方式，可以在去除肿瘤之前将所述可植入材料应用于切除位点来将正常的周围组织与肿瘤组织分离，和/或来阻止在外科的切除期间移去的肿瘤细胞的不经意污染引起的疾病向周围组织和间质或邻近器官的扩散。根据一个实施方式，在切除肿瘤之前施用所述可植入材料，例如，来准备用于切除操作的外科位点，和/或来保护周围组织免于切除术操作期间可能的肿瘤细胞移位。根据另一个实施方式，所述可植入材料可以在肿瘤的切除之后施用，例如，来减少来自切除的肿瘤附近的移位的肿瘤细胞的移动，和降低肿瘤细胞转移的可能性。

根据本发明的各种实施方式，所述可植入材料被施加于多种切除的肿瘤位点，包括但不限于，膀胱、骨骼、脑、乳腺、宫颈、结肠、食道、胆囊、肾脏、喉、肝脏、肺、口腔、卵巢、胰腺、前列腺、胃、睾丸或甲状腺的肿瘤。

对于本发明来说，相信的是，使用本发明的可植入材料的治疗提供了有益的自我平衡性环境，从而，当所述可植入材料被置于受影响或受治疗结构的邻近或附近时，无论是在介入之时或是在后来，在全身性炎症性和病理性血管生成性状况和相关的介入中常见的症状和并发症，例如，炎症、凝结和/或附属静脉的生长被降低。

可以在许多不同阶段的任何时候向被治疗的结构提供本发明的可植入材料。所述可植入材料可以在开始的外科手术介入期间或之后提供，来一般性地加快痊愈，以及将受治疗位点维持在临床上的稳定状态。期待的是，所述可植入材料可以不仅在开始治疗的时间使用，而且在随后的时点使用（例如，用于在外科操作之后维持受治疗的位点）。随后的施用可以手术地或非侵入性地实现。

本发明的材料和方法可以与任何上文描述的状况、或许多其他的治疗或控制介入一起使用。此外，本发明的材料和方法可以与需要手术的任何介入一起使用来改善外科成功率并促进痊愈。本发明的材料和方法可以与这些或其他手术一起使用来提高有效性并促进痊愈。

可植入材料

一般问题：本发明的可植入材料包含在生物相容性基质之上、之中和/或之内移植的细胞。移接是指经由细胞与细胞和/或细胞与基质相互作用牢固地连接，从而细胞经得起在此公开的准备性操作的苛刻条件。如在此其他地方说明的，可植入材料的操作性实施方式包括具有优选表型的近汇合、汇合或后汇合的细胞群体。要理解的是，可植入材料的实施方式可能在准备性操作期间脱落细胞，和/或某些细胞不是与其他细胞一样牢固地连接的。唯一需要的是，可植入材料包含满足在此阐述的功能或表型指标的细胞。

本发明的可植入材料是在组织工程化的原则上开发的，代表了解决上述临床需求的新方法。本发明的可植入材料的独特之处在于在所述生物相容性基质之上、之中和/或之内移接的活细胞能够在生理学反馈控制之下以生理学比例供给被切除位点多种基于细胞的产物。如在此的其它地方描述的，适用于可植入材料的细胞包括内皮的、内皮样的、上皮的、上皮样的、非内皮的细胞，或任何上述细胞类型的功能性类似物。在生理上动态的给药中这些细胞进行的多种化合物的局部递送，提供了对以下过程的更有效的调节，所述过程是减少与全身性炎症状况、病理性血管生成相关的症状、以及维持功能上切除的结构、以及减少与切除相关的临床后遗症的原因。

在此期待的是，表面可以是眼睛、关节、皮肤或切除的结构的外表面，眼睛、关节、皮肤或切除的结构的内表面，切除边缘之处，或围绕这样的结构的组织之内。对于本发明来说，表面是受影响或受治疗的结构之处或附近的任何部分。

本发明的可植入材料当沉积或以其他方式与受影响或受治疗位点或周围组织接触时，用来重建稳态。也就是说，本发明的可植入材料可以提供一种环境，其模拟了支持性的生理机能并有助于处理或控制治疗的位点。

对于本发明来说，接触是指直接或间接地与在此其他地方定义的受影响结构的外表面或内表面相互作用。对于某些优选的实施方式来说，实际的物理接触不是有效性所需的。在其他实施方式中，实际的物理接触是优选的。实践本发明唯一所需的是，以有效治疗所述位点的数量，在受影响位点之处、邻近或附近实现可植入材料的外部或内部沉积。

内皮细胞可以释放各种各样的试剂，这些试剂组合地可以抑制或缓解与急性和慢性的并发症相关的有害生理学事件，所述事件是由于例如全身性炎症状况、病理性血管生成状况、异常新血管形成状况或肿瘤切除术而导致的。如在此例示的，重现正常的生理机能和给药的组合物和使用方法，对于治疗和控制这些状况是有用的。一般地，治疗包括将本发明的可植入材料置于受影响位点之处、邻近或附近，例如，放置在早先被所切除的肿瘤占据的间隙中，或与间质直接接触。当沉积于受影响位点处或以其他方式与受影响位点接触时，可植入材料的细胞可以向所述受影响位点提供调节化合物。期待的是，当接触受影响位点时，包含具有移植细胞的生物相容性基质或颗粒的本发明的可植入材料提供了来自细胞的多种调节化合物的连续供应。

细胞来源：如在此描述的，本发明的可植入材料包括细胞。细胞可以是异源的、异种的或自体的。在某些实施方式中，活细胞的来源可以来自适合的供体。在某些其他实施方式中，细胞的来源可以来自尸体或来自细胞库。

在一个当前优选的实施方式中，所述细胞是内皮细胞。在特别优选的实施方式中，这种内皮细胞从血管组织获得，优选的但不限于动脉组织。如以下例示的，适合使用的一种血管内皮细胞是主动脉内皮细胞。适合使用的另一种血管内皮细胞是脐带静脉内皮细胞。以及，适合使用的另一种血管内皮细胞是冠状动脉内皮细胞。适合使用的又一种血管内皮细胞是隐静脉的静脉内皮细胞。适合本发明使用的其他种类的血管内皮细胞包括肺动脉内皮细胞和回肠动脉内皮细胞。

在另一种当前的优选实施方式中，适合的内皮细胞可以从非血管组织获得。非血管组织可以来自任何解剖结构、组织或器官。非血管组织可以来自进行治疗的任何组织类型。非血管的解剖结构包括肾脏系统、生殖系统、生殖泌尿系统、胃肠系统、肺系统、呼吸系统以及脑和脊髓的室系统的结构。

在又一个实施方式中，内皮细胞可以来自内皮祖细胞或干细胞。在又一个实施方式中，内皮细胞一般可以来自祖细胞或干细胞。在其他优选的实施方式中，细胞可以是同种异体的、异种的或自体的非内皮细胞，并且可以来自血管或非血管的组织或器官。细胞可以在它们的组织来源和/或它们的免疫原性的基础上来选择。示范性的非内皮细胞包括上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、干细胞、内皮祖细胞、心肌细胞、分泌和纤毛细胞。本发明还预期遗传改变的、修饰的或工程化的任何上述细胞。

在进一步的实施方式中，两种或多种细胞被共培养来制备当前的组合物。例如，第一细胞可以导入到生物相容的可植入材料中并培养直到汇合。第一细胞类型可以包括，例如，分泌细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、成纤维细胞、干细胞、内皮祖细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的组合、任何其他期望的细胞类型或适合于创建有助于内皮细胞生长环境的期望细胞类型的组合。一旦第一细胞类型达到汇合，第二细胞类型被播种到生物相容性基质之中、之上或之内的第一汇合细胞类型的顶部，并培养直到第一细胞类型和第二细胞类型达到汇合。第二细胞类型可以包括，例如，内皮细胞或任何其他期望的细胞类型或细胞类型的组合。预期的是，第一和第二细胞类型可以逐步地或作为单一混合物来引入。还预期的是，细胞密度可以被修改来改变平滑肌细胞与内皮细胞的比例。

为了防止平滑肌细胞或其他倾向于过度增殖的细胞类型的过度增殖，可以修改培养过程。例如，在第一细胞类型的汇合之后，可以在引入第二细胞类型之前用适合于第二细胞类型的附着因子包被培养物。示范性的附着因子包括用明胶包被培养物来改善内皮细胞的附着。根据另一个实施方式，肝素可以在培养第二细胞类型期间添加到培养基中来降低第一细胞类型的增殖并优化期望的第一细胞类型与第二细胞类型比例。例如，在平滑肌细胞的初步生长之后，可以施用肝素来控制平滑肌细胞生长以实现更大的内皮细胞与平滑肌细胞的比例。

在优选的实施方式中，通过首先用平滑肌细胞播种生物相容的可植入材料来产生结构，从而创建共培养物，所述结构例如是但不限于，模拟治疗位点的大小和/或形状的结构。一旦平滑肌细胞达到汇合，将内皮细胞播种到可植入材料上培养的平滑肌细胞顶部来创建模拟的结构。

唯一需要的是，当前组合物的细胞是展现了一种或多种优选的表型或功能性质的细胞。如在此较早描述的，本发明基于以下发现，当与优选的基质（在此其他地方描述）结合时，具有易于鉴定的表型的细胞可以促进、修复和/或以其他方式调节通常与受影响结构的治疗相关的细胞生理机能和/或细胞或组织稳态。

对于本发明来说，本发明的细胞的一种这样优选的、易于鉴定的典型表型是抑制或以其他方式干扰平滑肌细胞增殖和/或迁移的能力，如以下描述的体外分析所测定的。这在此称为抑制性表型。

由当前组合物的细胞展现的一种另外的易鉴定的表型是，它们是抗血栓性的或能够抑制血小板粘附和聚集。抗血栓活性可以使用如下所述的体外硫酸乙酰肝素分析和/或体外血小板凝聚分析来测定。

当前组合物的细胞所展现的另一种易鉴定的表型是，恢复蛋白水解平衡、MMP-TIMP平衡的能力，相对于TIMP的表达降低MMP的表达的能力，或相对于MMP的表达提高TIMP的表达的能力。蛋白水解平衡活性可以使用如下所述的体外TIMP分析和/或体外MMP分析来测定。

当前组合物的细胞所展现的另一种易鉴定的表型是抑制管形成的能力。管形成活性可以利用如下所述的体外Matrigel分析来测定。

在本发明的典型操作性实施方式中，细胞不必展现超过一种上述表型。在某些实施方式中，细胞可以展现超过一种上述表型。

虽然上述表型各自代表了功能性的内皮细胞，例如但不限于血管内皮细胞，但是展现了这种表型的非内皮细胞对于本发明来说被考虑为内皮样的，并因而适用于本发明。内皮样的细胞在此也称为内皮细胞的功能类似物；或内皮细胞的功能模拟物。因而，仅仅举例来说，适用于在此公开的材料和方法的细胞还包括产生内皮样细胞的干细胞或祖细胞；非内皮细胞来源的但使用在此列出的参数又功能上表现像内皮细胞的细胞；任何来源的、被工程化或以其他方式修饰以具有使用在此列出的参数的内皮样功能的细胞。

一般地，当以汇合、近汇合或后汇合群体存在并与例如在此其他地方描述的优选的生物相容性基质结合时，本发明的细胞展现一种或多种上述表型。本领域普通技术人员理解的是，细胞的汇合、近汇合或后汇合群体可以通过各种技术容易地鉴定，最常见和广泛承认的是直接显微镜检查。其他计数包括使用标准细胞计数技术评估每份表面积的细胞数量，例如但不限于血球计数器或库尔特粒度仪。

另外，对于本发明来说，内皮样细胞包括但不限于功能上和表型上模仿或模拟汇合的、近汇合的或后汇合内皮细胞的细胞，如在此所列的参数所测量的。

因而，使用以下阐述的详细说明和指导，本领域普通技术的医师将理解如何生产、使用、测试和鉴定在此公开的可植入材料的操作性实施方式。也就是说，在此提供的教导公开了生产和使用本发明的可植入材料所需的所有内容。进一步的，在此提供的教导公开了鉴定、生产和使用含有操作上等效的细胞的组合物所必需的所有内容。实际上，所有需要的是，含等效细胞的组合物对于根据在此公开的方法治疗、控制、调节和/或改善受影响位点是有效的。熟练医师将理解的是，当前组合物的等效实施方式可以仅使用常规实验和在此提供的教导来鉴定。

在某些优选的实施方式中，本发明的可植入材料中使用的内皮细胞从人类尸体供体的主动脉分离。每一批细胞来自单个供体或来自多个供体，广泛地测试内皮细胞纯度，生物学功能，细菌、真菌、已知的人类病原体和其他外来试剂的存在。细胞使用公知的技术低温保存并入库，用于稍后在培养中扩增用于随后配制在生物相容性可植入材料中。

细胞制备：如上所述，适合的细胞可以从各种组织类型和细胞类型获得。在某些优选的实施方式中，可植入材料中使用的人类主动脉内皮细胞分离自尸体供体的主动脉。在其他实施方式中，猪的主动脉内皮细胞通过用于分离人类主动脉内皮细胞的相似操作分离自正常的猪主动脉。每一批细胞可以来自单个供体或来自多个供体，广泛地测试内皮细胞生存力，纯度，生物学功能，支原体、细菌、真菌、酵母、已知的人类病原体和其他外来试剂的存在。细胞使用公知的技术进一步扩增、表征和低温保存，来形成处于第三到第六次传代的工作细胞库，用于稍后在培养中扩展，并用于随后配制到生物相容性可植入材料中。

人类或猪主动脉内皮细胞在通过添加每烧瓶约15ml内皮细胞生长培养基而预处理的T-75烧瓶中制备。人类主动脉内皮细胞在内皮生长培养基（EGM-2，Lonza，Basel，Switzerland）中制备。EGM-2由补充有含2%FBS的EGM-2单等分量的内皮细胞基础培养基（EBM-2，Lonza）构成。猪细胞在补充有5%FBS和50μg/ml庆大霉素的EBM-2中制备。烧瓶置于维持在大约37℃和5%CO₂/95%空气、90%湿度的孵化器中至少30分钟。细胞的一个或两个小瓶从-160℃移动到-140℃冷冻器，在大约37℃解冻。每个解冻细胞的小瓶以大约3×10³个细胞/cm²的密度、优选不低于1.0×10³和不超过7.0×10³的密度播种到两个T-75烧瓶中；将含有细胞的烧瓶放回孵化器中。在约8-24小时之后，除去消耗了的培养基，用新鲜培养基替换。此后，每两到三天改变培养基，直到细胞达到优选的约85-100%汇合，但不低于60%和不超过100%。当所述可植入材料预计用于临床应用时，在人类主动脉内皮细胞的解冻后培养中和本发明的可植入材料制造中仅使用无抗生素培养基。

然后除去内皮细胞生长培养基，用10ml HEPES缓冲盐水（HEPES）冲洗单细胞层。除去HEPES，添加2ml胰蛋白酶来从T-75烧瓶表面剥离细胞。一旦发生剥离，添加3mL胰蛋白酶中和溶液（TNS）来终止酶反应。添加另外5mL HEPES，使用血球计对细胞计数。离心细胞悬浮液，对于人类细胞来说，使用无抗生素的EGM-2调节到密度大约2.0-1.75×10⁶个细胞/ml，或对于猪细胞来说，使用补充有5%FBS和50μg/ml庆大霉素的EBM-2调节到密度大约2.0-1.50×10⁶个细胞/ml。

生物相容性基质：根据本发明，所述可植入材料包含生物相容性基质。所述基质对于细胞生长和附着到基质之上或之内是容许的。所述基质是柔性的和贴合的（conformable）。所述基质可以是固体、半固体或可流动的多孔组合物。对于本发明来说，可流动组合物是指能够利用注射或注射型递送装置，例如但不限于，针、注射器或导管而施用的组合物。采用挤压、喷出或排出的其他递送装置也是在此预期的。多孔基质是优选的。所述基质也可以是处于柔性平面形式。所述基质也可以是凝胶、泡沫、悬浮液、颗粒、微载体、微囊或纤维结构的形式。优选的可流动组合物是保持形状的。当前优选的基质具有颗粒形状。所述生物相容性基质可以包含颗粒和/或微载体，所述颗粒和/或微载体可以进一步包含明胶、胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白或附着肽。一种示范性的附着肽是序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸盐（RGD）的肽。

所述基质，当植入到受影响结构的外或内表面上时，在它生物侵蚀之前可以存留在植入位置至少约7-90天，优选的约至少7-14天，更优选约至少14-28天，最优选约至少28-90天。

一种优选的基质是Gelfoam

（Pfizer，Inc.，New York，NY），一种可吸收的明胶海绵（以下称“Gelfoam基质”）。另一种优选的基质是Surgifoam

（Johnson & Johnson，New Brunswick，NJ），其也是一种可吸收的明胶海绵。Gelfoam和Surgifoam基质是从特别处理的、纯化的猪皮明胶溶液制备的多孔的和柔性的外科用海绵。

根据另一个实施方式，所述生物相容性基质材料可以是修饰的基质材料。当细胞与基质相连时，可以选择对基质材料进行修饰，来优化和/或控制细胞的功能，包括如上所述的细胞的表型（例如，抑制性表型）。根据一个实施方式，对基质材料的修饰包括用增强细胞能力的附着因子或粘附肽来包被所述基质，以降低细胞外基质降解、减少病理性血管生成、减少异常新血管形成、提高TIMP产生、减少炎症、提高硫酸乙酰肝素产生、提高前列环素产生、和/或提高TGF-β₁和氧化氮（NO）产生。

根据另一个实施方式，所述基质是Gelfoam以外的基质。其他示范性的基质材料包括，例如，血纤蛋白凝胶、藻酸盐、聚苯乙烯磺酸钠微载体、胶原包被的葡聚糖微载体、PLA/PGA和pHEMA/MMA共聚物（每种共聚物的聚合物比例为1-100%）。根据一个实施方式，合成的基质材料，例如PLA/PGA用NaOH处理来提高材料的亲水性，从而，提高细胞附着到所述材料的能力。根据优选的实施方式，这些其他的基质被修饰以包括附着因子或粘附肽，如以上叙述和描述的。示范性的附着因子包括，例如，明胶、胶原蛋白、纤连蛋白、血纤蛋白凝胶、和利用标准的含水碳二亚胺化学作用（aqueous carbodiimide chemistry）共价连接的细胞粘附配体（包括例如RGD）。其他细胞粘附配体包括具有细胞粘附识别序列的肽，所述细胞粘附识别序列包括但不限于：RGDY、REDVY、GRGDF、GPDSGR、GRGDY和REDV。

可植入材料的实施方式：如前所述，本发明的可植入材料可以是柔性的平面形式或可流动组合物。当处于柔性的平面形式时，它可以采取多种形状和大小，优选的，当置于受影响或被切除位点之处、邻近或附近时，符合受影响结构或被切除结构的轮廓内表面或外表面的形状和大小。适合于照这样使用的优选的构型的实例在共同拥有的、在2005年12月6日提交的国际专利申请PCT/US05/43967（代理人编号No.ELV-002PC）中公开，其全部内容通过引用合并在此。

可流动组合物：在此预期的某些实施方式中，本发明的可植入材料是可流动组合物，其包含颗粒的生物相容性基质，所述基质可以处于凝胶、泡沫、悬浮液、颗粒、微载体、微囊、大孔的珠子或其他可流动材料的形式。本发明预期提供可以用注射型递送装置施用的任何可流动组合物。例如，可以在受影响或被切除结构的内部穿过的递送装置，或透皮注射型递送装置，适合于这种目的，如下文所描述的。可流动组合物优选的是保持形状的组合物。因而，在此处预期的可流动型颗粒基质之中、之上或之内包含细胞的可植入材料，可以被配制用于任何可注射递送装置，所述递送装置内径范围从约18规格（gauge）到约26规格，并能够递送约50mg包含颗粒材料的可流动组合物,在约1到3ml的所述可流动组合物中含有约1百万个细胞。

根据当前优选的实施方式，所述可流动组合物包括生物相容的颗粒基质，例如Gelfoam

颗粒、Gelfoam

粉剂、或粉碎的Gelfoam

（PfizerInc.，New York，NY）（在下文中称为″Gelfoam颗粒”），其是来自猪皮明胶的产品。根据另一个实施方式，所述颗粒基质是Surgifoam^TM（Johnson& Johnson，New Brunswick，NJ）颗粒，包括可吸收的明胶粉末。根据另一个实施方式，所述颗粒基质是Cytodex-3（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）微载体，包含与交联的葡聚糖基质结合的变性的胶原蛋白。根据进一步的实施方式，颗粒基质是CultiSpher-G（Percell Biolytica AB，Astorp，Sweden）微载体，包含猪明胶。根据另一个实施方式，颗粒基质是大孔材料。根据一个实施方式，所述大孔颗粒基质是CytoPore（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）微载体，包含被带正电的N,N，-二乙氨基乙基基团取代的交联的纤维素。

根据可选择的实施方式，所述生物相容的可植入颗粒基质是修饰的生物相容性基质。修饰包括以上对于可植入基质材料描述的那些。

适合根据本发明用来控制受影响位点中痊愈的发生和/或发展的相关可流动组合物在共同拥有的、2005年12月6日提交的国际专利申请PCT/US05/43844（代理人编号No.ELV-009PC）中公开了，其全部内容通过引用合并在此。

可植入材料的制备：在细胞播种之前，生物相容性基质通过添加没有抗生素的EGM-2在大约37℃和5%CO₂/95%空气中再水化12到24小时。然后从它们的再水化容器中移出可植入材料，放置到各个组织培养平皿中。以大约1.5-2.0×10⁵个细胞（1.25-1.66×10⁵个细胞/cm³基质）的优选的密度播种生物相容性基质，置于维持在大约37℃和5%CO₂/95%空气、90%湿度中的孵化器中3-4小时以便于细胞附着。播种的基质然后放置到各个容器（Evergreen，Los Angeles，CA）中，这些容器各自装有带0.2μm过滤器的帽子并含有EGM-2，在大约37℃和5%CO₂/95%空气下温育。做为选择，三件播种的基质可以置于150mL瓶子中。此后，每两到三天改变培养基，直到细胞达到汇合。在一个优选的实施方式中的细胞优选的传代6次，但是可以使用更少或更多次传代的细胞。

细胞生长曲线和汇合：在或大约第3或4、6或7、9或10、和12或13天移出可植入材料的样品，计数细胞并评定生存力，构建和评估生长曲线以评估生长特点，和确定是否达到汇合、近汇合或后汇合。在附图1A和1B中呈现了来自包含猪主动脉内皮细胞植入批次的可植入材料的两个制品的代表性生长曲线。在这些实例中，所述可植入材料处在柔性平面形式。一般地，普通技术人员将理解早期、中期和晚期时点的可接受的细胞生长的特征，例如在早期时点时观察到细胞数量增加（当参考附图1A时，约2-6天之间），随后是近汇合阶段（参考附图1A时，在约6-8天之间），随后是如相对恒定的细胞数量所指示的，一旦细胞达到汇合时细胞数量的平台期（参考附图1A时，在约8-10天之间），和当细胞是后汇合时细胞数量的维持（参考附图1A时，在约10-14天之间）。对于本发明来说，处于平台期至少72小时的细胞群体是优选的。

通过使用CaCl₂溶液中的0.5mg/mL胶原酶的溶液完全消化可植入材料的等分量，实现细胞计数。在测量消化的可植入材料的体积之后，用0.4%锥石蓝稀释已知体积的细胞悬液（细胞与锥石蓝的比例为4:1），通过锥石蓝排阻评定生存力。使用血球计数器计数活细胞、非存活细胞和总细胞。通过将活细胞数目相对于培养天数作图来构建生长曲线。在达到汇合之后将细胞装运和移植。

对于本发明来说，汇合被定义为当可植入材料是柔性平面形式（1.0×4.0×0.3cm）时存在至少约4×10⁵个细胞/cm³，当可植入材料是柔性组合物时优选的每等分量（50-70mg）约7×10⁵到1×10⁶个总细胞。对这两者，细胞生存力是至少约90%，但优选不低于80%。如果到第12或13天细胞不汇合，改变培养基，继续温育额外一天。继续这个过程直到达到汇合或直到播种后14天。在第14天，如果细胞没有汇合，全部丢弃该批次。如果在进行过程中检查之后确定细胞是汇合的，进行最后的培养基改变。这种最后的培养基改变使用没有酚红和没有抗生素的EGM-2进行。在培养基改变之后立刻地，给试管装上无菌栓塞密封帽用于装运。

功能和表型的评估：对于在此描述的发明来说，在植入之前进一步测试可植入材料的功能和表型的指标。例如，在培养期间收集条件培养基来确定培养的内皮细胞产生的硫酸乙酰肝素、转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、基质金属蛋白酶的组织抑制物（TIMP）和氧化氮（NO）的水平。在某些优选的实施方式中，当总细胞数量是至少约2、优选至少约4×10⁵个细胞/cm³可植入材料；活细胞的百分比是至少约80-90%，优选≥90%，最优选至少约90%；条件培养基中的硫酸乙酰肝素是至少约0.23-1.0，优选至少约0.5微克/mL/天；条件培养基中的TGF-β1是至少约200-300皮克/mL/天，优选至少约300皮克/ml/天；条件培养基中的b-FGF低于约200皮克/ml，优选不超过约400皮克/ml；条件培养基中的TIMP-2是至少约5.0-10.0ng/mL/天，优选至少约8.0ng/mL/天；条件培养基中的NO是至少约0.5-3.0μmol/L/天，优选至少约2.0μmol/L/天时，所述可植入材料可以用于在此描述的目的。

硫酸乙酰肝素水平可以使用常规的二甲基亚甲蓝-软骨素酶ABC消化分光光度分析来定量。总硫酸化糖胺聚糖（GAG）水平使用二甲基亚甲蓝（DMB）染料结合分析来测定，其中未知样品与使用在搜集培养基中稀释的已知数量的纯化硫酸软骨素产生的标准曲线比较。在添加DMB显色试剂之前将其他的条件培养基样品与软骨素酶ABC混合来消化软骨素和硫酸皮肤素。在与GAG标准物混合的DMB染料的最大波长吸光度下，一般在约515-525nm下测定所有的吸光度。通过条件培养基样品中总硫酸化糖胺聚糖浓度乘以通过酶消化所计算的硫酸乙酰肝素百分比，来计算每天的硫酸乙酰肝素浓度。软骨素酶ABC活性通过消化纯化的100%硫酸软骨素的样品以及纯化的硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素的50/50混合物来确定。如果低于100%的纯化的硫酸软骨素被消化，适当地校正条件培养基样品。硫酸乙酰肝素水平也可以使用采用单克隆抗体的ELISA分析来定量。

TGF-β1、TIMP和b-FGF水平可以使用采用单克隆或多克隆抗体、优选多克隆抗体的ELISA分析来测定。对照搜集培养基也可以使用ELISA分析来定量，根据对照培养基中存在的TGF-β1、TIMP和b-FGF水平适当地校正样品。

氧化氮（NO）水平可以使用标准的格里斯反应分析来定量。氧化氮的短暂和挥发性特性使它不适合大多数检测方法。然而，氧化氮的两种稳定的分解产物，硝酸（NO₃）和亚硝酸（NO₂）可以使用常规光度方法来检测。在存在硝酸还原酶的情况下，格里斯反应分析酶学地转化硝酸盐为亚硝酸盐。使用比色法检测作为有色偶氮染料产物的亚硝酸盐，其在约540nm的范围内吸收可见光。系统中存在的氧化氮的水平通过以下方法测定：转化所有的硝酸盐为亚硝酸盐、测定未知样品中亚硝酸盐的总浓度、然后比较产生的亚硝酸盐浓度与使用转变成亚硝酸盐的已知数量的硝酸盐产生的标准曲线。

利用如上所述的定量性硫酸乙酰肝素、TGF-β1、TIMP、NO和/或b-FGF分析，以及下文的平滑肌细胞生长、血栓形成抑制的定量体外分析，来评估早先描述的优选的抑制性表型。对于本发明来说，当一种或多种这些可选择的体外分析证实可植入材料展现优选的抑制性表型时，可植入材料准备好用于植入。

为了评估体外的平滑肌细胞生长的抑制作用，测定与培养的内皮细胞相关的抑制作用的大小。猪或人类主动脉平滑肌细胞稀疏地播种到24孔组织培养平板中的平滑肌细胞生长培养基（SmGM-2，Lonza）中。容许细胞附着24小时。然后使用含有0.2%FBS的平滑肌细胞基础培养基（SmBM）替换培养基48-72小时来延滞细胞生长。从后汇合内皮细胞培养物制备条件培养基，用2×SMC生长培养基1：1稀释，并添加到培养物中。平滑肌细胞生长的抑制作用的阳性对照被包括在每个分析中。在三到四天之后，每个样品中的细胞数量在添加染料之后利用库尔特粒度仪或利用比色分析来计数。通过比较即将添加条件培养基之前每反应孔的平滑肌细胞数目和暴露于条件培养基以及对照培养基（有和没有添加生长因子的标准生长培养基）之后三到四天的数目，测定条件培养基对平滑肌细胞增殖的影响。将与条件培养基样品相关的抑制作用的大小同与阳性对照相关的抑制作用的大小相比较。根据优选的实施方式，如果条件培养基抑制了肝素对照物所能抑制的大小的约20%，所述可植入材料被考虑为抑制性的。

为了评估体外的血栓形成抑制作用，测定与培养的内皮细胞相关的硫酸乙酰肝素水平。硫酸乙酰肝素具有抗增殖和抗血栓性质。使用上文详述的常规的二甲基亚甲蓝-软骨素酶ABC消化分光光度法分析或ELISA分析，计算出硫酸乙酰肝素的浓度。当条件培养基中的硫酸乙酰肝素是至少约0.23-1.0、优选至少约0.5微克/mL/天时，所述可植入材料可以用于在此描述的目的。

评估血栓形成的抑制作用的另一种方法涉及体外测定与富含血小板的血浆或血小板浓缩物相关的血小板聚集的抑制作用的大小（ResearchBlood Components，Brighton，MA）。从后汇合内皮细胞培养物制备条件培养基，并添加到血小板浓缩物的等分量中。将血小板聚集剂（激动剂）添加到播种在96孔平板中的血小板作为对照。血小板激动剂通常包括花生四烯酸、ADP、I型胶原蛋白、肾上腺素、凝血酶（Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO）或瑞期托菌素（可从Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO获得）。其他的血小板的孔不添加血小板激动剂或条件培养基，来评定基线的自发血小板凝聚。用于血小板凝聚抑制作用的阳性对照还被包括在每个分析中。示范性的阳性对照包括阿斯匹林、肝素、吲哚氯甲酰（Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO）、阿昔单抗（ReoPro

Eli Lilly，Indianapolis，IN）、替罗非班（Aggrastat

Merck & Co.，Inc.，Whitehouse Station，NJ）或eptifibatide（Integrilin

Millennium Pharmaceuticals，Inc.，Cambridge，MA）。然后利用平板读取器和405nm处的吸光度读取来测量所有测试条件的产生的血小板聚集。血小板读取器通过监视光密度来测量血小板聚集。血小板聚集时，更多的光线可以通过样本。血小板读取器以“吸光度”报告结果，这是血小板聚集速度的函数。作为在添加激动剂之后6-12分钟间的最大聚集来评定聚集。通过比较添加条件培养基之前的最大激动剂聚集与血小板浓缩物对条件培养基和阳性对照的暴露之后的最大激动剂聚集，来测定条件培养基对血小板聚集的影响。结果表示为基线的百分比。将与条件培养基样品相关的抑制作用的大小同与阳性对照相关的抑制作用的大小相比较。根据优选的实施方式，如果条件培养基对血栓形成的抑制达到对照的至少约20%，更优选达到对照的至少约40%、以及最优选达到对照的至少约60%，则所述可植入材料被认为是调节性的。

为了体外评估对血管生成的调节，Javaherian等人的血管形成Matrigel栓塞分析被用于评估Matrigel剖面的血管形成密度。Javaherian et al.J. Bio.Chem.277:45211-45218（2002）.在4℃多孔平皿（24孔）用250μlMatrigel包被，Matrigel是一种来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤的ECM制品（BD PharMingen），在37℃温育30-60分钟以形成栓塞。将人类脐静脉内皮细胞（HUVEC，Lonza BioSciences，Basel，Switzerland）以50,000-100,000个细胞/mL播种到0.5mL EGM-2-MV培养基（Lonza BioSciences）中。从可植入材料的样品或共培养系统中的可植入材料收集的条件培养基作为可植入材料掺入物（insert），在标绘的时点（t=0）或在37℃下在各个HUVEC温育时间之后（t=2、4、8、12或16小时）施加于Matrigel。

在Matrigel内形成的内皮细胞管的密度通过在低倍视野（40×）下的三次人工计数来测定。没有细胞的生物相容性基质的样品（或不向Matrigel施加任何物质）被用作阴性对照。任何已知的抗血管生成药物可以用作阳性对照（例如，凝血栓蛋白-1、内皮抑制素或阿伐他汀）。

附图2A描绘了在有和没有用本发明的可植入材料处理的Matrigel中HUVEC管形成的照片。附图2B是在施用条件培养基或可植入材料之后的管形成密度的图形表示。参考附图2A和2B，根据这种方法，与对照相比，所述可植入材料引起了Matrigel中管形成密度的降低。根据这个实施方式，容许Matrigel-HUVEC用来自可植入材料的条件培养基温育72小时。在施用条件培养基后16和72小时，显著的管形成保留在未处理的Matrigel样品中。另一方面，在可植入材料样品中，管形成的密度被显著降低。因此，相对于对照，可植入材料能够抑制Matrigel中的血管生成。

当准备植入时，在最终产物容器中提供平面形式的可植入材料，所述容器各自优选含有1×4×0.3cm（1.2cm³）的无菌可植入材料，具有优选大约5-8×10⁵、优选至少约4×10⁵个细胞/cm³，和至少约90%的活细胞（例如，来自单一尸体供体的人类主动脉内皮细胞）每立方厘米的在大约45-60ml、优选的约50ml内皮生长培养基（例如，不包含酚红和抗生素的内皮生长培养基（EGM-2））中的可植入材料。当使用猪主动脉内皮细胞时，生长培养基也是不包含酚红的EBM-2，但补充有5%FBS和50μg/ml庆大霉素。

在其他优选的实施方式，在最终产物容器中提供可流动组合物（例如，颗粒形状的生物相容性基质），所述容器包括例如，用过滤器盖子修饰的密封的组织培养容器或预先加载的注射器，优选各含有约50-60mg的可流动组合物，所述可流动组合物在约45-60mL、优选约50mL的每等分量生长培养基中包含约7×10⁵到约1×10⁶个总内皮细胞。

可植入材料的贮藏期限：包含汇合、近汇合或后汇合细胞群体的本发明的可植入材料可以在室温下以稳定和存活状况维持至少两周。优选的，这种可植入材料以约45-60ml、更优选约50ml每份可植入材料的量，维持在有或没有额外的FBS或VEGF的转移培养基中。转移培养基包含没有酚红的EGM-2培养基。FBS可以添加到转移培养基中，直至约10%FBS，或约12%FBS的总浓度。然而，由于FBS必需在植入之前从可植入材料中除去，优选的是限制转移培养基中使用的FBS的数量来降低植入前所需的清洗时长。VEGF可以添加到转移培养基中直到约3-4ng/ml的浓度。

可植入材料的低温保存：本发明的可植入材料可以被低温保存，用于贮存和/或转运到临床位置，而在最后解冻时不降低它的临床效力或完整性。优选的，可植入材料低温保存在15ml冷冻瓶（Nalgene

Nalge Nunc Int′l，Rochester，NY）中含有约10%DMSO、约2-8%葡聚糖和约20-75%FBS或人类血清的约5ml CiyoStor CS-10溶液（BioLife Solutions，Oswego，NY）中。冷冻瓶置于冷的异丙醇水浴中，转移到-80℃冷冻器中4小时，随后转移到液氮中（-150℃到-165℃）。

可植入材料的低温保存的等分量然后在室温下慢慢解冻约15分钟，随后在室温水浴中额外解冻大约15分钟。然后所述材料在约200-250mL盐水、乳酸化的ringers或EBM中洗涤约3次。三次清洗操作在室温下进行约5分钟。然后植入所述材料。

为了测定解冻的材料的生物活性，在解冻和清洗操作之后，容许低温保存的材料在约10ml的恢复溶液中静息约48小时。对于猪的内皮细胞，恢复溶液是补充有5%FBS和50μg/ml庆大霉素的EBM-2，在37℃下且在5%CO₂中；对于人类内皮细胞，恢复溶液是有或者没有抗生素的EGM-2。进一步的解冻后调节可以在使用和/或包装用于贮存或转运之前进行另外的至少24小时。

在即将植入之前，倒出转运或低温保存的培养基，在约250-500ml无菌盐水（USP）中清洗可植入材料。如有必要，最终产品中的培养基含有少量的FBS来在转运到临床位置期间维持细胞生存力。FBS已经根据Title 9CFR:Animal and Animal Products广泛地测试了细菌、真菌和其他病毒剂的存在。仅在植入之前采取清洗操作，其减少转运的FBS的数量，优选减少至每个植入物0-60ng之间，但优选的不超过每个植入物1-2μg。

每个人类患者的总细胞载荷优选的是大约1.6-2.6×10⁴个细胞每kg体重，但是不低于约2×10³以及不超过约2×10⁶个细胞每kg体重。

可植入材料的施用：本发明的可植入材料当处于可流动组合物中时包含颗粒状生物相容性基质和细胞，优选内皮细胞，更优选血管内皮细胞，所述细胞是约90%存活的，优选的密度为约0.8×10⁴个细胞/mg，更优选约1.5×10⁴个细胞/mg，最优选约2×10⁴个细胞/mg，所述细胞可以产生条件培养基，所述培养基含有硫酸乙酰肝素至少0.23-1.0、优选至少约0.5微克/mL/天，含有TGF-β1至少约200-300皮克/mL/天、优选至少约300皮克/mL/天，以及含有b-FGF低于约200皮克/ml和优选不超过约400皮克/ml；条件培养基中的TIMP-2是至少约5.0-10.0ng/mL/天，优选至少约8.0ng/ml/天；条件培养基中的NO是至少约0.5-3.0μmol/L/天，优选至少约2.0μmol/L/天，以及，所述细胞显示早前描述的抑制性表型。

对于本发明来说，一般地，可植入颗粒材料的施用被定位到受影响位点之处、邻近或附近的位置。可植入材料的沉积的位点是受影响结构的内表面或外表面，或在邻近或周围的组织处。如在此预期的，局部的沉积可以如下实现。

在特别优选的实施方式中，可流动组合物首先利用适合的针、导管或其他适合的透皮肤递送装置透皮地施用，进入患者的身体靠近受影响结构，然后沉积在受影响关节、切除位置或其他空腔的内表面、受影响结构的外表面，直接接触邻近于或围绕受影响或受治疗位点的基质或间隙位置。做为选择，所述可流动组合物使用针、导管或其他适合的递送装置透皮地递送，结合识别步骤来促进对期望位点的递送。识别步骤可以在透皮肤递送之前或同时发生。识别步骤可以利用身体检查、超声和/或CT扫描来实现，略举数例。任选地进行所述识别步骤，而不是实践本发明的方法必需的。

可流动组合物也可以通过邻近于或连接到受影响结构的管状结构腔内地施用。例如，所述组合物可以通过能插入到管状结构内的任何设备来递送。在这种情况下，这种管腔内的递送装置装配有导向或穿透设备，其导向或穿透管状结构的腔壁来到达受影响结构的内表面或外表面。可流动组合物然后沉积在受影响结构或邻近或周围组织的表面。

在此预期的导向或穿透设备可以利用，例如，单个递送点或以期望的几何构型布置的多个递送点来实现可流动组合物向受影响结构的表面的递送，而不破坏所述位点。可以布置多个递送点，例如，单环形、同心圆形、或平面阵列排列，略举数例。

根据本发明的优选实施方式，所述穿透设备在治疗位点的近端或远端经由结构的内表面插入。在某些临床受试者中，在治疗位点之处或附近插入穿透设备会破坏或引起受影响结构的进一步损伤。因而，在这些受试者中，应当小心地在离受影响结构一定距离的位置插入所述穿透设备，优选的是由临床医师取决于手头的特定环境所确定的距离。

优选的，在待治疗位点之处或所述位点的邻近或附近，可流动组合物沉积在受影响结构的内表面或外表面。所述组合物可以沉积在相对于受影响位点的多种位置，例如，在所述位点处、接触间质、环绕所述位点或邻近于所述位点。根据优选的实施方式，邻近的位点处在受影响位点的约0cm到2cm内。在另一个优选的实施方式中，位点在约2cm到4cm之内；在又一个优选的实施方式中，位点在约4cm到6cm之内。在另一个优选的实施方式中，位点处在约6cm到10cm之内。做为选择，邻近的位点是任何其他的、临床医师确定的邻近位点，在此沉积的组合物能够展现对于要治疗的位点附近的受影响位点的期望效果。

在另一个实施方式中，所述可流动组合物直接递送到受影响结构之处、邻近或附近的手术暴露的内表面或外表面。在这种情况下，通过对该位点的直接观察来引导和指导递送。还是在这种情况下，通过同时使用如上所述的识别步骤，可以帮助递送。同样，识别步骤是任选的。

根据本发明的另一个实施方式，柔性的平面形式的可植入材料被局部地递送到受影响位点之处、邻近或附近的手术暴露的外表面或内表面或腔。在一个实例中，至少一片可植入材料被应用于腔的内部；它仅需要贴合并接触位点的表面，并以治疗所述位点的有效量植入。

根据一个实施方式，单独地或任选的在外科的肿瘤切除术之后，切除位点被施用放射治疗来照射所述切除位点之处或附近的肿瘤和/或剩余癌细胞。根据另一个实施方式，单独地或任选的在外科的肿瘤切除术之后，患者被施用化学治疗来杀死所述切除位点之处或附近的肿瘤和/或剩余癌细胞。根据这些实施方式的任一个，在放射治疗和/或化学治疗完成之后，可植入材料被递送到切除术的空腔中。根据这种方法，可植入材料被用于治疗、改善、控制和/或降低肿瘤切除术、放射治疗和/或化学治疗对切除术空腔和/或周围组织的影响。

实施例

1.猪中的血管损伤

这项研究例示了本发明的材料和方法来调节病理性血管生成和异常新血管形成的用途。选择用于这种范例的实验模型是外科手术诱导的血管损伤和外伤之后的新血管形成。此外，这个实施例提供了实验性方案，用于在动物测试受试者中对血管结构的介入，例如，AV移植物的引入之后测试和利用本发明的优选的实施方式来降低或调节异常新血管形成的征候，包括新血管形成、血管密度和MMP的表达水平。

使用标准的手术操作，在颈动脉和颈静脉之间创建AV移植物。然后将可植入材料放置在每个手术创建的AV移植物接合点邻近的血管周围间隙中；以下列出了一个示范性操作的细节。如较早描述的，可植入材料的放置和结构可以改变。在这项研究中，所述可植入材料处于柔性平面形式。

特别地，该研究包括经历了AV移植物手术的20个猪测试受试者。常规的AV移植物手术操作将根据标准操作技术进行。在移植手术完成以及通过移植物的流通被建立之后，可植入材料被应用到AV移植物接合点并如以下描述的环绕。

对于经历了AV移植手术的每个测试受试者，将一个六毫米内径的PTFE移植物置于测试受试者的左侧颈总动脉和右侧外颈静脉之间。使用连续6-0普罗纶（prolene）缝合线，在移植物的每个末端创建倾斜的端对面接合点。在手术之后，所有测试受试者接受内部起作用的肝素和每天施用的阿斯匹林。

十位测试受试者在手术当天接受包含主动脉内皮细胞的可植入材料。五个这样的植入物被应用给每个测试受试者。两个植入物卷绕到两个接合位点的每一个上。在这种环境下，将可植入材料的第一片的一端穿过接合段下方，直到植入物的中部处在血管和移植物会合的点上。第二片可植入材料然后以与第一片相反的方向卷绕，置于接合段的上部，末端塞入接合点下方。然后将两端卷绕缝合线，保持植入物中心在缝合线上。末端最低限度地叠盖来固定材料就位。对于每个测试受试者，另外一个植入物沿着近端静脉段的长度纵向地放置，在接合点处开始。植入物不完全地卷绕静脉的圆周。

十名测试受试者接受没有细胞的对照植入物，在手术当天卷绕接合点位置并置于移植物的近端静脉段上。根据体重的总细胞载荷是大约2.5×10⁵个细胞每kg。

手术操作。在颈部的每一侧在胸锁乳突肌肉上创建双侧的8-cm颈部切口。利用这些切口，在分离左侧颈总动脉之后，分离右侧外颈静脉。从周围组织剥离大约4-8cm静脉和动脉段，静脉外的所有分支用3-0丝缝线连接。6-mm内径PTFE移植物（Atrium Medical Corp.，Hudson，NH）在两个切口之间的皮下管道中穿过。钳住分离的颈静脉，产生10mm静脉切开口。用肝素化的盐水溶液冲洗静脉，利用连续6-0普罗纶缝合线在静脉移植物之间创建倾斜的端对面接合点。平均移植物长度是18.6±0.9cm。一旦形成，除去静脉的夹具，用肝素-盐水溶液冲洗移植物并重新钳住。然后夹住左侧颈动脉，进行8mm的动脉切开术。用肝素化的盐水溶液冲洗动脉，利用连续6-0普罗纶缝合线在动脉和移植物之间创建倾斜的端对面接合点。除去血管夹，通过移植物中震颤的物理触诊确认移植物的流通。确认每个血管接合点的血液静态，在个别情况下额外的6-0普罗纶缝合线以阻断方式置于接合的出血点处。

在完成接合之后，放置PTFE动静脉移植物以防止扭结。PTFE动静脉移植物使用23-规格蝴蝶针就在颈动脉移植物接合点远端透皮地插管。为了确认位置，将血液吸出到带有10cc注射器的系统中。然后用10cc盐水冲洗该系统。然后在研究的动物的颈部上放置C-臂荧光镜，从而可以显现静脉移植物接合点和静脉流出道。在连续的荧光检查之下，注射10-15cc的碘化了的对比物（Renograffin，全强度）。

在血管造影完成之后，将接合位点包在湿润的4″×4″纱布海绵中。维持接合位点的压力持续大约5分钟的时间，之后除去纱布海绵，检查接合位点。如渗血所证明的，如果还没有实现止血，再次缠绕该位点另外5分钟。如果从该位点的出血是严重的，在外科医生的判断下放置其他缝合线。一旦实现止血，用无菌盐水填充颈部伤口，使用6mm跨音速流动探针在远端静脉流出道处进行流动探针分析。如有必要，除去盐水，使接合点尽可能干燥，用包含主动脉内皮细胞的可植入材料或对照植入物来处理。一些位点不用任一种植入物处理，直到已经控制了所有的出血，确认了移植物的流通且使该区域尽可能干燥。完成时，按层闭合伤口，容许动物从麻醉中恢复。

在手术前作为100U/kg的弹丸注射加上35U/kg/hr的连续输注来施用肝素，维持直到手术结束。根据需要施用另外的弹丸剂量（100U/kg），以维持ACT≥200秒。

移植物开放。在手术之后立即地、手术后3-7天以及此后每周一次地，使用彩色流动多普勒超声和跨音速流动探针（Transonic Systems，Inc.，Ithaca，NY）通过通路流量测定来确认AV移植物开放。严密监视移植物的血流。

病变过程。动物试验受试者使用戊巴比妥钠麻痹（65mg/kg，IV）。在通过如上所述的全息血管造影的尸检之前确定移植物开放。在完成血管造影之后，移植物/接合点用PBS、随后是福尔马林来灌注。

组织学。一半的动物测试受试者（5例细胞移植的植入物受试者；5例对照植入物受试者）在手术后3天安乐死。其余的动物测试受试者（5例细胞移植的植入物受试者；5例对照植入物受试者）在手术后一月安乐死。

在所有测试受试者上进行有限的尸检，其被定义为施用位点的宏观检查，包括所有接合点和近端静脉位点和周围组织，包括导液淋巴结。对于在手术后一个月安乐死的所有测试受试者，收集并保存来自主要器官，包括脑、肺、肾脏、肝脏、心脏和脾脏的组织。仅当从身体外表面的宏观检查、或从施用位点和周围组织的显微镜检查产生异常发现时，器官才被分析。没有出现异常的发现，这保证了对被编入这项研究中的任何动物中主要器官进行进一步检查。

所有的AV移植物接合位点和周围组织，包括每个接合的静脉和动脉的5cm段，被修整、固定在10%福尔马林（或等效物）中，并包埋在乙二醇甲基丙烯酸酯（或等效物）中。使用C-形不锈钢刀（或等效物）切下的大约3μM厚的切片，从至少三个区域制备切片：静脉移植物接合点、移植物-动脉接合点和静脉流出道。横断通过静脉移植物接合点地制备三个切片。在静脉流出道上制备五个切片（因而覆盖1.5cm的流出静脉）。以1mm的间隔在移植物-动脉接合点制备三个切片。这些切片放置在明胶包被的（或等效物）玻璃载片上，用苏木素和曙红或Verhoeff’s弹性蛋白染料来染色。

评估每个切片的新血管形成的存在和/或程度。为每个变量按0到4的标度分配分值（0=没有显著的变化；1=最小的；2=轻微的；3=中度的；4=严重的）。新血管形成发现的代表性的分级指标在以下的表1中示出。

表1

HPF=高倍视野

为了检查血管周的植入物对基质金属蛋白酶（MMP）表达的影响，对静脉组织切片进行免疫组织化学分析。切下五微米石蜡切片，通过在高pH值Target Retrieval溶液（Dako USA，Carpinteria，CA）中加热切片20分钟进行抗原恢复。玻片用过氧化物酶封闭剂（Peroxidase Block（Dako USA））覆盖5分钟来淬灭内源的过氧化物酶活性。在室温下施加初级的鼠抗人MMP-2（1:250稀释度，Chemicon International，Inc.Ternecula，CA）45分钟，在室温下施加初级的兔抗人MMP-9（1:250稀释度，Chemicon International，Inc.Ternecula，CA）60分钟。所有玻片用Mayer’s苏木素（Sigma Chemical Co.）复染。猪的肝脏用作阳性对照，小鼠IgG1或兔IgG用作阴性对照。对于每种样本，每个切片分析至少6个不相交的视野。对于阳性MMP染色的定量评定，利用Olympus BX60显微镜对随机选择的区域成像。捕捉数字图象（200×放大率），利用Image-Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics，Silver Spring，MD）分析。每个感兴趣的区域（例如，内膜、中层和外膜）被加亮，通过颜色分割来定量阳性染色。结果表示为阳性染色区域的百分比（阳性区域（mm²）在总区域（mm²）上的比例）。

动物受试者的结果。在管状或非管状组织结构之处或邻近的位点处放置本发明的可植入材料，有效降低了跟随着组织破坏例如跟随外科手术的新血管形成。在外科处理的管状或非管状组织结构之处或邻近的位点施用处本发明的可植入材料降低了被治疗的组织结构中的异常新血管形成。此外，可植入材料降低了管状或非管状组织结构的MMP表达和/或活化。

在两个时点在两个组中观察到了新血管形成的证据。外膜新血管形成的特征在于进入新形成的小血管（毛细管）的组织的向内生长，其在它的最大程度上具有与肉芽组织相符的次序模式（血管垂直于成纤维细胞），受损组织的重新组织或是进入通常不会含有血管的材料中的新的生长。当与施用对照材料的静脉相比时，在用可植入材料处理的静脉中急性和慢性的新血管形成都降低了（在两种情况中存在1个严重度点的平均差异，表2）。

表2

本发明的可植入材料还降低了用本发明的可植入材料治疗的动物中基质金属蛋白酶的表达。手术后3天和1个月，在总血管、内膜、中层和外膜中，MMP-2和MMP-9阳性细胞的免疫组织化学分析揭示了，与施用对照材料的静脉相比，在用可植入材料处理的静脉中MMP表达降低。

在对照组中，在第3天在外膜、中层和内膜中观察到显著的MMP-2阳性细胞。在施用对照材料的动物的组织切片中观察到的MMP-2阳性细胞水平是外膜中11.2±1.0%，中层中4.4±0.6%，内膜中2.1±0.2%。在接受对照材料的动物中，MMP-2的阳性染色主要位于外膜中。在1个月时，施用对照材料的动物中染色的数量在外膜中降低（5.7±0.9%），但是在中层（4.9±1.0%）和内膜（2.6±0.8%）中仍然提高。

在用可植入材料治疗的组中，在第3天在血管的外膜、中层和内膜中观察到MMP-2的表达降低。在用可植入材料治疗的动物的组织切片中观察到MMP-2阳性细胞比例是外膜中6.9±1.2%（P≤0.05）；中层中2.3±0.4%（P<0.05）；以及在内膜中0.8±0.2%（P<0.05）。在用可植入材料治疗的动物中从第3天到1个月，MMP-2表达保持相对不变。

附图3是在第3天和在1个月用可植入材料治疗的受试者和施用对照材料的受试者的染色组织切片中MMP-2表达的图形表示。与施用对照材料的静脉相比，在用可植入材料治疗的静脉中MMP-2的表达方面的显著降低是明显的。在第3天和1个月在用可植入材料治疗的静脉的内膜、中层和外膜中观察到降低的MMP-2表达。

以上讨论的，与MMP-2表达相比，对于接受对照材料的动物和接受可植入材料的动物来说，在两个时点MMP-9表达是不太强的。在第3天，与对照相比，用可植入材料治疗的静脉的外膜中存在降低的染色。在1个月，与对照相比，在治疗的组的内膜和外膜中观察到降低的MMP-9表达（P≤0.05）。附图4是在第3天和在1个月用可植入材料治疗的受试者和施用对照材料的受试者的染色组织切片中MMP-9表达的图形表示。

不希望受到理论的限制，相信的是，本发明的可植入材料恢复了用可植入材料处理的结构中的蛋白水解平衡，或MMP和TIMP之间的平衡。组织结构以非常紧密控制的比例组成性地分泌MMP和TIMP。然而，组织结构的疾病或损伤可以诱导结构中MMP:TIMP比例的偏离，足以启动引起异常新血管形成的事件的级联。可植入材料降低了MMP的表达或提高了TIMP的表达，来恢复MMP和TIMP之间的平衡，足以为治疗的结构降低异常新血管形成或恢复正常的新血管形成。

2.裸鼠中结肠肿瘤的切除

这些研究例示了本发明的材料和方法来在肿瘤切除手术之后调节病理性血管生成、异常新血管形成、细胞外基质降解和MMP与TIMP的表达水平中的用途。进一步的，当与上文的详细说明中的教导一起阅读时，这些实施例提供了实验性方案，用于测试和利用本发明的优选的实施方式来降低或调节动物受试者中切除实体肿瘤的介入之后的细胞外基质降解、病理性血管生成、异常新血管形成、以及MMP和TIMP的表达水平的征候。

根据这个实施例，结肠癌细胞被注射到裸鼠背部的腔内，容许生长成重量0.5-1.0g的肿瘤。外科地切除肿瘤，外科地闭合切除术空腔。类似地维持两组小鼠，不同的是治疗组将在外科的闭合之前在切除术空腔接受有效量的可植入材料。将通过腹腔镜检查、超声、MRI，或通过处死小鼠并在显微镜下检查切除空腔来持续地监视病理性血管生成、细胞外基质降解、MMP的表达水平以及炎症的征候的降低和/或改善。预期的是，与对照小鼠相比，用本发明的可植入材料治疗的小鼠将展现病理性血管生成、异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

3.Lewis肺癌小鼠中肺肿瘤的切除

根据这个实施例，根据O′Reilly等人在Cell 88:277-285（1997）中描述的小鼠模型，Lewis肺癌细胞被注射到小鼠背部的腔中。癌细胞被容许生长成重量0.5-1.0g的原发肿瘤。外科地切除原发肿瘤，外科地闭合切除术空腔。类似地维持两组小鼠，不同的是治疗组将在外科的闭合之前在切除术空腔接受有效量的可植入材料。

将通过腹腔镜检查、超声、MRI，或通过处死小鼠并在显微镜下检查切除空腔来持续地监视病理性血管生成、异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平以及炎症的征候的降低和/或改善。进一步的，将通过腹腔镜检查、超声、MRI或通过处死小鼠并在显微镜下检查切除术空腔和肺部，来持续地监视对于在切除原发肿瘤的位点处癌细胞的再生的抑制作用以及对于向肺部的癌细胞转移的抑制作用。预期的是，与对照小鼠相比，用本发明的可植入材料治疗的小鼠将展现病理性血管生成、异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平、炎症征候、切除术空腔处癌细胞的再生以及癌细胞向切除边缘、向肺部或向周围组织的转移的降低和/或改善。

4.人类中肿瘤的切除术

被诊断具有实体肿瘤的人类患者将被研究来展现肿瘤切除术之后对切除位点的治疗或控制。将检查患者来识别实体肿瘤。类似地维持两组患者，不同的是一组将在实体肿瘤的切除之后在切除术空腔接受有效量的可植入材料。可植入材料将施加在切除术空腔的非癌细胞和/或它们的间质之处或附近。将通过超声、MRI、CT扫描、身体检查和取决于患者中的切除术空腔类型的其他相关操作，来持续地监视病理性血管生成、异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平以及炎症的征候的降低和/或改善。预期的是，与对照患者相比，用可植入材料治疗的患者将展现切除术空腔处以及周围组织处的病理性血管生成、异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

5.人类中的化学治疗和/或放射治疗

已经被诊断具有肿瘤生长的人类患者将被研究来展现在肿瘤位点处进行用于消退肿瘤的化学治疗和/或放射治疗之后对肿瘤位点的治疗或控制。将检查患者来识别适合于用化学治疗和/或放射治疗来治疗的肿瘤生长。类似地维持两组患者，不同的是一组将在化学治疗和/或放射治疗的施用之后在治疗的肿瘤位点接受有效量的可植入材料。

将通过超声、MRI、CT扫描、身体检查和取决于患者中的治疗位点的类型的其他相关操作，来持续地监视病理性血管生成、异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平以及炎症的征候的降低和/或改善。预期的是，与对照患者相比，用可植入材料治疗的患者将展现在治疗位点处以及周围组织处的病理性血管生成、异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

6.小鼠中黄斑变性的治疗

根据这个实施例，根据Hangai等人在Am.J.Pathology161:1429-1437（2002）中描述的模型，研究患有缺血诱导的视网膜新血管形成的小鼠，来展现对眼睛的治疗或控制，以减少黄斑变性的症状和/或延迟黄斑变性的发作。类似地维持两组小鼠，不同的是一组将在被治疗的眼睛或周围组织处接受有效量的可植入材料。

将通过腹腔镜检查、超声、MRI或通过处死小鼠并在显微镜下检查眼睛，来持续地监视异常或病理性新血管形成、MMP表达水平以及炎症征候的降低和/或改善。预期的是，与对照小鼠相比，用本发明的可植入材料治疗的小鼠将展现在受影响组织处的异常或病理性新血管形成、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

7.小鼠中的类风湿性关节炎

根据这个实施例，根据Li等人在PNAS 103:17432-17437（2006）中描述的模型，研究患有类风湿性关节炎的小鼠，来展现对关节炎的关节的治疗或控制，以减少类风湿性关节炎的症状和/或延迟类风湿性关节炎的发作。类似地维持两组小鼠，不同的是一组将在被治疗的关节或周围组织处接受有效量的可植入材料。

将通过腹腔镜检查、超声、MRI或通过处死小鼠并在显微镜下检查关节，来持续地监视异常或病理性新血管形成、MMP表达水平以及炎症征候的降低和/或改善。预期的是，与对照小鼠相比，用本发明的可植入材料治疗的小鼠将展现在受影响组织处的异常或病理性新血管形成、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

8.人类中的类风湿性关节炎

已经被诊断患有类风湿性关节炎的人类患者将被研究来展现对受影响关节的治疗或控制，来减少类风湿性关节炎的症状和/或延迟类风湿性关节炎的发作。将检查患者来识别适合于治疗的关节。类似地维持两组患者，不同的是一组将在被治疗的关节或周围组织处接受有效量的可植入材料。

将通过腹腔镜检查、超声、MRI，或通过处死小鼠并在显微镜下检查关节和周围组织，来持续地监视细胞外基质降解、异常新血管形成、MMP的表达水平以及炎症的征候的降低和/或改善。预期的是，与对照小鼠相比，用本发明的可植入材料治疗的小鼠将展现在受影响关节和/或周围组织处的异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

9.小鼠的银屑病性关节炎

已经被诊断患有银屑病性关节炎的小鼠将被研究来展现对关节的治疗或控制，以减少银屑病性关节炎的症状和/或延迟银屑病性关节炎的发作。类似地维持两组小鼠，不同的是一组将在被治疗的关节或周围组织处接受有效量的可植入材料。

将通过腹腔镜检查、超声、MRI，或通过处死小鼠并在显微镜下检查关节和周围组织，来持续地监视异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平以及炎症的征候的降低和/或改善。预期的是，与对照小鼠相比，用本发明的可植入材料治疗的小鼠将展现在受影响关节和/或周围组织处的异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

10.小鼠的银屑病

已经被诊断患有银屑病的小鼠将被研究来展现对皮肤的治疗或控制，以减少银屑病的症状和/或延迟银屑病的发作。类似地维持两组小鼠，不同的是一组将在被治疗的银屑病病变或周围组织处接受有效量的可植入材料。

将通过腹腔镜检查、超声、MRI，或通过处死小鼠并在显微镜下检查皮肤，来持续地监视细胞外基质降解、异常新血管形成、MMP的表达水平以及炎症的征候的降低和/或改善。预期的是，与对照小鼠相比，用本发明的可植入材料治疗的小鼠将展现在银屑病病变处的异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

11.离体大鼠主动脉环模型中的血管生成

根据这个实施例，根据Kruger等人在Biochem.Biophy.Research Comm.268:183-191（2000）中所描述的模型，研究血管生成的离体大鼠主动脉环模型，来展现可植入材料调节血管生成的能力。从八到十周龄雄性Sprague-Dawley大鼠中切下胸主动脉，移除纤维脂肪性组织。主动脉将被切成1mm长横切片，清洗并置于Matrigel包被的反应孔中。类似地维持大鼠主动脉环切片，不同的是一个组接受有效量的可植入材料，一个组接受有效量的条件培养基，一个组接受对照培养基。

将通过在显微镜下检查主动脉环切片来持续地监视细胞外基质降解、异常新血管形成、MMP的表达水平以及炎症的征候的降低和/或改善。预期的是，与对照相比，用本发明的可植入材料治疗的大鼠主动脉环将展现异常新血管形成、细胞外基质降解、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

12.小鼠中血管生成的Matrigel栓塞分析

根据这个实施例，根据Chander等人在British J.Cancer96:1368-1376（2007）中所描述的模型，研究血管生成的小鼠Matrigel栓塞分析，来展现可植入材料调节血管生成的能力。类似地维持两组小鼠，不同的是一组将对Matrigel栓塞接受有效量的可植入材料。

将通过腹腔镜检查、超声、MRI或通过提取Matrigel栓塞并在显微镜下检查切片，来持续地监视异常或病理性血管生成、MMP表达水平以及炎症征候的降低和/或改善。预期的是，与对照小鼠相比，用本发明的可植入材料治疗的Matrigel栓塞将展现在受影响组织处的异常或病理性血管生成、MMP的表达水平和/或炎症征候的降低和/或改善。

13.小鼠中角膜新血管形成的角膜囊袋分析

根据这个实施例，根据Cao，R.等人在Cancer Cell 6:333-345（2004）中所描述的模型，研究角膜新血管形成的小鼠角膜口袋分析，来展现可植入材料调节新血管形成的能力。简要地，含有人类重组bFGF和VEGF的Sucrafate（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）和hydron[聚（2-HEMA）]（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）的丸粒将被植入到6到7周龄小鼠中手术产生的每个角膜囊袋内。将丸粒置于离角膜缘血管1.0-1.4mm处。在植入之后，将抗生素眼膏施加到每只眼睛上。类似地维持两组小鼠，不同的是一组将皮下地或腹膜内地接受有效量的可植入材料。

为了诱导新血管形成，通过施加平行于角膜缘的旋转运动来除去两只眼睛的角膜和边缘上皮。通过裂隙灯活组织显微镜检查眼睛，用于测量从丸粒的前缘的角膜缘血管长度（丸粒距离），从角膜缘朝向丸粒的最长血管分支（血管长度），以及围绕眼睛的圆周血管生长了多长。

通过在显微镜下检查切片来监视异常新血管形成的减少和/或改善。预期的是，与对照小鼠相比，用本发明的可植入材料治疗的小鼠将展现在受影响组织处异常新血管形成的减少和/或改善。

本发明可以在不背离其精神或基本特征的前提下以其他特定的形式体现。当前的实施方式因而被认为是示例性的而非限制性的，本发明的范围由权利要求而不是由上述描述来表明，因而本发明意图涵盖处在权利要求的等效性的含义和范围内的所有变化。

Claims

1.一种组合物在制备适合于对病理性血管生成的位点进行治疗或控制的药物中的应用，所述组合物包含生物相容性基质和内皮细胞，其中所述组合物的量是治疗或控制所述病理性血管生成的位点的有效量，并且其中所述生物相容性基质是柔性平面材料或可流动组合物。

2.权利要求1的应用，其中所述可流动组合物进一步包含附着肽，并且所述细胞移接在所述附着肽上。

3.权利要求1的应用，其中所述组合物调节所述病理性血管生成的位点处的细胞外基质降解。

4.权利要求1的应用，其中所述组合物调节所述病理性血管生成的位点处的MMP的表达。

5.权利要求1的应用，其中所述组合物调节所述病理性血管生成的位点处的炎症征候。

6.权利要求1的应用，其中所述病理性血管生成的位点是肿瘤切除或放射治疗的位点。