CN103180432B - 制备耐贮存益生菌食品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制备需要长保质期的益生菌食品的成分，所述成分包含耐贮存益生微生物。所述成分是通过用渗透压休克的益生微生物的悬浮液包覆颗粒或其团聚物并干燥产物而制备的。

Description

制备耐贮存益生菌食品的方法
发明领域
本发明概括地涉及制备包含活益生微生物的耐贮存(shelfstable)食品的方法。
发明背景
益生微生物(益生菌)是通过增加人肠道中的有益菌而有益地改善宿主健康的微生物。确信的是，益生菌通过抑制致病菌、预防肠疾病、改善乳糖不耐症人群的乳糖利用并有助于控制血清胆固醇水平来改善健康(Adamiec,2009)。
益生微生物(还称为益生菌细胞)通常包含在乳制品中，所述乳制品具有相对短的保质期并需要保持冷藏。例如，目前益生菌通常被添加到发酵乳(fermentedmilks)和酸乳酪(yoghurts)中。
然而，对在干燥或半干耐贮存食品中的益生菌递送存在越来越多的关注。
干燥食品在室温下通常具有6个月至1年的保质期。然而，在这些条件下，益生菌通常在数月内失去它们的活力(Ubbink&Kruger,2006)并在几周内降低至在功能上无意义的水平。
当在环境条件下贮存时，还难以在半干食品中保持益生菌的活力(Lee&Sakninen,2009)。
在耐贮存食品中的益生菌的存活具有高商业重要性。因此，研究人员在产品加工、贮存和胃滞留期间保持益生菌活力的尝试中，试图使用各种不同的微囊化技术和多种食品成分来包囊益生菌(AnalandSingh,2007)。还已使用了各种干燥方法。
然而，这些技术已产生不同的结果，并且没有开发出能够在室温下将益生菌活力保持对于在商业上用于耐贮存食品而言足够长的时间的方法。
因此，本领域需要提供用于获得在室温下保持益生微生物活力或至少为公众提供有用选择的产品的方法。
发明概述
本发明涉及制备直接用作食品或用作食品成分的耐贮存的活益生微生物的方法。
第一方面，本发明提供制备可食用(consumable)包衣颗粒或其团聚物(agglomeration)的方法，其包括：
a)用渗透压休克(osmoticallyshocked)的益生微生物的悬浮液至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒；以及
b)干燥所述包衣颗粒或其团聚物；
其中所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含活益生微生物。
第二方面，本发明提供制备可食用包衣颗粒或其团聚物的方法，其包括：
a)用渗透压休克的益生微生物的悬浮液至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒；以及
b)干燥所述包衣颗粒或其团聚物；
其中所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含活益生微生物，并且其中使用流化床设备进行步骤a)和b)。
第三方面，本发明提供制备可食用包衣颗粒或其团聚物的方法，其包括：
a)用渗透压休克的益生微生物的悬浮液至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒；以及
b)干燥所述包衣颗粒或其团聚物；并且
其中所述干燥的包衣颗粒或其团聚物包含至少107cfu/克的活益生微生物；并且
其中所述活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于2logcfu/克。
在一实施方案中，所述干燥的包衣颗粒的团聚物包含包埋的益生微生物。
第四方面，本发明提供通过本发明方法制备的可食用包衣颗粒或其团聚物。
第五方面，本发明提供可食用颗粒和/或所述颗粒的团聚物，所述颗粒包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪，并包覆有渗透压休克的益生微生物。
第六方面，本发明提供可食用产品，其包含本发明的可食用包衣颗粒或其团聚物。
第七方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的可食用包衣颗粒或其团聚物以及药学可接受的赋形剂。
在上述方面中：
在一实施方案中，细菌选自干酪乳杆菌(L.casei)CRL431(ATCC编号55344)、干酪乳杆菌ATCC393、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)ATCC4356、鼠李糖乳杆菌(L.rbamnosus)ATCC53103和乳糖双歧杆菌(B.lactis)BB12。
在另一实施方案中，所述包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒包括乳粉(dairypowder)，优选奶粉(milkpowder)。
在另一实施方案中，在20°C至50°C下干燥所述包衣颗粒或其团聚物。
在该说明书中，当引用专利说明书、其它外部文献或其它信息来源时，通常是为了提供背景来讨论本发明特征的目的。除非另外具体指出，对此类外部文献的参考不应解释为承认此类文献或其它信息来源在任何范围内为现有技术或形成本领域公知常识的一部分。
附图简述
图1为示出可用于本发明的顶喷雾流化床团聚物干燥系统的示意过程的示意图。
图2为示出干酪乳杆菌CRL431细胞在MRS肉汤中的生长曲线的图。在图上标示的值为在每一时间点的3个样品的平均OD值。
图3为示出与冷冻干燥的干酪乳杆菌CRL431培养物(■)相比，当用热(●)、渗透(◆)、复合应激(x)和无应激的对照(▲)使细胞预适应时，在25°C下贮存48周的包埋干酪乳杆菌CRL431细胞的稳定性的图。
图4为示出当包埋入复合基质中并在压缩干粮(cerealbars)(■)和巧克力酱(chocolatespreads)(▲)中强化时益生菌干酪乳杆菌CRL431的稳定性的图。
图5为示出在受控干燥之前和之后藻酸盐胶囊的细胞负载的图。在所有四个湿样品中的初始细胞计数高于10.00logcfu/克。
图6为示出当在藻酸盐中包囊并在25°C下贮存4周时干酪乳杆菌CRL431活力的图。
图7为示出当在藻酸盐中包囊并进一步包覆在脂质中并在25°C下贮存4周时干酪乳杆菌CRL431活力的图。
图8是一系列示出在25°C下长达8个月的贮存之后的细胞活力的图。将嗜酸乳杆菌ATCC4356(图8A)、鼠李糖乳杆菌ATCC53103(图8B)、干酪乳杆菌ATCC393(图8C)和乳糖双歧杆菌BB12(图8D)的渗透应激(osmoticallystressed)的细胞(■)与无应激的细胞(◆)进行对比。由(▲)示出冷冻干燥的细胞。
图9为示出在25°C下贮存12周的包埋的干酪乳杆菌CRL431的稳定性的图。该图示出与使用喷雾干燥(x)和冷冻干燥()而干燥的渗透应激的细胞相比，用新技术(◆)渗透应激和包囊的干酪乳杆菌细胞的活力。对照样品(●)表示相同细菌的商购冷冻干燥的颗粒。
图10为示出与全脂奶粉(▲)和脱脂奶粉(■)相比，本发明的益生菌成分(◆)的粒度分布的图。
图11为示出与全脂奶粉(▲)和脱脂奶粉(◆)相比，本发明的益生菌成分(■)的流动性的图。
图12为示出在添加和不添加本发明的益生菌成分的情况下麦乳精(maltedmilk)饮料的感官性质的图。
图13为示出与在乳蛋白分离物中包囊的渗透应激的干酪乳杆菌细胞(■)和在葡萄糖中包囊的渗透应激的干酪乳杆菌细胞(▲)相比，本发明产品(◆)的贮存活力的图。
发明详述
本发明的方法可用于制备包含活益生微生物的可食用颗粒及其团聚物。这些可食用颗粒和团聚物可用于制备可食用产品，例如食品、饮料、饮食补充剂和营养保健品。
所述微生物在可食用产品中保持相对长时间的活力，使得该可食用产品就益生微生物而言为“耐贮存的”。
因为在本发明方法的过程中将益生微生物掺入包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的包衣颗粒或颗粒团聚物中或其上，因此所述益生微生物保持活力。
因此，本发明的方法制备可在含益生菌的可食用食品的生产中用作成分的可食用颗粒，所述食品无需冷藏而保持益生微生物的活力。
定义
如本说明书所用的术语“包含”表示“至少部分由…组成”。当解释本说明书中包括该术语的表述时，在每一表述或权利要求中以该术语为前序的特征均需要存在，但其它特征也可存在。相关的术语如“包括”以相同方式解释。
术语“包衣颗粒”包括已部分包衣的颗粒，但不包括形成液态悬浮液部分的颗粒。换言之，颗粒为所得产品提供了形状。
术语“至少部分地包覆”表示待包衣颗粒与一些细菌悬浮液有接触。颗粒可以是，但不必是被细菌悬浮液完全覆盖的。
如本说明书中所用的术语“可食用产品”表示对人和/或动物的食用而言是安全的产品。其可以是与水、奶、果汁或成为饮料的任意其它液体混合的食品或产品。其还可以是饮食补充剂或营养保健品。
用于本发明方法的益生微生物
联合国粮食和农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)将益生微生物定义为“当以足量方式给予时为宿主提供健康益处的活微生物”。包含至少106-107cfu/克的产品被认为提供了健康益处(FAO/WHO,2001)。
因此，本发明可使用的益生菌包括已被确定为对宿主具有有益作用的任何微生物，并可以包括尚未被确认为具有有益宿主作用的菌株。
可食用包衣颗粒或其团聚物可包含来自一种或多种株、种或属的益生微生物。
已知诸如乳酸菌和双歧杆菌的细菌可用作益生菌，但诸如某些种类的酵母的其它微生物也可用于本发明的方法。
例如，可用于本发明的益生菌株可以选自：酵母，例如酵母菌属(Saccharomyce)、德巴利酵母属(Debaromyces)、多形假丝酵母(CandidawPichia)和球拟酵母属(Torulopsis)；霉菌，例如曲霉菌属(Aspergillus)、根霉菌属(Rhizopus)、毛霉菌属(Mucor)、青霉菌属(Penicillium)和球拟酵母属(Torulopsis)；以及诸如以下属的细菌：双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、考克氏菌属(Kocuriaw)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、消化链球菌属(Peptostrepococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、微球菌属(Micrococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、气球菌属(Aerococcus)、酒球菌属(Oenococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)，或它们的混合物。
在一实施方案中，用于本发明的益生微生物选自：黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(A.oryzae)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、马铃薯杆菌(B.mesentericus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、枯草杆菌(B.subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、嗜淀粉拟杆菌(Bacteroidesamylophilus)、多毛拟杆菌(Bac.capillosus)、栖瘤胃拟杆菌(Bac.ruminocola)、猪拟杆菌(Bac.suis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)、短双歧杆菌(B.breve)、两岐双歧杆菌(B.bifidum)、婴儿双歧杆菌(B.infiantis)、乳糖双歧杆菌(B.lactis)、长双歧杆菌(B.longum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)、Candidapintolepesii、肉毒梭菌(Clostridiumbutyricum)、乳脂肠球菌(Enterococcuscremoris)、双醋酸乳肠球菌(E.diacetylactis)、屎肠球菌(E.faecium)、中间型肠球菌(E.intermedius)、乳酸肠杆菌(E.lactis)、蒙氏肠球菌(E.muntdi)、嗜热肠球菌(E.thermophilus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、食品乳杆菌(L.alimentarius)、噬淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、纤维二糖乳杆菌(L.cellobiosus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckiiss.bulgaricus)、香肠乳杆菌(L.farciminis)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、鼠李糖乳杆菌GG株(L.GG)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、乳酸乳杆菌(L.lactis)、胚芽乳杆菌(L.plantarum)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、约翰逊乳杆菌(L.johnsonii)、罗伊乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、肠膜样明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、啤酒片球菌(P.cereviseae(有害片球菌(damnosus)))、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、谢曼丙酸杆菌(Prop,shermanii)、酿酒酵母(Saccharomycescereviseae)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(Staph.xylosus)、婴儿链球菌(Streptococcusinfantarius)、唾液链球菌嗜热亚种(Strep.salivariusss.thermophilus)、嗜热链球菌(Strep.thermophilus)、乳酸链球菌(Strep.lactis)以及它们的混合物。
在另一实施方案中，所述益生微生物选自：短双歧杆菌R070、短双歧杆菌株优格(yakult)、乳糖双歧杆菌Bbl2、长双歧杆菌R023、两岐双歧杆菌R071、婴儿双歧杆菌R033、长双歧杆菌BB536、乳糖双歧杆菌BB12、乳糖双歧杆菌HN019(HOWRU)、长双歧杆菌SBT-2928以及它们的混合物。
在另一实施方案中，所述益生微生物选自：胚芽乳杆菌299v、嗜酸乳杆菌BG2F04、嗜酸乳杆菌INT-9、胚芽乳杆菌ST31、罗伊乳杆菌、约翰逊乳杆菌LA1、嗜酸乳杆菌NCFB1748、干酪乳杆菌代田株(LactobacilluscaseiShirota)、嗜酸乳杆菌NCFM、嗜酸乳杆菌DDS-1、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubspeciesdelbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种2038型、嗜酸乳杆菌SBT-2062、短乳杆菌、唾液乳杆菌UCC118、干酪乳杆菌431、干酪乳杆菌ATCC393、嗜酸乳杆菌ATCC4356、鼠李糖乳杆菌ATCC53103、胚芽乳杆菌ATCC8014、胚芽乳杆菌LP293V、副干酪乳杆菌副干酪亚种F19(LactobacillusparacaseisubspparacaseiF19)，以及它们的混合物。
在另一实施方案中，所述益生微生物选自：乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactissubspeciescremoris)(乳脂链球菌)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubspecieslactis)NCDO712、乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI527、乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI1061、乳酸乳球菌乳酸亚型双醋酸乳变种(Lactococcuslactissubspecieslactisbiovardiacetylactis)NIAI8W、乳酸乳球菌乳酸亚型双醋酸乳变种ATCC13675，以及它们的混合物。
在另一实施方案中，所述益生微生物选自：唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcussalivarussubspeciesthermophilus)1131型、屎肠球菌SF68、鲍氏酵母菌(Saccharomycesboulardii)(麦酒酵母菌(SaccharomycescerevisiaeHansen)CBS5296)，以及它们的混合物。
在一实施方案中，所述益生微生物选自：约翰逊乳杆菌、干酪乳杆菌、乳糖双歧杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、胚芽乳杆菌、嗜热链球菌，以及它们的混合物。
在一实施方案中，所述益生微生物为细菌。在另一实施方案中，所述细菌为乳杆菌属、双歧杆菌或其混合物。
在一实施方案中，所述细菌选自干酪乳杆菌CRL431(ATCC编号55344)、干酪乳杆菌ATCC393、嗜酸乳杆菌ATCC4356、鼠李糖乳杆菌ATCC53103和乳糖双歧杆菌BB12。
在一实施方案中，所述益生微生物为干酪乳杆菌431。
制备益生微生物的方法是本领域中公知的。例如，可从供应商处购得益生菌的培养物，然后可将其悬浮在合适的肉汤例如MRS肉汤中并在其中生长。可通过测量悬浮液的UV吸光度来监控细菌的生长。
可在任何适于微生物生长的液体生长培养基中制备用于本发明的益生微生物。这样的培养基对于本领域技术人员而言是已知的。例如，液体生长培养基可以是LB肉汤或MRS肉汤。当微生物为乳酸菌时，优选乳清或奶基生长培养基(例如补充有矿物质和氮源的干酪乳清或脱脂奶)。
渗透压休克的微生物的悬浮液
在本发明的方法中，将益生微生物在与包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒结合之前渗透压休克。本文所用的术语“渗透压休克”和“渗透应激”是指细胞周围的溶质浓度突然变化，导致穿过细胞膜的水的移动快速变化。在高浓度溶质(例如盐)的情况下，水通过渗透而被抽出细胞。渗透压休克微生物细胞的方法是本领域中已知的，并且任何方法可用于本发明。
在一实施方案中，将益生微生物通过增加益生微生物的悬浮液的渗透性而渗透压休克。
在一实施方案中，通过增加益生微生物的悬浮液的溶质浓度而增加渗透性。
任何形式的食用盐均可用于本发明以渗透压休克益生微生物。优选使用的盐例如氯化钠、氯化铵、碳酸氢钠、氯化钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾和氯化钾。
或者，可通过添加其它溶质例如无机盐、糖衍生物(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖或海藻糖)或多元醇化合物(如甘油或山梨醇)来渗透压休克益生微生物的悬浮液。
在一实施方案中，益生微生物的悬浮液的溶质浓度增加至约0.2M至约2M的溶质。在另一实施方案中，益生微生物悬浮液的溶质浓度增加至约0.2M至约1M的溶质。
在另一实施方案中，益生微生物的悬浮液的溶质浓度增加至约0.4M至约0.8M的溶质。
在一实施方案中，将氯化钠添加至益生微生物的悬浮液中，以使所述悬浮液包含约0.2M至约1M的氯化钠，优选约0.4M至约0.8M、更优选约0.6M的氯化钠。所述悬浮液通常包含益生微生物在其中生长的培养基。
在另一实施方案中，将葡萄糖添加至益生微生物的悬浮液中，以使所述悬浮液包含约0.4M至约2M的葡萄糖，优选约0.8M至约1.6M、更优选约1.2M的葡萄糖。
为了进行渗透压休克过程，可向益生菌细胞在其中生长的培养基补充溶质，然后继续细胞生长。然而，还可将细胞沉淀(pelleted)，然后重悬浮在新鲜的含渗透压休克剂的培养基中。
如由本领域技术人员所理解的那样，所述悬浮液必须在其被渗透压休克之前包含相对高浓度的益生微生物。
优选地，将浓度为0.2M至1.5M的盐、糖衍生物或多元醇化合物掺入益生菌生长培养基中以渗透压休克培养物。0.4M至0.8M、例如0.6M的浓度是优选的。
优选地，不将益生微生物的悬浮液渗透压休克，直至其达到106-1012cfu/ml培养基、更优选106-109cfu/ml的浓度。在一实施方案中，当益生微生物达到106cfu/ml培养基的浓度时，将悬浮液渗透压休克。在一些实施方案中，当悬浮液达到107、108、109、1010、1011或1012cfu/ml培养基的浓度时，将其渗透压休克。
渗透压休克益生微生物的方法不导致活细胞的显著减少。因此，在用于本发明方法的渗透压休克的悬浮液(包覆悬浮液)中的益生菌细胞的浓度优选为106cfu/ml至1012cfu/ml。更优选地，所述包覆悬浮液包含108cfu/ml至1012cfu/ml。最优选地，所述包覆悬浮液包含1011cfu/ml至1012cfu/ml。
在一实施方案中，益生微生物的悬浮液具有约6至7的pH。
在一实施方案中，将益生微生物的悬浮液渗透压休克2至10小时。在另一实施方案中，将益生微生物的悬浮液渗透压休克4至8小时。
除了将益生菌细胞渗透压休克之外，在一些实施方案中，可将细胞热激(heatshock)。
用于本发明方法的包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒
用于本发明方法的颗粒必须包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪。
用于本发明方法的颗粒通常包含可食用物质的粉末。
在一实施方案中，所述颗粒包含3wt%的碳水化合物、3wt%的蛋白质和至少3wt%的脂肪。
在一实施方案中，所述颗粒包含至少5wt%、10wt%、15wt%、20wt%、25wt%、30wt%、35wt%、40wt%、45wt%、50wt%、55wt%、60wt%、65wt%或70wt%的碳水化合物。
在一实施方案中，所述颗粒包含至少5wt%、10wt%、15wt%、20wt%、25wt%、30wt%、35wt%、40wt%、45wt%、50wt%、55wt%、60wt%、65wt%或70wt%的蛋白质。
在一实施方案中，所述颗粒包含至少5wt%、10wt%、15wt%、20wt%、25wt%、30wt%、35wt%、40wt%、45wt%、50wt%、55wt%、60wt%、65wt%或70wt%的脂肪。
在一实施方案中，所述颗粒包含1-60重量%的脂肪、5-80重量%的蛋白质、5-80重量%的碳水化合物，其中所述颗粒包含的脂肪、碳水化合物和蛋白质的量小于或等于100%。
更优选地，所述颗粒包含3-40重量%的脂肪、10-50重量%的蛋白质、10-60重量%的碳水化合物，其中所述颗粒包含的脂肪、碳水化合物和蛋白质的量小于或等于100%。最优选地，所述颗粒包含20-35重量%的脂肪、25-45重量%的碳水化合物和15-30重量%的蛋白质，其中所述颗粒包含的脂肪、碳水化合物和蛋白质的量小于或等于100%。
在一实施方案中，所述颗粒基本由碳水化合物和蛋白质组成。可以存在少量的脂肪(<0.5wt%)。
在一实施方案中，待包衣颗粒为粉末形式。所述粉末可以是乳粉。或者，待包衣粉末可以是大豆基的，例如大豆蛋白质分离物或大豆蛋白质浓缩物。或者，待包衣粉末可以在其组成中包含植脂末(non-dairycreamer)、麦芽糊精、可可粉、麦芽粉(maltpowder)或淀粉。或者，所述粉末可以包含任意这些成分的混合物。
在一实施方案中，所述颗粒包含奶粉。在一实施方案中，所述颗粒包含脱脂奶粉。
在另一实施方案中，所述颗粒包含植脂末。
在又一实施方案中，所述颗粒包含奶粉和植脂末的混合物。
所述颗粒还可以包含矿物质、维生素和其它大分子(例如益生元(prebiotics)、食用纤维、肽、游离脂肪酸、植物素等)以及小百分比的水分。
在一实施方案中，所述颗粒基本由乳粉组成。
包覆和干燥颗粒以制备包含活益生微生物的可食用包衣颗粒或其团聚物
在本发明的方法中，渗透压休克的益生微生物的悬浮液用于至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒。包衣颗粒可以部分地团聚。团聚是使较小颗粒集合以通过将它们粘附在一起而形成较大颗粒的过程。
在颗粒团聚的情况下，渗透压休克的益生微生物不仅包覆颗粒，而且还自身被其它颗粒围绕或包覆。然后，干燥包衣颗粒或包衣颗粒的团聚物。
可使用任何使颗粒至少部分地被渗透压休克的益生微生物的悬浮液包覆的方法来进行本发明的方法。在优选的实施方案中，包衣颗粒是团聚的。
通常，引入的干燥空气具有20-65°C、优选30-60°C的温度。在一实施方案中，本发明方法在约20-50°C的温度下进行。在另一实施方案中，温度为约30-45°C，更优选30-35°C。
一方面，本发明提供制备可食用包衣颗粒或其团聚物的方法，其包括：
a)用渗透压休克的益生微生物的悬浮液至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒；以及
b)在20-50°C下干燥所述包衣颗粒或其团聚物；
其中所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含活益生微生物。
在一实施方案中，使用流化床设备进行所述方法。在流化床方法中存在三种相。固体(基体材料)、液体(粘合材料)和气体(流化空气)均彼此同时接触。流化床促进相之间的高水平接触。流化床加工包括在使固体/流体混合物表现为流体的条件下引导压缩流体通过固体颗粒物质。在流化床干燥中，流化气体提供热量以蒸发液相。
在一实施方案中，在具有20-40°C、优选30-35°C的出口温度的流化床设备中进行所述方法。或者，可以通过其它方法例如真空干燥进行干燥。
图1例示本发明的优选方法，其中固体基体材料(包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒)被放置在具有精细固位板(fineretentionplate)和在其底部上的空气分配板的倒置截锥(invertedtruncatedcone)中。暖空气流经分配板，并且包埋基质变得流化，而包含渗透压休克的益生菌细胞的液体被精细地喷射在基体材料上。优选地，干燥空气的湿度保持在最小的实际相对湿度，例如35%至50%的相对湿度。
在几个湿润-干燥循环之后，喷射浆体的水部分引起芯材料的团聚。益生菌细胞被截留在团聚的微小颗粒中，并且最终水由于干燥作用而被蒸发出。获得具有与最初基体材料相同或更低水平的水活性(Aw)的自由流动的粒状粉末物质。
优选地，在完成干燥过程之后，可食用颗粒的直径为约35-100μm，更优选40-95μm，最优选50-80μm。然而，当颗粒团聚时，可以观察到达1μm的直径。当使用流化床设备时，粒度可受到雾化气压、液体喷射速率和流化空气温度的影响。当这些因素高时，则获得较低直径的颗粒。其它影响因素包括喷嘴锥度和与粉末床的邻近程度。本领域技术人员能够选择合适的设定以制备所需尺寸范围的颗粒。如需要，可使用粒度降低步骤，例如研磨或碾磨。
本发明的方法提供了对保存益生微生物的其它方法例如冷冻干燥、喷射干燥或包囊的替代方法。本发明的方法具有下列优势，即，其不导致细胞活力的任何显著损失，并且制备其中益生微生物长时间保持活力的产品。
因此，一方面，本发明提供制备可食用包衣颗粒或其团聚物的方法，其包括：
a)用渗透压休克的益生微生物的悬浮液至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒；以及
b)干燥所述包衣颗粒或其团聚物；
其中所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含至少107cfu/克的活益生微生物。
另一方面，本发明提供制备可食用包衣颗粒或其团聚物的方法，其包括：
a)用渗透压休克的益生微生物的悬浮液至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒；以及
b)干燥所述包衣颗粒或其团聚物；并且
其中所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含至少107cfu/克的活益生微生物；并且
其中所述活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于2logcfu/克。
在上述方面中：
在一实施方案中，所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含至少108cfu/克的活益生微生物。
在另一实施方案中，所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含至少109cfu/克的活益生微生物。
在另一实施方案中，所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含至少1010cfu/克的活益生微生物。
在另一实施方案中，所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含至少1011cfu/克的活益生微生物。
在一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于1.8logcfu/克。
在一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于1.6logcfu/克。
在一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于1.4logcfu/克。
在一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于1.2logcfu/克。
在一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于1.0logcfu/克。
在一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于0.8logcfu/克。
在另一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于0.6logcfu/克。
在另一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于0.4logcfu/克。
在另一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于0.2logcfu/克。
在一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于2.0logcfu/克。
在一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于1.8logcfu/克。
在另一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于1.6logcfu/克。
在一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于1.4logcfu/克。
在另一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于1.2logcfu/克。
在另一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于1.0logcfu/克。
在另一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于0.8logcfu/克。
在另一实施方案中，使用流化床设备进行步骤a)和b)。
在另一实施方案中，在约20-50°C下干燥包衣颗粒或其团聚物。
可通过在室温下贮存一段时间之后计数cfu/克来评价可食用颗粒或其团聚物的稳定性。可改变贮存条件。当不需要湿度控制时，样品应优选被密封在密闭容器中以确保最大稳定性。
在一方面，本发明提供制备包含至少107cfu/克活干酪乳杆菌431的可食用包衣颗粒或其团聚物的方法，其包括：
a)用渗透压休克的干酪乳杆菌431细胞的悬浮液至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒；以及
b)干燥所述包衣颗粒或其团聚物；
其中使用流化床设备进行步骤a)和b)；并且
其中活干酪乳杆菌431细胞的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于1logcfu/克。
在一实施方案中，在20-50°C下进行步骤a)和b)。
在一实施方案中，活干酪乳杆菌细胞的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于2logcfu/克。
在一实施方案中，所述包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒包括乳粉。
通过本发明方法制备的颗粒和颗粒团聚物具有作为可食用食品中的成分的应用。独特的加工条件确保了在颗粒上和颗粒之间包覆的益生微生物长时间保持活力。
一方面，本发明提供通过本发明方法制备的可食用包衣颗粒或其团聚物。
另一方面，本发明提供可食用包衣颗粒和/或这样的颗粒的团聚物，所述颗粒包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪，并至少部分包覆有渗透压休克的益生微生物。
在上述方面中：
在一实施方案中，所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含至少107、108、109、1010或1011cfu/克的活益生微生物。
在另一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于2、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4或0.2logcfu/克。
在另一实施方案中，活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于2、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0或0.8logcfu/克。
在另一实施方案中，所述益生微生物为干酪乳杆菌431。
可食用食品
通常在发酵乳制品例如酸乳酪中发现益生微生物。这些产品必须冷藏并具有短的保质期。更难以制备包含足够多量的活益生微生物以具有健康益处的谷类制品。这样的产品需要具有长保质期(长达六个月或一年)并且活益生微生物的细胞计数可能在几天内下降至显著水平。
然而，本发明的颗粒和团聚物持续数月保持高活益生微生物水平，因此理想地用于可食用食品，特别是需要长保质期的那些产品。
因此，本发明还提供包含本发明的可食用包衣颗粒或其团聚物的可食用食品。
为确保可食用产品中的益生菌细胞的活力保持尽可能长的时间，应尽快使用包含益生菌的颗粒或其团聚物。优选地，经干燥和包衣的颗粒包含约109-1010cfu/克。优选地，使用1-10%(w/w)的通过本发明方法制备的包衣颗粒来强化食品，从而该强化食品包含107-109cfu/克。
更优选地，通过本发明方法制备的食品或成分包含107至1010cfu/克，最优选107至109cfu/克。然而，更低的量例如约103-105的量也可能提供有益作用。包含活益生菌细胞的颗粒可用作食品。例如，干燥的颗粒可以是供复原并例如用作鲜奶替代物的乳粉。
所述包含活益生微生物的颗粒可用于干燥食品或半干食品中。
食品或饮料中的水的可用性被称为食品的水活性(Aw)，由食品中的水量而测定。水活性影响微生物生长和最终可食用产品的耐贮存性。干燥的食品被定义为具有Aw<0.25的值，而半干食品被定义为0.4-0.8的Aw值。纯水具有10.0的水活性。
在本发明中，可以有用地掺入颗粒的干燥和半干食品的实例为粉末、乳基饮料、麦芽/大豆/谷物基饮料、早餐谷物食品如什锦谷物早餐片(muesliflake)、水果和蔬菜汁粉末、压缩干粮和/或巧克力条、糖果、糊状食品(spreads)、面粉、奶或果昔(smoothies)。
可食用包衣颗粒或其团聚物特别适于掺入谷物中或其上。然而，可食用包衣颗粒或其团聚物可以在水中复原以制得液体饮料之后直接食用。
所使用的可食用颗粒或其团聚物的用量随其所要掺入的可食用产品而改变。
例如，乳制品可以补充有多达10%w/w的可食用包衣颗粒及其团聚物。包覆有颗粒的谷类可以仅包含1%w/w或2%w/w。
优选地，掺入颗粒及其团聚物上及其中的益生微生物在室温下存活6个月至1年。在可食用颗粒或其团聚物中观察到的活益生微生物浓度的逐渐降低反映在可食用食品中。例如，可食用颗粒或其团聚物的约1logcfu/克的损失降导致其所掺入的可食用食品的约1logcfu/克的损失。
这种损失比通常在室温下保存的包含益生微生物的产品中所观察到的损失更低。损失是足够低的，使得即使在数月之后，可食用产品仍能够递送足以向消费者提供健康益处的益生微生物。
通过本发明方法制备的包衣颗粒或团聚颗粒可直接用作食品，或食品的成分，或饮食补充剂或营养保健品。
在一实施方案中，所述食品或食品成分为糖果、奶、奶制品、奶粉、复原乳、酸乳(culturedmilk)、酸乳酪、优酪乳(drinkingyoghurt)、凝固性酸乳酪(setyoghurt)、饮料(drink)、乳制饮料(dairydrink)、奶饮料(milkdrink)、食品添加剂、饮料添加剂、饮食补充剂、营养品(nutritionalproduct)、医疗食品、营养保健品(nutraceutical)或药物。
这些产品可以包含任何消费者可食用产品，其能够携带碳水化合物、蛋白质或任选存在的脂肪或它们的组合。合适的消费者可食用产品的实例包括：含水产品(aqueousproduct)、烘烤物品、糖果产品(包括巧克力、凝胶、冰激凌、谷物、复原水果产品、零食棒(snackbar)、食物棒(foodbar)、什锦谷物早餐条(mueslibar)、糊状食品、调味酱(sauces)、沙司(dips)、乳制品(包括酸乳酪和奶酪)、饮料(包括乳基和非乳基饮料)、奶、奶粉、运动补充剂(包括乳基和非乳基运动补充剂)、果汁、食品添加剂(如蛋白末(proteinsprinkles))以及饮食补充剂产品(包括日常补充片剂、胶囊剂、软凝胶剂和散剂)。本文可用的合适的营养组合物可以类似形式提供。
优选地，通过本发明方法制备的颗粒可以是干燥、半干燥(semi-dried)或中度干燥(intermediatedried)的食品，例如乳基或大豆基粉末、乳基粉状饮料、麦芽/大豆/谷物基饮料、早餐谷物食品、水果或蔬菜汁粉末。或者，通过本发明方法制备的颗粒用于增强半干燥或中度干燥的食品，例如乳基或大豆基营养粉末、乳基粉状饮料、麦芽/大豆/谷物基饮料、早餐谷物食品、水果或蔬菜汁粉末、压缩干粮、巧克力棒、糖果、糊状食品、调味酱或果昔。
待治疗的疾病
已对益生微生物在预防和治疗疾病中的作用进行了许多研究。
益生菌例如鼠李糖乳杆菌GG和乳糖双歧杆菌BB-12与预防和治疗感染性腹泻特别是由轮状病毒在儿童中引起的腹泻有关(FAO/WHO,2001)。
益生菌还被认为在个体用抗生素治疗之后可用于恢复肠道微生物区系，从而防止和/或治疗艰难梭菌(Clostridiumdifficile)的异常升高，所述异常升高可导致腹泻(FAO/WHO,2001)。
已证明乳酸菌在体内有效地抑制幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的生长，已知所述幽门螺杆菌诱发乙型胃炎、消化性溃疡和胃癌(FAO/WHO,2001)。
目前仍在进行支持用益生菌治疗炎性综合征和肠综合征如隐窝炎和局限性肠炎的研究。
其它研究使益生菌与预防一些癌症和辅助缓解便秘相关联。
研究者已证明益生菌能够调节免疫参数，例如在老年人中激活天然杀伤细胞、诱发粘液产生、激活巨噬细胞、刺激益生作用部位的sIgA和嗜中性粒细胞以及刺激升高的外周免疫球蛋白。
其它研究已证明益生菌可用于治疗心血管疾病、泌尿生殖道疾病、细菌性阴道病、酵母性阴道炎(yeastvaginitis)和泌尿道感染(FAO/WHO,2001)。
因此，已证明用益生菌治疗个体产生广泛的健康益处。本发明的颗粒及其团聚物可用于药物应用。
一方面，本发明包括包含包衣颗粒或其团聚物以及药学可接受的赋形剂的药物组合物。
现以非限制性方式通过参考下列实施例而阐述本发明的各方面。
泛言之，本发明还可(独立或共同地)存在于本申请说明书所涉及或所指明的各部分、要素和特征，存在于所述部分、要素或特征的两种或更多种的任一或所有组合，并且其中本文提及的具体整数具有本发明所涉及领域的已知等同物，此类已知等同物视为援引加入本文，如同单独所述。
实施例
使用干酪乳杆菌CRL431菌株进行实施例1-5。
实施例1-干酪乳杆菌CRL431菌株的生长期的确定
该实验设计为测定实验菌株干酪乳杆菌CRL431的对数期的开始、中点和终点以及静止期的持续时间。
通过使用分光光度计(Hitachi,Inc.)测量培养基(MRS肉汤)的光密度的变化来确定细菌生长期。
将冷冻干燥的细胞在MRS肉汤中连续复水3天，然后以1.0%(v/v)在10ml的MRS肉汤中接种并在37°C下孵育。还将在瓶中的预消毒胨水(每个9ml)在37°C下保持以供稀释目的。
在每一时间点，将300μl的培养基无菌转移入9ml胨水瓶中。将培养基用0.2%胨水稀释并使用涡流搅拌器彻底混合。然后，在610nm的波长下测量稀释的培养基的光密度。以2小时间隔采集读数，共持续24小时。
确认的是，从初始接种时间起，干酪乳杆菌CRL431的对数中期和早期静止期分别为14小时和20小时。
在图2中示出显示干酪乳酸菌CRL431生长曲线的实验结果。
实施例2-休克处理
渗透压休克处理
使干酪乳杆菌CKL431细胞连续生长三代。通常，益生菌细胞的一个生长周期在17-20小时中完成。在该时期之后，将接种物接种到新鲜的生长培养基中以生长另一代。该过程在获得最终细胞之前重复三次。
在生长周期进行连续3天之后，用2%(v/v)接种(4×400mlMRS肉汤+4×8ml接种物)制备批量培养物，并且在37°C下孵育。
将细胞如实施例1所述孵育14小时，直至达到对数中期。在四个400ml培养基的两个中各自添加100ml另外的预消毒MRS肉汤(其包含16gm的氯化钠)。在最终500ml培养基中的盐浓度为0.6M。
其它两瓶培养基为阴性对照，其各自补充有100ml无菌MRS肉汤。
将所有四个瓶再孵育6小时，直至细胞达到它们的静止生长期(从接种起20小时)。然后，通过将四个瓶子在7500RPM下离心10分钟来获得每一瓶中的细胞沉淀，由此收集细胞。然后，将细胞沉淀各自重悬浮于0.2%胨水中，通过轻微振摇而洗涤，并且进一步离心以收集洗涤的细胞沉淀。从每一瓶中获得约5克的细胞沉淀。
热激处理
用2%(v/v)的再生培养原种(revivedculturestock)接种MRS肉汤(2×400ml)，并在37°C下孵育20小时。
然后，将包含接种的培养基的duran瓶放置在预热至50°C的循环水浴中。在轻微振摇下将瓶子在水浴中保持30分钟。
在30分钟之后，将培养基通过在瓶子周围的循环自来水而立即冷却至室温。细胞收集、洗涤和沉淀采集方法与上述相同。
热激和渗透压休克组合处理
细胞制备和渗透压休克处理与上述相同。然而，在生长20小时之后，将细胞洗涤并从含氯化钠的培养基中移除，重悬浮于新鲜的无菌MRS肉汤中，然后进行上述方法的热激。
实施例3-使用流化床干燥器的包埋
细胞生长条件、渗透压休克、热激、组合应激和细胞收集操作与实施例1和2所述相同。
通过添加0.2%无菌胨水而将由离心和后续洗涤获得的细胞沉淀形成悬浮液。对于每一样品，将从2L的MRS肉汤获得的12.5克细胞沉淀补充至25ml以供喷射。制备全脂奶粉(FonterraCo-Operative,NZ)和商购植脂末(来自Kerry的Vanablanca35C)的干混物，以得到表1所示的最终组合物。
表1
乳脂 25.92%
植物脂肪 3.5%
乳碳水化合物(乳糖) 34.20%
葡萄糖 5.85%
乳蛋白质 22.07%
矿物质 5.14%
水分 3.32%
将两百五十克的该混合粉末放置流化床干燥器(GlattInc.Germany)中。将25mL的干酪乳杆菌细胞浆体间歇性地喷射在粉末床上以确保细胞均匀且彻底地分散在基质中。同时进行流化和干燥步骤以喷射细菌细胞浆体。
将流化空气保持在48-55°C。定期测试样品的水活性(Aw)值，并继续干燥直至Aw达到0.25以下。每一样品的干燥过程约消耗1小时。
然后，将干燥样品包装在双层低密度聚乙烯(LDPE)袋中，并在没有湿度控制或干燥条件下在25°C下贮存，从而模拟商用展示货架的贮存环境。使用标准倾注平板法定期测试样品以获得活乳酸杆菌的细胞计数。
为将该方法结果与冷冻干燥技术进行比较，通过使细胞在MRS肉汤中生长并转移入复原脱脂奶然后冻干而制备冷冻干燥的干酪乳杆菌样品。然后，将干燥的培养物以1%(w/w)与流化床干燥试验所用相同的包埋基质(参见表1)干混，并且在类似贮存条件下进行耐贮存分析。
结果重复两次，这些结果的平均值在图3的对数标度中示出并在以下进行讨论。
结果
对于四种样品中的每一种，初始细胞浓度高于109cfu/gm水平。如下表2所示。
表2
组合处理(渗透和热) 109.92cfu/g
热应激 109.63cfu/g
渗透 109.55cfu/g
对照 109.50cfu/g
在没有湿度控制或干燥条件的情况下在25°C下的贮存和中温导致所有样品的细胞活力损失，但细胞死亡的程度则每一样品各有不同。
在商购冷冻干燥样品中观察到活细胞计数的最大损失，其中细胞计数在12周内降低至4.30logcfu/克。该水平完全低于FAO/WHO所规定的指导水平(106-107/克)。因此，在12周后中断该样品的进一步技术。对照和热应激样品在细胞死亡率方面表现出类似趋势，并且在24周结束时，这些样品的活细胞计数分别为6.6logcfu/克和7.0logcfu/克。在48周之后，活细胞计数分别为6.81logcfu/克和6.60logcfu/克。组合应激处理对细胞活力的影响是中度的(在36周之后为8.1logcfu并且在48周之后为7.45logcfu)。
在包埋过程之前进行渗透压休克的干酪乳杆菌细胞中，细胞死亡率降低得最多。该样品在贮存36周之后具有8.43logcfu/克的活细胞计数，其等于仅1.12log的细胞活力降低。在48周之后，该样品表现出7.68logcfu/克的活细胞计数。该样品的最终结果完全高于在任何食品中递送每克6.0logcfu活细胞的FAO/WHO指导水平。
因此，该实验证明本发明的方法在中温长期贮存期间产生优异的细胞活力保护。
实施例4-当用于商购食品时成分的耐贮存性
因为实施例3证明进行渗透应激然后干燥的细胞是最耐贮存的，因此仅对这些细胞的样品进行商购产品应用的进一步稳定性测试。
根据实施例3所述相同方法制备耐贮存益生菌成分。该成分用于强化可商购半干食品：压缩干粮(CadburyBrunchBar,Cadbury,NZ)和巧克力酱(Cottee’sChocolateWhizz,HJHeinzCo,Australia,Ltd)，并在贮存期间测试活细胞计数。
通过将干粮条纵向切半而制备压缩干粮。然后，将1.0%(w/w)的益生菌成分放置在两半之间。将压缩干粮重新包装在LDPE层状铝箔中，并热封，并且在没有湿度控制的情况下在25°C下贮存24小时。
将6%(w/w)的益生菌成分混入商购的巧克力酱中。然后，将该酱放入具有气密盖的无菌塑料容器中。在没有湿度控制的情况下，将样品在25°下C贮存24周。
结果
该实验的结果在图4中示出并进行以下讨论。
含6%(w/w)所述成分的巧克力酱具有7.63logcfu/gm的初始干酪乳杆菌群，其在24周贮存期内几乎保持稳定。在24周的时间段结束时，细胞计数已降低至7.41logcfu/克。
含1%(w/w)所述成分的压缩干粮表现出6.98logcfu/克的更低的初始计数，并且在24周结束时为6.2logcfu/克。
在这两种情况下，强化产品均能够保持由作为指导的FAO/WHO所建议的益生菌最小水平。
存在通过增加初始细胞负载来递送更高量的活细胞的范围。目前正在进行涉及这点的进一步研究。
实施例5-藻酸钠的微囊化
细胞生长和渗透压休克
细胞生长条件、渗透压休克和细胞收集操作与实施例1和2所述相同。
微囊化
制备的四种样品包括对照、渗透压休克细胞、热激细胞和组合休克的干酪乳杆菌细胞。然后，将各样品如下包囊。
将藻酸钠溶液(1%w/v)高压灭菌，并且将4克离心的细胞沉淀加入100克该溶液中，然后在Ultra-Turax混合器中以8500RPM均质化1分钟，从而均匀分散细胞。然后，使用300μm直径的喷嘴将该芯-壁混合物喷射在无菌4.0%CaCl2溶液上以形成微小凝胶颗粒。这是微胶囊化益生菌的标准挤出技术。用于包囊的设备是来自EncapBioSystemsAG,Greifensee,Switzerland的Inotech封装器。
然后，使微囊在搅拌(300RPM)下硬化30分钟。将CaCl2溶液倾出，并且用无菌蒸馏水洗涤小珠两次。然后，通过在4500RPM下离心3分钟来收集小珠。
真空干燥过程
使含细菌细胞的藻酸盐小珠的离心团块经过真空干燥过程。为了在干燥过程中给予最小的热应激，通过将真空水平调节为-80KPa以在干燥器中保持40-45°C的温度。从约为0.93-0.95的初始水活性水平开始，花费约5小时来将团块干燥至0.45-0.47的Aw水平。
脂质膜包衣过程
所选的包衣材料为由BungeIndiaPvt.Ltd.,India(DALDA)制造的部分氢化油的混合物。该材料在环境温度下为固体形式并在40°C之上熔化。通过将脂肪放置在50°C的水浴中而使脂肪熔化。将干燥的藻酸盐胶囊以3:4的比率混入熔化的脂肪。选择该比率以对于合适的可见包衣添加恰好足够的油。更高量的油可能导致不期望的感官性质以及在最终成分中更少的截留细胞的有效负载。然后通过将混合物冷却至室温而固化包覆的包衣。
然后将未包覆的和脂质包覆的藻酸盐微胶囊与微晶纤维素(MCC)(2克藻酸盐胶囊/5克MCC)干混。然后，将混合物包封在LDPE袋中并在25°C下贮存。
活干酪乳杆菌细胞的计数
在stomachar的辅助下将藻酸盐胶囊(湿润的和干燥的)溶解在0.2M磷酸钠溶液中以释放截留的细菌细胞，然后在0.2%胨水中连续稀释并在MRS琼脂上倾注平板计数。
结果
实施例5的结果在图5、6和7中示出并在以下讨论。
在所有四个湿样品中的初始细胞计数高于10.00logcfu/克。该量被认为是满意的，因为当最终产品包含1%的这些细胞时，递送了足量的活益生菌细胞(108cfu/克)。然而，在干燥过程之后，观察到相当大的活力损失，并且所有样品的活细胞群下降至平均9.50logcfu/克(图5)。如果在贮存期间不发生进一步显著活力损失，则该水平仍然是满意的。
下面图6和7示出当干燥的微胶囊(脂质包衣的和未包衣的)与作为惰性基体材料的MCC混合之后在25°C下贮存时的细胞活力的衰退。
从图5、6和7中明显看出，所有四种样品均经受非常高水平的死亡率，这归因于高贮存温度和低水活性的不利贮存条件。与对照样品相比，细胞中的应激适应仅导致微弱改善的活力。在脂质包衣样品中没有观察到任何死亡率方面的显著差异。
因此，假定的是，尽管在文献中已报道应用这样的屏障膜有效改善酸稳定性，但这可能仅当在含高水平水分的产品基质中应用包囊益生菌时是有用的。
因为所有样品的活细胞计数降低到可接受水平之下，所以中断样品的进一步计数。
作为测试各种产品应用中保质期稳定性的平行实验，将开发的成分(干燥的/脂质包衣的藻酸盐微胶囊)进压缩干粮和巧克力酱中。然而，在任何样品中，4周之后未记录到任何可接受的活力水平。因此，在此不提供详细结果。
实施例6-当进行本发明方法时的不同菌株稳定性
将实施例2和3中概述的技术用于制备使用不同益生菌株的益生菌包衣颗粒的样品。使用四种菌株来比较无应激细胞与渗透应激细胞的稳定性。包衣颗粒包含实施例3所述的基质(表2)。在流化床中进行包衣和干燥，如实施例3所述。
图8所示的结果证明，在嗜酸乳杆菌ATCC4356(图8A)和乳糖双歧杆菌BB12(图8D)菌株的情况下，与无应激细胞(◆)相比，在渗透应激细胞(■)中观察到贮存活力的显著改善，并且在干酪乳杆菌ATCC393(图8C)和鼠李糖乳杆菌ATCC53103(图8B)菌株的情况下，记录到微弱的改善。将冷冻干燥技术用作对照()，其中所有细菌的残留活力在2至5个月内降低至非显著的水平。
实施例7-本发明方法与常规干燥技术的比较
使用根据实施例2制备的渗透压休克干酪乳杆菌细胞来包覆实施例3所述的食品基质(表1)。使用不同技术来包覆和干燥颗粒。结果在表9中示出。
使用渗透压休克细胞以及在流化床中包覆和干燥颗粒的组合提供了比当用渗透压休克细胞包覆颗粒并使用其它方法(例如喷雾干燥或冷冻干燥)干燥时更稳定的产品。
为理解低温流化床干燥对贮存活力的作用，使用标准喷射干燥和冷冻干燥技术来使干酪乳杆菌细胞稳定，保持渗透应激水平并干燥与本发明方法所用相同的基质。图9的结果表明，在12周的25°C贮存之后，在流化床干燥的情况下存在非常微小的细胞活力下降，而喷雾干燥和冷冻干燥的细胞则分别降低了约3.0logcfu/克和3.5logcfu/克。
建议在零度以下的温度贮存商购样品。因此，这些细胞预期受环境贮存的影响最小。渗透应激和流化床干燥技术的组合产生有益结果。
实施例8-根据本发明方法制备的益生菌成分的物理特性
将干酪乳杆菌细胞渗透应激并使用实施例2和3所述的技术和材料包囊。测量不同的物理性质例如粒度分布、流动能力、溶解度，并且与两种在食品工业中最常见的粉末(即脱脂奶粉(SMP)和全脂奶粉(WMP))进行比较。
本发明的益生菌粉末的粒度分布是均匀的(图10)，基于表面的平均直径(D32)为125.6μm，其范围是7μm至832μm。WMP和SMP的D32值分别实测为76.1μm和66.3μm。WMP的直径范围略微较短(6μm至550μm)，而SMP的非常类似(5μm至954μm)。显著较高的平均直径明确表明本发明的益生菌粉末是高度团聚的，这是易于操作和更好分散性所期望的性质。
本发明的包囊益生菌粉末、WMP和SMP的流函数(flowfunction)在图11中示出。粉末的流动性由曲线斜率定义。最高流动性是SMP所记录的。WMP的流动性质和益生菌粉末的非常接近，并且益生菌粉末略微更好。较高的粒度由于上述所报道的益生菌粉末的团聚而可以成为较好流动性质的可能原因。对于益生菌粉末、WMP和SMP，样品的平均堆密度分别实测为469.72kg/m3、540.52kg/m3和583.25kg/m3。益生菌粉末的相对更低的密度还可能归因于高度团聚的较大尺寸颗粒的存在，如先前所报道的(Szulc&Lenart,2010)。
益生菌粉末、WMP和SMP的溶解指数分别实测为1.5ml、1.0ml和1.0ml。益生菌粉末的水活性实测为0.27，其低于WMP(0.33)和SMP(0.30)二者。更低的水活性表明更少的包囊细菌可用的游离水，这限制了它们的增加。因此，低水活性被认为是成分的耐贮存性的有利因素。
实施例9-本发明的益生菌粉末的感官性质
FAO/WHO发布的指导声称应以充足的量食用益生菌富集产品，以使在每天的饮食中可获得至少10,000,000-100,000,000个活细胞。将用于感官评价的麦乳精饮料与10%益生菌粉末预混合。通过使用流化床，用渗透压休克的干酪乳杆菌CRL431包覆实施例3所述的颗粒基质(表1)来制备本发明的益生菌成分。整个混合物的活细胞计数为4×106/克。因此，发现10克该饮料足以满足成年人的每日需求。因此，通过添加90ml在65°C下预热的巴士消毒奶(含3.5%的脂肪)来复原该饮料。在制备饮料之后立即将其置入40ml白塑料杯中以提供给一组10名的知情感官品尝者。
随后的实验方案与Guergoletto等人于2009年所报道的工作类似。进行三角试验(triangulartest)以发现其中加入或不加入本发明的益生菌粉末的复原麦芽饮料之间的任何差异。将制得的饮料就益生菌粉末强化饮料的风味、颜色、味道和整体接受度而言的接受水平与无益生菌的对照样品相比较，并且评价10名品尝者的意见。依次提供该样品，并且使用结构化九点感官等级(structurednine-pointhedonicscale)来记录判断。该等级设定为将品尝者的定性意见量化为1-9分的范围，1为“非常不喜欢”而9为“非常喜欢”。
在感官性质测试中，通过将10名品尝者给出的分数平均化而计算1-9级的整体接受分数。对于未添加益生菌成分的麦乳精饮料，分数为7.0。对于益生菌饮料，其为6.8，这表明两者为几乎相同的接受度(图12)。两种饮料的风味和味道也非常类似，并且在两种饮料之间存在微弱的颜色差异(图12)。在三角试验中，10名判断者中的7名不能确认具有或不具有添加的益生菌成分的样品之间的差异。总体上，没有收到与具有添加的益生菌的特定样品的接受度有关的负面评价。
实施例10-本发明的包囊益生菌细胞在模拟粉状饮料饮用条件下的热稳定性
通过将10wt%的耐贮存干燥营养粉末形式的本发明的益生菌粉末与麦芽饮料粉末干燥混合来测试该粉末的应用，所述麦芽饮料粉末包含从当地市场采购的麦芽提取物(maltextract)、可可、糖、乳固体(milksolid)、焦糖和葡萄糖。将活益生菌成功递送入麦芽饮料中的重要标准是菌株的热稳定性，因为这是惯例并且还由制造商指示在添加热水而非开水之后来食用。因此，在该试验中，通过直接将90ml的55°C、65°C和75°C的热水添加至10克的麦芽饮料+本发明益生菌成分来模拟类似的饮用条件。在5分钟和30分钟之后计算活细胞计数。观察到30分钟时间段为饮料从最高热水(75°C)添加点达到室温所必须的最长时间，并且大概是人饮完一杯饮料所需要的最长时间。
结果(表3)表明，当90ml的75°C的水添加至10克的混合饮料(麦芽饮料+益生菌成分)中并在5分钟内测试混合物的活菌计数时，从混合物的初始细胞群(8.4-7.9logcfu/克)下降0.5log。在保持30分钟之后，温度降低至35°C，并且细胞群进一步降低至7.3logcfu/克。如果我们假定在长时间(30分钟)内饮用饮料，则活益生菌的推荐水平仍保持在上述范围中。在添加65°C水的情况下，当饮料温度记录为25°C时，在5分钟之后细胞群几乎保持相同，并且在30分钟之后略微降低至7.9logcfu/克。
添加的55°C的水对活细胞计数根本没有任何影响。因此可观察到，尽管推荐的饮料制备技术包括将细菌细胞暴露于升高的温度，但甚至在考虑活力的可能损失之后，消费者仍可获得满足推荐水平的足量的活细胞。
表3.当在本发明益生菌成分中包囊时在不同温度下添加热水对干酪乳杆
菌CRL431细胞活力的影响
实施例11-本发明益生菌成分的贮存活力与使用其它基质制备的益生菌成分的比较
根据实施例2使用渗透压休克的干酪乳杆菌CRL431细胞来制备本发明的益生菌成分。使用如实施例3所述的流化床，使用该细胞来至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒。
还通过用以相同方式制备的干酪乳杆菌细胞在流化床中至少部分地包覆(a)乳蛋白质分离物和(b)葡萄糖的颗粒，从而制备比较例。结果在表13中示出。
实验表明，颗粒基质的所有三种组分(即碳水化合物、任选存在的脂肪和蛋白质)是实现本发明益生菌成分所证明的优异稳定性质所必需的。
甚至当将干酪乳杆菌在包衣步骤之前渗透压休克时，当包覆在仅含葡萄糖或蛋白质的颗粒上时，它们也不能保持活力。
工业应用
本发明具有制备当在室温下长期贮存时保持活力的益生微生物的用途。因此，本发明的方法制备可掺入耐贮存的干燥和半干食品中的益生微生物。
本领域技术人员应理解，上述描述仅以例示方式提供，并且本发明不限于此。
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Claims (22)

1.制备可食用包衣颗粒或其团聚物的方法，其包括：
a)用渗透压休克的益生微生物的悬浮液至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒；以及
b)干燥所述包衣颗粒或其团聚物；
其中所述可食用包衣颗粒或其团聚物包含活益生微生物，
其中使用流化床设备进行步骤a)和b)，并且所述益生微生物选自乳杆菌、双歧杆菌、乳杆菌混合物、双歧杆菌混合物或者乳杆菌与双歧杆菌的混合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述益生微生物选自干酪乳杆菌(L.casei)CRL431、干酪乳杆菌ATCC393、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)ATCC4356、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)ATCC53103和乳糖双歧杆菌(B.lactis)BB12。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述益生微生物为使用NaCl进行渗透压休克的。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒包括奶粉。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述干燥的包衣颗粒或其团聚物包含至少1010cfu/克的活益生微生物。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于2.0logcfu/克。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于2.0logcfu/克。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中在20-50℃下进行步骤b)。
9.制备包含至少107cfu/克的活干酪乳杆菌CRL431的可食用包衣颗粒或其团聚物的方法，其包括：
a)用渗透压休克的干酪乳杆菌CRL431细胞的悬浮液至少部分地包覆包含碳水化合物、蛋白质和任选存在的脂肪的颗粒；以及
b)干燥所述包衣颗粒或其团聚物；
其中使用流化床设备进行步骤a)和b)；并且
其中活干酪乳杆菌CRL431细胞的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于1logcfu/克。
10.通过权利要求1至9中任一项所述的方法而制备的可食用包衣颗粒或其团聚物。
11.如权利要求10所述的可食用包衣颗粒或其团聚物，其中活益生微生物的浓度在室温下贮存6个月之后降低了小于2.0logcfu/克。
12.如权利要求10所述的可食用包衣颗粒或其团聚物，其中活益生微生物的浓度在室温下贮存12个月之后降低了小于2.0logcfu/克。
13.可食用产品，其包含权利要求10至12中任一项所述的包衣颗粒或其团聚物。
14.如权利要求13所述的可食用产品，其为奶制品。
15.如权利要求14所述的可食用产品，其中所述奶制品选自奶、奶粉、复原乳和酸乳。
16.如权利要求13所述的可食用产品，其为糖果。
17.如权利要求13所述的可食用产品，其为酸乳酪。
18.如权利要求17所述的可食用产品，其中所述酸乳酪选自酸奶、优酪乳和凝固性酸乳酪。
19.如权利要求13所述的可食用产品，其为食品添加剂。
20.如权利要求13所述的可食用产品，其为饮料添加剂。
21.如权利要求13所述的可食用产品，其为饮食补充剂、营养品、医疗食品、营养保健品或药物。
22.药物组合物，其包含权利要求10至12中任一项所述的包衣颗粒或其团聚物。
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