CN117981874A - 添加于食物和饮料的耐热益生菌及其制备方法 - Google Patents

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CN117981874A CN202311446198.1A CN202311446198A CN117981874A CN 117981874 A CN117981874 A CN 117981874A CN 202311446198 A CN202311446198 A CN 202311446198A CN 117981874 A CN117981874 A CN 117981874A
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尤茹艳
高俊熙
吴子威
谢家敏
王睦
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Abstract

本发明提供一种耐热耐酸益生菌微球，尺寸为20至250微米，可容易掺入随后需要进行热处理的食品或饮料中。合生制剂核心包括由至少一种多糖形成的芯材层。益生菌微生物被覆盖在芯材层上。耐酸壳层位于合生制剂核心之上，该耐酸壳层包含一种或多种pH响应性聚合物。耐热双层壳位于耐酸壳层上，耐热双层壳包括内壳层和外壳层，其中内壳层包括耐热脂质体层，外层包括耐热二糖或多糖。

Description

添加于食物和饮料的耐热益生菌及其制备方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年11月2日提交的美国临时申请第63/421,575号及2023年11月1日提交的美国申请第18/499,252号的优先权，所述文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及一种健康食品或饮料，其用于将通常经过热处理的食品或饮料中的热敏营养物递送给消费者。更具体地，本发明涉及具有包衣组合物的包埋益生菌，以保护益生菌在工业加工过程中免受高温，同时在随后保证有足够数量的活性益生菌被人体摄入，并在胃肠消化环境中存活。
背景技术
在近年，菌群失调(即微生物群的不平衡)导致微生物组的功能和代谢出现问题，可能导致人类宿主免疫力较低，对感染的易感性较高(Xu et al.,2020)，并可能以各种疾病的形式表现。菌群失调最常见于胃肠道，这可能导致一些疾病和病症，包括但不限于胃肠道症状(呕吐、腹泻、腹痛、营养不良等)、克罗恩病、炎症性肠病和II型糖尿病。
然而，这种失调可以通过菌群再生来补救，该过程利用包括益生菌在内的治疗工具来重新建立天然微生物群。世界卫生组织将益生菌定义为“当施用足够量时可以赋予宿主健康上的益处的活性微生物”。因此，益生菌在全球越来越受欢迎，预计益生菌相关产品的销量将在全球持续大幅增长。研究表明，与药丸或片剂相比，大多数人会选择食物和/或饮料作为首选的益生菌摄取形式。然而，丸剂或片剂形式的补充剂是当前市场上占主导地位的益生菌产品。对于老年人和儿童来说，服用这些补充剂一直是一个难题，因为他们可能存在吞咽困难和“药丸疲劳”心理。将益生菌添加到食品中被认为是一种更自然的摄取方式，可以帮助克服将益生菌作为处方或药物的看法。此外，公众健康意识的增强也催生了对多功能健康食品的需求。因此，需要开发新型益生菌食品和饮料来满足这种需求。
传统上，益生菌已被掺入乳制品中用于发酵以生产酸奶等食品。发酵剂的最佳生长条件使益生菌能够在此类产品中存活；然而，产品必须冷藏以防止变质导致的保质期缩短。冷藏的需求限制了益生菌产品的种类。近年来，耐储存的功能性食品和饮料行业大幅增长。高温加工在行业中很常见，这限制了益生菌在食品和饮料中的应用，因为益生菌的活性在加工食品的制造过程中容易受到热应激的影响。由于现有技术的限制，将益生菌加入到零食、果汁和谷物棒等食品中只能通过直接混合到成品中来完成，因为这样的加入不会涉及加热从而导致益生菌失活。此外，在饮料中加入益生菌必须始终在密封饮料包装之前的产品热处理过程中进行，以避免交叉污染。因此，含有益生菌的热处理食品和饮料产品有限，益生菌必须在热处理后、食品或饮料冷却后添加。对于烘焙产品等食品来说，这种做法是不方便或不可能的；对于极易受到细菌污染的巴氏灭菌饮料(例如鲜奶或果汁)同样不可行。
许多益生菌只在具有活性时表现出它们对健康的益处。因此，益生菌除了需要能够在食品/饮料的制造过程和保质期中生存之外，还应该能够在具有低pH胃酸和消化酶存在的胃肠道环境中生存，然后才能到达小肠并定殖。虽然市面上有许多商业化的益生菌产品，特别是粉末/丸剂形式的补充剂，但大多数在高温食品加工、储存和胃肠环境中就会失去活性。此外，热应激的益生菌对高温特别敏感(Hao et al.,2021；Gardiner et al.,2000)，并且往往会在通过具有挑战性的胃肠道时失去活性。
乳杆菌属和双歧杆菌属是最常用的益生菌属，其耐热温度通常为60℃以下(Haoet al.，2021；Gardiner et al.，2000)。为了发挥健康益处，建议每克或毫升益生菌的最低剂量为106个菌落形成单位(cfu)。为了解决胃酸带来的挑战，制造商通常在产品中添加过量的益生菌，希望其中一部分能够在热处理和胃肠道中存活下来。然而，这种做法并不符合成本效益；此外，益生菌的保质期不确定，耐高温仍然是制造商面临的挑战。尽管耐热芽孢杆菌已被提议作为乳杆菌的替代品，但芽孢杆菌具有孢子形成特征，由于其毒素和抗生素耐药性，可能会造成公共健康风险。芽孢杆菌对工业消毒过程具有抵抗力而令其难以消除。并且，芽孢杆菌不能很好地在胃肠道定殖(Bernardeau et al.2017)。
聚合物和蛋白质是用于保护益生菌免受胃酸侵害的制剂中的典型成分。然而，常规制剂在高温加工过程中会发生结构变化，并且在没有肠溶衣的情况下无法提供适当的针对胃酸的保护。迄今为止，还没有具有针对热应激和胃肠道双重保护作用的制剂。
例如，EP2648528B1描述了一种组合物和方法，用于改善益生菌在食品中递送时的稳定性和延长保质期，特别是耐氧和耐湿性。该多层制剂含有益生菌和稳定剂/抗氧化剂作为核心，具有至少三层包衣，其中包括疏水性固体脂肪包衣，用于防止水/湿气渗透到核心中，水封包衣作为中间包衣层用于降低表面张力，氧气和湿度密封涂层用于减少湿度和氧气的传输以维持益生菌的活性。但都没有讨论如何保护益生菌免受高温加工的影响。
US2004/0175389公开了一种用于在益生菌通过胃和在肠中释放期间保护益生菌的制剂。该制剂为胶囊形式，包含益生菌与单价藻酸盐的无水混合物和肠溶衣。胶囊的外壳在与酸性环境接触时变成凝胶。凝胶提供了防止质子流入胶囊芯的保护屏障。然而，该组合物仅适用于在水分活度非常低的条件下储存的片剂和胶囊，需要充氮处理或真空密封的储存条件；而且并没有与热保护相关的描述。
WO 94/00019描述了一种通过在冷却后将活益生菌注射到烘焙产品中来制备含有活微生物的烘焙产品的方法。然而，注射过程需要通过多个针头，成本高、不方便，并且可能会破坏烘焙产品的质地。
EP2451300B1描述了一种制备拥有多层外衣的益生菌颗粒的方法，用于将其混合到健康食品中，其中微生物被稳定化以在食品、特别是干燥食品的热处理过程中存活。该颗粒包含益生菌和作为核心吸附益生菌的基质、内油层包衣和由两种不同聚合物组成的两个外层包衣，分别用于抵抗胃肠道上部的消化以及耐热。该制剂以80℃干式加热30或45分钟为例。并无对于益生菌的耐热外层对其耐酸性影响的相关描述。同时，其颗粒的尺寸是否适合加入到食品和饮料中是值得怀疑的。
RU2549098C2描述了一种制造益生菌颗粒的方法，以益生菌核心包覆三层外衣，其中包括覆盖益生菌核心的第一内油层、用于抵抗胃肠道上部消化的第一外层和耐高温的第二外层。其中没有提供关于保护益生菌耐高温的外层如何影响热处理益生菌的耐酸性能力的描述或方向。
CN111134332A公开了一种采用流化床喷雾造粒法制备益生菌微胶囊的方法，产品作为食品保健行业的膳食补充剂。其中没有提供关于这些外层如何保护益生菌免受高温或胃酸影响的描述或说明。
CN102178238B公开了粒径在20至400微米之间的耐热微囊益生菌，经受80至90℃高温3分钟后，活菌数从109至1010cfu/g减少1至1.5个数量级。其中没有提供关于保护益生菌耐高温的保护层如何影响热处理益生菌的耐酸性能力的描述或说明。
上述组合均未提供能够在高温加工中有效保护益生菌并抵抗胃肠道胃酸和酶的挑战以使足够数量的活性益生菌到达肠道的混合物。本发明解决了这个问题。
发明内容
一种耐热耐酸益生菌微球，其尺寸为20至250微米，易掺入随后进行热处理的食品或饮料中。益生菌与益生元的合生制剂核心包括由至少一种糖类形成的芯材，并将益生菌覆盖在芯材之上。耐酸壳层覆盖于合生制剂核心之上，该耐酸壳层包含一种或多种pH响应性聚合物。耐热双层壳位于耐酸层上，耐热双层壳包括内壳层和外壳层，其中内壳层包括耐热脂质体层，外壳层包括耐热二糖或多糖。
所述的尺寸为20至250微米的耐热耐酸益生菌微球，其包括粒状合生制剂核心。颗粒状合生制剂核心包括芯材，芯材可以为寡糖和多糖。粒状合生制剂核心还包含益生菌。粒状合生制剂核心还可包含一种或多种粘合剂，包括乳清蛋白和乳蛋白。所述耐热耐酸益生菌微球还包括耐酸壳层，所述耐酸壳层具有一种或多种pH响应性聚合物，所述一种或多种pH响应性聚合物可包括L100和藻酸盐。耐热耐酸益生菌微球还包括耐热双层壳。耐热双层壳具有内层和外层，其中内层包括：一种或多种类异戊二烯稳定的磷脂脂质体。一种或多种类异戊二烯稳定的磷脂脂质体具有选自磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的磷脂。耐热双层壳的内层具有一种或多种类异戊二烯。一种或多种类异戊二烯具有胆固醇和β-胡萝卜素。耐热双层壳的内层还可包含多糖。多糖包括麦芽糊精，而耐热双层壳的外层具有二糖，例如海藻糖。耐热双层壳的外层还可包含一种或多种矿物质，例如滑石粉。
所述的耐热耐酸益生菌颗粒可耐受75-90℃的温度5-15分钟。
所述的耐热耐酸益生菌颗粒的重量百分比包括50-79.2％的芯材、0.01-0.1％的活性益生菌、1.6-3％的蛋白质、2-6.3％的聚合物、4-7.9％的脂质体、0-1.6％的多糖、0-3.2％的二糖和0-0.3％的矿物质。
所述的耐热耐酸益生菌颗粒的重量百分比包括79.2％的芯材、0.01％的活性益生菌、1.6％的蛋白质、6.3％的聚合物、7.9％的脂质体、1.6％的多糖、3.2％的二糖和0.3％的矿物质。
所述的耐酸壳层和耐热双层壳具有至少四层。
所述的耐热耐酸益生菌颗粒在胃肠道消化后保持活菌数大于106CFU/g。
所述的耐热耐酸益生菌颗粒具有与外层偶联的附加防水涂层。
所述的耐高温益生菌颗粒耐90℃温度15分钟。
所述的附加防水涂层具有6-10％虫胶和甲基丙烯酸二甲氨基乙酯-共聚物EPO。
所述的耐热耐酸益生菌颗粒可在巴氏灭菌之前加入液体饮料如牛奶和果汁中并进行过热处理。
本发明还提供了一种耐高温和耐胃肠消化环境的益生菌颗粒的制备方法，该方法包括:
a.通过筛分制备尺寸在10-125微米之间、密度在0.65-0.75g/cm3之间的芯材；
b.用益生元和蛋白质制备质地均匀的活性益生菌溶液，通过搅拌混合来增强益生菌的活性和颗粒化；
c.通过加热搅拌制备耐酸的pH响应性聚合物；
d.将薄膜法制备的前体脂质体搅拌混合，制备稳定的类异戊二烯磷脂脂质体；
e.通过搅拌混合制备包含二糖的耐热外层；
f.利用流化床将芯材表面包覆益生元和益生菌层，然后包覆耐酸层和耐热双层，制备耐高温益生菌微球。
所述的制备益生菌颗粒的方法还包括制备芯材、在芯材表面上包覆益生菌、耐酸保护层和多个耐热保护层。
所述的制备益生菌颗粒的方法还包括微球的包埋率大于95％。
所述的制备益生菌颗粒的方法还包括达到108-1010CFU/g的活菌数。
所述的益生菌颗粒的尺寸在20-250微米范围内，平均尺寸为167微米。
所述的制备益生菌颗粒的方法还包括在巴氏灭菌之前将益生菌颗粒加入食品、食品添加剂或液体饮料例如牛奶或果汁中。
所述的加入益生菌颗粒的食品还包括经过热处理例如完全烘焙生产过程的干食品，例如糕点和面包。
附图说明
图1显示了使用流化床系统制造的益生菌耐热核壳系统的预测结构。
图2显示了在模拟胃酸挑战和肠道释放测试之前和之后耐高温益生菌的活性。
具体实施方式
本发明通过提供能够承受一段时间高温的核-壳包埋系统，解决了当热敏性营养物质/益生菌直接加入食品中时活性损失的问题。此外，核-壳系统为益生菌提供保护，从而将足够量的活性益生菌递送至宿主，并可以进一步抵抗随后的胃肠道消化挑战。耐高温益生菌采用专门的包埋配方，可使用流化床包衣进行大规模生产。流化床包衣既经济又方便，因为包衣和干燥过程可以被视为使用相同设备的单一过程。通过流化床中的一步制粒过程，可以在几小时内获得所需的微米级颗粒的干粉产品。所形成的颗粒尺寸极小，有利于将益生菌直接加入食品和饮料中，从而轻松将益生菌递送至宿主体内。
耐热耐酸益生菌颗粒100的研制
图1描绘了根据一个实施方案的耐热耐酸益生菌颗粒100的实例。在本发明的一方面，颗粒可以采取微球的形式。耐热耐酸益生菌微球100由芯材10和具有特定功能的四层外壳组成：益生菌和益生元核心层20、耐酸层30、耐热脂质体层40和耐热二糖或多糖层50。
核-壳颗粒100包括芯材10。芯材10可选自可为益生菌提供营养的材料。示例性材料可以是以下的一种或多种：蔗糖球、菊粉、淀粉、纤维素。芯材的选择是根据材料的涂覆性进行的。特别是不同的润湿特性影响芯材颗粒上的沉积速率。润湿能力差导致包衣效率差，从而导致活性损失(实施例2，表2)。典型的芯材/核心尺寸为10-125微米，密度为0.65至0.75g/cm3。
位于芯材10上的是益生菌和益生元核心层20，其可以是一种或多种益生菌，例如双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、链球菌属、肠球菌属、葡萄球菌属、酵母属和克鲁维酵母属。益生菌和益生元核心层20还可以包括用于向益生菌提供营养的益生元。益生元可以选自低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、果胶；蛋白质例如乳清蛋白、大豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、大米蛋白、豌豆蛋白、鸡蛋蛋白、酪蛋白、乳蛋白、玉米醇溶蛋白和牛血清白蛋白中的一种或多种则作为粘合剂来凝聚和包埋益生元，从而形成自由流动的颗粒。除了益生菌和任选的益生元之外，还可以在益生菌和益生元核心层20中提供热敏营养物。这些包括维生素，例如维生素C、维生素B1和维生素E。
耐酸层30形成在益生菌和益生元核心层20之上并包埋益生菌和益生元核心层20。覆盖益生菌和益生元核心层20的耐酸壳层30可以是pH响应性聚合物，例如L100、L100-55、Acryl-/>、紫胶、藻酸盐、果胶或这些材料的混合物。该层在摄入后在小肠内提供受控释放功能，不会被胃酸溶解。所选择的具有pH响应性的聚合物将在pH值低于3时胶凝，但在pH大于6时发生羧酸基团去质子化后迅速溶解。
耐热双层包括内脂质体层40和外二糖或多糖层50。耐热脂质体层40可以是比脂质体更稳定、易于分布、转移和储存的前脂质体。由含有磷脂的组分的脂质体制成的脂质体可以选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇中的一种或多种；类异戊二烯化合物可以选自胆固醇、β-胡萝卜素和番茄红素；水溶性载体可选自麦芽糖糊精、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、木糖醇或其任意组合。
前体脂质体的制备包括以一定比例混合磷脂(磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺和二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇)、类异戊二烯化合物(胆固醇、β-胡萝卜素和番茄红素)和水溶性载体(麦芽糊精、山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇)。类异戊二烯(胆固醇和β-胡萝卜素)可以通过钉子和铆钉样机制稳定磷脂双层。它们通过将自身插入磷脂内，与磷脂的头基形成氢键来稳定磷脂双层；并允许范德华吸引力将相邻的脂质链按顺序排列。通过加热测试研究了它们在耐热双层开发中稳定结构的能力以及由此产生的耐热能力。水溶性载体(麦芽糖糊精、山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇)由于其高表面积和孔隙率，可用于在前体脂质体的制备过程中支撑磷脂，从而允许水合时脂质体分散体的快速转化。
薄膜法可用于制备类异戊二烯稳定的磷脂脂质体。可以将磷脂、类异戊二烯和水溶性载体溶解在溶剂例如乙醇中，然后使用旋转蒸发系统除去溶剂以获得干燥的粒状薄膜材料。然后在使用前将粉末状前体脂质体重新溶解在水中以形成脂质体。脂质体结构提供耐热性能。含有相似的磷脂和类异戊二烯组合物的乙醇溶液的喷涂可能不会赋予益生菌所需的耐热特性(实施例5，表10)。
外耐热层50包括二糖或多糖以及任选的矿物质添加物。二糖可以是蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖或壳二糖中的一种或多种。滑石粉、高岭土、ZnO、TiO2和SiO2或其组合可以用作矿物添加剂。示例性的二糖是海藻糖，由于二糖的高粘度，添加了大约1％的滑石粉以增加流化粉末的流动性。
双层40/50的耐热特性在加热过程中吸收动能，使得磷脂分子能够保持更远的距离，并在磷酸酯头和酰基脂质链之间产生不利于热传递的间隙空间。通过类似钉子和铆钉的机制将类异戊二烯插入磷脂中，通过与磷脂的头部基团形成氢键，帮助稳定双层结构，同时允许范德华引力按顺序排列相邻的脂质链。外层50例如是海藻糖，由于两种己糖的高度稳定的键合和将海藻糖紧密地结合成具有低分子迁移率的刚性的巨大簇的强分子间氢键，其减少了热传递。
本发明颗粒中的示例性成分％重量如下：a)50-79.2％芯材的颗粒化合生制剂核心；0.01-0.1％活益生菌原料、1.6-3％蛋白质、0-1.6％多糖；b)2-6.3％聚合物的耐酸壳层；c)耐热双层壳，内层4-7.9％脂质体，外层0-3.2％二糖，和0-0.3％矿物质。
喷雾造粒和流化床包衣分别是形成颗粒和在颗粒或颗粒上形成包衣的方法。喷雾造粒首先用于生产合生制剂核心，其中含有益生元、益生菌和粘合剂的液体混合物同时干燥，同时形成无尘颗粒。在流化床包衣中，合生制剂核心粉末通过使垂直空气流过系统底部的分配板而流化。涂层材料可以是熔体、悬浮液或溶解在水或有机溶剂中的溶液，被喷射到流化颗粒上，其中单个液滴与颗粒表面碰撞并扩散，而溶剂不断蒸发。剩余的固体组分沉积在颗粒表面并形成层壳，导致颗粒生长。该过程的目的是使液滴均匀沉积在单个颗粒和整个颗粒群上，这对于实现均匀且光滑的涂层至关重要。
耐高温益生菌被加入食品和饮料中，例如待烘烤的面团或待巴氏灭菌的液体。双层外壳在食品加工过程中提供隔热作用，而耐酸层克服了胃肠道的挑战，在到达小肠时实现受控释放，以提供足够的活益生菌。
实例1
用于加热测试和活性测试的实验装置
使用对流烘箱进行加热测试。带有探头的数字烤箱温度计被放置在烤箱内以检测温度，通过金属线连接到放在烤箱外部进行监控的显示器。由于放入样品时打开烤箱门后热量散失，只有当温度显示为90℃时才开始15分钟的加热时间计时。加热后，样品在生物安全柜中冷却30分钟。随后，使用匀浆器在37℃下以50rpm操作30分钟，将包埋的益生菌释放到配制的释放溶液中，该释放溶液pH为6.8，含有碳酸氢钠、胆汁盐、胰酶和脂肪酶。将释放后的益生菌混悬液接种在MRS琼脂上，并在37℃下培养24-48小时。依据琼脂平板表面形成益生菌菌落计算活性益生菌数。
实例2
耐高温益生菌的耐热性能，其中外壳层包括与胆固醇稳定附着的磷脂酰胆碱脂质体和海藻糖双分子层连接的特定丝状聚合物
益生菌和益生元核心开发
在选择用于合生制剂核心的材料开发时，具有不同润湿特性的颗粒将极大地影响颗粒上的沉积速率并导致较差的包衣效率，从而导致活性损失。因此，在使用冻干益生菌作为芯材的试验A(表1)中，加热测试后的活性损失与对照(表2)相当。随后，通过使用菊粉作为芯材载体进行重新配制，核心层包含益生菌和益生元的混合物，并以乳清蛋白作为粘合剂，以凝聚并包埋菊粉载体以形成自由流动的颗粒。
表1:试验A的芯材和核心层的制剂以及合生制剂核心开发中的耐高温益生菌
表2:加热前后益生菌的活性和对数减少
使用菊粉(10-250微米，0.70g/cm3)作为芯材。核心层包含益生菌和益生元的混合物，以及作为粘合剂的乳清蛋白，以凝聚并包覆菊粉以形成自由流动的颗粒。将高达1011CFU/g的预培养益生菌清洗并与5％w/w益生元和5％w/w乳清蛋白混合，然后喷涂菊粉。流化床参数为流量20立方米/小时，产品温度41.3℃，喷雾速率2.0克/分钟，喷雾压力0.4bar。5％的重量增加就是为此目的而设计的。
耐酸层30的研制
耐酸层30用于在消耗耐高温益生菌时在小肠道中控制释放功能。L100是一种具有pH依赖性溶解度的聚合物，在pH大于6时羧酸基团去质子化后会迅速溶解。
未经预处理(预热)的具有耐酸层30的制剂影响耐热壳在90℃对流烘箱中加热15分钟后的耐热能力(表3)。包埋的益生菌遭受巨大损失，加热后活性降至106cfu/g以下。
表3：直接涂覆耐酸层30的加热测试前后包埋益生菌的活性和对数减少量(未预热)
*对照粉末：益生菌包衣的菊粉
预热、喷涂温度和溶质浓度影响其长丝(filament)形成。将20％w/w的L100在50℃下预热12小时，然后以25m3/h的流量、41℃的产品温度、3.2g/min的喷雾速率和0.4bar的喷雾压力进行喷雾。该处理条件使得耐热脂质体层能够粘附而不损害耐热能力；同时保持其pH响应性的新颖功能。8％的重量增加就是为此目的而设计的。
耐热双层开发
耐热双层包含内部类异戊二烯稳定的磷脂脂质体层40和外部海藻糖层50。首先制备用于在包埋后形成类异戊二烯稳定的磷脂脂质体的前体脂质体。前脂质体是一种水溶性干燥磷脂颗粒，易于分布、转移和储存，有利于未来的规模化生产。加入水性溶剂并摇动后，可以由前体脂质体形成脂质体。前体脂质体的制备包括以最佳比例混合磷脂(磷脂酰胆碱(PC))、类异戊二烯(胆固醇或β-胡萝卜素)和水溶性载体(麦芽糖糊精和乙醇)四种成分。简而言之，将PC、类异戊二烯和麦芽糖糊精在乙醇中混合，然后将它们放入圆底烧瓶中，使用旋转蒸发系统除去乙醇，得到干燥的颗粒材料。该粉末形成前脂质体，然后在使用前重新溶解在水中形成脂质体。类异戊二烯稳定的磷脂脂质体(可溶于乙醇且可再溶解于水)的最佳配比为：4g PC、0.8g类异戊二烯和20g麦芽糖糊精溶于160g水中。流化床参数流量为30m3/h，产品温度为43.5℃，喷雾速率为2.0g/min，喷雾压力为0.4bar。9％的重量增加就是为此目的而设计的。
外海藻糖层以10％喷涂，另外添加1％滑石粉以降低流化床包衣期间的粉末粘性。流化床参数为流量30立方米/小时，产品温度40.5℃，喷雾速率2.0克/分钟，喷雾压力0.4巴。为此目的设计了3.6％的重量增加。
表4:耐高温益生菌中耐热双层的配方
在对流烘箱中在90℃下加热15分钟后，包埋的益生菌仅从8.96Log CFU/g活性损失0.16Log CFU/g，相比之下对照中的0.83Log CFU/g(从7.83Log CFU/g)分钟(表5)。
表5:耐高温益生菌加热试验前后活性及对数减少量
*对照粉末：益生菌包衣的菊粉
实例3
不同浓度的β-胡萝卜素稳定的磷脂酰胆碱脂质体作为耐高温益生菌的耐热层的耐热性能
益生菌和益生元核心开发
菊粉用作芯材。核心层包含益生菌和益生元的混合物以及作为粘合剂的乳清蛋白，以附聚并包覆菊粉以形成自由流动的颗粒。将高达1011CFU/g的预培养益生菌清洗并与5％w/w益生元和5％w/w乳清蛋白混合，然后喷涂菊粉。流化床参数包括：流量20m3/h、产品温度41.3℃、喷雾速率2.0g/min和喷雾压力0.4bar。5％的重量增加就是为此目的而设计的。
耐酸层30的研制
预热、喷涂温度和溶质浓度影响其长丝(filament)形成。将20％w/w的L100在50℃下预热12小时，然后以25m3/h的流量、41℃的产品温度、3.2g/min的喷雾速率和0.4bar的喷雾压力进行喷雾。该处理条件有助于耐热脂质体层的粘附而不损害耐热能力，并且保持其pH响应性的新功能。8％的重量增加就是为此目的而设计的。
耐热脂质体层的开发
在使用前将由磷脂酰胆碱、β-胡萝卜素和麦芽糖糊精组成的前体脂质体粉末重新溶解在水中以形成脂质体。类异戊二烯稳定的磷脂脂质体(LP-BCA)的比例为0.5x或1x(160g水中的4g PC、0.8gβ-胡萝卜素和20g麦芽糖糊精)。流化床参数流量为30m3/h，产品温度为43.5℃，喷雾速率为2.0g/min，喷雾压力为0.4bar。9％的重量增加就是为此目的而设计的。
表6:耐高温益生菌中耐热双层的配方
与1x脂质体(0.97Log CFU/g活性损失)相比，用0.5x脂质体配制的耐热层(0.72Log CFU/g活性损失)在加热测试后益生菌的耐热能力更好。在对流烘箱中90℃加热15分钟后，对照的活性损失为0.95Log CFU/g(表7)。
表7:使用表6中的制剂制造的耐高温益生菌在加热测试之前和之后的活性和对数减少
*对照粉末：益生菌包衣的菊粉
实例4
不同浓度胆固醇稳定磷脂酰胆碱脂质体作为耐高温益生菌耐热层的耐热性能
益生菌和益生元核心20的开发
使用菊粉作为芯材，核心层包含益生菌和益生元的混合物以及作为粘合剂的乳清蛋白以附聚并包覆在菊粉上以形成自由流动的颗粒。将高达1011CFU/g的预培养益生菌清洗并与5％w/w益生元和5％w/w乳清蛋白混合，然后喷涂于菊粉之上。流化床参数包括：流量20m3/h，产品温度41.3℃，喷雾速率2.0g/min，喷雾压力0.4bar。5％的重量增加就是为此目的而设计的。
耐酸层30的开发
预热、喷涂温度和溶质浓度影响其长丝(filament)形成。将20％w/w的L100在50℃下预热12小时，然后以25m3/h的流量、41℃的产品温度、3.2g/min的喷雾速率和0.4bar的喷雾压力进行喷雾。该处理条件有助于耐热脂质体层的粘附，且不降低耐热能力；同时保持其pH响应性的新颖功能。8％的重量增加就是为此目的而设计的。
耐热脂质体层的开发
在使用前将由磷脂酰胆碱、β-胡萝卜素和麦芽糖糊精组成的前体脂质体粉末重新溶解在水中以形成脂质体。类异戊二烯稳定的磷脂脂质体(LP-CHL)的比例为1x或2x(4gPC、0.8g胆固醇和20g麦芽糖糊精溶于160g水中)。流化床参数为流量30立方米/小时、产品温度43.5℃、喷雾速率2.0克/分钟、喷雾压力0.4bar。9％的重量增加就是为此目的而设计的。
表8:耐高温益生菌中耐热双层的配方
与2x脂质体(0.48Log CFU/g益生菌活性损失)相比，用1x脂质体(0.21Log CFU/g益生菌活性损失)配制的耐热层在加热测试后的制剂的耐热能力更好。在对流烘箱中于90℃加热15分钟后，对照的活性损失为0.59Log CFU/g(表9)。
表9:使用表8中的制剂制造的耐高温益生菌在加热测试之前和之后的活性和对数减少
/>
*对照粉末：益生菌包衣的菊粉
用磷脂和类异戊二烯的乙醇混合物(200g 3％ PC+1.5％胆固醇+1.5％ ATO5+4％滑石粉；代替脂质体)包被的制剂的耐热能力不令人满意。该配方还涉及未预热的耐酸涂层(L100)。结果显示，加热测试后，胶囊化益生菌的活性损失比未配制对照更高(胶囊化益生菌为2.7Log CFU/g，未配制对照为1.7Log CFU/g)。
表10:用磷脂和类异戊二烯的乙醇混合物包被的胶囊化益生菌的活性和对数减少
*对照粉末：益生菌包衣的菊粉
实例5
胆固醇稳定的磷脂酰胆碱和不同浓度的海藻糖作为耐高温益生菌的耐热双层的耐热性能
益生菌和益生元核心20的开发
选择菊粉作为芯材。核心层包含益生菌和益生元的混合物，以及作为粘合剂的乳清蛋白，以凝聚并包覆菊粉芯材以形成自由流动的颗粒。将高达1011CFU/g的预培养益生菌清洗并与5％w/w益生元和5％w/w乳清蛋白混合，然后喷涂菊粉。流化床参数包括：流量20m3/h，产品温度41.3℃，喷雾速率2.0g/min，喷雾压力0.4bar。5％的重量增加就是为此目的而设计的。
耐酸层30的开发
预热、喷涂温度和溶质浓度影响其长丝(filament)形成。将20％w/w的L100在50℃下预热12小时，然后以25m3/h的流量、41℃的产品温度、3.2g/min的喷雾速率和0.4bar的喷雾压力进行喷雾。该处理条件有助于耐热脂质体层的粘附，且不降低耐热能力；同时保持其pH响应性的新颖功能。8％的重量增加就是为此目的而设计的。
耐热双层的开发
在使用前将由磷脂酰胆碱、β-胡萝卜素和麦芽糖糊精组成的前体脂质体粉末重新溶解在水中以形成脂质体。类异戊二烯稳定的磷脂脂质体(LP-CHL)的比例为1x或2x(4gPC、0.8g胆固醇和20g麦芽糖糊精溶于160g水中)。流化床参数流量为30m3/h，产品温度为43.5℃，喷雾速率为2.0g/min，喷雾压力为0.4bar。9％的重量增加就是为此目的而设计的。
外海藻糖层以5％和10％喷涂，另外添加1％滑石粉以降低流化床包衣期间的粉末粘性。流化床参数流量为30m3/h，产品温度为40.5℃，喷雾速率为2.0g/min，喷雾压力为0.4bar。为此目的设计了3.6％的重量增加。
表11:耐高温益生菌中耐热双层的配方
较低浓度的海藻糖(5％w/w＝5g)显示出比10％w/w(0.27 Log CFU/g活性损失)更大的耐热能力(0.16 Log CFU/g活性损失)。对照的活性损失(0.83 Log CFU/g)分别比相应海藻糖试验高5倍和3倍。
表12:使用表11中的制剂制造的耐高温益生菌在加热测试之前和之后的活性和对数减少
*对照粉末：益生菌包衣的菊粉
实例6
耐高温益生菌的包埋率
包埋效率是包埋过程之后益生菌的存活率，这对于通过所开发的核-壳系统递送活益生菌至关重要。通过平板计数法评估益生菌活性，并通过比较包埋的活益生菌与初始添加的益生菌数量计算包埋率。
表13:包埋过程后耐高温益生菌的活性和对数减少
包埋效率＝log10(释放的活截留细胞的数量)/log10(添加的游离细胞的数量)x100％。
保加利亚乳杆菌游离细胞总数 9.98 Log CFU/g
最终产品中保加利亚乳杆菌活包埋细胞的释放总数 9.57 Log CFU/g
包埋效率 97.72％
实例7
耐高温益生菌的粒度分布(基于体积)
使用动态图像分析Camsizer X2(湿模块)在100％乙醇中测量耐高温益生菌的粒度。粉末的当量球径d50为161.77微米。
表14:耐高温益生菌的基于体积的粒径分布及其特征直径
平均直径(微米)
d10 41.26
d50 161.77
d90 235.10
实例8
模拟胃肠道挑战和耐高温益生菌的释放
通过进行模拟胃酸抗性测试测定来进行热处理的耐高温益生菌的模拟胃酸抗性。将经过热处理的耐高温益生菌在模拟胃液(胃蛋白酶，pH 3)中于37℃下孵育2小时，并以120rpm的速度连续摇动。孵育后，通过使用平板法在模拟胃条件下孵育前后量化活益生菌的数量来评估益生菌的活性。
在胃酸测试测定之后，进行经热处理的耐高温益生菌从模拟小肠释放测试的释放，其中将它们在含有pH 6.8的胆汁的模拟小肠环境中在37℃下再孵育2小时。以120rpm的速度连续摇动。孵育后，通过使用平板法在模拟胃和肠道条件下孵育前后定量活益生菌的量来评估益生菌的活性。
耐高温益生菌的耐酸层能够保护包埋的益生菌，其中在pH 3、37℃下模拟胃酸挑战2小时后释放的益生菌为0.70Log CFU/g，相比之下对照组为1.60Log CFU/g。
此外，酸挑战的耐高温益生菌(8.79±0.01Log CFU/g)在模拟小肠条件下从包埋材料中有效地释放，其中它实现了92％的益生菌(8.09±0.12Log CFU/g–多于6Log CFU/g)的释放。另一方面，在模拟胃酸激发和小肠释放试验后，对照未达到最低有效剂量(5.05±0.75Log CFU/g)(图2)。
实例9
根据本发明的高温益生菌在全面包烘烤条件下的耐热性评估
面包和面包卷是疫情流行期间盛行的烘焙食品之一。它们因其新鲜美味、方便快捷而成为世界各地许多消费者不可替代的主食早餐。因此，将益生菌加入面包/烘焙产品中是否能给消费者带来好处，值得研究。评估了包埋益生菌在工业中使用的面包烘焙过程中的稳定性。
表15:耐高温益生菌中耐热双层的制剂
首先，将9g干酵母与4g糖和80mL温水(≤40℃)混合以激活酵母。将混合物静置约15分钟直至起泡。然后，将500克强力面粉、70克糖、3克盐、60克鸡蛋、200毫升水和起泡酵母混合物全部加入一个大碗中，搅拌直至面团表面粗糙。然后休息30分钟。然后将30克未融化的黄油加入到面团中。然后将面团放入搅拌机(博世)中揉捏直至面团表面变得光滑且不粘。然后将面团转移到干净的大碗中，盖上保鲜膜，放在温暖的地方。将面团静置约1小时或直至发酵至两倍大。之后，将包含2g(约9.24Log cfu/g)益生菌粉末(表15中的配方)-2g椰子油混合物的馅料添加到成型为包子的60g面团的中心。成型后的面团放入烤箱，30-40℃烘烤1小时或至两倍大。然后将包子放入预热好的烤箱，180℃，中层烤15分钟。监测包子内部温度，8分钟内包子核心达到90℃，余下7分钟继续升温至98℃。烘烤后立即将面包从烤箱中取出，放在金属架上冷却。在烘烤之前和之后测定了面包中益生菌的活数量。将包埋的益生菌释放到配制的释放溶液中，pH 7.4，37℃，120rpm，持续2小时。将混合物连续稀释并接种在MRS琼脂上，并在37℃下孵育24-48小时。将琼脂平板表面上形成的益生菌菌落计算为活益生菌。使用未包埋的益生菌作为对照。
烘烤后，用对照制作的小圆面包中的所有益生菌均被灭活。对于含有耐高温益生菌的样品，益生菌活性略有下降，其中含有8.39Log CFU的活益生菌。这一发现表明，本发明的包衣层为益生菌提供了当用作面包中的馅料时在烘烤过程中发挥的耐热性。
表16:将小圆面包(60g)在180℃烘烤15分钟之前和之后小圆面包中益生菌的活菌数
烘烤前(Log CFU) 烘烤后(Log CFU)
对照组 8.74 0
耐高温益生菌 9.24 8.39
*对照粉末：益生菌包衣的菊粉
实例10
用于巴氏灭菌的牛奶中根据本发明的高温益生菌的耐热性评估
巴氏灭菌是食品工业中使用的温和热处理，以消除病原体并延长食品和饮料例如牛奶和果汁的保质期。为了使用饮料作为益生菌载体，将益生菌加入饮料中并对其进行巴氏灭菌对于食品安全是必要的。为了实现这一目的，将防水层喷雾分散在耐高温益生菌的耐热外层上，以防止添加到饮料中时水渗透。
表17:耐高温益生菌中耐热双层的制剂
评价了工业中在牛奶中巴氏灭菌过程中包埋的益生菌的稳定性。将约1.37x 109的耐高温益生菌(表17中的配方)以5％w/w添加到牛奶中，并在65℃水浴中巴氏灭菌30分钟，然后在冰浴中快速冷却。首先将牛奶的pH值调节至7.4-7.6，然后在37℃、120rpm下摇动60分钟以释放包埋的益生菌，从而评估热处理前后益生菌的活菌数。将混合物连续稀释并接种在MRS琼脂上，并在37℃下孵育24-48小时。琼脂平板表面上形成的益生菌菌落定量为cfu/100ml样品。使用未包埋的益生菌作为对照。
由于耐热性，保加利亚乳杆菌能够在巴氏灭菌过程中存活下来。包埋对特定比例的热处理益生菌起到了保护作用。这一发现表明，涂层保护了2.57x 105CFU的益生菌，使其能够在热灭活过程中存活。
表18:牛奶在65℃巴氏灭菌30分钟之前和之后的益生菌活菌计数
*对照粉末：益生菌包衣的菊粉
实例11
用于巴氏灭菌的橙汁中根据本发明的高温益生菌的耐热性评估。
天然和新鲜的橙汁在世界范围内的需求正在增加。这种高营养果汁饮料是益生菌的理想载体，除了维生素之外，它还带来先进的健康益处。为了延长其保质期，采用巴氏灭菌法消除果汁中的分解微生物并钝化可引起化学变化的酶。因此，在巴氏灭菌之前将耐高温益生菌注入果汁中是必要的，以确保热处理后活益生菌的可持续性。在包埋的益生菌上涂覆了一层额外的防水层，以保持包埋层完整，并在将其添加到饮料中时防止水渗透。
表19：具有附加防水层的耐高温益生菌的制剂
评价了在工业中在果汁中巴氏灭菌期间包埋的益生菌的稳定性。将约100ml含有2％(w/v；8.91±0.07Log CFU)包埋益生菌(表19中的配方)的橙汁在65℃下进行巴氏灭菌30分钟，然后在冰浴中快速冷却。首先将橙汁的pH值调节至7.4，然后在37℃、120rpm下摇动120分钟以释放包埋的益生菌，从而评估热处理前后益生菌的活菌数。将混合物连续稀释并接种在MRS琼脂上，并在37℃下孵育24-48小时。琼脂平板表面上形成的益生菌菌落定量为cfu/100ml样品。使用未包埋的益生菌作为对照。
进行巴氏灭菌后，2.37Log CFU的细胞从8.91±0.07Log CFU灭活，剩余6.54±0.24Log CFU的耐高温益生菌存活；而对照经历了从8.29±0.05Log CFU减少3.72Log CFU，热处理后仅含有4.57±0.91Log CFU益生菌(表20)。将耐高温益生菌注入橙汁并进行巴氏灭菌可确保向胃肠道输送至少1x 106CFU的益生菌，并在食用后带来健康益处。
表20:橙汁在65℃温度下进行巴氏灭菌30分钟之前和之后的益生菌活菌计数
*对照粉末：益生菌包衣的菊粉
本发明的前述描述是为了说明和描述的目的而提供的。其并非旨在是穷举的或将本发明限制于所公开的精确形式。许多修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。
选择和描述实施例是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够理解本发明的各种实施例以及适合于所设想的特定用途的各种修改。
上文简单地描述本公开的若干实施例和细节的特征。本公开中所描述的实施例可易于用作设计或修改用于实现本公开的实施例中所引入的相同或类似目标和/或获得相同或类似优点的其它过程和结构的基础。此类等效构造不脱离本公开的精神和范围并且可在不脱离本公开的精神和范围的情况下作出各种变化、替代和修改。
参考文献
以下参考文献通过引用整体并入本文：
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Claims (19)

1.一种耐热耐酸益生菌颗粒，其特征在于尺寸为20微米至250微米，并包括：
合生制剂核心，包含：
包含至少一种多糖的芯材层；和
包覆在芯材层上的益生菌层；
位于合生制剂核心之上的耐酸壳层，包含一种或多种pH响应性聚合物；和
位于耐酸壳层之上的耐热双层壳，包含：
包含耐热类异戊二烯稳定的磷脂脂质体的内壳层；和
包含耐热二糖或多糖的外层。
2.根据权利要求1所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其中所述芯材层的至少一种多糖选自蔗糖、菊粉、淀粉和/或纤维素。
3.根据权利要求1所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其特征在于，所述益生菌层中的益生菌选自双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、链球菌属、肠球菌属、葡萄球菌属、酵母属和克鲁维酵母属中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其中所述益生菌层进一步包括：
选自低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉和/或果胶的一种或多种多糖；
选自乳清蛋白、大豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、大米蛋白、豌豆蛋白、鸡蛋蛋白、酪蛋白、乳蛋白、玉米醇溶蛋白和/或牛血清白蛋白的一种或多种结合蛋白；和/或一种或多种选自维生素C、维生素B1和/或维生素E的热敏性维生素。
5.根据权利要求1所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其中所述耐酸壳是选自甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物、虫胶、藻酸盐和/或果胶中的一种或多种的pH响应性聚合物。
6.根据权利要求1所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其中所述耐热双层壳的内壳层的类异戊二烯稳定的磷脂由前体脂质体形成，所述前体脂质体包含：
选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺和/或二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇中的一种或多种磷脂；
选自β-胡萝卜素、胆固醇和/或番茄红素的一种或多种类异戊二烯；和
选自麦芽糖糊精、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇和/或木糖醇的一种或多种水溶性载体。
7.根据权利要求1所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其中所述双层壳的外壳层的耐热二糖或多糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖或壳二糖中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其中所述双层壳的外壳层还包含选自滑石粉、高岭土、氧化锌、氧化钛、氧化硅或其任何组合的矿物质。
9.根据权利要求1所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其特征在于，所述微球的重量百分比包括50-79.2％芯材、0.01-0.1％活益生菌、1.6-3％蛋白质、2-6.3％聚合物、4-7.9％脂质体，多糖等于或小于1.6％，二糖等于或小于3.2％，矿物质等于或小于0.3％。
10.根据权利要求1所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其还包含与所述外层偶联的附加防水涂层，所述外层包含虫胶和甲基丙烯酸二甲氨基乙酯-共聚物。
11.根据权利要求1所述的耐热耐酸益生菌颗粒，其中所述颗粒耐受高达90℃的温度长达15分钟的时间而不释放益生菌核心。
12.一种耐高温和胃肠消化挑战的益生菌颗粒的制备方法，所述方法包括：
通过筛分制备尺寸为10-125微米、密度为0.65-0.75g/cm3的芯材；
通过搅拌混合制备具有益生元的均质活益生菌溶液；
通过加热搅拌制备耐酸pH响应性聚合物；
通过搅拌混合前体脂质体制备类异戊二烯稳定的磷脂脂质体；
通过搅拌混合制备包含二糖的耐热外层；
将芯材包衣有益生元和益生菌层，然后通过流化床包衣制备耐酸层和耐热双层，制备耐高温益生菌颗粒。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述益生菌颗粒还包含芯材、芯材表面上具有粘合剂涂层的益生菌、耐酸保护层和多个耐热保护层。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述益生菌颗粒具有大于95％的颗粒包埋效率。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述益生菌颗粒具有108-1010CFU/g的活菌计数。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述益生菌颗粒的尺寸为20-250微米。
17.根据权利要求12所述的方法，还包括将所述益生菌颗粒注入食品、食品添加剂和液体饮料中。
18.根据权利要求17所述的方法，其中对所述液体饮料进行包括巴氏灭菌的热处理。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述食品还包括经过包括完全烘烤生产过程的热处理的干食品。
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