CN103203225A - 一种弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相及其制备方法和应用 - Google Patents
一种弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种结构通式(I)所示的色谱固定相,该色谱固定相是将硅烷偶联剂键合到表面带有羟基的活化硅胶表面上,再将PEG键合到表面带有环氧基的硅胶固定相上,最后再与丁二酸酐或邻苯二甲酸酐等反应而获得。本发明固定相稳定、合成成本低、使用寿命长、分离效果好,用一根色谱柱实现IEC-HIC或HIC-IEC二维色谱分离。
Description
技术领域
本发明涉及一种弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相,属于分离科学技术领域。
背景技术
液相色谱(LC)是蛋白分离纯化最有效的工具,二维液相色谱(2DLC)已成为蛋白质组学研究的关键技术。色谱柱是LC分离分析的核心。传统的色谱柱均是基于一种分离机理,只能用单一分离模式对蛋白质进行分离纯化,其特征是“一柱一用”。如离子交换色谱(IEC)对应的是电荷作用力,反相色谱(RPLC)对应的是色散力,疏水相互作用色谱(HIC)对应的是疏水相互作用力,亲合色谱(AFC)对应的是亲合力等。虽然单模式色谱在蛋白质分离中已得到广泛应用,但仅用一种模式色谱技术很难将复杂样品中的蛋白质纯化至所需纯度。
“混合模式色谱”(Mixed mode chromatography, MMC)是利用蛋白质与固定相配基之间多种相互作用力进行分离的色谱模式[Mc Laughlin, et al., Chem Rev, 1989, 89:309-319]。在合成MMC色谱填料时,在配基中合理地引入多个作用位点,使固定相和蛋白质之间存在多种相互作用,以提高固定相的选择性和柱效。与单一色谱分离模式相比,MMC具有更高的选择性和吸附量。目前已报道的MMC主要有RPLC/IEC[Apfelthaler E, et al,J Chromatogr. A, 2008, 1191: 171-181]、亲水色谱(HILIC)/ IEC [Gilar M, Y, et al, J Chromatogr A, 2008,1191: 162-170]、HIC/IEC[姚善泾等,化工学报,2007,58: 2169-2177;Zhao G F, et al.,J Biotech, 2009,144 :3–11]、RPLC/HILIC[Liu X, et al, J Chromatogr. A, 2008, 1191: 83-89]、疏水性电荷诱导色谱(hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)[Mant C T, et al, J Sep Sci, 2008, 31: 2754-277; Liu X D, et al,J Chromatogr A, 2008, 1191: 83-89]等几种类型。
虽然RP/IEC和HILIC/IEC等MMC在小分子和多肽分离中表现出了传统单模式RPLC所无法比拟的优势[Zhao G, et al,J Chromatogr A, 2008, 1211: 90-98; 冯钰琦, 201010176027.8; Cai X, et al,J Chromatogr A, 2012, 1228: 242-249; Guo Z M, et al, J Chromatogr A, 2009, 1216: 257-263],但由于这些MMC洗脱条件苛刻,不能用于分离活性蛋白,而且这些MMC仍以RP或HILIC单模式分离为主,引入IEC功能团的目的是让其与带电溶质之间产生静电作用(静电引力或斥力),以此来改变溶质的色谱行为,从而达到增加RPLC和HILIC分离能力的目的,但这类MMC固定相并不能单独在IEC模式下分离物质。
早期在制备HIC填料时,先用溴化氰活化载体,再与疏水配基进行偶联。由于配体上带有胺基,这种疏水填料在与蛋白质相互作用时除了具有疏水作用以外还会表现出静电相互作用的性质。Kennedy等[ Kennedy L A, et al, J Chromatogr A, 1986, 359: 73-84]合成了一种弱阴离子交换填料,该填料具有一定的疏水相互作用性质。Horvath等[Melander W R, et al,J Chromatogr, 1989, 469: 3-27]]合成了一种聚合物基质的混合模式弱阴离子交换分离介质。目前IEC/HIC MMC色谱柱已有商品化,如美国GE Healthcare公司的Capto MMC and Capto adhere,前者配基中含有苯基和羧基,后者则含有季铵盐和苯基。Pall Life Sciences 公司设计生产的HEA, PPA and MEP HyperCel耐盐层析介质,其配基含有己基和叔胺基。在流动相中易于质子化而带正电荷,在较低的盐浓度下可通过疏水和静电引力两种作用力来吸附等电点小于流动相pH值的酸性蛋白。耐盐层析填料的制备一般是通过增加疏水配基密度或疏水配基的疏水性从而使填料表面具有较强的疏水性,以保证蛋白质在填料上的吸附量基本与盐浓度无关[Burton S C, et al, Biotech Bioeng, 1997, 56: 45-55; Gao D, et al, J App Poly Sci, 2008, 107: 674–682]。洗脱时,通过调低流动相的pH值,使蛋白质表面和固定相带上相同的正电荷,依靠静电斥力将蛋白排斥下来。
疏水电荷诱导色谱(hydrophobic charge induction chromatography, HCIC)[Pezzini J, et al, J Chromatogr A, 2011, 1218: 8197-208; Ghose S, et al, Biotech Prog. 2005, 21: 498-508;Zhao G F, et al.,J Biotech, 2009,144 :3–11]主要通过增加疏水基团的键合密度,同时选择合适的离子化配基,使其在pH为3-7时不带电荷,使蛋白在吸附时只靠疏水相互作用力。解吸附时通过调节洗脱液pH值,依靠它们之间的斥力将蛋白质洗脱下来。
与传统单一模式色谱相比,MMC 具有高选择性、高负载量和高峰容量等优点,但目前大多数MMC在分离过程中,都是利用一种主要作用模式进行分离,另一种模式只是起到辅助分离的作用,也就是说一种模式分离效果好而另一种模式并不能达到理想的分离效果,因此这样一根MMC柱仅能用于一种分离模式,并不能代替相应的两根单模式色谱柱使用。
“二维色谱柱”2DLC以其高分辨率,高峰容量等优点在蛋白质组学等复杂样品分离分析中得到了越来越广泛的应用。目前2DLC的构建需要两根作用力性质完全不同的色谱柱,而且第二维分离常采用RPLC,所以无法用于整体活性蛋白的分离纯化。此外,还存在着样品如何在两根色谱柱之间进行切换以及两种模式流动相之间的兼容性的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新型弱阳离子交换/疏水混合模式色谱固定相,实现在离子交换模式和疏水模式下对蛋白质的高效分离。
本发明另一目的是提供上述混合模式色谱固定相的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
结构通式(I)所示的色谱固定相,
n=5~20;
结构式(I)所示的色谱固定相的制备方法,包括以下步骤:
(1)硅胶微球在盐酸中活化;
(2)活化后的硅胶微球清洗至中性,在pH为4.0~6.0的缓冲溶液中与γ-缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷反应得到γ-缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷活化的硅胶微球;
(3)将步骤(2)活化的硅胶微球在二氧六环溶剂中与分子量为200-1000的聚乙二醇(PEG)反应,催化剂为三氟化硼乙醚,反应完后经洗涤、干燥得到PEG键合硅胶衍生物;
(4)将PEG键合硅胶衍生物分散在二氧六环溶剂中,加入PEG键合硅胶衍生物1.5~3倍重量的丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、1,2,4-苯三酸酐、戊二酸酐、2-甲基琥珀酸酐或2,3-吡啶二羧酸酐,在催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下反应得到结构式(I)所示的色谱固定相。
上述步骤(1)中,硅胶微球用质量百分比浓度为20% 的HCl,经超声处理后在90~120℃回流活化,所述的硅胶微球粒径为3~40μm,孔径为5~30 nm。
上述步骤(2)中, pH为4.0~6.0的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液;每克硅胶微球加入0.5~1mL γ-缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷。
上述步骤(3)中,每克硅胶微球加入1.5~2.5 mL分子量为200-1000的聚乙二醇反应。
上述步骤(4)中,反应温度在20~90℃。
本发明的积极效果是:
(1)本发明采用简单易行的方法合成了用于蛋白分离的弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相,该固定相稳定、合成成本低、使用寿命长、分离效果好;
(2)实验表明该弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相可以在离子交换和疏水两种模式下分别实现对混合蛋白质的有效分离;
(3)IEC和HIC的分离机理是正交的,利用阀切换技术,本发明采用一根装填结构式(I)双功能分离介质的色谱柱可代替两根常用的弱阳离子交换和疏水色谱柱对蛋白质进行分离纯化,用一根色谱柱实现IEC-HIC或HIC-IEC二维色谱分离。
附图说明
图1为本发明实施例 1制备的弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相的红外光谱图;
图2为本发明实施例 1制备的弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相在离子交换模式下对五种蛋白质的分离色谱图;
图3为本发明实施例 1制备的弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相在疏水模式下对六种蛋白质的分离色谱图;
图4为本发明实施例 2制备的另一种弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相在离子交换模式下对五种蛋白质的分离色谱图;
图5本发明实施例 2制备的另一种弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相在疏水模式下对六种蛋白质的分离色谱图;
图6为商品柱TSKgel CM-5PW在离子交换模式下对四种蛋白质的分离色谱图;
图7为商品柱TSKgel Ether-5PW在疏水模式下对六种蛋白质的分离色谱图;
图8为采用本发明实例 1制备的弱阳离子交换/疏水双功能色谱柱采用单柱二维色谱技术对7种标准蛋白的色谱分离图。
具体实施方式
本发明弱阳离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相可以在离子交换和疏水两种模式下分别实现对混合蛋白质的有效分离。下面结合实施例和附图,对本发明做进一步说明。应当理解,实施例仅限于说明本发明而不是对本发明的限定。
将硅烷偶联剂键合到表面带有羟基的活化硅胶表面上,再用分子量为200~1000范围的PEG在无水三氟化硼乙醚的催化下键合到表面带有环氧基的硅胶固定相上,最后再与丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、1,2,4-苯三酸酐、戊二酸酐、2-甲基琥珀酸酐或2,3-吡啶二羧酸酐在有机催化剂的催化下反应而获得弱阳离子交换/疏水色谱固定相。其制备方法包括以下步骤:
(1)称取1份硅胶加到100 mL干净的三颈瓶中加入20% HCl 50~70 mL,超声5 min,90~120℃回流3~7 h,冷却,蒸馏水洗涤至中性;所用的硅胶为全多孔硅胶微球,粒径为3~40 μm,孔径为5~30 nm,且经过1:1盐酸活化后洗至中性,100~160℃真空干燥10~24 h。
(2)在缓冲溶液中加入上述清洗硅胶,超声5 min,90℃滴加1份γ-缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷,搅拌反应1~2 h,冷却、水、甲醇、水洗涤干净40℃真空干燥。反应步骤如下所示:
所用缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液,其pH为4.0~6.0,每克硅胶所需缓冲溶液的量为50~70 mL。
(3)在有机溶剂二氧六环中加入0.5~2 mL无水三氟化硼乙醚,3~6 mL不同分子量的PEG于干燥的100 mL的三颈瓶中,超声3-5分钟,加入所述步骤2)制备的1份重量的环氧键合硅胶,搅拌0.5~3 h,反应完毕后洗涤、真空干燥。该步反应可表示为:
其中n=5~20,每克环氧基键合硅胶衍生物所需有机溶剂的量为25~40 mL。
(4)将所述步骤3)制备的1份重量的PEG键合硅胶衍生物分散于有机溶剂二氧六环中,加入1.5~3份重量的丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、1,2,4-苯三酸酐、戊二酸酐、2-甲基琥珀酸酐或2,3-吡啶二羧酸酐,在0.05~0.3份有机催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下,在20~90℃下搅拌反应8~24 h,产物过滤,依次用三次水、甲醇各洗涤两遍,所得固体50℃真空干燥5~15 h,即可得弱阳离子交换/疏水混合模式色谱固定相,该步反应可表示为:
实施例1
(1)称取2 g硅胶(粒径为5μm,孔径为8 nm)加到100 mL干净的三颈瓶中加入20% HCl 50 mL,超声5分钟,120℃回流4 h,冷却,蒸馏水洗涤至中性;
(2)量取50 mL pH为5.5的HAc-NaAc缓冲溶液于干净的100 mL的三颈瓶中加入上述清洗硅胶2 g,超声5 min,90℃滴加γ-缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷1 mL,搅拌反应2 h,冷却、水、甲醇、水洗涤干净40℃真空干燥;
(3)量取50 mL二氧六环、2 mL无水三氟化硼乙醚、4 mL PEG400于干燥的100 mL的三颈瓶中,超声3-5min,加入环氧化硅胶2 g,搅拌1 h,洗涤后真空干燥;
(4)量取50 mL二氧六环,加入丁二酸酐3.2 g和催化量的对二甲氨基吡啶,超声3-5 min,加入PEG硅胶2 g,35℃搅拌12 h,依次用水、丙酮、甲醇洗涤干净40℃真空过夜干燥。即可得到权利要求1所述的弱阳离子交换/疏水混合模式色谱固定相。
上述步骤中所得固定相用傅里叶变换红外光谱仪进行测试,测试结果如图1所示。1号光谱图中波数在3448cm-1和1100 cm-1两处的吸收为硅胶基质的背景吸收,2号光谱图中2946cm-1 为亚甲基的碳氢伸缩振动,说明环氧活化基团成功地键合在硅胶上。4号光谱图中1737cm-1处吸收明显增强,这是羧酸中羰基的特征吸收峰,说明酸酐配基已被成功的键合在硅胶上。
实施例2
(1)称取2 g硅胶(粒径为5μm,孔径为8 nm)加到100 mL干净的三颈瓶中加入20% HCl 50 mL,超声5分钟,120℃回流4 h,冷却,蒸馏水洗涤至中性;
(2)量取50 mL pH 5.5 的HAc-NaAc缓冲溶液于干净的100 mL的三颈瓶中加入上述清洗硅胶2 g,超声5 min,90℃滴加γ-缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷1.5 mL,搅拌反应2 h,冷却、水、甲醇、水洗涤干净40℃真空干燥;
(3)量取50 mL二氧六环、2 mL无水三氟化硼乙醚、4 mL 分子量为1000的PEG于干燥的100 mL的三颈瓶中,超声3-5min,加入环氧化硅胶2 g,搅拌1 h,依次用水、丙酮、甲醇洗涤干净40℃真空干燥;
(4)称取 3.0 g 邻苯二甲酸酐于 100 mL 干燥的三颈瓶中,加入 50 mL 二氧六环,使其溶解加入 PEG 键合硅胶 2 g,80-85℃加入催化量的 4-DMAP 水浴搅拌 12 小时,所得产物依次用水、甲醇、丙酮洗涤干净,60-70℃ 烘干得到弱阳离子交换/疏水混合模式色谱固定相。
实施例3
使用实施例1制备的色谱填料装柱,然后在离子交换模式下对五种标准蛋白进行分离。分离条件:
流动相:A液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 6.5); B 液: 20 mmol/L KH2PO4 + 1.0 mol/L NaCl (pH 6.5), 线性梯度洗脱,0→100%B,30 min;流速为1.0 mL/min,对RNase B、RNase A、cytochrome c、α-chymotrypsin A、lysozyme等五种蛋白质实现了良好的分离(如图2所示1、2、3、4、5分别为RNase B、RNase A、cytochrome c、a-chymotrypsin A、lysozyme)。
实施例4
使用实施例1制备的色谱填料装柱,然后在疏水模式下对六种标准蛋白进行分离,分离条件:流动相: A液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0) + 3.0 mol/L (NH4)2SO4 (pH 7.0); B 液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0),线性梯度洗脱,0→100%B,30 min,流速为1.5 mL/min,对cytchrome c、RNase A、OVA、lysozyme、α-amylase、insulin等六种蛋白质实现了良好的分离(如图3所示1、2、3、4、5、6分别为cytchrome c、RNase A、OVA、lysozyme、α-amylase、insulin)。
实施例5
使用实施例2所制备的色谱填料装柱,然后在离子交换模式下对五种标准蛋白进行分离。分离条件:流动相:A液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 6.5); B 液: 20 mmol/L KH2PO4 + 1.0 mol/L NaCl (pH 6.5), 线性梯度洗脱,0→100%B,30 min;流速为1.0 mL/min,对RNase B、RNase A、cytochrome c、a-chymotrypsin A、lysozyme等五种蛋白质实现了良好的分离(如图4所示1、2、3、4、5分别为RNase B、RNase A、cytochrome c、a-chymotrypsin A、lysozyme)。
实施例6
使用实施例2制备的色谱填料装柱,然后在疏水模式下对六种标准蛋白进行分离,分离条件:流动相: A液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0) + 3.0 mol/L (NH4)2SO4 (pH 7.0); B 液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0),线性梯度洗脱,0→100%B,30 min,流速为1.5 mL/min,对cytchrome c、RNase A、OVA、lysozyme、α-amylase、insulin等六种蛋白质实现了良好的分离(如图5所示1、2、3、4、5、6分别为cytchrome c、RNase A、OVA、lysozyme、α-amylase、insulin)。
实施例7
使用WCX商品柱TSKgel CM-5PW,然后在离子交换模式下对四种标准蛋白进行分离,分离条件:流动相:A液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 6.5); B 液: 20 mmol/L KH2PO4 + 1.0 mol/L NaCl (pH 6.5), 线性梯度洗脱,0→100%B,30 min;流速为1.0 mL/min,对myoglobin、RNase A、cytochrome c、lysozyme等四种蛋白质实现了良好的分离(如图6所示1、2、3、4、分别为myoglobin、RNase A、cytochrome c、lysozyme)。
实施例8
使用HIC商品柱TSKgel Ether-5PW,然后在疏水模式下对六种标准蛋白进行分离,分离条件:流动相: A液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0) + 3.0 mol/L (NH4)2SO4 (pH 7.0); B 液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0),线性梯度洗脱,0→100%B,30 min,流速为1.5 mL/min,对cytchrome c、myoglobin 、RNase A、lysozyme、a-chymotrypsin A、insulin等六种蛋白质实现了良好的分离(如图7所示1、2、3、4、5、6分别为cytchrome c、Myoglobin 、RNase A、lysozyme、a-chymotrypsin A、insulin)。
实施例9
使用实施例1所制备的色谱填料装柱,利用离线单柱二维色谱技术完成了对七种标准蛋白的分离,分离条件:流动相: 1号液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0) + 3.0 mol/L (NH4)2SO4 (pH 7.0); 2号 液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0),在 IEC 模式下 ,2号液做 A 液, 1号液做 B液,HIC 模式下 1号液做 A 液2号液做 B 液,线性梯度洗脱,线性梯度如图所示。先收集 IEC 模式下不保留的色谱峰,再用累积进样的方法在 HIC 模式下完成对 IEC 中不保留的酸性蛋白的分离。(如图8所示1、2、3、4、5、6、7分别为HAS、 BSA、 insulin、 RNAse B、 cytochrome c、 α-chymotrypsin A、 lysozyme)。
Claims (9)
2.根据权利要求1所述的色谱固定相,其特征在于:所述的硅胶微球粒径为3~40μm,孔径为5~30 nm。
3.权利要求1所述色谱固定相的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)硅胶微球在盐酸中活化;
(2)活化后的硅胶微球清洗至中性,在pH为4.0~6.0的缓冲溶液中与γ-缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷反应得到γ-缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷活化的硅胶微球;
(3)将步骤(2)活化的硅胶微球在二氧六环溶剂中与分子量为200-1000的聚乙二醇反应,催化剂为三氟化硼乙醚,反应完后经洗涤、干燥得到聚乙二醇键合硅胶衍生物;
(4)将PEG键合硅胶衍生物分散在二氧六环溶剂中,加入聚乙二醇键合硅胶衍生物1.5~3倍重量的丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、1,2,4-苯三酸酐、戊二酸酐、2-甲基琥珀酸酐或2,3-吡啶二羧酸酐,在催化量的4-二甲氨基吡啶催化下反应得到结构式(I)所示的色谱固定相。
4.根据权利要求3所述混合模式色谱固定相的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,硅胶微球用质量百分比浓度为20% 的HCl,经超声处理后在90~120℃回流活化,所述的硅胶微球粒径为3~40μm,孔径为5~30 nm。
5.根据权利要求3所述混合模式色谱固定相的制备方法,其特征在于:步骤(2)中, pH为4.0~6.0的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
6.根据权利要求3所述混合模式色谱固定相的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,每克硅胶微球加入0.5~1mL γ-缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷。
7.根据权利要求3所述混合模式色谱固定相的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,每克硅胶微球加入1.5~2.5 mL分子量为200-1000的聚乙二醇反应。
8.根据权利要求3所述混合模式色谱固定相的制备方法,其特征在于:步骤(4)中,反应温度在20~90℃。
9.权利要求1所述的色谱固定相在蛋白质分离及纯化中的应用。
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