CN103215033B - 脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针的应用，是基于芳环构建的，具有如式所示的结构：其中R为苯基，带供电子或吸电子取代基的芳基，或喹啉、菲、联苯、蒽中的任意一种。该类化合物可制备荧光探针用于肿瘤细胞成像。

Description

脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针的应用

技术领域

本发明涉系列脱氢枞酸基二芳胺化合物及其作为荧光探针在检测肿瘤细胞中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，目前已成为人类死亡的主要原因，并且其发病率呈逐年上升的趋势。若能早期发现肿瘤并及时治疗，可大大提高肿瘤的治愈率。因此，对于肿瘤的早期检测和诊治已成为各国科学家关注的热点。荧光探针以其快速、高灵敏度等特点成为探测肿瘤细胞的首选。

脱氢枞酸主要由歧化松香分离提纯得到的具有三环菲骨架的二萜类一元树脂酸。脱氢枞酸最大的特点在于骨架中芳环的存在，可以像其它芳香簇化合物一样进行多种亲电取代反应，引进取代基或活性基团。前人研究表明，一些脱氢枞酸基二芳胺、三芳胺喹啉、三芳胺苯乙烯、含氮杂环等化合物具有较好的荧光性质(H.D.Burrows,et al.J Fluoresc,2007,(17):701;H.D.Burrows，et al.,J Fluoresc.,2006,(16):227;B.Gigante,et al.,New J Chem,2009,33:877)。

发明内容

本发明公开了一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针的应用，是一类光稳定性好、对肿瘤细胞毒性低的荧光探针，可应用于肿瘤细胞成像。

本发明的技术方案为：一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针的应用，所述的脱氢枞酸基二芳胺化合物具有如下式所示的结构：

其中R为苯基、带供电子或吸电子取代基的芳基、喹啉基、菲基、联苯基、蒽基中的任意一种；R₁为-H或异丙基。

供电子取代基为甲氧基、甲基、乙基、异丙基或苯基中的任意一种；所述的吸电子取代基为硝基、氰基、溴、氯、碘、三氟甲基中的任意一种。

所述的-NH-R的取代位置为12、13或14位。

所述的脱氢枞酸基二芳胺的结构为：

R为苯基、喹啉基、菲基、蒽基、联苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对异丙基苯基、对硝基苯基、对氰基苯基、对溴苯基、对氯苯基、对碘苯基、对三氟甲基苯基中的任意一种。

所述的脱氢枞酸基二芳胺的结构为：

R为苯基、喹啉基、菲基、蒽基、联苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对异丙基苯基、对硝基苯基、对氰基苯基、对溴苯基、对氯苯基、对碘苯基、对三氟甲基苯基中的任意一种

所述的脱氢枞酸基二芳胺的结构为：

资为苯基、喹啉基、菲基、蒽基、联苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对异丙基苯基、对硝基苯基、对氰基苯基、对溴苯基、对氯苯基、对碘苯基、对三氟甲基苯基中的任意一种。

所述的一类脱氢枞酸基二芳胺化合物按下式反应制备：

，其中R为苯基、带供电子或吸电子取代基的芳基、喹啉基、菲基、联苯基、蒽基中的任意一种；R₁为-H或异丙基。

一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针在探测肿瘤细胞中的应用。

其中R为苯基，带供电子或吸电子取代基的芳基，或喹啉、菲、卤代联苯、蒽中的任意一种。

有益效果：

1.本发明脱氢枞酸基二芳胺化合物，激发波长在285-300nm，发射波长在360-410nm之间，荧光强度较高。

2.本发明化合物，具有较好的光稳定性和较低的细胞毒性。

3.本发明化合物，可被多种肿瘤细胞所吸收，并能荧光成像。

附图说明

图1化合物L1的光稳定性。

图2化合物L1对肿瘤细胞HeLa、SMMC-7721、SGC-7901和A549的毒性。

图3化合物L1在肿瘤细胞HeLa、SMMC-7721、SGC-7901和A549中的荧光成像及荧光分布。

荧光探针在使用过程中，要受到荧光显微镜光源紫外光激发，所以需要探针较好的紫外光照稳定性。图1是化合物L1在水相中对紫外灯照射下的荧光发射波长的变化，可以看出，化合物L1在照射30min后，其荧光发射波长蓝移21nm，荧光强度降低123(a.u.),具有较好的光稳定性。

有机荧光化合物作为荧光探针应用于细胞体系中时，需要将化合物溶于水相中，这样就需要用有机溶剂如DMSO等助溶，考虑到溶剂DMSO以及化合物本身对细胞的毒性，必须进行细胞毒性试验，图2为2uM的化合物L1被四种肿瘤细胞HeLa、SMMC-7721、SGC-7901和A549摄取24h后的存活率，可见，四种细胞的存活率均大于90%，表明具有较小的细胞毒性。

图3为化合物L1在四种肿瘤细胞中的荧光显微镜成像。其中A为化合物L1在HeLa中的，B为7721的，C为7901的，D为A549的成像。

图4为化合物L1在四种肿瘤细胞中的荧光分布情况。

其中A为化合物L1在HeLa中的，B为7721的，C为7901的，D为A549的荧光分布情况。

由图3、4可见，化合物L1能被四种细胞摄取具有较好荧光成像，并且化合物富集在细胞质中，可以作为细胞质荧光探针推广应用。

图5反例的荧光成像情况。

由图5可以看出并不是所有的脱氢枞酸基二芳胺化合物都可以有很好的荧光成像的。

具体实施方式

下面通过实施例详述本发明，然而本发明不限于下列实施例。

本发明的化合物采用申请号为201210236120.2，名称为脱氢枞酸基二芳胺类化合物及其合成方法和应用中方法制备得到。

结构式为：

其中R为苯基，带供电子或吸电子取代基的芳基，或喹啉基、菲基、联苯基、蒽基中的任意一种；R₁为-H或异丙基。

所述的供电子取代基为甲氧基、甲基、乙基、或异丙基中的任意一种；所述的吸电子取代基为硝基、氰基、溴、氯、碘、三氟甲基中的任意一种。

所述的-NH-R取代位置为12、13或14位。

优选的，上述化合物，具有如下结构之一：

L1-15

R=苯、喹啉、菲、蒽、联苯、对甲氧基苯、对甲基苯、对乙基苯、对异丙基苯、对硝基苯、对氰基苯、对溴苯、对氯苯、对碘苯、对三氟甲基苯

L16-30

R=苯、喹啉、菲、蒽、联苯、对甲氧基苯、对甲基苯、对乙基苯、对异丙基苯、对硝基苯、对氰基苯、对溴苯、对氯苯、对碘苯、对三氟甲基苯

R=苯、喹啉、菲、蒽、联苯、对甲氧基苯、对甲基苯、对乙基苯、对异丙基苯、对硝基苯、对氰基苯、对溴苯、对氯苯、对碘苯、对三氟甲基苯

本发明脱氢枞酸基二芳胺类化合物的合成路线为：

脱氢枞酸基二芳胺类化合物的合成方法为，在氮气存在下，以13-胺-脱异丙基脱氢枞酸甲酯（或2-胺-脱氢枞酸甲酯、14-胺-脱氢枞酸甲酯）和芳卤化合物为起始原料，醋酸钯为催化剂、有机碱和有机膦为助催化剂，在有机溶剂中进行C-N偶联反应得到产物，本发明所用的13-胺-脱异丙基脱氢枞酸甲酯、12-胺-脱氢枞酸甲酯、14-胺-脱氢枞酸甲酯是以脱氢枞酸为原料，经过酯、硝化、还原反应，按照文献（M.A.Esteves,N.Narender,J.Nat.Prod.64(2001)761）的方法合成。

化合物1中NH2基取代位置可以是苯环的13位，也可以是12,14位；溴化物2中的R可以是苯基，也可以是带供电子或吸电子取代基的芳基，也可以是喹啉、菲、卤代联苯、蒽等。供电子取代基为甲氧基、甲基、乙基、或异丙基中的任意一种；所述的吸电子取代基为硝基、氰基、溴、氯、碘、三氟甲基中的任意一种。

溴化物2与13-胺-脱异丙基脱氢枞酸甲酯（或12-胺-脱氢枞酸甲酯、14-胺-脱氢枞酸甲酯）（1）的物料摩尔比为10:1至1:10；催化剂、助催化剂的用量为催化剂用量，醋酸钯的摩尔用量为13-胺-脱异丙基脱氢枞酸甲酯与溴化物中摩尔用量较少一方的0.01-1%；有机碱摩尔用量为13-胺-脱异丙基脱氢枞酸甲酯与溴化物中摩尔用量较少一方的0.1-10%；有机膦摩尔用量为13-胺-脱异丙基脱氢枞酸甲酯与溴化物中摩尔用量较少一方的0.1-20%；反应温度为20-200℃；反应时间为1-24小时。

其中所述的有机碱为醇钠、醇钾，正丁锂，异丁锂，叔丁锂等；其中所述的有机膦为三苯基膦、三苯基氧膦、三丁基膦、三丁基氧膦、三叔丁基膦、二苯基膦等；其中所述的有机溶剂，极性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙醇、氯仿；非极惰性性溶剂为甲苯、二甲苯、邻二甲苯或二氧六环中的任意一种。

在100ml三口烧瓶中加入13-胺-脱异丙基脱氢枞酸甲酯（0.1mmol）、对溴苯(0.11mmol)、叔丁醇钠(0.12mmol)、三丁基膦（0.01mmol）和醋酸钯催化剂，依次加入5ml二甲苯中，搅拌，通氮气，升温至130℃，反应8h。冷至室温，用乙醚萃取，有机相中加入无水硫酸镁，放置4h，过滤，减压蒸除二甲苯。经柱层析纯化，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯（8﹕1），浓缩除去洗脱剂即得二芳胺(L1)。

L3就是将上述的对溴苯换成α-溴菲；L16是将13-胺-脱异丙基脱氢枞酸甲酯换成12-胺-脱氢枞酸甲酯；L31是将13-胺-脱异丙基脱氢枞酸甲酯换成12-胺-脱氢枞酸甲酯。

以下通过实验数据说明本发明的荧光探针的光稳定性、细胞毒性及用于肿瘤细胞成像（任选化合物L1为实施例说明）。

实施例1脱氢枞酸基二芳胺化合物L1光稳定性试验

将化合物L1溶于DMSO配成浓度为25mM的母液，分别取母液5微升，配成10mL水溶液。将水溶液置于荧光比色皿中，置于距离9W的紫外灯下20cm处照射，每照射3min测试一次荧光光谱，连续照射30min。荧光强度从原来的433(a.u.)下降到310(a.u.),荧光强度没有明显降低，具有较好的光稳定性，结果如图1所示。

实施例2脱氢枞酸基二芳胺化合物L1的细胞毒性试验

取处于对数生长期的肿瘤细胞HeLa、SMMC-7721、SGC-7901和A549于10%胎牛血清（FBS）中，调整细胞悬液浓度，加于96孔培养板，每孔100μl,使待测细胞调密度至5×10⁵cell/well，置于37℃,5%CO2中孵育24h，加药L1(浓度2μΜ)10μl，再孵育24h，然后加入MTT（5mg/ml）20μl/孔，继续培养5h，用酶标仪在570nm波长下测定各孔的吸光值OD值，计算细胞的存活率，如图2。肿瘤细胞HeLa、SMMC-7721、SGC-7901和A549的幸存率分别为97.35%,96.05%,94.49%and93.07%，说明化合物对细胞毒性很低。

实施例3L1在肿瘤细胞中的荧光显微镜成像实验

所用的肿瘤细胞为HeLa、SMMC-7721、SGC-7901和A549。

将上述加药孵育好的细胞，除去悬浮液，用胎牛血清（pH=7）洗三次，置于荧光显微镜下观察。化合物能被肿瘤细胞很好吸收，并能清楚成像。结果如图3所示。化合物能较好的被细胞摄取，并能荧光成像，而且化合物富集在细胞质中。

反例

化合物的荧光成像情况见图5，在HeLa(A),7721(B),7901(C)and A549(D)中成像。由图5可以看出并不是所有的脱氢枞酸基二芳胺化合物都可以有很好的荧光成像的。所以是需要进行筛选的。

Claims (7)

1.一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针在肿瘤细胞成像中的应用，所述的脱氢枞酸基二芳胺化合物具有如下式所示的结构：

其中R为苯基、带供电子或吸电子取代基的芳基、喹啉基、菲基、联苯基、蒽基中的任意一种；R₁为-H或异丙基。

2.如权利要求1所述的一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针在肿瘤细胞成像中的应用，其特征在于，供电子取代基为甲氧基、甲基、乙基、异丙基或苯基中的任意一种；所述的吸电子取代基为硝基、氰基、溴、氯、碘、三氟甲基中的任意一种。

3.如权利要求1或2所述的一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针在肿瘤细胞成像中的应用，其特征在于，所述的-NH-R的取代位置为12、13或14位。

4.如权利要求3所述的一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针在肿瘤细胞成像中的应用，其特征在于，所述的脱氢枞酸基二芳胺的结构为：

R为苯基、喹啉基、菲基、蒽基、联苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对异丙基苯基、对硝基苯基、对氰基苯基、对溴苯基、对氯苯基、对碘苯基、对三氟甲基苯基中的任意一种；R₁为-H 或异丙基。

5.如权利要求3所述的一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针在肿瘤细胞成像中的应用，其特征在于，所述的脱氢枞酸基二芳胺的结构为：

R为苯基、喹啉基、菲基、蒽基、联苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对异丙基苯基、对硝基苯基、对氰基苯基、对溴苯基、对氯苯基、对碘苯基、对三氟甲基苯基中的任意一种。

6.如权利要求3所述的一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针在肿瘤细胞成像中的应用，其特征在于，所述的脱氢枞酸基二芳胺的结构为：

R为苯基、喹啉基、菲基、蒽基、联苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对异丙基苯基、对硝基苯基、对氰基苯基、对溴苯基、对氯苯基、对碘苯基、对三氟甲基苯基中的任意一种。

7.如权利要求1或2或4-6任一所述的一类脱氢枞酸基二芳胺化合物作为荧光探针在肿瘤细胞成像中的应用，其特征在于：所述的一类脱氢枞酸基二芳胺化合物按下式反应制备：

，其中R为苯基、带供电子或吸电子取代基的芳基、喹啉基、菲基、联苯基、蒽基中的任意一种；R₁为-H或异丙基。