CN103214489A - 一类具有抗肿瘤活性的多靶点激酶抑制剂及其制备方法 - Google Patents
一类具有抗肿瘤活性的多靶点激酶抑制剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103214489A CN103214489A CN2013100603199A CN201310060319A CN103214489A CN 103214489 A CN103214489 A CN 103214489A CN 2013100603199 A CN2013100603199 A CN 2013100603199A CN 201310060319 A CN201310060319 A CN 201310060319A CN 103214489 A CN103214489 A CN 103214489A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phenyl
- group
- amine
- base
- pyrimidine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Abstract
本发明涉及医药技术领域，是一类具有抗肿瘤活性的化合物以及其制备方法和用途。该类化合物的结构通式为：
其中，R1为烷基、杂环基、取代苯基、取代脂肪环基或脂杂环基，其中的取代基为2，3-亚乙基二氧基，3，4-亚乙基二氧基，2，3-亚甲基二氧基，3，4-亚甲基二氧基，或是各位取代的氢、烷基、烷氧基、卤素、胺基、羟基、三氟烷基、甲酸酯等；R2为杂环基、取代苯基，其中苯基的取代为2，3-亚乙基二氧基，3，4-亚乙基二氧基，2，3-亚甲基二氧基，3，4-亚甲基二氧基，或是各位取代的氢、烷基、烷氧基、卤素、胺基、羟基、三氟烷基、甲酸酯等。本发明化合物具有明显的肿瘤细胞毒作用以及广谱的激酶抑制活性，可以用来制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是关于一类具有抗肿瘤活性的N-(6-取代-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)取代苯胺类化合物的特定化学结构及其制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康，威胁人类生命的疾病。对恶性肿瘤的防治一直受到各国医学界的高度重视。研究开发新型的抗肿瘤药物始终是各国研究机构的重大研究课题。目前临床应用的抗肿瘤药物种类很多。但大多传统的药物属于细胞毒类药物。这类药物由于选择性较差，毒性大，易产生耐药性等问题，使其临床应用受到限制。因此，研究肿瘤治疗新策略，开发靶向抗肿瘤药物成为各国研究人员重点研究课题。
研究发现，细胞癌变的本质是细胞信号转导通路的失调导致的细胞无限增生，从而导致了肿瘤的发生。在各种因素参与的信号转导过程中，各种蛋白激酶介导的信号转导异常与肿瘤的发生和发展直接相关。蛋白激酶由于突变或重排，可引起信号转导过程障碍或出现异常，导致细胞生长、分化、代谢和生物学行为异常，引发肿瘤。抑制过度表达的激酶，能够抑制肿瘤生长，发挥抗肿瘤作用。因此，蛋白激酶成为抗肿瘤药物设计、开发的重要药靶。蛋白激酶抑制剂研究成为目前抗肿瘤药物的研究热点。目前已有十多个激酶抑制剂开发上市，如酪氨酸激酶(TK)抑制剂，丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)抑制剂，吉非替尼(易瑞沙)，厄洛替尼(特罗凯)，索拉非尼(多吉美)等，显示出良好的前景。但目前临床应用的激酶抑制剂也存在毒性和耐药性等问题。因此，进一步研究开发新型的，高活性，低毒的抗肿瘤激酶抑制剂用于临床治疗，具有很好的开发前景和社会意义。
发明内容：
发明人在抗肿瘤活性药物研究的过程中，发现了一类具有抗肿瘤活性的全新结构类型的N-(6-取代-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)取代苯胺类蛋白激酶抑制剂或药学上可接受的盐类。本发明同时公开了该类化合物的制备方法、医疗用途及其组合物。
对该类化合物进行肿瘤相关生物学试验表明，该类化合物具有明显的抗肿瘤活性，特别是对与肿瘤相关的多种激酶具有广谱的抑制活性。
本发明的多靶点激酶抑制剂的结构通式为：
其中：R1基团代表
(1)取代苯基；
取代苯基上的取代基可以是位于苯基的2位，3位，4位，5位，6位，取代基可以是单取代，或者是多取代，取代基是指：
a.H或者是卤素；
b.1～6个碳原子的直链或者支链烷烃；
1～6个碳原子的直链或者支链烷烃是指：甲基、三氟烷基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基；
c.亲水性取代基：羟基；
d.吸电子取代基或推电子取代基：氰基、甲酸酯、烷氧基、氨基；
e.2，3-亚乙基二氧基、3，4-亚乙基二氧基、2，3-亚甲基二氧基、3，4-亚甲基二氧基；
(2)杂环基，如：呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、吡啶-2-基、吡啶-4-基等；
(3)1～6个碳原子的直链烷烃或者末端取代的直链烷烃、1～6个碳原子的支链烷烃；
1～6个碳原子的直链或者支链烷烃是指：甲基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基；1～6个碳原子的直链烷烃末端取代基可以是多元脂肪环：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基；
(4)取代的脂肪环基或脂杂环基；
脂肪环基是指：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基；脂杂环基是指：含一个杂原子的脂肪环基，杂原子可以指：氮原子、氧原子、硫原子，脂肪环基或脂杂环基的取代基位于脂肪环基或脂杂环基上，取代基可以是单取代，或者是多取代，取代基是指：
a.H或者是卤素；
b.1～6个碳原子的直链或者支链烷烃；
1～6个碳原子的直链或者支链烷烃是指：甲基、三氟烷基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基；
c.亲水性取代基：羟基；
d.吸电子取代基或推电子取代基：氰基、甲酸酯、烷氧基、氨基；
e.2，3-亚乙基二氧基、3，4-亚乙基二氧基、2，3-亚甲基二氧基、3，4-亚甲基二氧基；
其中：R2基团代表
(1)取代苯基；
取代苯基上的取代基可以是位于苯基的2位，3位，4位，5位，6位。取代基可以是单取代，或者 是多取代，取代基是指：
a.H或者是卤素；
b.1～6个碳原子的直链或者支链烷烃；
1～6个碳原子的直链或者支链烷烃是指：甲基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基；
c.亲水性取代基：羟基；
d.吸电子取代基或推电子取代基：氰基、甲酸酯、烷氧基、氨基；
e.2，3-亚乙基二氧基、3，4-亚乙基二氧基、2，3-亚甲基二氧基、3，4-亚甲基二氧基；
(2)杂环，如：呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、吡啶-2-基、吡啶-4-基等；
本发明已合成并被证实具有抗肿瘤活性的部分N-(6-取代-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)取代苯胺类化合物的化学结构见表1。
表1部分化合物的结构表征及氢谱、质谱、部分碳谱数据
本发明包括该类化合物的制备方法如下：
1、合成路线
2、具体操作过程为：
(1)硝基苯硼酸经硝化和还原生成邻胺基苯硼酸(III)；
(2)2，4-二氯嘧啶与取代苯胺经取代反应生成6-氯-N-取代苯嘧啶-4-胺(IV)；
(3)邻胺基苯硼酸(III)与6-氯-N-取代苯嘧啶-4-胺(IV)经偶联反应生成6-邻胺基苯基-N-取代苯嘧啶-4-胺(V)；
(4)6-邻胺基苯基-N-取代苯嘧啶-4-胺(V)与各种取代甲醛经缩合反应生成6-(2-取代甲烯胺基苯基)-N-取代苯嘧啶-4-胺(VI)的盐酸盐；
(5)各种取代的甲烯胺基化合物(VI)经硼氢化钠还原环合得到N-(6-取代-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)取代苯胺类类化合物(I)
(6)按照常规方法制备为药学上可接受的盐的形式。包括其无机盐和有机盐：无机盐包括(但不限于)盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸、硝酸等；有机酸包括(但不限于)乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸、草酸等。
具体实施方式：
下面实施例为对本发明的具体描述，但实施例不应看作是对本发明范围的限制。
一.化合物的合成
实施例1：中间体6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺的制备
1.邻硝基苯硼酸(II)
反应瓶中加入苯硼酸(164mmol)和醋酐(1800ml)，于冰盐浴下冷却至-15℃，慢慢滴加含少量尿素的发烟硝酸(31.5g)，控制内温低于-10℃，约30min加完。滴完后于-5～0℃下搅拌1.5hr，然后再在5～10℃下搅拌1hr，反应液呈棕色清液。于冰水冷却下，向反应液中慢慢加入碎冰(400g)，然后搅拌1hr。减压浓缩反应液，至剩约100ml残液时，加入水(200ml)，继续减压浓缩。至剩约80ml残液后，用乙酸乙酯(150ml×3)提取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩，得褐色油状物。将油状物用甲苯(100ml)回流打浆1hr，冷却至室温后搅拌2hr，过滤，得浅棕色固体。将固体用环己烷/乙酸乙酯(1∶1)重结晶，过滤后干燥，得淡黄色化合物(11.5g)，收率42％，Mp：138-140℃(分解)。
2.邻胺基苯硼酸(III)
反应瓶中加入化合物II(8g，47.9mmol)、乙醇(40ml)和水(60ml)，于50℃油浴下保温。氮气保护下，加入铁粉(16g)和浓盐酸(0.5ml)，保温反应3hr。反应结束后，向反应液中加入乙醇(80ml)，趁热用硅藻土过滤，得浅褐色清液。减压浓缩后为褐色固体，用50％乙醇重结晶，过滤后干燥，得浅灰色色化合物(5.5g)，收率83％。
3.6-氯-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺
反应瓶中加入2，4-二氯嘧啶(14.9g，100mmol)、6-氨基-1，4-苯并二氧杂环(19.6g、130mmol)和异丙醇(150ml)，加热回流0.5hr。冷却至室温后，加入浓盐酸(15ml)，于室温下搅拌2hr，过滤，用少量异丙醇洗涤，抽干，滤饼于50℃下鼓风干燥得淡紫色固体(17g)，收率56.7％。
4.6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺
反应瓶中加入化合物III(1.9g，14mmol)、化合物IV(3.0g，10mmol)、固体碳酸钠(5.3g，50mmol)、DME(120ml)、乙醇(16ml)和水(24ml)，在氮气保护下，加入三苯基膦氯化钯(0.35g，0.5mmol)。于90℃油浴中保温搅拌1hr，冷却至室温后，分液，水相用DME(100ml×2)提取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。有机相减压浓缩后得褐色粘稠物，用二氯甲烷(10ml)重结晶，滤饼干燥后得灰白色固体(2.9g)，
实施例2：目标化合物N-(6-(吡啶-4-基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物1)
反应瓶中加入6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)，4-吡啶甲醛(1.2mmol)和无水乙醇(6ml)，搅拌15min。滴加浓盐酸(0.2ml)，然后于室温下搅拌2hr，过滤固体，少量乙醇洗涤，抽干，滤饼于50℃下鼓风干燥，得黄色固体6-(2-(吡啶-4-基甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率91％。
反应瓶中加入6-(2-(吡啶-4-基甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.7mmol)和无水乙醇(6ml)，搅拌15min。然后分三批加入硼氢化钠(1mmol)，室温下搅拌1hr，TLC检测无反应物后，将反应液用稀盐酸淬灭，减压浓缩至干。所得固体用凝胶柱层析，甲醇洗脱，馏分浓缩后得黄色固体N-(6-(吡啶-4-基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(1)，收率94％。
实施例3：目标化合物N-(6-(4-(三氟甲基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物2)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺与4-三氟甲基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-((4-三氟甲基)苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-((4-三氟甲基)苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-(三氟甲基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(2)，收率43％。
实施例4：目标化合物N-(6-(2，6-二氯苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物3)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与2，6-二氯苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(2，6-二氯苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率93％。
按实施例2的方法，6-(2-(2，6-二氯苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(2，6-二氯苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(3)，收率45％。
实施例5：目标化合物N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物4)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与4-叔丁基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-((4-叔丁基)苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率90％。
按实施例2的方法，6-(2-((4-叔丁基)苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(4)，收率47％。
实施例6：目标化合物N-(6-(吡啶-2-基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物5)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与2-吡啶甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(吡啶-2-基甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率95％。
按实施例2的方法，6-(2-(吡啶-2-基甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(吡啶-2-基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(5)，收率87％。
实施例7：目标化合物N-(6-(4-甲基苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物6)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与4-甲基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-甲基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-甲基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-甲基苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(6)，收率44％。
实施例8：目标化合物N-(6-苯基-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物7)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-(苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-苯基-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(7)，收率54％。
实施例9：目标化合物N-(6-(3，5-二甲氧基苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物8)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与3，5-二甲氧基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(3，5-二甲氧基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-(3，5-二甲氧基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(3，5-二甲氧基苯基)-3，4，6，7-四氢-2HH-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(8)，收率50％。
实施例10：目标化合物N-(6-(2-氟苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物9)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与2-氟苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(2-氟苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率90％。
按实施例2的方法，6-(2-(2-氟苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(2-氟苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(9)，收率54％。
实施例11：目标化合物N-(6-(4-氟苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物10)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol) 与4-氟苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-氟苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率95％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-氟苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-氟苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(10)，收率56％。
实施例12：目标化合物N-(6-(2，4-二氯苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物11)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与2，4-二氯苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(2，4-二氯苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率90％。
按实施例2的方法，6-(2-(2，4-二氯苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(2，4-二氯苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(11)，收率38％。
实施例13：目标化合物N-(6-(2-氯苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物12)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与2-氯苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(2-氯苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-(2-氯苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(2-氯苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(12)，收率54％。
实施例14：目标化合物甲基-4-(2-((2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)烯胺)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-6-基)苯酸酯(表1中化合物13)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与4-甲酰基苯甲酸甲酯(1.2mmol)反应生成黄色固体甲基4-(((2-(6-((2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)胺基)嘧啶-4-基)苯基)亚胺)甲基)苯酸酯，收率94％。
按实施例2的方法，甲基4-(((2-(6-((2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)胺基)嘧啶-4-基)苯基)亚胺)甲基)苯酸酯用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体甲基4-(2-((2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)烯胺)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-6-基)苯酸酯(13)，收率54％。
实施例15：目标化合物N-(6-(4-氯苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物14)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与4-氯苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-氯苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-氯苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-氯苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(14)，收率54％。
实施例16：目标化合物N-(6-(4-溴苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二 氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物15)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与4-溴苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-溴苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率90％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-溴苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-溴苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(15)，收率50％。
实施例17：目标化合物N-(6-(苯并[d][1，3]二氧五环-5-基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物16)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与3，4-(亚甲二氧基)苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(苯并[d][1，3]二氧五环-5-基甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-(苯并[d][1，3]二氧五环-5-基甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(苯并[d][1，3]二氧五环-5-基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(16)，收率43％。
实施例18：目标化合物N-(6-(噻吩-2-基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物17)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与2-噻吩甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-((噻吩-2-基甲烯)胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-((噻吩-2-基甲烯)胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(噻吩-2-基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(17)，收率44％。
实施例19：目标化合物N-(6-(4-羟基苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b]1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物18)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与4-羟基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-羟基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-羟基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-羟基苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(18)，收率54％。
实施例20：目标化合物N-(6-(3，4-二甲氧基苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(表1中化合物19)
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺(0.32g，1mmol)与3，4-二甲氧基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(3，4-二甲氧基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺，收率97％。
按实施例2的方法，6-(2-(3，4-二甲氧基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(3，4-二甲氧基苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并 [1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-胺(19)，收率50％。
实施例21：目标化合物N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)苯胺(表1中化合物20)
按实施例1的方法合成化合物，6-邻胺基苯基-N-苯基嘧啶-4-胺。
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-苯基嘧啶-4-胺(1mmol)与4-叔丁基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-苯基嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-苯基嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)苯胺(20)，收率54％。
实施例22：目标化合物N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-4-甲氧基苯胺(表1中化合物21)
按实施例1的方法合成化合物，6-邻胺基苯基-N-(4-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺。
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(4-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺(1mmol)与4-叔丁基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(4-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺，收率94％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(4-甲氧基苯基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-4-甲氧基苯胺(21)，收率51％。
实施例23：目标化合物N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-4-氯苯胺(表1中化合物22)
按实施例1的方法合成化合物，6-邻胺基苯基-N-(4-氯苯基)嘧啶-4-胺。
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(4-氯苯基)嘧啶-4-胺(1mmol)与4-叔丁基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(4-氯苯基)嘧啶-4-胺，收率93％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(4-氯苯基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-4-氯苯胺(22)，收率51％。
实施例24：目标化合物N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，4-二甲基苯胺(表1中化合物23)
按实施例1的方法合成化合物，6-邻胺基苯基-N-(2，4-二甲基苯基)嘧啶-4-胺。
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，4-二甲基苯基)嘧啶-4-胺(1mmol)与4-叔丁基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，4-二甲基苯基)嘧啶-4-胺，收率93％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，4-二甲基苯基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，4-二甲基苯胺(23)，收率51％。
实施例25：目标化合物N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，5-二甲氧基苯胺(表1中化合物24)
按实施例1的方法合成化合物，6-邻胺基苯基-N-(2，5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺。
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(2，5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺(1mmol)与4-叔丁基苯甲醛 (1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺，收率93％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(2，5-二甲氧基苯基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-2，5-二甲氧基苯胺(24)，收率51％。
实施例26：目标化合物N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-4-(三氟甲基)苯胺(表1中化合物25)
按实施例1的方法合成化合物，6-邻胺基苯基-N-(4-(三氟甲基)苯基)嘧啶-4-胺。
按实施例2的方法，6-邻胺基苯基-N-(4-(三氟甲基)苯基)嘧啶-4-胺(1mmol)与4-叔丁基苯甲醛(1.2mmol)反应生成黄色固体6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(4-(三氟甲基)苯基)嘧啶-4-胺，收率93％。
按实施例2的方法，6-(2-(4-叔丁基苯甲烯胺基)苯基)-N-(4-(三氟甲基)苯基)嘧啶-4-胺用硼氢化钠还原环合，生成淡黄色固体N-(6-(4-(叔丁基)苯基)-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)-4-(三氟甲基)苯胺(25)，收率51％。
二、本发明化合物的细胞毒试验
实验瘤株：A549(人肺腺癌细胞)、HCT116(人结肠癌细胞)、ZR-75-30(人乳腺癌细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、HL-60(人白血病细胞)作为筛选对象，均由上海医药工业研究院药理室提供。K562、BGC-823、SMMC-7721、HepG2、HT-29和SK-OV-3均由江苏正大天晴药业股份有限公司提供。
培养液及试验器材：
样品配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成1000μM的溶液或均匀的混悬液，然后用含DMSO的PBS(-)稀释。终浓度为100、10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml。
培养液：DMEM+10％FBS+双抗
其他材料：全波长多功能酶标仪；型号：Varioskan Flash；生产厂商：Thermo scientific；进口96孔培养板等。
试验方法：
MTT法：96孔板每孔加入浓度为4-5×104个/ml的细胞悬液100μl，置37℃，5％CO2培养箱内。24h后，加入样品液，10μl/孔，设双复孔，37℃，5％CO2作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，作用4h后加入溶解液，100μl/孔，置培养箱内，溶解后用全波长多功能酶标仪测570nm OD值。并计算细胞抑制率，以相应溶媒作阴性对照。
部分化合物细胞毒活性：见表2
表2、部分化合物对肿瘤细胞增殖的抑制IC50值(μM)
*NR表示无数据
由此可见，本发明化合物具有抗肿瘤活性，特别是化合物4的细胞毒活性比较显著。
三、本发明中化合物4对30种激酶蛋白的抑制试验
利用Mobility Shift Assay的方法在Km ATP的情况下，在激酶上对化合物4进行筛选；检测化合物4对激酶的IC50。
利用Lance Ultra Assay的方法在Km ATP的情况下，mTOR上对化合物4进行筛选。
利用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay的方法在Km ATP的情况下，P13Ka上对化合物4进行筛选；
利用Lanthascreen Assay的方法在Km ATP的情况下，BRAF上对化合物4进行筛选：
背景
在这个实验中，筛选的最高浓度为200uM，3倍梯度稀释，10个浓度2复孔检测。
实验激酶蛋白：激酶蛋白见表3，均由睿智化学提供。
表3激酶蛋白信息
实验方法：
I.Mobility shift assay
1.配制1x的激酶缓冲液和终止液
1).不含MnCl2的1倍激酶缓冲液：50mM HEPES，pH7 .5，0.0015％Brij-35，10mM MgCl2，2mM DTT 2).含MnCl2的1倍激酶缓冲液：50mM HEPES，pH 7.5，0.0015％Brij-35，10mM MgCl2，10mM MnCl2，2mM DTT
3).终止液：100mM HEPES，pH 7.5，0.015％Brij-35，0.2％Coating Reagent#3，50mM EDTA
2.化合物配制
1)化合物稀释
化合物4检测终浓度为200uM，首先配置成50X浓度，即10mM。在96孔板的第一行孔中加入50μl的20mM化合物，加入50μl的100％DMSO，配成100μl的10mM化合物。
将配制的10mM化合物加100μl到一个96孔板的第二个孔，第三至第十二孔加入60μl的100％DMSO，从第二孔吸出30μl化合物加到第三个孔，依次向下做3倍稀释，共稀释10个浓度。
2)转移5倍化合物到反应板
从上述96孔板的每一孔取10μl到另一块96孔板中，加入90μl超纯水。因此化合物溶解于10％DMSO中。
从上述96孔板中取出5μl到一块384孔反应板。因此，384孔反应板中就有5μl的10％DMSO溶解的5倍化合物。阴性对照孔中加入5ul250mM的EDTA。
3.激酶反应
1)配制2.5倍酶溶液
将激酶加入1倍激酶缓冲液，形成2.5倍酶溶液。
2)配制2.5倍的底物溶液
将FAM标记的多肽和ATP加入1倍激酶缓冲液，形成2.5倍底物溶液。
3)向384孔板中加入酶溶液
384孔反应板中已有5μl的10％DMSO溶解的5倍化合物。
在384孔反应板中加入10μl的2.5倍酶溶液。
室温下孵育10分钟。
4)向384孔板中加入底物溶液
在384孔反应板中加入10μl的2.5倍底物溶液。
5)激酶反应和终止
28℃下孵育一定时间(由各个激酶决定)。
加25μl终止液终止反应。
4.Caliper读取数据
Caliper上读取转化率数据。
5.抑制率计算
从Caliper上复制转化率数据。
把转化率转化成抑制率数据。其中max是指DMSO对照的转化率，min是指无酶活对照的转化率。
Percent inhibition＝(max-conversion)/(max-min)*100.
II.mTor激酶反应
1.配制1x的激酶缓冲液
1xKinase base buffer，50mM HEPES，pH 7.5，10mM MgCl2，1mM EGTA，3mM MnCl2，0.01％Tween-20，2mM DTT
2.化合物配制
1)化合物检测终浓度为200uM，首先配置成100倍浓度，即20mM。将配制的20mM化合物加100μl到一个96孔板的第二个孔，第三至第十二孔加入60μl的100％DMSO，从第二孔吸出30μl化合物加到第三个孔，依次向下做3倍稀释，共稀释10个浓度。
2)第一孔和第十二孔中分别加入100μl 100％DMSO
3)化合物中间稀释。转移4μl化合物到一个新的96孔板中，加入96μl的1x的激酶缓冲液，在振板机上振荡混匀10分钟。
4)转移化合物到反应板，从上述96孔板中取出2.5μl到一块384孔反应板。例如，从96孔板的A1孔转移2.5ul的化合物到384孔板的A1和A2孔中，96孔板的A2孔转移2.5ul的化合物到384孔板的A3和A4孔中，依次类推。
3.配制4x激酶溶液
1)使用1倍激酶缓冲液配置4倍mTor溶液。激酶溶液终浓度为2.5nM。
2)转移2.5μl4倍酶溶液到384孔板反应孔中，阴性对照孔加入1倍激酶缓冲液。
3)振荡，混匀，室温下静置
4.配制2x底物溶液
1)使用1倍激酶缓冲液配置2倍底物溶液。
底物溶液终浓度为ULight-4E-BP1 50nM；ATP 10.8uM。
2)转移5μl 2倍底物溶液到384孔板反应孔中起始反应
3)振荡，混匀。
5.激酶反应
将96孔板盖上盖子，于室温下孵育1小时。
6.反应结果的检测
1)将检测试剂平衡到室温。
2)转移10μl检测试剂到384孔板反应孔中终止反应。
3)在振板机上轻轻振荡15分钟。室温下平衡1小时。
7.数据读取
在Envision读取样品发光数值。
8.曲线拟合
1)从Envision程序上复制发光读数的数据
2)将发光读数的值通过公式转换为抑制百分率。
Percent inhibition＝(Lance signal-min)/(max-min)*100.
“max”为不加酶进行反应的对照样荧光读数；“min”为加入DMSO作为对照的样品荧光读数。
3)将数据导入MS Excel并使用Graphpad5.0进行曲线拟合。
III.PI3Ka激酶反应
1.配制1x的激酶缓冲液：50mM HEPES，pH 7.5，3mM MgCl2，1mM EGTA，100mM NaCl，0.03％CHAPS，2mM DTT
2.化合物配制
1)化合物检测终浓度为200uM，首先配置成100倍浓度，即20mM。将配制的20mM化合物加100μl到一个96孔板的第二个孔，第三至第十二孔加入60μl的100％DMSO，从第二孔吸出30μl化合物加到第三个孔，依次向下做3倍稀释，共稀释10个浓度。
2)化合物中间稀释。转移4μl化合物到一个新的96孔板中，加入96μl的1x的激酶缓冲液，在振板机上振荡混匀10分钟。
3)转移化合物到反应板，从上述96孔板中取出2.5μl到一块384孔反应板。例如，从96孔板的A1孔转移2.5ul的化合物到384孔板的A1和A2孔中，96孔板的A2孔转移2.5ul的化合物到384孔板的A3和A4孔中，依次类推。
3.配制4x激酶溶液
1)使用1倍激酶缓冲液配置4倍PI3Ka溶液。
激酶溶液终浓度为PI3Ka 1.65nM。
2)转移2.5μl 4倍酶溶液到384孔板反应孔中，阴性对照孔加入1倍激酶缓冲液。
3)振荡，混匀，室温下静置
4.配制2x底物溶液
1)使用1倍激酶缓冲液配置2倍底物溶液。
底物溶液终浓度为PIP2 50uM；ATP 25uM。
2)转移5μl 2倍底物溶液到384孔板反应孔中起始反应
3)振荡，混匀。
5.激酶反应
将96孔板盖上盖子，于室温下孵育1小时。
6.反应结果的检测
1)将Kinase-Glo检测试剂平衡到室温。
2)转移10μl Kinase-Glo检测试剂到384孔板反应孔中终止反应。
3)在振板机上轻轻振荡15分钟。
7.数据读取
在Flexstation读取样品发光数值。
8.曲线拟合
1)从Flexstation程序上复制发光读数的数据
2)将发光读数的值通过公式转换为抑制百分率。
Percent inhibition＝(max-conversion)/(max-min)*100.
“max”为不加酶进行反应的对照样荧光读数；“min”为加入DMSO作为对照的样品荧光读数。
3)将数据导入MS Excel并使用Graphpad 5.0进行曲线拟合。
IV.Kinase BRAF激酶反应
1.配制1x酶缓冲液
用5x激酶缓冲液稀释到1x酶缓冲液
2.化合物配制
1)化合物检测终浓度为200uM，首先配置成100倍浓度，即20mM。将配制的20mM化合物加100μl到一个96孔板的第二个孔，第三至第十二孔加入60μl的100％DMSO，从第二孔吸出30μl化合物加到第三个孔，依次向下做3倍稀释，共稀释10个浓度。
2)第一孔和第十二孔中分别加入100μl 100％ DMSO
3)化合物中间稀释。转移4μl化合物到一个新的96孔板中，加入96μl的1x的激酶缓冲液，在振板机上振荡混匀10分钟。
4)转移化合物到反应板，从上述96孔板中取出2.5μl到一块384孔反应板。例如，从96孔板的A1孔转移2.5ul的化合物到384孔板的A1和A2孔中，96孔板的A2孔转移2.5ul的化合物到384孔板的A3和A4孔中，依次类推。
3.配制2x激酶溶液
1)使用1倍激酶缓冲液配置2倍BRAF溶液。
激酶溶液终浓度为：3.5nM
2)转移5μl 2倍酶溶液到384孔板反应孔中，阴性对照孔加入1倍激酶缓冲液。
3)振荡，混匀，室温下静置
4.配制4x底物溶液
1)使用1倍激酶缓冲液配置4倍底物溶液。
底物溶液终浓度为：Fluorescein-MAP2K1 0.2uM；；ATP 0.5uM；
2)转移2.5μl 4倍底物溶液到384孔板反应孔中起始反应
3)振荡，混匀。
5.激酶反应
将96孔板盖上盖子，于室温下孵育1小时。
6.反应终止
1)使用Antibody缓冲液配置2倍终止液。
终止液终浓度为：Antibody2nM；EDTA10mM
2)转移10μl终止液到每个反应孔中，振荡1分钟，室温静置30分钟。
7.数据读取
在Envision读取样品发光数值。
8.曲线拟合
1)从Envision程序上复制发光读数的数据
2)将发光读数的值通过公式转换为抑制百分率。
Percent inhibition＝(max-sample ratio)/(max-min)*100.
max”为不加酶进行反应的对照样荧光读数；“min”为加入DMSO作为对照的样品荧光读数。
3)将数据导入MS Excel并使用Graphpad5.0进行曲线拟合。
化合物4的激酶抑制活性：见表4。
表4化合物4对30种激酶的抑制IC50值(uM)
由此可见，化合物4对绝大部分激酶均由相当的抑制活性，为广谱性的激酶抑制剂。
综上所述，本发明化合物N-(6-取代-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)取代苯胺类化合物是一类全新结构的具有抗肿瘤活性的化合物，其中部分化合物具有明显的细胞毒作用以及广谱的激酶抑制活性，这为进一步深入研究和开发新的抗肿瘤药物开辟了新的途径和方向。
Claims (4)
1.N-(6-取代-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)取代苯胺类化合物类抗肿瘤化合物或其药学上可接受的加成盐，结构通式如下：
其中：R1基团代表
(1)取代苯基；
取代苯基上的取代基可以是位于苯基的2位，3位，4位，5位，6位，取代基可以是单取代，或者是多取代，取代基是指：
a.H或者是卤素；
b.1～6个碳原子的直链或者支链烷烃；
1～6个碳原子的直链或者支链烷烃是指：甲基、三氟烷基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基；
c.亲水性取代基：羟基；
d.吸电子取代基或推电子取代基：氰基、甲酸酯、烷氧基、氨基；
e.2，3-亚乙基二氧基、3，4-亚乙基二氧基、2，3-亚甲基二氧基、3，4-亚甲基二氧基；
(2)杂环基，如：呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、吡啶-2-基、吡啶-4-基等；
(3)1～6个碳原子的直链烷烃或者末端取代的直链烷烃、1～6个碳原子的支链烷烃；
1～6个碳原子的直链或者支链烷烃是指：甲基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基；1～6个碳原子的直链末端取代基可以是多元脂肪环：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基；
(4)取代的脂肪环基或脂杂环基；
脂肪环基是指：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基；脂杂环基是指：含一个杂原子的脂肪环基，杂原子可以指：氮原子、氧原子、硫原子，脂肪环基或脂杂环基的取代基位于脂肪环基或脂杂环基上，取代基可以是单取代，或者是多取代，取代基是指：
a.H或者是卤素；
b.1～6个碳原子的直链或者支链烷烃；
1～6个碳原子的直链或者支链烷烃是指：甲基、三氟烷基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基；
c.亲水性取代基：羟基；
d.吸电子取代基或推电子取代基：氰基、甲酸酯、烷氧基、氨基；
e.2，3-亚乙基二氧基、3，4-亚乙基二氧基、2，3-亚甲基二氧基、3，4-亚甲基二氧基；
其中：R2基团代表
(1)取代苯基；
取代苯基上的取代基可以是位于苯基的2位，3位，4位，5位，6位。取代基可以是单取代，或者是多取代，取代基是指：
a.H或者是卤素；
b.1～6个碳原子的直链或者支链烷烃；
1～6个碳原子的直链或者支链烷烃是指：甲基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基；
c.亲水性取代基：羟基；
d.吸电子取代基或推电子取代基：氰基、甲酸酯、烷氧基、氨基；
e.2，3-亚乙基二氧基、3，4-亚乙基二氧基、2，3-亚甲基二氧基、3，4-亚甲基二氧基；
(2)杂环基，如：呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、吡啶-2-基、吡啶-4-基等。
2.按权利要求1所述的化合物，其特征在于R1和R2基团作如下搭配：
3.权利要求1至2所述的化合物或其加成盐的制备方法，包括如下步骤：
(1)硝基苯硼酸经硝化和还原生成邻胺基苯硼酸(III)；
(2)2，4-二氯嘧啶与取代苯胺经取代反应生成6-氯-N-取代苯嘧啶-4-胺(IV)；
(3)邻胺基苯硼酸(III)与6-氯-N-取代苯嘧啶-4-胺(IV)经偶联反应生成6-邻胺基苯基-N-取代苯嘧啶-4-胺(V)；
(4)6-邻胺基苯基-N-取代苯嘧啶-4-胺(V)与各种取代甲醛经缩合反应生成6-(2-取代甲烯胺基苯基)-N-取代苯嘧啶-4-胺(VI)的盐酸盐；
(5)各种取代的甲烯胺基化合物(VI)经硼氢化钠还原环合得到N-(6-取代-3，4，6，7-四氢-2H-嘧啶并[1，6-c]喹唑啉-2-烯基)取代苯胺类类化合物(I)
(6)按照常规方法制备为药学上可接受的盐的形式。包括其无机盐和有机盐：无机盐包括(但不限于)盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸、硝酸等；有机酸包括(但不限于)乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸、草酸等。
4.权利要求1至3所述的化合物或其加成盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310060319.9A CN103214489B (zh) | 2013-02-25 | 2013-02-25 | 一类具有抗肿瘤活性的多靶点激酶抑制剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310060319.9A CN103214489B (zh) | 2013-02-25 | 2013-02-25 | 一类具有抗肿瘤活性的多靶点激酶抑制剂及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103214489A true CN103214489A (zh) | 2013-07-24 |
| CN103214489B CN103214489B (zh) | 2016-10-26 |
Family
ID=48812697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310060319.9A Expired - Fee Related CN103214489B (zh) | 2013-02-25 | 2013-02-25 | 一类具有抗肿瘤活性的多靶点激酶抑制剂及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103214489B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104788484A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-07-22 | 杭州拜善晟生物科技有限公司 | 一种2-硝基苯基硼酸的合成方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1198743A (zh) * | 1995-10-02 | 1998-11-11 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 作为5HT2c－受体拮抗剂的嘧啶衍生物 |
| WO2003050090A1 (en) * | 2001-11-27 | 2003-06-19 | Wyeth Holdings Corporation | 3-cyanoquinolines as inhibitors of egf-r and her2 kinases |
| CN101631464A (zh) * | 2006-12-05 | 2010-01-20 | 拜耳先灵医药股份有限公司 | 用于治疗过度增殖疾病和血管发生相关性疾病的2,3-二氢咪唑并[1,2-c]喹唑啉取代衍生物 |
| CN102906094A (zh) * | 2010-11-11 | 2013-01-30 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 用于治疗过度增殖性病症和与血管发生相关的疾病的氨基醇取代的2,3-二氢咪唑并[1,2-c]喹唑啉衍生物 |
-
2013
- 2013-02-25 CN CN201310060319.9A patent/CN103214489B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1198743A (zh) * | 1995-10-02 | 1998-11-11 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 作为5HT2c－受体拮抗剂的嘧啶衍生物 |
| WO2003050090A1 (en) * | 2001-11-27 | 2003-06-19 | Wyeth Holdings Corporation | 3-cyanoquinolines as inhibitors of egf-r and her2 kinases |
| CN101631464A (zh) * | 2006-12-05 | 2010-01-20 | 拜耳先灵医药股份有限公司 | 用于治疗过度增殖疾病和血管发生相关性疾病的2,3-二氢咪唑并[1,2-c]喹唑啉取代衍生物 |
| US20110083984A1 (en) * | 2006-12-05 | 2011-04-14 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Substituted 2,3-dihydroimidazo[1,2-c]quinazoline Derivatives Useful for Treating Hyper-Proliferative Disorders and Diseases Associated with Angiogenesis |
| CN102906094A (zh) * | 2010-11-11 | 2013-01-30 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 用于治疗过度增殖性病症和与血管发生相关的疾病的氨基醇取代的2,3-二氢咪唑并[1,2-c]喹唑啉衍生物 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MIZUHARA, TSUKASA 等: "Concise synthesis and anti-HIV activity of pyrimido[1,2-c][1,3]benzothiazin-6-imines and related tricyclic heterocycles", 《ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY》, vol. 10, no. 33, 22 June 2012 (2012-06-22) * |
| PING YIN 等: "Synthesis of 2,4-Diaminoquinazolines and Tricyclic Quinazolines by Cascade Reductive Cyclization of Methyl N-Cyano-2-nitrobenzimidates", 《THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY》, vol. 77, no. 6, 27 January 2012 (2012-01-27) * |
| RENZHONG FU 等: "Rapid Access to Pyrimido[5,4-c]isoquinolines via a Sulfur Monoxide Extrusion Reaction", 《ORGANIC LETTERS》, vol. 9, no. 4, 20 January 2007 (2007-01-20) * |
| 周峰 等: "具新生血管抑制及血管阻断双重作用的肿瘤血管靶向药物研究进展", 《药学进展》, vol. 37, no. 1, 15 January 2013 (2013-01-15) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104788484A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-07-22 | 杭州拜善晟生物科技有限公司 | 一种2-硝基苯基硼酸的合成方法 |
| CN104788484B (zh) * | 2015-04-30 | 2017-01-11 | 杭州拜善晟生物科技有限公司 | 一种2-硝基苯基硼酸的合成方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103214489B (zh) | 2016-10-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Design, synthesis and biological evaluation of novel thieno [3, 2-d] pyrimidine derivatives containing diaryl urea moiety as potent antitumor agents | |
| EP3567043B1 (en) | 2-[[5-[(4-hydroxy-3-chloro-2-methyl)-phenyl]-thieno[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]-3-(2-methoxybenzene)propanoic acid derivatives as mcl-1 and bcl-2 inhibitors for treating cancer | |
| Durgun et al. | Synthesis of 4-sulfamoylphenyl-benzylamine derivatives with inhibitory activity against human carbonic anhydrase isoforms I, II, IX and XII | |
| EP2155734A2 (en) | Triazolyl aminopyrimidine compounds | |
| Tang et al. | Discovery of novel 7-azaindole derivatives bearing dihydropyridazine moiety as c-Met kinase inhibitors | |
| Umadevi et al. | Synthesis and in-vitro antibacterial activity of some new urea, thiourea and thiosemicarbazide derivatives | |
| Li et al. | Design, Synthesis and Evaluation of Novel Rhodanine‐containing Sorafenib Analogs as Potential Antitumor Agents | |
| KR20080093155A (ko) | 키나제 억제제로서의 헤테로비시클릭 카르복스아미드 | |
| Ebenezer et al. | Antibacterial evaluation and molecular docking studies of pyrazole–thiosemicarbazones and their pyrazole–thiazolidinone conjugates | |
| CN104803925A (zh) | 一类以 fgfr 为靶点的 2,4,5-三取代嘧啶类化合物及其制备方法和用途 | |
| Abdelhameed et al. | Synthesis of arylidene hydrazinylpyrido [2, 3-d] pyrimidin-4-ones as potent anti-microbial agents | |
| Jarrahpour et al. | Synthesis of novel mono-and bis-Schiff bases of morpholine derivatives and the investigation of their antimalarial and antiproliferative activities | |
| Farooq et al. | One‐pot and two‐pot methods for chalcone derived pyrimidines synthesis and applications | |
| Hu et al. | Design, synthesis and biological evaluation of novel thieno [3, 2-d] pyrimidine and quinazoline derivatives as potent antitumor agents | |
| Ma et al. | Synthesis and Biological Evaluation of Benzothiazole Derivatives Bearing the ortho‐Hydroxy‐N‐acylhydrazone Moiety as Potent Antitumor Agents | |
| Rashdana et al. | A novel approach of potent antioxidant and antimicrobial agents containing coumarin moiety accompanied with cytotoxicity studies on the newly synthesized derivatives | |
| Quiroga et al. | Preparation of 6-chloropyrazolo [3, 4-b] pyridine-5-carbaldehydes by Vilsmeier–Haack reaction and its use in the synthesis of heterocyclic chalcones and dipyrazolopyridines | |
| CN103450176A (zh) | 一类含2-（4-氨基苯基）苯并噻唑萘酰亚胺化合物及其应用 | |
| Bhatt et al. | Synthesis of some bioactive sulfonamide and amide derivatives of piperazine incorporating imidazo [1, 2-B] pyridazine moiety | |
| Patle et al. | Synthesis and evaluation of 2, 4, 6-trisubstituted pyrimidine derivatives as novel antileishmanial agents | |
| Sridhar et al. | Synthesis and anticancer activity of some novel pyrimidine derivatives | |
| Dave et al. | Syntheses and anti-microbial evaluation of new quinoline scaffold derived pyrimidine derivatives | |
| Mettu et al. | Mechanistic investigations on substituted benzene sulphonamides as apoptosis inducing anticancer agents | |
| Das et al. | An efficient stereo-controlled synthesis of bis-pyrimido-[4, 5-d]-pyrimidine derivatives via aza-Diels–Alder methodology and their preliminary bioactivity | |
| CN103214489A (zh) | 一类具有抗肿瘤活性的多靶点激酶抑制剂及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20161026 Termination date: 20170225 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |