CN103215194B - 新型酵母菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种分离的巴斯德酵母菌No.54，所述巴斯德酵母菌具有调节血糖、肥胖或其相关症状的功效，有助于调控I型糖尿病的高血糖或同时调控II型糖尿病的高血糖及肥胖等两项高危险因数。

Description

新型酵母菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种新型巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus)No.54及其生物分子的应用，特别是涉及调节血糖、肥胖或其相关症状的应用。
背景技术
胰岛分泌的胰岛素是调降血液中葡萄糖浓度最重要的激素，其与肌肉细胞膜或脂肪细胞膜上的胰岛素受体结合后，首先会使这些细胞发生一连串的下游信息反应(包括活化PI3、PKC、Akt及P38MAPK等酶)，进而刺激带有葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的囊泡往细胞膜移动，从而增加细胞膜上葡萄糖输送蛋白4的数量，使得这些细胞吸收葡萄糖的速度提升，达到调降血糖的效果。
当胰岛无法分泌足量的胰岛素或是胰岛素无法使肌肉细胞、脂肪细胞发生足量的下游信息反应，造成血糖长期维持在126毫克/分升以上时，身体的各个组织器官将会受到严重的损害，包括视网膜病变、肾脏病、自主神经系统功能丧失、动脉粥状硬化等，更严重时甚至会发生昏迷、死亡等情形。因此，临床上特别定义空腹血糖高于126毫克/分升以上的病理状况为糖尿病。
糖尿病有两种常见的形式：I型及II型糖尿病。其中，I型糖尿病是一种免疫系统对胰岛进行攻击破坏的自体免疫疾病，使得患者的胰岛无法分泌足量的胰岛素，一般需要靠长期注射胰岛素以控制体内血糖浓度。
II型糖尿病的患者一般仍具有正常分泌胰岛素的能力，但因为肌肉细胞及脂肪细胞有严重的胰岛素抗性(Insulin resistance)，因此，胰岛素无法使这些细胞发生足量的下游信息反应，导致血糖无法降到正常值。其中，肥胖是导致所述胰岛素抗性及II型糖尿病的重要因素，这归因于脂肪细胞所分泌的细胞因子(cytokines)及趋化因子(chemokines)是引发胰岛素抗性及II型糖尿病的重要原因，而肥胖者体内的脂肪细胞显然比一般人多出许多，因此肥胖会大幅度地提升发生胰岛素抗性及II型糖尿病的风险。统计数据显示，50％的 肥胖者将来会患有II型糖尿病，且至少有70％以上的II型糖尿病患者为过重或肥胖者，若这些过重的糖尿病患者能够减重的话，其胰岛素抗性情形将可以恢复到正常或接近正常值。
目前II型糖尿病最佳的治疗方式是饮食控制，它有助于维持血糖及正常体重。若原本的体重过重，则减重是最有效的治疗方式，可使体内的胰岛素发挥更佳的降血糖功能。若减重及饮食都无法控制糖尿病时，则必须遵照医师的嘱咐定期服用口服糖尿病药物或注射胰岛素。
需特别说明的是，目前具备降血糖功效的药物仍限于胰岛素，缺乏替代性的药物，其他口服糖尿病药物仅能辅助性地增加胰岛素的分泌、改善胰岛素的功能、抑制糖类分解或延缓单糖类在胃肠道的吸收等。因此，当口服糖尿病药物配合高剂量胰岛素仍无法控制血糖时(例如具有严重胰岛素抗性的II型糖尿病患者)，将没有其他替代性的药物可以调降血糖，仅能靠减重使胰岛素抗性降低而逐渐恢复胰岛素降血糖的功效，但减重对大部分的患者而言是困难的。此外，长期使用高剂量的胰岛素也有其缺点，当长期使用高剂量胰岛素却仍无法使血糖回复正常时(例如具有严重胰岛素抗性的II型糖尿病患者)，会进一步造成胰岛逐渐丧失分泌胰岛素能力的不利后果，此时即便成功地透过减重而降低病患胰岛素抗性的问题，由于病患已恶化成无法自行分泌胰岛素的患者，将永远失去自主调控血糖的能力。
因此，有必要寻找一种具有调降血糖功效的替代性物质，可取代胰岛素而达到调降血糖的效果，使I型及II型糖尿病患者有多种具备降血糖功效的物质可供选择。此外，有必要寻找一种物质，其能引发细胞发生一连串类似于胰岛素的下游反应，而解决严重胰岛素抗性个体的血糖不受胰岛素调节的问题。再者，有必要寻找一种能有效达到减肥效果的物质，使II型糖尿病患者的胰岛素抗性情形降低，让II型糖尿病患者回复到可以有效地、自主地调降血糖的状态。
发明内容
鉴于糖尿病患者对于新型降血糖物质的需要，本发明的目的在于提供一种酵母菌菌株或其衍生的活性物质，其具有调降血糖的功效，可取代胰岛素作为调降I型及II型糖尿病患者血糖的治疗物质。
本发明的另一个目的在于提供一种酵母菌菌株或其衍生的活性物质，其能引发细胞发生类似于胰岛素的下游反应，而适用于具有胰岛素抗性的个体作为调降血糖的物质。
本发明的另一个目的在于提供一种酵母菌菌株或其衍生的活性物质，其使得具有胰岛素抗性的个体的血糖值下降，避免个体长期处于高血糖的状况下而发生永远无法分泌胰岛素的不利后果。
本发明的再一个目的在于提供一种酵母菌菌株，具有调节肥胖或其相关症状的功效，利于II型糖尿病患者改善其胰岛素抗性情形。
本发明提供一种分离的酵母菌株，巴斯德酵母菌No.54(Saccharomyces pastorianus No.54)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年12月31日，保藏编号CCTCC M 2011496。
根据上述发明，其特征在于具有调节血糖的功效。
根据上述发明，其特征在于藉由所述酵母菌株产生的序列为SEQ IDNO：1的蛋白质达到调节血糖的功效；或者，其特征在于藉由所述酵母菌株产生的序列为SEQ ID NO：1的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，达到调节血糖的功效。
本发明提供一种衍生酵母菌株，其为上述发明所述酵母菌株的衍生突变体，其特征在于所述衍生酵母菌株具有调节血糖的功效。
根据上述发明，其为藉由所述衍生酵母菌株产生的序列为SEQ ID NO：1的蛋白质达到调节血糖的功效；或者，其特征在于藉由所述衍生酵母菌株产生的序列为SEQ ID NO：1的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，达到调节血糖的功效。
根据上述发明，其特征在于具有调节肥胖或其相关症状的功效。
本发明提供一种菌体提取物组合物，其包含上述发明所述酵母菌株的菌体提取物或所述酵母菌株的衍生突变体的菌体提取物中的至少任一种，其特征在于，具有调节血糖或调节肥胖或其相关症状的功效中的至少任一种。
本发明提供一种纯化菌体提取物组合物，其为由上述发明所述菌体提取物组合物，再进一步纯化而制得，其特征在于具有调节血糖或调节肥胖或其相关症状的功效中的至少任一种。
本发明提供一种纯化或人工合成的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
根据上述发明，其为具有调节血糖的功效的蛋白质；或者，其调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，以达到调节血糖的功效。
本发明提供一种重组蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1中的一个或多个氨基酸经删除、添加或取代后所衍生的序列，其特征在于所述重组蛋白质为具有调节血糖的功效的蛋白质。
根据上述发明，其调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，以达到调节血糖的功效。
本发明提供一种经分离或人工合成的核酸分子，其编码包含氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质。
根据上述发明，其中所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质具有调节血糖的功效；或者，其中所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，以达到调节血糖的功效。
本发明提供一种重组核酸分子，其为将上述发明所述的经分离或人工合成的核酸分子进行一个或多个核苷酸的取代、删除或添加后所衍生的衍生核酸分子，其特征在于所述重组核酸分子编码包含具有调节血糖的功效的蛋白质。
根据上述发明，其中所述具有调节血糖的功效的蛋白质调控目标个体细胞膜上的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的含量或胰岛素受体的含量，达到所述调节血糖的功效。
附图说明
图1：菌体提取物经柱分离后，各段收集液对分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞吸收葡萄糖的影响的柱形图。
图2：菌体提取物经柱分离后，其中的DW1收集液的蛋白质凝胶电泳分析图。
图3：分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞经所述分子量为54kDa的蛋白质处理后，细胞上各种信息分子变化量的柱形图。
图4：分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞经所述54kDa的蛋白质处理后，细胞膜上葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)变化量的蛋白质印记分析图。
具体实施方式
鉴于现有技术的局限性及缺陷，本发明提供了一种酵母菌菌株，即巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus)No.54的酵母菌菌株或其衍生突变体(其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCM2011496，保藏日期为2011.12.31，保藏中心地址为中国武汉市武昌珞珈山)，其具有调节血糖的功效，且能有效地调节II型糖尿病个体的血糖。此外，所述菌株也具有调节肥胖或其相关症状的功效。
以下提供了利用本发明的实施例的详细说明书、本发明的技术及特点，然而，所述实施例并非用以限定本发明，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种改动与修饰。
实施例1：制备具调节血糖、肥胖或其相关症状功效的酵母菌菌株及其菌体提取物
将Saccharomyces pastorianus No.54接种至麦芽提取物液体培养基(malt extract broth，MEB，购自Difico Labotories)中，于25℃培养48小时。以同样方式进行第二次活化后，将活化的Saccharomyces pastorianus No.54接种于所述麦芽提取物液体培养基，菌液浓度为105CFU/mL。20℃、150rpm振荡培养4天。离心，以二次去离子水将下层菌体清洗三次后，收集该菌体。
将离心后的湿菌体置于三角锥型瓶中，以0.1N NH4OH于30℃、100rpm条件下提取酵母菌活性物质2小时，再经冷冻干燥，所得的粉末即为酵母菌菌体提取物。
实施例2：制备STZ诱导的II型糖尿病大鼠
将雄性Sprague-Dawley(SD)品系的大鼠分只饲养于不锈钢笼中，动物房的温度维持在23±1℃，湿度则维持在40-60％。每日的光照周期为12小时，饲料与蒸馏水自由摄食。大鼠饲养至平均重量为300g时，以烟碱(nicotinamide，230mg/kg体重)和链脲佐菌素(STZ，65mg/kg体重，柠檬酸盐 缓冲液中，pH 4.6)将其诱导成II型糖尿病大鼠，一周后进行口服葡萄糖耐量试验(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)，以评估是否产生II型糖尿病症状。经确认产生糖尿病症状后的大鼠即为STZ诱导的II型糖尿病大鼠。
实施例3：制备分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞
以补充了10％胎牛血清的高葡萄糖DMEM(购自Gibco，含10μg/mL胰岛素、1μM DEX及0.5mM IBMX)培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞株(细胞株编号为BCRC60159，购自财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及菌种中心，新竹，台湾)8天，使其分化成小鼠3T3-L1脂肪细胞。利用Oil-Red-O染色剂(配方为0.3％Oil-Red-O，60％异丙醇)在室温下避光染色30分钟，以确认该细胞是否已成为分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞。
实施例4：菌体提取物对II型糖尿病大鼠空腹血糖及胰岛素浓度的影响
请参见下列表1，其为STZ诱导的II型糖尿病大鼠经喂食酵母菌菌体提取物6周后的空腹血糖及胰岛素浓度测试结果。其中，血糖的测试方式为：将10μL血浆与葡萄糖酶促试剂盒(Cat.No.GL 2623，Randox)中的试液混合，于37℃作用5分钟后，以分光光度计测量其在500nm的吸光值。比对不同浓度的标准品的标准曲线后，即可换算出血浆中的葡萄糖浓度。此外，胰岛素浓度的测试方式为：取25μL血浆，以大鼠胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia AB，Sweden)进行实验，并利用ELISA读数仪(μ Quant，BIO-TEK，U.S.A)读取其在450nm的吸光值。比对不同浓度的标准品的标准曲线后，即可换算出血浆中的胰岛素浓度。
糖尿病对照组的空腹血糖为220.65±20.88mg/dL，显着高于正常对照组空腹状态的血糖192.73±18.56mg/dL(p＜0.05)。经喂食酵母菌菌体提取物6周的糖尿病大鼠(即酵母菌体提取物组)，其空腹血糖为194.47±21.02mg/dL，显着低于糖尿病对照组的空腹血糖(p＜0.05)，且与正常对照组无显着差异，表明酵母菌菌体提取物有助于调降糖尿病个体的血糖达正常值。在大鼠空腹血浆的胰岛素浓度方面，糖尿病对照组的空腹胰岛素浓度为2.10±0.72mg/L，显着高于正常对照组的空腹胰岛素浓度1.44±0.65mg/L(p＜0.05)。经喂食酵母菌菌体提取物6周后的糖尿病大鼠，其空腹胰岛素浓为1.28±0.55 mg/L，显着降低其胰岛素浓度约达39％(p＜0.05)，并与正常对照组无显着差异。以上结果显示，经喂食酵母菌菌体提取物6周能显着调降糖尿病大鼠的高血糖及高胰岛素达正常值。
表1
以上数据为7-9只大鼠实验的结果，以平均值±标准差表示。
*代表该数据与正常对照组之间具有显着差异(p＜0.05)。
**代表该数据与糖尿病对照组之间具有显着差异(p＜0.05)。
实施例5：分离酵母菌菌体提取物中的活性物质
为了分离酵母菌菌体提取物中的降血糖物质，首先以DEAE纤维素(DEAE cellulose)与DOWEX 50WX8-200两种柱分离酵母菌菌体提取物中吸附程度不同的各个成分，并依主要波峰位置将分离液分别收集于不同管中，共计有DC1、DC2、DC3、DW1、DW2、DW3、DW4七管收集液。
请参见图1，其为菌体提取物经柱分离后，各管收集液对小鼠前脂肪细胞株3T3-L1吸收葡萄糖的影响的柱形图，其横轴由左至右依序为DC1、DC2、DC3、DW1、DW2、DW3、DW4收集液，纵轴则为3T3-L1细胞经各管收集液刺激后，葡萄糖被分化的3T3-L1脂肪细胞吸收的增加百分比。由图1可观察到，7管收集液中仅DW1收集液可增加细胞对葡萄糖的吸收，且其增加百分比达130％。
请再参见图2，其为DW1收集液的蛋白质凝胶电泳分析图，其横轴方向上第1行为已知分子量的蛋白质标志，第2行为DW1收集液，纵轴则为分子量大小。由图2可观察到DW1收集液主要含有分子量为54kDa的蛋白质，测序后发现所述分子量为54kDa的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
SEQ ID NO：1的序列如下所示：
 1 MSLSSKLSVQ DLDLKDKRVF IRVDFNVPLD GKKITSNQRI VAALPTIKYV 
51 LEHHPRYVVL ASHLGRPNGE RNEKYSLAPV AKELQSLLGK DVTFLNDCVG 
101 PEVEAAVKAS APGSVILLEN LRYHIEEEGS RKVDGQKVKA SKEDVQKFRH 
151 ELSSLADVYI NDAFGTAHRA HSSMVGFDLP QRAAGFLLEK ELKYFGKALE 
201 NPTRPFLAIL GGAKVADKIQ LIDNLLDKVD SIIIGGGMAF TFKKVLENTE 
251 IGDSIFDKAG AEIVPKLMEK AKAKGVEVVL PVDFIIADAF SADANTKTVT 
301 DKEGIPAGWQ GLDNGPESRK LFAATVAKAK TIVWNGPPGV FEFEKFAAGT 
351 KALLDEVVKS SAAGNTVIIG GGDTATVAKK YGVTDKISHV STGGGASLEL 
401 LEGKELPGVA FLSEKK
实施例6：所述分子量为54kDa的蛋白质对分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞的影响
请参见图3，其为分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞经所述分子量为54kDa的蛋白质处理后，所述细胞上各种信息分子的变化量。测试方法：细胞以染色缓冲液(PBS中的2％FBS和0.1％叠氮化钠)清洗3次，离心(300×g，5min)，将细胞分别悬浮于1mL一次抗体于室温下反应30min，以染色缓冲液清洗3次，再加入1mL FITC标记的二次抗体，于室温下反应30min，以染色缓冲液清洗3次后，以BD FACSCantoTM Flow Cytometer分析各关键酶的表达量。图3中，横轴方向由左至右包括7种信息分子，依次为活化的胰岛素受体、活化的PTP酶、活化的PI3酶、活化的PKC酶、活化的Akt酶、细胞内的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)及活化的P38MAPK酶，每种信息分子又包括三组实验，分别为空白组(以白色符号表示)、分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞未经刺激的对照组(以左斜线符号表示)及分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞经所述分子量为54kDa的蛋白质刺激的实验组(以双斜线符号表示)；纵轴为吸光值(ODvalue)，将同一种信息分子的三组实验数值互相比较后，其吸光值越高表示该信息分子的量越多。
由图3可观察到经所述54kDa的蛋白质处理后，细胞膜上活化的胰岛素受体、活化的PTP酶、活化的PI3酶、活化的PKC酶、活化的Akt酶、细胞内的葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)及活化的P38MAPK酶的量均明显增加。这些结果表明所述54kDa的蛋白质具有类似于胰岛素的三种信息传递功能，包括：1、经胰岛素受体-PTP-PI3-PKC路径刺激带有葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的囊泡往细胞膜移动的信息传递功能；2、经胰岛素受体-PTP-PI3-Akt路径刺激带有葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的囊泡往细胞膜移动的信 息传递功能；及3、经胰岛素受体-P38MAPK酶引导的促进进入细胞的葡萄糖进一步合成肝糖储存起来的信息传递功能。
请再参见图4，其为分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞经所述54kDa的蛋白质处理后，细胞膜上葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)变化量的蛋白质印记(Western blotting)分析图。测试方法：将细胞以PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，pH 7.3)清洗二次，以裂解缓冲液(Tris-HCl，pH 7.4，1mM EGTA，1mM NaF，150mM NaCl，1mM PMSF，5μg/ml亮肽素(leupeptin)，20μg/ml aprotinin，1mM Na3VO4，1％Triton X-100)及离心处理，取得细胞膜蛋白质的提取液，以120伏特电泳60分钟，电压100伏特转印60分钟，将蛋白质由电泳胶片转印至PVDF膜上，经一次GLUT4抗体及二次抗体(HRP结合的羊抗兔IgG)作用后，使用增强化学荧光系统(Enhanced chemiluminescence system，ECL)标记蛋白质，最后，将已被标记的PVDF膜，置于X-ray胶卷下感光。图4横轴方向由左至右依序为分化3T3-L1脂肪细胞未经刺激的对照组1、仅由所述分子量为54kDa的蛋白质刺激的实验组1、经胰岛素刺激的对照组2及经所述分子量为54kDa的蛋白质及胰岛素共刺激的实验组2；此外，图中的染色带颜色越深、越宽，代表该组细胞的细胞膜上含有越多的葡萄糖输送蛋白4。由图4可观察到在胰岛素不存在的情况下，54kDa活性蛋白本身即可增加细胞膜上葡萄糖输送蛋白4(GLUT4)的量(参见对照组1及实验组1的结果)；在胰岛素及所述54kDa的蛋白质共刺激的情形下，GLUT4含量也高于只加胰岛素的情形(参见对照组2及实验组2的结果)。显示在所述菌体提取物中，确实是由所述54kDa的蛋白质造成调降血糖的效果，且其调降机制与胰岛素的机制类似。
需特别说明的是，Saccharomyces pastorianus No.54酵母菌株内的所述54kDa的蛋白质，其作用机制与胰岛素类似，且单独存在的情况下即可引发反应，因此，可作为替代胰岛素作用的新型治疗物质。此外，由实施例3的结果可知Saccharomyces pastorianus No.54酵母菌株内的54kDa的蛋白质在II型糖尿病患身上仍具有降血糖功能，因此，适用于具有胰岛素抗性的个体，作为降血糖的治疗物质，且能进一步避免具有胰岛素抗性的个体长期处于高血糖的状况而发生永远无法分泌胰岛素的不利后果。
实施例7：菌体提取物对II型糖尿病大鼠体重的影响
请参见下列表2，其为正常与II型糖尿病大鼠经管喂菌体提取物6周间的起始体重、最终体重及体重增加量。由表2可知，正常对照组、糖尿病对照组及酵母菌体提取物组的起始体重分别为321.00±10.68g、313.50±8.04g及307.33±8.51g，彼此间均无显着差异。6周后，糖尿病对照组的最终体重为463.17±18.00g，体重增加量为149.67±14.81g，与正常对照组的最终体重445.00±24.54g及体重增加量124.00±18.07g之间均有显着差异(p＜0.05)，显示糖尿病大鼠的体重增加量显着高于正常大鼠。经喂食酵母菌菌体提取物6周的糖尿病大鼠(即酵母菌体提取物组)的最终体重为432.11±27.15g，体重增加量为124.78±24.38g，显着低于糖尿病对照组(p＜0.05)。比较糖尿病对照组所得体重增加量149.67g及酵母菌体提取物组所得体重增加量124.78g，体重增加量减少约16.63％。
表2
以上数据为7-9只大鼠实验的结果，以平均值±标准差表示。
*代表该数据与正常对照组之间具有显着差异(p＜0.05)。
**代表该数据与糖尿病对照组之间具有显着差异(p＜0.05)。
实施例8：菌体提取物对II型糖尿病大鼠脂肪组织重量的影响
请参见下列表3，其为正常与II型糖尿病大鼠经管饲喂菌体提取物6周后的脂肪组织重量。所述脂肪组织重量为肾周围脂肪重量与副睪脂肪重量之和。正常对照组的脂肪组织重量及相对脂肪组织重量分别为12.70±7.38g及2.83±1.57(g/100g体重)，糖尿病对照组的脂肪组织重量及相对脂肪组织重量分别为13.17±1.62g及3.02±0.40(g/100g体重)，两组之间的脂肪组织重量及相对脂肪组织重量均无显着差异。经喂食酵母菌菌体提取物6周的糖尿病大鼠(即酵母菌体提取物组)的脂肪组织重量及相对脂肪组织重量分别为10.32±2.08g及2.40±0.47(g/100g体重)，与糖尿病对照组相比均具有显着 差异(p＜0.05)。以上结果与体重增加量结果一致，推测酵母菌菌体提取物组体重增加量减少，可能与脂肪组织量减少有所关联。
表3
以上数据为7-9只大鼠实验的结果，以平均值±标准差表示。
1脂肪组织重量(g)＝肾周围脂肪重量(g)+副睪脂肪重量(g)。
*代表该数据与正常对照组之间具有显着差异(p＜0.05)。
**代表该数据与糖尿病对照组之间具有显着差异(p＜0.05)。
实施例9：菌体提取物对II型糖尿病大鼠肝脏总胆固醇的影响
请参见下列表4，其为正常与II型糖尿病大鼠经管喂菌体提取物6周后的肝脏总胆固醇浓度。其中，肝脏总胆固醇的测量方式为：以均质器均质并离心(3000xg，10min)后，将上层液以减压真空浓缩机除去有机溶剂，再以氯仿/甲醇(2∶1v/v)混和溶液定量至10mL。根据Carlson and Goldford(1979)的方法，分别取10μL上述肝脂质提取液，加入10μL Triton X-100，混合均匀以减压真空浓缩机浓缩1小时，再以市售试剂盒(Cat.No.CH 201和Cat.No.TR 213，Randox)测定肝脏总胆固醇含量。
经喂食菌体提取物6周后，正常对照组的肝脏总胆固醇浓度及单位肝脏重量的总胆固醇浓度分别为45.91±1.46mg/dL及9.18±0.29mg/g肝脏，糖尿病对照组的肝脏总胆固醇浓度及单位肝脏重量的总胆固醇浓度则分别为45.56±2.69mg/dL及9.11±0.54mg/g肝脏，两组之间的肝脏总胆固醇浓度及单位肝脏重量的总胆固醇浓度均无显着差异。经喂食酵母菌菌体提取物6周的糖尿病大鼠(即酵母菌体提取物组)的肝脏总胆固醇浓度及单位肝脏重量的总胆固醇浓度分别为42.56±1.03mg/dL及8.51±0.21mg/g肝脏，与正常对照组之间或与糖尿病对照组组之间均有显着差异(p＜0.05)。
表4
以上数据为7-9只大鼠实验的结果，以平均值±标准差表示。
*代表该数据与正常对照组之间具有显着差异(p＜0.05)。
**代表该数据与糖尿病对照组之间具有显着差异(p＜0.05)。
实施例10：菌体提取物对II型糖尿病大鼠血浆脂质浓度的影响
请参见下列表5，其为正常与II型糖尿病大鼠经管喂菌体提取物6周后的血浆脂质浓度。其中，总胆固醇浓度之测量方式为：取10μL血浆与胆固醇酶促试剂盒(Cat.No.CH 7945，Randox)中的试液混合，于37℃作用5分钟后，利用分光光度计测量其在500nm波长下的吸光值。比对不同浓度的标准品的标准曲线后，即可换算出血浆中的总胆固醇浓度。此外，高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的测量方式为：取500μL血浆与市售试剂盒(Cat.No.CH203，Randox)中的试剂混合均匀，在室温下静置10分钟后立即离心(12000xg，2min)，则上层液即为高密度脂蛋白(HDL-C)，下层则为低密度脂蛋白(LDL-C)，再以市售试剂盒(Cat.No.CH201，Randox)分别测试两种脂蛋白的含量。再者，甘油三酯浓度的测量方式为：取10μL血浆与甘油三酯酶促试剂盒(BXC0272C，Fortress)中的试液混合，于37℃作用5分钟后，利用分光光度计测量其在500nm波长下的吸光值。比对不同浓度的标准品的标准曲线后，即可换算出血浆中的甘油三酯浓度。
正常对照组血浆中的总胆固醇浓度、高密度脂蛋白浓度、低密度脂蛋白浓度及甘油三酯浓度分别为70.00±7.76mg/dL、37.54±8.40mg/dL、32.46±9.70mg/dL及127.10±28.50mg/dL，糖尿病对照组则分别为72.09±4.13mg/dL、32.56±4.53mg/dL、39.53±3.39mg/dL及143.59±42.04mg/dL，两组之间的各种指标均无显着差异。经喂食酵母菌菌体提取物6周的糖尿病大鼠(即酵母菌体提取物组)血浆中的总胆固醇浓度、高密度脂蛋白浓度、低密度脂蛋白浓度及甘油三酯浓度分别为74.77±6.29mg/dL、38.58±5.45 mg/dL、36.20±5.89mg/dL及106.72±14.05mg/dL，其中总胆固醇浓度及低密度脂蛋白浓度两项数值与糖尿病对照组之间无显着差异，高密度脂蛋白浓度显着高于糖尿病对照组(p＜0.05)，甘油三酯浓度则显着低于糖尿病对照组(p＜0.05)，降低程度达25％。
表5
以上数据为7-9只大鼠实验之结果，以平均值±标准差表不。
**代表该数据与糖尿病对照组之间具有显着差异(p＜0.05)。
综合以上结果可知，Saccharomyces pastorianus No.54酵母菌株内的所述54kDa的蛋白质，其作用机制与胰岛素类似，且单独存在的情况下即可引发反应，可作为替代胰岛素作用的新型治疗物质，且其在II型糖尿病患身上仍具有降血糖功能，可适用于具有胰岛素抗性的个体，作为有效的降血糖治疗物质，并能进一步避免具有胰岛素抗性的个体长期处于高血糖的状况而发生永远无法分泌胰岛素的不利后果。此外，Saccharomyces pastorianus No.54酵母菌株具有调节肥胖或其相关症状的功效，包括，降低体重、减少脂肪组织、降低肝脏总胆固醇浓度、提升血浆中高密度脂蛋白浓度并降低血浆中的甘油三酯浓度，利于II型糖尿病患者改善其胰岛素抗性情形。因此，本发明不但提供一种可替代胰岛素作用的新型治疗物质，且可适用于具有严重胰岛素抗性的个体，避免具有胰岛素抗性的个体发生无法分泌胰岛素的不利后果，更重要的是，其有助于肥胖者进行减重及减少体内脂肪组织，利于改善其胰岛素抗性情形而能回复自主调控血糖至正常值或接近正常值。故本发明提供的Saccharomyces pastorianus No.54酵母菌株及其衍生的活性物质(例如1.以紫外线、突变剂或其他方式得到的具有调节血糖、肥胖或其相关症状功效的所述菌株的衍生突变体；2.所述菌株或其衍生突变体的菌体提取物；3.包含所述菌体提取物的菌体提取物组合物；4.由包含所述菌体提取物的菌体提取物 组合物再进一步纯化所制得的纯化菌体提取物组合物；5.氨基酸序列为SEQID NO：1的蛋白质；6.所述蛋白质的重组蛋白质，其氨基酸序列为SEQ IDNO：1中的一个或多个氨基酸经删除、添加或取代后所衍生的序列；7.包含所述蛋白质或所述重组蛋白质的组合物；8.编码氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质的核酸分子，其是指细菌、酵母菌、真菌、植物细胞、动物细胞或其他宿主细胞能根据此核酸分子的编码信息，产生氨基酸序列为SEQ IDNO：1的蛋白质；或9.所述核酸分子的重组核酸分子，其是将所述核酸分子序列进行一个或多个核苷酸之取代、删除或添加后所衍生的序列，其是指细菌、酵母菌、真菌、植物细胞、动物细胞或其他宿主细胞能根据此重组核酸分子所编码的信息，产生氨基酸序列与SEQ ID NO：1相差一个或多个氨基酸的蛋白质，且此被编码的蛋白质具有调节血糖的功效)能有效地改善并控制各类型糖尿病患者的血糖，益于促进糖尿病在医学及药学上的发展。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的保护范围，因此，凡其他未脱离本发明所揭示的精神下所完成的各种改动或修饰等，均应包含于本申请的范围内。

Claims (4)

1.巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)在制备用于减少目标个体的体重以及增加目标个体细胞膜上葡萄糖输送蛋白4的含量的组合物中的用途，其中，所述巴氏酵母的细胞包括氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质。
2.巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)在制备用于减少目标个体的体重以及增加目标个体细胞膜上胰岛素受体的含量的组合物中的用途，其中，所述巴氏酵母的细胞包括氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质。
3.巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)在制备用于减少目标个体的体重以及调降目标个体的血糖的组合物中的用途，其中，所述巴氏酵母的细胞包括氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质。
4.如权利要求1、2或3所述的用途，其中所述目标个体为Ⅱ型糖尿病患者。
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