CN103180333A - 聚丙基醚亚胺的糖树状聚体 - Google Patents

Abstract

糖树状聚体，包含：a)支持平均9－64个末端羧酸基团的无毒性树状聚体聚丙基醚亚胺芯；和b)与所述芯共轭的2－8个氨基糖或硫酸氨基糖，其选自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、它们的任意一种的硫酸盐及其组合，其中每个糖直接通过0长度的酰胺键与末端羧酸基团的残基连接。本发明还扩展至包含所述糖树状聚体的定义的群体、包含所述分子或群体的药物组合物、所述分子和制剂的制备方法和所述分子、群体和组合物的治疗应用。

Description

聚丙基醚亚胺的糖树状聚体

本申请要求2010年8月24日提交的美国临时申请US61/344,571和2011年6月2日提交的英国申请号GB1109292.1的优先权，将这两篇文献的内容引入本文参考。

本说明书涉及包含聚丙基醚亚胺芯的糖树状聚体（glycodendrimer）、包含它们的药物制剂及其在治疗、特别是治疗促炎细胞因子例如白细胞介素-6和白细胞介素-8介导的病症中的应用。本说明书还涉及糖树状聚体的生产方法和聚丙基醚亚胺芯在制备所述糖树状聚体中的应用。

背景

在2009年，Park等人定义了通过TLR4-MD2识别LPS的结构基础(Park BS,Song DH,Kim HM,Choi BS,Lee H,Lee JO.Thestructural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2complex.Nature2009；458:1191–1195；Viriyakosol S,Tobias PS,Kitchens RL,Kirkland TN.MD2binds to bacteriallipopolysaccharide.J.Biological Chemistry2001；276(41):38,044-38,051)。

简言之，MD2具有配有带电荷的亲水性入口的疏水性袋。脂质A(由两个彼此通过酯键连接的磷酸化葡糖胺分子组成)结合这种袋的入口。其脂质链然后进入MD2的疏水性袋。TLR4-MD2-LPS复合物进行构象改变且TLR4二聚化。随后发生胞内信号传导。

近来强化了LPS的糖部分和LPS与MD2之间的静电相互作用的重要性(Meng J等人,MD2residues TYR42,ARG69,ASP122andLEU125provide species specificity for Lipid IVA.J Biol Chem.DOI:M110.134668；Meng J,Lien E,Golenbock DT.MD2mediatedionic interactions between Lipid A和TLR4are essential for receptoractivation.J Biol Chem.2009；285:8695-8702)。

认为最相关的残基是Tyr102，然后是Lys91、Arg96、Arg106、Asn114和Ser118。已经将这些残基和/或其极为亲近性的残基鉴定为在MD2识别LPS中具有重要作用(Park BS,Song DH,Kim HM,ChoiBS,Lee H,Lee JO.The structural basis of lipopolysacchariderecognition by the TLR4-MD2complex.Nature2009；458:1191–1195；Meng J等人,MD2residues TYR42,ARG69,ASP122和LEU125provide species specificity for Lipid IVA.J Biol Chem.DOI:M110.134668；Meng J,Lien E,Golenbock DT.MD2mediated ionicinteractions between Lipid A&TLR4are essential for receptoractivation.J Biol Chem.2009；285:8695-2)。

细菌感染和手术组织损伤引起基于TLR4免疫-调节的相同细胞表面受体-配体相互作用。这并不涉及单一受体-配体相互作用。而这些促炎细胞因子应答由细菌来源的脂多糖(LPS)和/或手术衍生的透明质酸片段与细胞表面TLR4受体之间的多价受体-配体相互作用介导(Atala A,Irvine DJ,Moses M,Shaunak S.Wound healing versusregeneration:Role of the tissue environment in regenerative medicine.MRS Bulletin August2010;35:597–606)。这些配体对这种受体的结合亲和力在受体-配体相互作用数量增加时呈指数地增加。因此，期望通过制成可以调节组织损伤途径的新生物材料使多价的概念适合于新的生物材料设计。

当多价需要多个和协作性受体-配体相互作用时，药物介入也需要基于也能够进行多个和协作性相互作用的分子的新的药物。这一目的已经使用基于蛋白质的药物实现，所述基于蛋白质的药物以高度亲和力与多个细胞表面受体发生相互作用。多年来，目的在于实现与合成大分子的类似的协同性相互作用。然而，已经发现，在生物系统中，应用线型聚合物的成功率远低于预期。使用线型聚合物的尝试受到如下情况的阻碍：-(1)所用大分子的结构不均匀性；(2)不能控制其大小和分子量特征；和(3)活化补体和凝固触发的途径的毒性副作用。

此外，就展示出糖的线型聚合物而言，它们具有自我缔合和形成胶束的趋势，原因在于许多聚合物-糖组合的两亲特征。就多糖而言，其结构不均匀性和涉及其制备的化学复杂性阻碍了具有适合的生物特性的所定义的寡糖-类分子的制备规模可伸缩性和可再现的合成。一般而言，需要许多合成步骤且化学中间体和产物的极性使得它们难以纯化。这些化合物也难以操控，因为它们倾向于变成吸湿性糖浆状物，在化学上不稳定，倾向于快速微生物降解和难以加工成药物。这些基础问题已经阻碍了基于糖的大分子在药物应用中的规模化制备。

WO03/089010公开了基于PAMAM芯的一些糖树状聚体。已经广泛研究了与葡糖胺或硫酸葡糖胺共轭以形成3.5代树状聚体（dendrimer）的第3代PAMAM树状聚体。

已经显示这些分子具有极为有意义的生物活性和低毒性，且特别是具有显著的抗-细胞因子和抗-趋化因子特性。

然而，迄今为止，尚未将这些化合物作为药物产品提出且始终没有对人体给药，因为尚无鉴定为可商业化和有活力地将它们制成适合于对人体给药的“纯度”水平的方式。众多所谓的“不纯物”是与期望的种类极为密切相关的种类，因此，分离不同的本体极为困难且使用目前可得到的基于色谱和/或过滤的技术是不可能的。

尽管不希望受到理论约束，但是目前本发明的发明人认为基于PAMAM糖树状聚体的化学自身与提供适合于药物应用的分子不相容。

然而，PAMAM糖树状聚体因其生物活性而是特殊的分子。尽管存在可以制备树状聚体的许多芯，但是似乎由几种可选的芯制成的糖树状聚体不具有必需的生物学特性。

本发明的发明人认为，令人意外地，本文所述的糖树状聚体可以提供适合的生物特性，从而使得它们适合于药物介入，另外，基于本发明分子的化学适合于提供一种分子，其最终可以用作药物产品。

发明概述

因此，提供了糖树状聚体，其包含：

a)以平均9－64个末端羧酸基团支持的无毒性树状聚体聚丙基醚亚胺芯；和

b)与所述芯共轭的2－8个氨基糖或硫酸氨基糖，其选自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、它们的任意一种的硫酸盐及其组合，

其中每个糖直接通过0长度的酰胺键与末端羧酸基团的残基连接。

发明详述

树状聚体是一类聚合物化合物，其不同于常规的线型聚合物的方面在于其高度分支的、环状和对称结构体系。

第一种树状聚体通过分支合成方法由

在1978年、AlliedCorporation的Denkewalter在1981年、Dow Chemical的DonaldTomalia在1983年和在1985年及Newkome在1985年制成。在1990年，Jean Fréchet引入了汇聚合成方法。树状聚体的普及性随后显著增加，截止到2005年产生了超过5,000篇的科学论文和专利(HouraniR等人.Advances in elegance of chemistry in designing dendrimers.Macromol.Rapid Commun.2010;31:947-74)。

分支合成是主要的，其中分子从中心向外以层叠加。所谓的代实际上是指生产树状聚体的合成中的叠层步骤数量。因此，在分支方法中，树状聚体从芯向外生长，典型地存在具有每种新“代”的反应官能团的数量倍增。然而，对术语“代”需要谨慎地加以采用，因为不同的原料需要不同的合成技术，这可能意味着在一些方式中，由一种原料制成的某些“代”的树状聚体可能不一定直接与由不同原料制备的树状聚体比拟，不过，名义上它们以相同的代数给出。术语“代”并不等同于树状聚体的绝对物理尺寸。

相反，汇聚合成在于其中分子以碎片构成并且在合成的最后步骤或后期阶段时组装。因此，汇聚生长方法包括将具有碳水化合物的树状楔形物合成为结构成分之一，然后使这些楔形物连接提供分支的其他成分，然后最终使这些树型单元(dendrons)连接芯成分，得到期望的树状聚体。采用这种汇聚合成方案典型地得到较大量的在树状聚体表面上展示的糖，特别是可以导致在组装最终的树状聚体时在树状聚体上完全糖封端。并不将以汇聚方式制备的树状聚体归为一代。

有利地，树状聚体具有可以比对线型聚合物可能的更精确得多定义的分子结构(Tomalia DA,Naylor AM,Goddard III WA.(1990)Starburst dendrimers:molecular level control of size,shape,surfacechemistry,topology and flexibility from atoms to macroscopic matter.Angewandte Chemie-International Edition,29,138-175.;Hourani R&Kakkar A.Advances in elegance of chemistry in designingdendrimers.Macromol.Rapid Commun.2010;31:947-74)。

如上所述，不同的原料可以用于生成芯。基于聚酰氨基胺(PAMAM)的树状聚体已经得到广泛研究。通过分支合成制备PAMAM树状聚体。有关分支合成的阴离子型羧酸封端的PAMAM树状聚体的详细综述可以在WO03/089010和Shaunak S,Thomas S,Gianasi E,Godwin A,Jones E,Teo I,Mireskandari K,Luthert P,Duncan R,Patterson S,Khaw P&Brocchini S.的Polyvalent dendrimerglucosamine conjugates prevent scar tissue formation.NatureBiotechnology2004；22:977–985中找到。

迄今为止，PAMAM树状聚体是商业化和分支合成的树状聚体的最佳研究结果。通过在芯上递增添加称作代的分支层形成它们。典型地，可以得到为胺封端的完整代和羧酸封端的半代的它们。树状聚体的代由此代表相关术语的其大小(测定为以埃计的其直径)及其分子量(Vogte F,Richardt G,Werner N.Dendrimer chemistry-concepts,synthesis,properties and applications.2009.Publisher Wiley.第1章,1–22页)。

分支树状聚体还可以由聚丙基亚胺(PPI)、聚赖氨酸、三嗪和聚丙基醚亚胺合成。在2010年有关目前领域中分支合成的树状聚体及其应用的详细综述可以在:-Menjoge AR,Kannan RM,Tomalia DA,Dendrimer based drug and imaging conjugates:design considerationsfor nanomedical applications.Drug Discovery Today2010;15(5-6):171–185)中找到。

有一些证据表明，与用胺基封端的那些相反，以游离羧酸封端的树状聚体已经改善了毒理学特性((Malik N,Wiwattanapatapee R,Klopsch R,Lorenz K,Frey H,Weener J W,Meijer E W,Paulus W&Duncan R.(2000)Dendrimers:Relationship between structure andbiocompatibility in vitro,and preliminary studies on thebiodistribution of125I-labelled polyamidoamine dendrimers in vivo.JControlled Release65,133-148))。

然而，当合成PPI树状聚体时，天然得到的端基是胺。这就促使本领域的一些技术人员尝试和将胺封端的树状聚体转化成相应的羧酸封端的树状聚体，参见Ashton PR,Boyd SE,Brown CL,NepogodievSA,Meijer EW,Peerlings HWI,Stoddart JF.Synthesis ofglycodendrimers by modification of poly(propylene imine)dendrimers.Chem.Eur.J.1997;3(6):974-984。这就产生了复杂的反应混合物。由此抛弃了使用羧酸封端的PPI树状聚体进行的另外的研究。然而，作者使用D-半乳糖和乳糖的间隔臂衍生物将胺封端的树状聚体转化成100%表面糖基化的树状聚体。

树状聚体已经应用于许多领域。在制药领域中，将它们作为药物载体研究并且在诊断应用中研究。因其自身的权利而极为罕见将树状聚体视为治疗本体，部分原因在于其大小和复杂性。

在树状聚体作为药物载体或作为诊断工具的应用中，该领域显然被生产越来越大的树状聚体所困扰。存在许多有关该物质的合成化学论文。然而，应注意，文献中已经反复证实高化合价(在这些大分子中)并不相当于高生物亲和力。实际上，基础骨架的精确性与糖配体/分子的拷贝数对具有生物活性的分子而言同样重要(Turnbull WB&Stoddard JF.Design and synthesis of glycodendrimers.Reviews inMolecular Biotechnology.2002;90:231-255)。即芯并非简单地是氨基糖分子的惰性支持物。

此外，作者持续地得出结论，尽管商购树状聚体可以以这样的方式被修饰，以改变其配体的表面密度，但是树状聚体骨架的重新设计是向前探索糖树状聚体的最佳方式，这种糖树状聚体具有有用的生物活性与谨慎定义的大小、形状、灵活性和表面配体密度。

WO03/089010公开了具有具备免疫-调节特性的部分糖基化表面的第3.5代PAMAM树状聚体。约15%或以下的表面末端羧酸通过0长度酰胺键与葡糖胺连接。

在2004年，Shaunak证实了第G3.5代羧酸封端的PAMAM树状聚体(MWt12,931，具有约64个周边羧酸基团)和通过0长度酰胺键具有12.5%表面载量的葡糖胺)阻断了促炎细胞因子应答(Shaunak S,Thomas S,Gianasi E,Godwin A,Jones E,Teo I,Mireskandari K,Luthert P,Duncan R,Patterson S,Khaw P&Brocchini S.Polyvalentdendrimer glucosamine conjugates prevent scar tissue formation.Nature Biotechnology2004;22:977–985;Vogte F,Richardt G,Werner N.Dendrimer chemistry-concepts,synthesis,properties andapplications.2009Publisher Wiley.第8章:Special properties andpotential applications.289–324页且还参见图2)。这种树状聚体葡糖胺通过高度纯化的LPS抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6从初级人单核细胞、巨噬细胞和树突细胞中释放。重要地，这种抑制作用在LPS后6h加入树状聚体葡糖胺时仍然可以观察到。该作用是剂量依赖性的并且可逆转，其中IC₅₀为70nM(图3&4&5)。

尽管这种PAMAM糖树状聚体具有一些有意义的体外或体内生物活性，特别是它可以减少促炎细胞因子和促炎趋化因子，且还证实有助于预防动物模型中的过度瘢痕形成，但是这种分子尚未发展成治疗剂(图1)，因为不能使得分子以适合的形式用作药物。

本发明的发明人目前对树状聚体葡糖胺的作用机制例如在抗-细胞因子和抗-趋化因子中的机制有了更好的理解。

脂多糖(LPS–变量MWt>10kDa)是诱导这种先天性免疫应答的革兰氏阴性菌外膜糖脂。它由如下成分组成-

(a)亲水性多糖芯；

(b)溶剂接触的疏水性脂质A成分；和

(c)O-抗原。

仅需要脂质A来诱导促炎细胞因子应答。它由通过酰胺或酯键连接3-羟基脂肪酸的二磷酸化β-1,6-连接的D-葡糖胺二糖组成，所述的3-羟基脂肪酸进一步被非羟基化的12–14个碳脂肪酸链取代。LPS、TLR4与MD2蛋白之间的细胞表面相互作用对于启动促炎细胞因子介导的应答是重要的。转运蛋白CD14首先汇集，然后将可溶性LPS递送至可溶性、循环和单体MD2。

脂质A(MWt～2kDa)的两种磷酸化葡糖胺残基通过静电相互作用与人MD2的疏水袋的带电荷入口(Ser118{4’磷酸}和Lys122{1’磷酸}及Arg90和Lys91)结合。二葡糖胺和磷酸基团保留在溶液中和疏水袋的外部；这些残基用于将LPS锚定MD2的疏水袋的入口。

然后LPS的脂质链在MD2的疏水袋中被埋藏。随后形成的人TLR4‐MD-2‐LPS复合物需要：-(a)人MD2上Met85、Leu87、Ile124和Phe126分别与人TLR4上Phe436、Phe436、Phe440和Phe444的疏水相互作用；(b)人MD-2上Arg90和Gly123分别与TLR4上Glu439和Ser416的氢键相互作用。

所形成的复合物进行构象改变，导致受体复合物二聚化，引起胞内信号传导事件并且启动促炎细胞因子产生。低水平刺激促炎细胞因子产生对处理感染而言是生理学有益的，因为能够使共刺激分子活化和产生适应性免疫应答。然而，过度促炎细胞因子产生可能变成病理性的，使宿主具有严重的不良反应，包括脓毒性休克和死亡。

我们对生物活性的糖树状聚体与无生物活性的糖树状聚体之间的差异的分析导致我们认为其与MD2腔的入口处的特定氨基酸残基的相互作用对它们的生物活性而言是重要的。

MD2上的袋的亲水性入口(脂质A所结合的)被本说明书的糖树状聚体且特别是树状聚体葡糖胺封闭。这防止了TLR4二聚化和信号传导事件(Barata TS,Teo I,Brocchini S,Zloh M,Shaunak S.Partiallyglycosylated dendrimers block MD2and prevent TLR4-MD2-LPScomplex mediated cytokine responses.PLoS Comput Biol2011;7(6):e1002095.doi:10.1371/journal.pcbi.1002095)。

我们的研究已经证实生物活性的部分糖基化的树状聚体显示最大数量和最强的与MD2袋的入口内层上的几个残基的相互作用。这些残基中的几个对LPS结合MD2而言也是重要的。具有最高标准化相互作用值的残基是Lys91、Tyr102、Arg106、Asn114和Ser118。具有较低相互作用值的几个其他残基也显著地促成了部分糖基化树状聚体与人MD2的协同性结合；它们是Arg96、Ser98、Lys109、Thr112和Thr116。

因此，在一个实施方案中，本说明书的树状聚体与一种或多种(例如1、2、3、4或5种)选自Lys91、Tyr102、Arg106、Asn114和Ser118的残基发生相互作用。

认为本说明书的糖树状聚体与一种或多种这些重要的氨基酸发生相互作用。本文所用的相互作用是指非共价键合，例如氢键、离子键、范德华力和疏水性相互作用。

在一个实施方案中，本说明书的树状聚体与Lys91发生相互作用。

在一个实施方案中，本说明书的树状聚体与Tyr102发生相互作用。

在一个实施方案中，本说明书的树状聚体与Arg106发生相互作用。

在一个实施方案中，本说明书的树状聚体与Asn114发生相互作用。

在一个实施方案中，本说明书的树状聚体与Ser118发生相互作用。

在一个实施方案中，本说明书的树状聚体与如下的残基发生相互作用：

Lys91和Tyr102；Lys91和Arg106；Lys91和Asn114；Lys91和Ser118；Tyr102和Arg106；Tyr102和Asn114；Tyr102和Ser118；Arg106和Asn114；Arg106和Ser118或Asn114&Ser118。

在一个或多个实施方案中，本说明书的树状聚体还具有至少一种(例如2、3、4或5种)与选自Arg96、Ser98、Lys109、Thr112和Thr116的残基的相互作用。

此外，部分糖基化树状聚体对人MD2的亲和力根据包括葡糖胺分子和几个树状聚体的周边羧酸分支的这两种分子之间紧密接触(即

)的数量增加得以证实。这些静电相互作用封闭了人MD2疏水袋的入口并且被认为封闭了LPS的脂质链的入口。

因此，推定树状聚体表面的生物活性是因存在来自芯树状聚体的游离周边羧酸和氨基糖(或其硫酸盐)所致。

有利地，例如，本说明书的部分糖基化树状聚体是灵活性的和动态的，并且具有亲水性边缘，这意味着构象改变可以诱导形状互补性。因此，本说明书的糖树状聚体与生物靶标的相互作用可以诱导分子上的“构象改变”。认为这能够使树状聚体表面的糖例如葡糖胺封闭MD2袋的入口。

与一些树状聚体的游离羧酸分支的另外的协同性静电相互作用随后发生。认为这些相互作用共同地阻断LPS的脂质链进入人MD2袋，并且还防止TLR4-MD2-LPS细胞表面复合物形成。生物学重要的结果在于促炎细胞因子级联不启动。

因此，在一个实施方案中，本说明书的树状聚体具有与例如如上所述的靶标中的一种或多种所述氨基酸发生的相互作用。作为本文所用的“密切”预以指

或以下例如

或以下、特别是

的相互作用。

我们还首次证实了存在脂质链并非是MD2拮抗剂或部分拮抗剂绝对必需的。

我们的分子对接(molecular docking)研究显示这些部分糖基化的树状聚体结合人MD2并且干扰如下的静电结合：-

(i)LPS的二-葡糖胺上的4’磷酸与MD2上的Ser118；

(ii)MD2上的LPS与Lys91；和

(iii)随后TLR4与MD2-LPS复合物上Tyr102结合。

这三种残基排列在MD2疏水袋的亲水性入口上。几种其他人MD2表面残基[即Arg96、Ser98、Arg106、Lys109、Thr112、Asn114和Thr116]与几种部分糖基化树状聚体的周边羧酸分支之间另外的多价相互作用显然能够决定其自身的位置，使得它始终封闭MD2袋的入口。这阻断了LPS的脂质链进入人MD2袋并且可以解释分子的拮抗剂活性。

来自我们的模型化研究和我们的生物学研究的结果还共同表明，至少G3.5部分糖基化PAMAM树状聚体(和本发明的有可能更适合的树状聚体)与人MD2的相互作用是特异性的，且树枝状结构对这种分子的生物活性而言是重要的(Barata TS,Shaunak S,Teo I,Zloh M,Brocchini S.Structural studies of biologically active glycosylatedpolyamidoamine(PAMAM)dendrimers.J Mol Model.Epub ahead ofprint:doi10.1007/s00894-010-0907-1；Barata TS,Brocchini S,Teo I,Shaunak S,Zloh M.From sequence to3D structure of hyperbranchedmolecules:application to surface modified PAMAM dendrimers.JMol Model.Epub ahead of print:doi10.1007/s00894-011-0966-y；Barata TS,Teo I,Brocchini S,Zloh M,Shaunak S.Partiallyglycosylated dendrimers block MD-2and prevent TLR4-MD-2-LPScomplex mediated cytokine responses.PLoS Comput Biol2011;7(6):e1002095.doi:10.1371/journal.pcbi.1002095；Shaunak S,Thomas S,Gianasi E,Godwin A,Jones E,Teo I,Mireskandari K,Luthert P,Duncan R,Patterson S,Khaw P&Brocchini S.Polyvalent dendrimerglucosamine conjugates prevent scar tissue formation.NatureBiotechnology2004；22:977-985)。

因此，我们的结果表明，需要通过树状聚体的臂连接的至少两种糖例如葡糖胺分子结合几种暴露和带电荷的氨基酸，它们排列在MD2上的腔的入口上。因此，本说明书的糖树状聚体一般包含至少2个氨基糖或其硫酸盐(包括其组合)。

由于具有所述的这种情况，本说明书的分子一般作为分子群体提供。该群体可以包含大量离散的分子，其中一些可以包含少于2个的氨基糖或硫酸氨基糖。一般而言，具有少于2个的氨基糖或硫酸氨基糖的分子数量较低，例如少于3%，例如2%，1%或以下，特别是0.5%或0.1%w/w。

认为20埃范围内的静电相互作用负责树状聚体例如树状聚体葡糖胺与MD2之间的这种相互作用，而非氢键相互作用(这仅可能出现在4埃距离内)。

推定因这种高亲和力结合，2个糖部分例如2个葡糖胺残基的最佳间隔可能为

。树状聚体例如树状聚体葡糖胺与MD2上的袋的亲水性入口结合几乎完全封闭了MD2内该袋的入口；它还诱导了MD2自身内的构象改变，使得LPS非常难以作为有效激动剂结合蛋白质。这有利地诱导了促炎细胞因子产生。这种重要的新机理性观察结果显示树枝状分子氨基糖（无任何脂质链或磷酸基团结合树状聚体）可以作为LPS结合MD2上疏水袋的带电荷的亲水性入口的部分拮抗剂起作用(图6&7)。

尽管不希望受到理论约束，但是认为表面特性(外臂灵活性和电荷分布)与分子大小对生物活性而言是极其重要的，特别是氨基糖和游离羧酸和例如群密度例如形成的0长度酰胺键的组合是在适合大小骨架上阻断靶受体和产生治疗结果所需的。糖树状聚体的亲水性表面也起重要作用。

能够产生协同性作用的化合物在调节免疫系统中的生物控制机制方面非常重要，更具体地，它们很少在纯合成分子中实现。本说明书的树状聚体适合于在体外和体内产生协同性作用。

尽管从第3.5代阴离子型羧酸封端的PAMAM树状聚体的分子中生成的数据已经极为富有希望和令人激动，但是其缺乏进展的一个原因在于，尽管本领域的许多工作人员作了反复尝试，但是尚不能将该分子制备成“单分散体”，即实际上的可以可再现性地制备令药物许可部门满意的特征化分子群体。这是因为，如同所有聚合物一样，最终PAMAM树状聚体不可避免地包括少量成分的混合物，它们因树状聚体合成过程中出现的副反应产生。就所有聚合物而言，难以将这些成分分离出来以生成单一种类。迄今为止，尚未得到生成PAMAM树状聚体单一种类的方法。可以认为化学自身存在缺陷的方面在于不能在这种分子的合成过程中防止副反应发生。

使用PAMAM化学的不完全反应和环化反应是指对PAMAM产物而言存在一些结构不均匀性。这意味着极难以制备这种分子，它具有规模化制备的纯度和可再现性以及许可部门批准例如来自FDA批准的新药所需的分析化学表征程度。

因此，有必要考虑PAMAM化学的现实的可替代选择以使用具有规模化制备的纯度和可再现性以及药物所需的分析化学表征程度的分子实现期望的生物效果。因此，发明人已经寻找了一种替代分子，它与第3.5代PAMAM树状聚体的分子共有特征。然而，结果是提供期望的生物特性的表面特征、大小、灵活性和亲水性并不如此的易于复制。

令人意外地，在本领域工作几乎8年后，发明人目前已经鉴定了极为有限数量的糖树状聚体，其具有期望的生物特性和基于不同化学的芯，因非常谨慎，所以它们可以用于制备具有规模化制备的纯度和可再现性以及药物所需的分析化学表征程度的分子，例如生成单分散体，即例如基本上单一的化学本体。

这种芯基于聚丙基醚亚胺，且令人意外地，使用这种芯制备的糖树状聚体似乎共有PAMAM糖树状聚体的一些或全部有利的生物特性，且在一个或多个领域中可以显示超过PAMAM糖树状聚体的改善。

已经生产了高纯度(至少95%)的聚丙基醚亚胺且聚丙基醚亚胺-葡糖胺具有白色结晶外观。

术语“单分散体”作为树状聚体化学领域中一般所理解的含义使用。这意味着树状聚体具有窄的分子量分布，其中主要存在一种定义分子量的具体种类。更具体地，一种具体种类以90%或以上，例如91、92、93、94、95、96、97、98%或以上存在。

有利地，认为本说明书的糖树状聚体具有有用的生物特性，一般而言，它们能够被制成具有规模化制备的纯度和可再现性以及药物所需的分析化学表征程度的分子，例如基本上为单一的化学本体。

在一个实施方案中，本发明的糖树状聚体是少量充分定义的化学本体的混合物，它们是无害的或基本上与主要树状聚体种类相似和例如具有相似的生物活性。

在本说明书上下文中的“无害”预以指不导致有害效应且在生物环境中基本上无害的不纯。例如，有害作用可以涉及组织毒性或催化作用或降解或任意其他可以被视为药物缺点的特性。

本文所述的“基本上相似”预以指其中分子包含与期望的种类相同的成分，但它们以不同比例存在，例如基本上相似一般是指包含相同的芯和糖的糖树状聚体，但芯上的羧酸的数和/或糖或与芯共轭的糖的数量与期望的不同。

在一个实施方案中，以分支方式制备树状聚体芯，因此，可以将得到的树状聚体指定为一代。

在一个实施方案中，芯树状聚体的“代”是4或以下，例如3、2、1或0.5。

本文所用的树状聚体芯预以指分支树状聚体聚合物，此后表面通过“氨基糖”与其共轭而得到修饰。一般而言，如果考虑最终的芯，则它以游离羧酸封端。然而，如果芯位于中间阶段，则它可以被非羧酸的官能团封端。

本文所用的末端羧酸基团预以指位于树状聚体的一个表面分支末端上的游离羧酸基团-C(O)OH和任意羧酸残基。

本文所用的末端羧酸残基预以指与另一种本体例如氨基糖发生化学反应后遗留的末端羧酸部分，例如-C(O)-。

游离羧酸基团预以指未反应(非共轭羧酸)的-C(O)OH。

本文所用的糖树状聚体预以指因树状聚体芯上糖例如氨基糖与一些末端羧酸共轭产生的本体。

糖，例如氨基糖与树状聚体芯通过糖上的氮与来自末端羧酸基团的羰基形成的酰胺键连接。这是直接的酰胺键，也称作0长度酰胺键。

在一个实施方案中，树状聚体芯上末端羧酸的数量平均为10或12－48，例如8、12、16、24、32、40或48，例如16、24、32或48。

在一个实施方案中，树状聚体芯具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个羧酸或其组合。

在一个实施方案中，树状聚体芯上末端羧酸的数量为16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28和其组合。

在一个实施方案中，树状聚体芯上末端羧酸的平均数为10－20，例如平均为14－18，例如平均为16个羧酸，特别是16个羧酸。

本领域技术人员显而易见，一般对指定分子群体而言，存在的羧酸的数量在计算时是整个群体内的平均值。

在一个实施方案中，将所述群体定义为，它不包括具有低于定义的下限阈值和高于定义的上限阈值的羧酸的分子，例如，如果需要包含16个羧酸的分子，则下限值可以为12且上限值可以为20乃至18。

在一个实施方案中，糖树状聚体包含组合数量的末端羧酸和相当于起始芯内游离羧酸数量的羧酸残基。

在本说明书的糖树状聚体的分子中，存在至少一个且一般是一个以上游离羧酸，例如，其中羧酸的数量=X-Y，其中X是9－64范围的数值(且相当于树状聚体芯的羧酸数量)，Y是2－8范围的数值(且相当于表面共轭糖分子的数量)。

在一个实施方案中，游离羧酸的数量为8、10、14、21、28、35或38(或其组合)。在一个实施方案中，游离羧酸的数量为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或其组合。在一个实施方案中，共轭后游离羧酸的数量在该群体中平均为12－14，例如14。这些游离羧酸可以在有利于糖树状聚体与靶受体增强的多价结合方面具有作用，且由此与分子的生物活性相关。

本说明书的糖树状聚体可以作为可表征的分子的离散群体提供。

有利地，羧酸封端的阴离子型聚丙基醚亚胺树状聚体与阳离子型聚丙基醚亚胺树状聚体相比在体外明显不具有毒性(Krishna TR&Jayaraman N.Synthesis of poly(propyl ether imine)dendrimers andevaluation of their cytotoxic properties.J.Organic Chemistry2003;68(25):9,694-9,704;Jain S,Kaur A,Puri R等人Polypropyletherimine dendrimer:A novel non-toxic dendrimer forsustained drug delivery.Eur J Med Chem201;45:4997-5005)。这种较高代阳离子型树状聚体的内在毒性是指它们对作为药物对人反复静脉内给药而言可能不适合或不安全(Malik N,Wiwattanapatapee R,Klopsch R,Lorenz K,Frey H,Weener J W,Meijer E W,Paulus W&Duncan R.(2000)Dendrimers:Relationship between structure andbiocompatibility in vitro,and preliminary studies on thebiodistribution of125I-labelled polyamidoamine dendrimers in vivo.Journal of Controlled Release65,133-148)。

因此，认为本说明书的糖树状聚体具有低毒性，使得它们适合于用作药物。

在一个实施方案中，与树状聚体芯共轭的氨基糖的平均范围在2－8，例如3、4、5、6或7，例如包含平均为16个羧酸的芯。

在一个实施方案中，2个氨基糖与树状聚体芯共轭。

在一个实施方案中，主要种类的糖树状聚体包含2个氨基糖，但群体例如还可以包含具有1或3个糖的本体。

在一个实施方案中，提供了与2、3、4或5例如2、3、或4、特别是2或3个糖共轭的树状聚体芯(例如具有16个羧酸或平均具有16个羧酸的群体)。还提供了包含所述分子的群体。

甚至在具有与之共轭的相同数量的糖分子的糖树状聚体群体中，分子也可以作为区域异构体存在。即糖本体、特别是糖树状聚体的相对位置可变。即糖的空间排列在该群体的一个分子与另一个分子比较时是不同的。

在一个实施方案中，使主要糖树状聚体种类的区域异构体的数量最小化，特别是对指定具有与之共轭的相同数量的糖的糖树状聚体群体而言，至少50%的所述群体是期望的区域异构体，特别是75%是期望的区域异构体。

可以影响区域异构体分布以通过优化共轭过程中的合成化学条件提供期望的结果。

在一个实施方案中，30%或以下的树状聚体的羧酸与糖共轭，例如29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%的树状聚体的羧酸是共轭的，例如28.75%。

在一个实施方案中，20%或以下的树状聚体的羧酸与糖共轭，例如19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或以下的树状聚体的羧酸是共轭的，例如16.75或12.5%。

在一个实施方案中，共轭羧酸的数量在3%－14%，例如6%－13%，特别是12.5%。

然而，本发明的发明人认为在每个分子中至少需要2个氨基糖以有效地阻断靶受体。

此外，在一个方面中，提供了高度优化的糖树状聚体，其包含2个氨基糖和14个其余的末端羧酸。在一个实施方案中，树状聚体是树状聚体群体，其中后面的本体是主要的成分，例如是单分散体。

这种分子(即第3代阴离子型羧酸封端的聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺)在外形上小于本领域在先描述的第3.5代PAMAM树状聚体葡糖胺。第3.5代PAMAM树状聚体在芯内具有64个末端羧酸。

在一个实施方案中，本说明书的糖树状聚体是第4代分子。

令人意外地，这种小的聚丙基醚亚胺树状聚体在芯内仅具有16个末端羧酸。在相同浓度(基于mg/ml)下，认为聚丙基醚亚胺芯在制备所述糖树状聚体中的应用可以减少一些促炎细胞因子，其程度等于或大于G3.5代PAMAM树状聚体葡糖胺，正如下表1中所概述的。

表1:来自所示的几个图的结果的概述表。当与G3.5PAMAM树状聚体葡糖胺比较时，量化了使用G3聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺在促炎细胞因子中的减少倍数。100%对照=从用25ng/ml LPS刺激的细胞中释放细胞因子的刺激。

(nd=未进行)

这种小和优化的第3代(G3)聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺从药物角度观察特别有用，因为在制备用于生产所述第3代(G3)聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺的原料方面和执行制备最终药物产品所需的化学步骤的便利性方面更加成本有效。

在一个实施方案中，树状聚体芯上的氨基糖的表面涂层是18.75%或以下，例如15%或以下，例如12.5%。

树状聚体芯是聚丙基醚亚胺芯。它通常基于3-氨基-丙-1-醇的单元。根据如何合成树状聚体，在芯的中心可以存在氧原子或在芯的中心可以存在氮原子。有关在芯上具有氮的聚丙基醚亚胺树状聚体的详细描述参见Krishna TR,Jain S,Tatu US,Jayaraman N.Synthesisand biological evaluation of3-amino-propanol-1-ol based poly(etherimine)dendrimers.Tetrahedron2005;61:4281-4288。有关在芯上具有氧的聚丙基醚亚胺树状聚体的详细描述参见下列论文:-KrishnaTR&Jayaraman N.Synthesis of poly(propyl ether imine)dendrimersand evaluation of their cytotoxic properties.J.Organic Chemistry2003;68(25):9,694-9,704;Jana C,Jayamurugan G,Ganapathy R,Maiti PK,Jayaraman N,Sood AK.Structure of poly(propyl etherimine)dendrimer from fully atomic molecular dynamics simulationand by small angle x-ray scattering.J.Chemical Physics2006;124:204719;Jayamurugan G,Jayaraman N.Synthesis of largegeneration poly(propyl ether imine)dendrimers.Tetrahedron2006;62:9582–9588。

在一个实施方案中，芯是基于3-氨基-丙-1-醇的聚丙基醚亚胺。这些树状聚体可以恰好在该分子的芯上具有氧原子或氮原子。

在一个实施方案中，树状聚体恰好在该分子的芯上具有氧原子。

在一个实施方案中，树状聚体恰好在该分子的芯上具有氮原子。

本文的糖树状聚体称作聚丙基醚亚胺糖树状聚体。

认为这些新的阴离子型聚丙基醚亚胺糖树状聚体结合单核细胞和巨噬细胞和树突细胞上的细胞表面TLR4受体，以减少作为对LPS或透明质素片段应答的促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8和/或IL-1β产生。

令人意外地，这些树状聚体芯在使用时提供正确的组合特征以支持所需载量的氨基糖或糖和提供生物活性。尤其令人意外的是小代聚丙基醚亚胺糖树状聚体具有有利的生物活性。

在一个方面中，提供了第3代－第3.5代阴离子型羧酸封端的(即16－64个周边羧酸基团)树状聚体葡糖胺，其具有例如12.5%表面载量的葡糖胺(即2－8个葡糖胺分子)和树状聚体芯与葡糖胺之间0长度的酰胺键。

特别地，提供了具有16或32个末端羧酸基团例如16个羧酸基团的聚丙基醚亚胺芯(和包含它的糖树状聚体)。

显然，这种期望的分子可以作为分子群体提供，特别是具有如本文所定义的平均特征的定义群体。

因此，在一个实施方案中，提供了第3代阴离子型羧酸封端的(即16个周边羧酸基团)聚丙基醚亚胺糖树状聚体(例如葡糖胺糖树状聚体)，其具有12.5%表面载量的糖，例如葡糖胺(即2个糖分子，例如葡糖胺分子)和树状聚体芯与糖例如葡糖胺之间的0长度酰胺键。在一个实施方案中，2个糖分子例如葡糖胺分子存在于树状聚体表面的相对侧，如图31中所示(即空间间隔成最大间隔距离)。

因此，在一个实施方案中，提供了G3阴离子型羧酸封端的(即16个周边羧酸)聚丙基醚亚胺糖树状聚体(例如葡糖胺糖树状聚体)，其具有18.75%的糖例如葡糖胺(即3个糖分子，例如葡糖胺分子)的表面载量和树状聚体芯与糖例如葡糖胺之间的0长度酰胺键。

在一个实施方案中，提供了一种组合物，其包含第3代阴离子型羧酸封端的具有2或3个糖、例如2或3个葡糖胺的聚丙基醚亚胺糖树状聚体分子的混合物。

因此，在一个实施方案中，提供了第3代阴离子型羧酸封端的(即16个周边羧酸基团)聚丙基醚亚胺糖树状聚体(例如葡糖胺糖树状聚体)，其具有25%的糖例如葡糖胺(即4个糖分子，例如葡糖胺分子)的表面载量和树状聚体芯与糖例如葡糖胺之间的0长度酰胺键。

在一个实施方案中，提供了一种组合物，其包含第3代阴离子型羧酸封端的具有3或4个糖、例如3或4个葡糖胺的聚丙基醚亚胺糖树状聚体分子的混合物。

因此，在一个实施方案中，提供了第3代阴离子型羧酸封端的(即16个周边羧酸基团)聚丙基醚亚胺糖树状聚体(例如葡糖胺糖树状聚体)，其具有31.25%的糖例如葡糖胺(即5个糖分子，例如葡糖胺分子)的表面载量和树状聚体芯与糖例如葡糖胺之间的0长度酰胺键。

在一个实施方案中，提供了一种组合物，其包含第3代阴离子羧酸末端的具有4或5个糖、例如4或5个葡糖胺的聚丙基醚亚胺糖树状聚体分子的混合物。

该混合物中具有2个糖的分子与具有其他数量糖的分子之比分别在1－99%:99－1%，且可以是例如50:50,75:25或25:72等。

在一个实施方案中，本说明书的糖树状聚体具有13或14个游离羧酸，例如14个。

在一个实施方案中，本说明书的糖树状聚体具有13个游离羧酸。

在一个实施方案中，本说明书的糖树状聚体具有12个游离羧酸。

在一个实施方案中，本说明书的糖树状聚体具有11个游离羧酸。

本文所用的分子的相对侧预以指直接相对的糖，例如葡糖胺或相似热力学和空间有利的构型。

推定这种观察结果与使用前线分子轨道理论进行的较高占据的分子轨道和最低占据的分子轨道计算一致。就第3代阴离子型羧酸封端的(即16个周边羧酸基团)聚丙基醚亚胺树状聚体而言，发现每个葡糖胺的递增添加以能量有利的方式进行，直到2个葡糖胺分子连接可利用的16个羧酸基团的2个。此后，较高占据的分子轨道能量值快速变为不利于添加另外的葡糖胺分子，不过，理论上能够连接至多4或5个葡糖胺分子。这表明树状聚体葡糖胺的分支合成方法一般有利于将2个葡糖胺分子添加到第3代阴离子型羧酸封端的聚丙基醚亚胺树状聚体的16个羧酸基团的2个上。典型地，2个葡糖胺分子位于树状聚体表面直接相对侧上(Barata TS,Shaunak S,Teo I,Zloh M,BrocchiniS.Structural studies of biologically active glycosylatedpolyamidoamine(PAMAM)dendrimers.J Mol Model.Epub ahead ofprint:doi10.1007/s00894-010-0907-1;Barata TS,Brocchini S,Teo I,Shaunak S,Zloh M.From sequence to3D structure of hyperbranchedmolecules:application to surface modified PAMAM dendrimers.JMol Model.Epub ahead of print:doi10.1007/s00894-011-0966-y;Barata TS,Teo I,Brocchini S,Zloh M,Shaunak S.Partiallyglycosylated dendrimers block MD-2and prevent TLR4-MD2-LPScomplex mediated cytokine responses.{在印刷中的PLOSComputational Biology中})。

在一个实施方案中，提供了树状聚体，其具有的组合的末端羧酸/羧酸残基与和与之共轭的氨基糖数量之比为8:1－6:1，特别是8:1。

除非上下文中另有暗示，否则术语糖和氨基糖在本文中一般是指氨基糖及其硫酸盐。

在一个实施方案中，氨基糖是葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、2-硫酸葡糖胺、3-硫酸葡糖胺、6-硫酸葡糖胺、2,6-二硫酸葡糖胺、3,6-二硫酸葡糖胺、3,4,6-三硫酸葡糖胺、2-硫酸N-乙酰葡糖胺、3-硫酸N-乙酰葡糖胺、6-硫酸N-乙酰葡糖胺、2,6-二硫酸N-乙酰葡糖胺、3,6-二硫酸N-乙酰葡糖胺或3,4,6-三硫酸N-乙酰葡糖胺或其组合。

在一个实施方案中，糖选自葡糖胺、2-硫酸葡糖胺、3-硫酸葡糖胺、6-硫酸葡糖胺及其组合，例如在本说明书的第3代糖树状聚体中。

在一个实施方案中，糖是葡糖胺,例如在本说明书的第3代糖树状聚体中。

在一个实施方案中，糖选自2-硫酸葡糖胺、3-硫酸葡糖胺和6-硫酸葡糖胺，例如在本说明书的第3代糖树状聚体中。

在一个实施方案中，氨基糖是甘露糖胺或半乳糖胺或其衍生物或其组合，例如相当于上述葡糖胺衍生物的硫酸化和/或酰化衍生物。

在一个实施方案中，氨基糖是甘露糖胺，例如在本说明书的甘露糖胺第3代聚丙基醚亚胺糖树状聚体中。在一个实施方案中，提供了树状聚体第3代硫酸甘露糖胺糖树状聚体或树状聚体第3代N-乙酰甘露糖胺糖树状聚体或树状聚体第3代硫酸N-乙酰甘露糖胺糖树状聚体或其任意的组合。

在一个实施方案中，上述鉴定的糖的一种或多种的组合用于与树状聚体芯共轭。

在一个实施方案中，氨基糖例如葡糖胺均匀地空间排列在树状聚体表面上。

本文所用的均匀空间排列预以指如下事实：糖以平衡方式通过树状聚体表面发散并且在该表面上的一个或多个位置上没有彼此簇集。

有利地，树状聚体是高分支的，其中每一分支的末端确定树状聚体的分子表面。注意：(1)其物理-化学特性与常规的小分子药物相似；(2)它们可以被修饰成在生理pH下作为两性离子存在；和(3)它们具有相当的缓冲能力，能够使得它们在物理-化学方面“相似”于血液蛋白(例如白蛋白)，且由此是生物相容性的。然而，不同于蛋白质，它们(1)在血浆中不进行蛋白水解降解；(2)不是免疫原性的；(3)反复静脉内给药后无毒性；(4)可以对其循环时间优化；和(5)与健康组织相比显示以50:1之比在包含炎症细胞的组织中优先蓄积。此外，NationalCancer Institute’s Nanotechnology Characterisation Laboratory近期对阴离子型PAMAM树状聚体进行了详细的化学和毒理学表征，并且发现它们是稳定和生物相容性的(参见NanotechnologyCharacterisation Laboratory NCI(2006)Dendrimer-based MRIcontrast agents website-http://ncl.cancer.gov/working technical reports.asp)。

有利地，本说明书的糖树状聚体是稳定的，即它们适合于在适合的条件下在贮存待用，例如用作治疗剂。

在另一个方面中，本发明提供了包含本发明聚丙基醚亚胺糖树状聚体和任选药学可接受的载体/赋形剂的药物制剂。

在一个实施方案中，该制剂包含10μg－1g的本说明书的糖树状聚体。

本发明的化合物和制剂适合于通过胃肠外给药，例如通过静脉内、皮下、肌内、腹膜内和眼内；通过口服；通过局部，包括通过气雾剂，例如通过鼻内；通过肺给药；直接对眼给药；通过透皮(皮肤)，例如通过浸渍的膏药或皮肤贴剂，特别是通过缓释制剂经皮对皮肤表面；和通过粘膜内层，例如通过口含或直肠给药，例如作为直肠灌肠剂，其中在适合的载体例如水性载体中配制化合物。

本文所用的局部给药包括对胃肠道口服给药和结肠给药等，其中所给予的化合物不通过全身吸收。

在另一个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含本说明书的化合物或其药学可接受的衍生物作为活性成分与药学可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体，该药物组合物用于治疗，且特别是用于治疗患有易于受抗微生物化合物改善的病症的人或动物受试者。

本文所用的活性成分预以指药理学有效成分，例如它们是治疗有效的。活性成分的实例包括皮质类固醇，例如丙酸氟替卡松、糠酸氟替卡松、糠酸莫米松、地塞米松、可的松、氢化可的松、倍他米松、泼尼松龙；非类固醇抗炎药，例如阿司匹林、布洛芬、萘普生。

本说明书还提供了药物组合物的制备方法，该方法包含混合本说明书的化合物或其药学可接受的衍生物与药学可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。

可以将本说明书的化合物配制成以任意便利的方式给药，以用于人药或兽药，且本说明书由此在其范围内包括包含适用于人药或兽药的化合物的药物组合物。可以以常规方式借助于一种或多种适合的赋形剂、稀释剂和/或载体将这种组合物制成可用的形式。用于治疗应用的可接受的赋形剂、稀释剂和载体是制药领域众所周知的且例如描述在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publ Co.(A.R.Gennaro编辑.1985)中。药物赋形剂、稀释剂和/或载体的选择可以根据指定的给药途径和标准制药实践进行选择。药物组合物可以包含任意适合的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂作为赋形剂、稀释剂和/或载体或还可以包含它们。

在药物组合物中还可以提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至矫味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯类。还可以使用抗氧化剂和助悬剂。

就一些实施方案而言，本说明书的活性剂还可以与环糊精联用。已知环糊精与药物分子一起形成包合物和非包合络合物。形成药物-环糊精络合物可以改善药物分子的溶解性、溶出速率、生物利用度和/或稳定性。药物-环糊精络合物一般对大部分剂型和给药途径是有用的。作为与药物络合的可替代选择，环糊精可以用作辅助添加剂，例如作为载体、稀释剂或增溶剂。最常用的是α-、β-和γ-环糊精，且适合的实例描述在WO91/11172,WO94/02518和WO98/55148中。

可以使用公知的研磨方法例如湿法研磨本说明书的化合物，得到适合于片剂形成和其他制剂类型的粒度。可以通过本领域公知的方法制备本发明化合物的细分的(纳米粒)制剂，例如参见国际专利申号WO02/00196。

给药(递送)途径包括但不限于如下的一种或多种：口服(例如作为干粉/自由流动的颗粒制剂、片剂、胶囊或可摄入的溶液或混悬液)、直肠、口含和舌下。本说明书的组合物包括尤其是为胃肠外、口服、口含、直肠、局部、植入、眼部、鼻部或泌尿生殖道应用配制的那些形式。在本发明的一个方面中，通过口服递送活性剂，因此，活性剂是适合于口服递送的形式。

在一些情况中，可以通过局部、胃肠外(例如通过可注射形式)或通过透皮途径包括粘膜(例如作为鼻腔喷雾剂或用于吸入的气雾剂)、鼻部、胃肠、脊柱内、腹膜内、肌内、静脉内、子宫内、眼内、真皮内、颅内、气管内、阴道内、脑室内、大脑内、皮下、眼部(包括玻璃体内或前房内)递送本说明书的化合物。

根据递送系统的不同可以存在不同的组合物/制剂要求。作为实例，可以将本说明书的药物组合物配制成使用小型泵或通过粘膜途径例如作为鼻腔喷雾剂或吸入用气雾剂或可摄入的溶液或通过胃肠外给药的形式，其中将组合物配制成可注射的形式，例如通过静脉内、肌内或皮下途径递送。或者，可以将制剂设计成通过两种途径递送。如果适合，可以通过如下方式给予药物组合物：通过吸入、以栓剂或阴道栓的形式、通过局部以洗剂、溶液、霜剂、软膏剂或撒粉的形式、通过使用皮肤贴剂、通过口服以包含赋形剂例如淀粉或乳糖的片剂的形式、或胶囊的形式或单独或与赋形剂的混合物的阴道栓剂的形式或包含矫味剂或着色剂的酏剂、溶液或混悬液的形式，或可以将它们通过胃肠外注射，例如通过静脉内、肌内或皮下注射。

就口含或舌下给药而言，可以以按照常规方式配制的片剂或锭剂的形式给予组合物。

就胃肠外给药而言，可以以无菌水溶液的形式使用组合物，该水溶液可以包含其他物质，例如足量的盐或单糖，使得该溶液与血液等渗。

如果通过胃肠外给予本说明书的化合物，则这种给药的实例包括如下的一种或多种：静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内，例如作为推注剂；或通过皮下给予活性剂和/或通过使用输注技术。

用于胃肠外给药的制剂可以以冻干形式提供，这种冻干形式用注射用水或输注液或等渗溶液例如葡萄糖重构。

可以以片剂、胶囊、阴道栓剂、酏剂、溶液或混悬液的形式给予(例如通过口服或局部)本说明书的化合物，这些剂型可以包含矫味剂或着色剂，用于速释、延缓释放、改进释放、持续释放、脉冲释放或控释应用。

还可以将本说明书的化合物制成用于适合于口服或口含给药形式的人药或兽药应用，例如溶液、凝胶、糖浆剂、漱口药或混悬液或用水或其他适合的媒介物在使用前溶解的干粉形式，其任选包含矫味剂和着色剂。

还可以使用固体组合物，例如片剂、胶囊、锭剂、软锭剂、丸剂、大丸剂、粉末、糊剂、颗粒、弹丸推注剂(bullets)或预混合物制剂。可以根据本领域众所周知的方法制备用于口服应用的固体和液体组合物。这种组合物还可以包含一种或多种药学可接受的载体和赋形剂，它们可以是固体或液体形式。

片剂可以包含赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、硫酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸、甘露糖醇、预胶化淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、崩解剂例如羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠和一些复合硅酸盐和成粒粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。

另外，可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。

相似类型的固体组合物还可以用作明胶或HPMC(羟丙基纤维素)胶囊中的填充剂。在这方面优选的赋形剂包括微晶纤维素、乳糖、碳酸钙、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露糖醇、预胶化淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉或高分子量聚乙二醇。就水性混悬液和/或酏剂而言，可以将活性剂与不同的甜味剂或矫味剂、着色物质或染料、乳化剂和/或助悬剂和稀释剂例如水、乙醇、丙二醇和甘油及其组合合并。

可以给胶囊填充粉末(单独的药物或作为与选择的填充剂的掺合物)或可选的液体，其各自包含一种或多种本发明的化合物和载体。如果给胶囊填充粉末，则可以将本发明的化合物和/或载体研磨或微粉化成具有适合粒度的材料。

在作为片剂或胶囊口服给药时，可以给本说明书的化合物包衣，例如用肠溶衣。如果适合，则例如可以用薄膜给片剂或胶囊包衣，例如购自Rohm Pharma Polymers的

薄膜，这使得它们能够在胃肠道中受控溶出。薄膜作为阳离子型聚合物例如

E100(甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物)或阴离子型丙烯酸聚合物例如

L(甲基丙烯酸共聚物)和EUDRAGIT S得到。

可渗透的丙烯酸聚合物例如

RL(氨基甲基丙烯酸酯共聚物)和

RS也是可得到的。

可以将这些包衣制剂制备成水性分散液，其包括任选的成分，例如滑石粉、硅氧烷消泡乳剂、聚乙二醇。或者，可以将包衣制剂制备成有机聚合物溶液。

或者，可以使用购自Colorcon的

(

)包衣系统给片剂包衣。水性系统一般包含至多15%w/w的。有机溶剂系统一般包含至多5%w/w的

。

通过已知的技术制备包衣层，例如通过：

1.称重所需量的薄膜包衣系统，2.将所需量的水或其他溶剂称入混合容器，3.使用容器中心处的混合螺旋桨和尽可能紧密接触容器底部，将溶剂搅拌成涡旋物，不将空气抽入液体，4.稳定和快速地添加

粉末至涡旋物中，避免粉末在液体表面飘浮，5.如果需要，则增加搅拌速度以维持涡旋，和6.在加入全部粉末成分后，降低搅拌速度，持续混合约45分钟。

可以通过已知技术、使用片剂包衣机施加包衣层。所施加的包衣层的厚度一般在5－35微米，例如10－30微米，更具体地是10或20微米，视所需的效果而定。

或者，如果适合，则可以将片剂或胶囊填充入另一种胶囊(优选HPMC胶囊，例如

)，得到在胶囊中的片剂或在胶囊中的胶囊的构造，当对患者给予时，其在胃肠道中产生受控溶出，由此提供与肠溶衣相似的效果。

因此，在一个方面中，本说明书提供了本发明化合物的固体剂型的制剂，例如其中制剂具有肠溶衣。

在另一个方面中，本说明书提供了包含保护性胶囊作为外层的固体剂型的制剂，例如作为在胶囊中的片剂或在胶囊中的胶囊。肠溶衣可以提供相比不包衣制剂的改善的稳定性。

在兽药中，还可以通过口服给予本说明书的化合物，以液体兽用顿服药的形式，例如活性成分连同药学可接受的载体或赋形剂的溶液、混悬液或分散液。

例如，还可以将本发明的化合物配制成栓剂，例如其包含常用的用于人药或兽药的栓剂基质；或配制成阴道栓，例如其包含常用的阴道栓基质。

在一个实施方案中，将制剂制成用于局部给药包括吸入的制剂。

适合的可吸入制剂包括可吸入粉末、包含抛射剂气体的可计量气雾剂或不含抛射剂气体的可吸入溶液。包含活性物质的本说明书的可吸入粉末可以仅由上述举出的活性物质或由上述举出的活性物质与生理学可接受的赋形剂的混合物组成。

这些可吸入粉末可以包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或它们一起的混合物。优选使用单糖或二糖，特别是使用乳糖或葡萄糖，但不限于其水合物的形式。

在肺中沉积的颗粒需要粒度小于10微米，例如1-9微米，适合地0.1－5μm，特别是优选自1－5μm。活性成分(即本说明书的化合物)的粒度应在该范围内。赋形剂例如乳糖的粒度可以大于该范围。

可以用于制备可吸入气雾剂的抛射剂气体已知来自现有技术。适合的抛射剂气体选自烃类，例如正-丙烷、正-丁烷或异丁烷和卤代烃类，例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述举出的抛射剂气体可以以其自身的形式或其混合物的形式使用。

特别适合的抛射剂气体是卤代烷衍生物，其选自TG11、TG12、TG134a和TG227。在上述举出的卤代烃类中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物适用于本发明的制剂。

包含抛射剂气体的可吸入气雾剂还可以包含其他成分，例如共溶剂、稳定剂、表面活性剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的物质。所有这些成分都是本领域公知的。

本发明包含抛射剂气体的可吸入气雾剂可以包含至多5%重量的活性物质。本说明书的气雾剂可以包含，例如0.002－5%重量、0.01－3%重量、0.015－2%重量、0.1－2%重量、0.5－2%重量或0.5－1%重量的活性成分。

本说明书的化合物还可以与其他治疗剂组合。因此，本说明书在另一个方面中提供了一种组合，其包含本说明书的化合物或其药学可接受的衍生物与另一种治疗剂。可以将该组合制成联用制剂或只是分别包装成单独的制剂，用于同时或依次递送。

可以补充本说明书的糖树状聚体的治疗活性的可能的活性成分列举如上所述。

治疗抗体也可以补充本说明书的糖树状聚体的治疗活性。治疗抗体的实例包括抗-TNF-α抗体，例如依那西普、英夫利西单抗、阿达木单抗、培舍珠单抗、戈利木单抗；白细胞介素-1抗体，例如阿那白滞素；利妥昔单抗；阿巴他塞；和托珠单抗。

应理解，该组合中并非所有的化合物(或分子)都需要通过相同的途径给予。因此，如果疗法包含一种以上活性成分，则可以通过不同途径给予那些成分。

可以依次或同时在单独或合并的药物制剂中通过任意便利的途径给予这种组合的各个成分。

当依次给药时，可以首先给予本说明书的化合物或第二种(另一种)治疗剂。当同时给药时，可以将该组合以相同或不同的药物组合物的形式给予。

可以将上述涉及的组合便利地制成药物制剂的形式，因此，包含如上述所定义的组合连同药学可接受的载体或赋形剂的药物制剂占据本说明书的另一个方面。

当合并在同一制剂中时，可以理解，两种化合物必须稳定且彼此和制剂的其他成分相容。当单独配制时，可以按照对这种化合物而言是本领域公知的这样的方式将它们制成任意便利的制剂。

组合物可以包含0.01-99%的活性物质。就局部给药而言，组合物一般包含0.01-10%、更优选0.01-1%的活性物质。

例如，所述药物制剂的制备方法可以在受控环境下进行，例如受控的湿度条件。

在一个实施方案中，使药物制剂避光，例如贮存在琥珀色瓶或小瓶中，用箔包住或包装，例如用箔外包装或将其填充入泡罩包或箔小囊中。在一个实施方案中，使药物制剂防湿，例如箔包住或包装，例如箔外包装或填充入泡罩包或箔小囊。在一个实施方案中，使制剂避空气/氧气，例如通过贮存在氮气气氛中。

泡罩包装是本领域技术人员众所周知的，然而，在一个实施方案中，泡罩是购自amcor的所谓的防晒泡罩或购自Alcan的相似泡罩。引入参考的US2006/0283758公开了适用于本发明制剂的一些泡罩包。

可以将有利地适合包装的制剂贮存在室温下。

当本说明书的化合物或其药学可接受的衍生物与针对相同疾病状态的第二种治疗剂联用时，每种化合物的使用剂量与单独使用该化合物时可以相同或不同。适合的剂量易于由本领域技术人员理解。还可以理解，用于治疗所需的本说明书的化合物的量根据所治疗的病症的性质和患者的年龄和病症的不同而改变，且最终由巡诊医生或兽医判定。

典型地，临床医师将确定最适合于个体受试者的实际剂量。用于任意特定个体的具体剂量水平和剂量频率可以改变，视各种因素而定，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用期限、年龄、体重、一般健康状况、性别、膳食、给药方式和给药时间、排泄速率、药物组合、具体病症的严重性和个体正在进行的疗法。

就对人口服和胃肠外给药而言，活性剂的每日剂量水平可以为单剂量或分次剂量。就全身给药而言，作为用于成人治疗的每日剂量为2-100mg/Kg体重，优选5-60mg/Kg体重，可以分1－4次每日剂量给予，例如视给药途径和患者病症而定。当组合物包含剂量单位时，每个单位优选包含100mg－1g活性成分。治疗期限根据应答速率而非任意的天数决定。在一个实施方案中，治疗方案持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或以上天。

如上所述，本说明书的化合物和包含它们的组合物可以用于治疗或预防人和/或动物。

处置选择性外科手术中的不受控制的免疫损伤

选择性外科手术导致将高分子量透明质素降解成低分子量透明质素的组织酶释放。小片段以几乎与细菌衍生的LPS相同的方式引起TLR4介导的促炎应答。过度促炎细胞因子释放干扰伤口愈合正常期限。伴随这种宿主先天性免疫应答的过度血管发生增加促炎单核细胞募集至伤口部位。瘢痕形成是因促进成纤维细胞增殖的持久性促炎应答所致。Shaunak推定早期免疫调节途径和抗血管生成途径的抑制能够是生理性的(非病理性的)修复和外科手术诱发的损伤再生，不会导致瘢痕组织形成。

选择青光眼过滤外科手术的家兔模型，因为这种外科手术介入是精确定义的，并且因为手术失败是因过度促炎应答与新生血管应答联合导致。当组合使用时，PAMAM树状聚体葡糖胺和PAMAM树状聚体6-硫酸葡糖胺在这种临床验证的家兔模型中将青光眼过滤外科手术的成功率从30%增加至80%(P=0.029)。因此，这种基于树状聚体的药物组合安全和协同性地防止了手术后瘢痕组织形成。组织学研究显示基于组织的炎症细胞浸润和异常胶原蛋白形成的程度最低(Shaunak S,Thomas S,Gianasi E,Godwin A,Jones E,Teo I,Mireskandari K,Luthert P,Duncan R,Patterson S,Khaw P&Brocchini S.Polyvalent dendrimer glucosamine conjugates preventscar tissue formation.Nature Biotechnology2004；22:977–985；Atala A,Irvine DJ,Moses M,Shaunak S.Wound healing versusregeneration:Role of the tissue environment in regenerative medicine.MRS Bulletin August2010；35:597–606)。

认为本发明的糖树状聚体也具有这些特性。因此，提供了本说明书的糖树状聚体或其组合或包含它们的药物组合物，其用于治疗或预防、特别是治疗或预防手术诱发的组织损伤或组织损害，这种损伤或损害如果不加治疗就可能导致瘢痕形成和最初组织功能受损，例如用于治疗或预防眼组织中的瘢痕组织。

在一个实施方案中，本实施方案中所用的糖树状聚体包含氨基糖和硫酸氨基糖的组合，例如葡糖胺和硫酸葡糖胺(例如6-硫酸葡糖胺)的组合。在一个实施方案中，使用糖树状聚体的组合，例如包含氨基糖的糖树状聚体和包含硫酸氨基糖的糖树状聚体，例如第3代葡糖胺聚丙基醚亚胺糖树状聚体和第3代硫酸葡糖胺(例如6-硫酸葡糖胺)聚丙基醚亚胺树状聚体。

组织损伤级联

手术创伤和细菌感染都可以导致严重组织损伤，其可以因细胞表面TLR4介导的受体-配体相互作用引起。这些细菌衍生的配体与内源性透明质素片段之间的多价相互作用可以导致威胁生命的促炎细胞因子例如IL-6和TNF-α和IL-8的释放。作为结果，这种途径在所有生物学有机体中得到紧密调节。引起和阻止这种组织损伤级联的关卡是重要的，因为它们存在被药物处置的可能性。

因此，在一个实施方案中，提供了本说明书的化合物和包含它们的组合物在治疗或预防瘢痕形成中的应用，包括过度瘢痕形成，特别是手术后的瘢痕形成，无论是在体内还是涉及身体的表面器官；例如皮肤或粘膜表面或涉及眼的表面。

与细菌感染相关的炎症应答

先天免疫性的基础在于识别与病原体相关的分子模式的模式识别受体(TLRs)。它们使得免疫系统能够区分自身结构与和病原体相关的非自身分子。它们是抵抗侵入病原体的第一线宿主防御(Zuany-Amorim C,Hastewell J,Walker C.Toll-like receptors aspotential therapeutic targets for multiple diseases.Nature ReviewsDrug Discovery2002；1:797–807)。

巨噬细胞和树突细胞上的TLR4是关键细胞表面受体。抗原介导的触发导致细胞因子表达、树突细胞成熟和适应性免疫应答。

所有革兰氏阴性菌的外膜都由双层构成，这种双层由内小叶上的磷脂和外小叶上的脂多糖(LPS)的脂质锚定区(即脂质A)组成。识别LPS作为TLR4-MD--CD14受体复合物的组成部分发生。Park等人近期定义了TLR4-MD2识别LPS的结构基础(Park BS,Song DH,KimHM,Choi BS,Lee H,Lee JO.The structural basis oflipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2complex.Nature2009；458:1191–1195)。简言之，MD2具有衬有带电荷的亲水性入口的疏水袋。脂质A(由通过酯键彼此连接的2个磷酸化葡糖胺分子组成)结合这种袋的入口，且其脂质链随后进入MD-2的疏水袋。TLR4-MD2-LPS复合物进行构象改变和TLR4二聚化。胞内信号传导随之发生。

仅需要极短的刺激TLR4导致树突细胞成熟和T细胞刺激。这与诱导促炎细胞因子例如TNF-α和IL-6所需的延长和持续刺激TLR4相反。由此与细胞因子释放相比在TLR4-MD2-LPS复合物内存在诱导细胞分化的CD标记表达的不同的阈值(在细胞表面水平上)(ParkBS,Song DH,Kim HM,Choi BS,Lee H,Lee JO.The structural basisof lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2complex.Nature2009；458:1191–1195)。近期仅认可了与所有其他TLR受体相比这种独特的TLR4特性(Kagan JC,Su T,Horng T,Chow A,Akira S,Medzhitov R.TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor4to theinduction of interferon-beta.Nature Immunology2008；9:361–368)。

因此，在一个方面中，提供了本说明书的化合物和包含它们的组合物在治疗或预防炎症应答或炎性疾病中的应用，例如由一种或多种细胞因子水平增加介导的应答，所述的细胞因子选自IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β和MIP-1β。在一个实施方案中，炎症机制是应答的形式，例如对结合细胞表面受体TLR4的LPS和/或透明质素片段的应答和/或对细菌感染例如在肠内层中的感染的应答。

在一个实施方案中，提供了本说明书的糖树状聚体或包含它们的组合物，其用于治疗或预防与革兰氏阴性菌感染相关的炎症，例如与炎性腹泻相关的革兰氏阴性菌感染，例如志贺氏菌属和沙门氏菌属和弯曲杆菌属和难辨梭菌（Clostridium difficile）和大肠杆菌导致的那些感染。

在一个实施方案中，提供了本说明书的糖树状聚体或包含它们的组合物，其用于治疗或预防炎性肠病，例如克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。

在一个实施方案中，提供了本说明书的糖树状聚体或包含它们的组合物，其用于治疗或预防那些肠易激疾病（irritable bowel disease）的形式，例如与肠细菌过度刺激Toll样受体相关的那些形式的疾病。

在一个实施方案中，提供了本说明书的糖树状聚体或包含它们的组合物，其用于治疗或预防呼吸系统中异常过度宿主促炎细胞因子介导的应答，例如在过敏反应、哮喘中或细菌和/或病毒感染后发生的那些应答。

在一个实施方案中，提供了本说明书的糖树状聚体或包含它们的组合物，其用于治疗或预防伤口愈合中的过度瘢痕形成、瘢痕疙瘩形成、湿疹和银屑病。

在一个实施方案中，提供了本说明书的糖树状聚体或包含它们的组合物，其用于治疗或预防移植或器官或组织，例如角膜和/或皮肤移植。

在一个实施方案中，提供了本说明书的糖树状聚体，特别是包含硫酸氨基糖(例如6-硫酸葡糖胺)的糖树状聚体，其用于治疗或预防不期望的血管发生或再狭窄(例如插入支架后)。

在一个实施方案中，提供了涂敷本说明书化合物的支架，特别是该支架涂敷了包含硫酸氨基糖例如6-硫酸葡糖胺的糖树状聚体。

在一个实施方案中，提供了本说明书的糖树状聚体或包含它们的组合物，其用于治疗或预防牙龈炎。

在一个实施方案中，提供了本说明书的糖树状聚体或包含它们的组合物，其用于治疗或预防类风湿性关节炎或骨质疏松症。

在一个实施方案中，本说明书的糖树状聚体或其药物制剂适合于作为滴眼液、通过将颗粒沉积在眼内或眼周围或通过注入眼内的任意房室或通过器官直接输注例如以2.5－2,500μg/ml的浓度直接对眼部给药。

在一个实施方案中，提供了治疗方法，包含对有此需要的患者给予治疗有效量的本说明书的糖树状聚体或包含它们的组合物，其特别用于治疗或预防本文所述的适应征。

在一个实施方案中，提供了糖树状聚体或包含它们的组合物在制备用于治疗本文所述的适应征的药物中的应用。

0长度酰胺键形成的方法化学

至多第3代聚丙基醚亚胺树状聚体芯(即具有16个周边羧酸基团)的详细分支化学合成详细描述在Krishna TR&Jayaraman N.Synthesis of poly(propyl ether imine)dendrimers and evaluation oftheir cytotoxic properties.J.Organic Chemistry2003;68(25):9694-9704中。

从氧芯开始，通过由2次还原和2次迈克尔加成反应组成的重复循环合成树状聚体。这些重复和连续反应使用α-β-不饱和酯和腈作为单体和支持的金属催化剂和金属氢化物作为试剂进行。将酯类转化成醇类，然后将醇类转化成带有侧链腈类的醚类，然后将腈转化成伯胺类，然后将伯胺类转化成带有侧链酯类的叔胺类。上述方法持续较长，但简便且收率良好。

依次合成每代树状聚体后通过HPLC和/或柱色谱的色谱法可以用于确保得到单一本体第3代聚丙基醚亚胺为终产物。在与下列论文相关的补充文件中显示了这种分子的MALDI-MS：-Krishna TR&Jayaraman N.Synthesis of poly(propyl ether imine)dendrimers andevaluation of their cytotoxic properties.J.Organic Chemistry2003;68(25):9694–9704。

在与下列论文中描述了较大代的聚丙基醚亚胺树状聚体的合成：-Jayamurugan G&Jayaraman N.Synthesis of large generationpoly(propyl ether imine)dendrimers.Tetrahedron2006;62:9582–9588。

在无生物活性的葡糖胺分子与无生物活性的阴离子型羧酸封端的树状聚体的分子共价连接的方法中，树状聚体芯与糖分子例如葡糖胺分子在偶合试剂例如碳二亚胺偶合试剂或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐{EDC}的存在下反应。该反应在水性溶剂例如水中和在室温和无外部热源的情况下进行。类似的方法描述在例如WO03/089010中。在一个实施方案中，芯是第3、3.5或4代树状聚体。

这种方法具有如下优点：包含生成共价0长度酰胺键的单一合成步骤，使用水作为溶剂，可以在室温下(即18-26°C)进行。该方法还具有如下优点：它避免了对使用通常在体内有毒性的有机溶剂的需求。

此外，有机溶剂需要额外的、复杂的和昂贵的纯化操作以从有机溶剂中分离终产物。共轭即水性环境中成分的共价连接有利于简化和直接纯化最终的药物产品。这具有重要的工业化优点和制备优点和新药的许可优点。这种方法特别用于制备阴离子型羧酸封端的糖树状聚体，包括包含非葡糖胺的氨基糖的糖树状聚体。在葡聚糖部分的3'、4'和6'位上包含不同硫酸盐部分的组合的糖例如葡糖胺也适合于使用相同连接化学连接。

适合地，树状聚体芯与包含氨基例如胺基、例如伯胺基的化合物共价连接，例如氨基糖及其硫酸化糖，特别是葡糖胺或硫酸化葡糖胺。

适合地，与表面羧酸基团连接的糖或硫酸化糖的分子数量与存在于树状聚体上的羧酸基团的数量存在有限的固定比例。表示为转化的表面羧酸基团的百分比的连接树状聚体的氨基糖例如葡糖胺的数量在例如1.5－30%、例如1.5－15%的范围。更适合地，它在6.25－15%的范围，例如12.5%。

典型地，通过共轭形成的共价键在18个月以上的期限内是稳定的，这在药物产品的贮存期限方面是重要的。在一个实施方案中，冻干形成的糖树状聚体。这可以进一步延长分子的贮存期限。

因此，在一个方面中，提供了本发明糖树状聚体的制备方法，包含使氨基糖或硫酸氨基糖或其组合与树状聚体芯、特别是聚丙基醚亚胺树状聚体芯、例如以分支方式制备的芯、例如第3代芯共轭的步骤。在一个实施方案中，共价0长度酰胺键在芯上的糖与羧酸残基之间形成。在一个实施方案中，使用选自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和EDC的偶合试剂。

在一个实施方案中，该方法使用水作为溶剂。在一个实施方案中，该反应在低于40°C、不施加外部额外的能源的条件下进行。

在一个实施方案中，在芯与糖共轭后纯化糖树状聚体，例如可以通过透析和/或柱色谱法实现纯化。

在一个实施方案中，获自所述方法的糖树状聚体是本发明的分子或群体，例如单分散体，例如具有2个连接在树状聚体表面相对端的葡糖胺分子。

在一个实施方案中，本说明书涉及可获自所述方法的产品。

重要的是注意到，这些阴离子型羧酸封端的树状聚体(无连接的葡糖胺)甚至在极高剂量下也对促炎细胞因子例如IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和MIP-1β没有作用。另外重要的是注意到，葡糖胺(独立地)在高剂量下对促炎细胞因子例如IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和MIP-1β也没有作用。

然而，本说明书还提供了本文所述的树状聚体芯(聚丙基醚亚胺芯，特别是第3代)在制备糖树状聚体、特别是治疗性糖树状聚体、特别是本文所述的那些中的应用。

在一个方面中，提供了氨基糖或硫酸氨基糖、特别是本文所述的那些在制备糖树状聚体特别是治疗性糖树状聚体、特别是如本文所述的那些中的应用。

本文所用的平均值预以指模态平均值或中数平均值。

特别将本文涉及的全部引述文献和文件引入参考。

在本发明上下文中的包含指的是包括。

上文描述了包含某些整数的实施方案。上述本发明的实施方案在技术上适合时可以合并。本说明书还扩展至由本文所述的所述整数组成的相应实施方案。

将全部涉及的文献和专利文件引入参考。

实施例

如下文本描述了一些制备的化合物和几年内在寻找生物活性树状聚体中进行的分子模型化研究。参比化合物并非本说明书涵盖的化合物。

表1是制备和分析的糖树状聚体的概述

参比化合物1第2代三嗪树状聚体:

分支合成的阴离子型第2代羧酸封端的(即12个周边羧基)三嗪树状聚体的研究:

如上文这些论文中所述合成第2代三嗪树状聚体：-Chouai A&Simanek EE.Kilogram-scale synthesis of a second-generationdendrimer based on1,3,5-triazine using green and industriallycompatible methods with a single chromatographic step.J.OrganicChemistry2008;73(6):2357–2366.Electrophoretic behaviour ofanionic triazine and PAMAM dendrimers:methods for improvingresolution and assessing purity using capillary electrophoresis.Lalwani S,Venditto VJ,Chouai A,Rivera GE,Shaunak S,SimanekEE.Macromolecules2009;42:3152–3161.;Mimicking PAMAMdendrimers with ampholytic,hybrid triazine dendrimers:acomparison of dispersity and stability.Lalwani S,Chouai A,PerezLM,Santiago V,Shaunak S,Simanek EE.Macromolecules2009;42:6723–6732.;Simanek EE,Abdou H,Lalwani S,Lim J,Mintzer M,Venditto VJ,Vittur B.The8year thicket of triazine dendrimers:strategies,targets and applications.Proc.R.Soc.A2010;466(2117);1445–1468。通过用琥珀酸酐处理胺封端的三嗪树状聚体制备具有12个周边羧酸基团的树状聚体。然后使葡糖胺通过酰胺键与其表面的羧酸基团共价结合。然后测试该分子的：-(a)其细胞毒性；和(b)其减少人单核细胞和巨噬细胞产生促炎细胞因子的能力。

如下测定细胞毒性。通过密度梯度离心法从新鲜人血液中分离外周血单核(PBMN)细胞，重新混悬于生长培养基(RPMI1640,20mM L-谷氨酰胺、青霉素[250IU/ml]、链霉素[250μg/ml]和10%无内毒素人血清)。然后使细胞与14cm塑料组织培养板粘附1h。洗涤培养板，用细胞刮棒刮取粘附的单核细胞，将细胞密度调整至10⁶细胞/ml。将200μL这些单核细胞以10⁶细胞/ml的密度在96孔培养板中铺板。将第2代树状聚体葡糖胺(0－800μg/ml)加入到单核细胞中，温育24h。使用MTT测定法评估细胞存活率。

用基于人单核细胞/巨噬细胞的试验测定这种基于三嗪的羧酸封端的树状聚体葡糖胺减少一组促炎细胞因子产生的能力。脂多糖(LPS)用于刺激促炎细胞因子释放。将1ml人单核细胞的等分部分(10⁶细胞/ml)转入24-孔组织培养板，在37°C温育30min。向这些粘附单核细胞中加入50－200μg/ml浓度的无内毒素(即<0.01内毒素单位[EU]/ml)的第2代羧酸三嗪封端的树状聚体葡糖胺，在37°C温育1h。加入25ng/ml的LPS(明尼苏达沙门菌,Sigma.目录号L9764)。仅用LPS处理阳性对照。阴性对照是未处理的细胞或仅用树状聚体处理的细胞。然后将细胞在37°C和5%CO₂维持3h。然后除去培养基，在500μLTri-试剂(Sigma)中裂解细胞，提取RNA。

使用RNAeasy逆转录试剂盒(Qiagen)在20μL具有200－400ng总RNA的反应混合物中进行促炎细胞因子mRNA逆转录。逆转录后，用水按照1：4稀释反应体系，一式三份2μl等分部分用于趋化因子和细胞因子mRNA的实时PCR扩增。使用Jumpstart Sybr Green扩增混合物(Sigma)在Corbett3000Rotorgene进行IL-6、TNF-α、IL-8、MIP-1β和HPRT mRNA的PCR扩增。循环条件是：在95°C活化3min，和以下的40个循环：在94°C变性5秒、58°C退火5秒、在72°C提取8秒和在78C和81°C荧光获取5秒。在每一PCR结束时，进行72°C－95°C的熔点获取。对每一基因而言，通过依次10-倍稀释掺入所有所关注的克隆基因序列的人细胞因子定量质粒生成标准曲线。将结果表示为细胞因子mRNA的绝对拷贝数/100,000个HPRT绝对拷贝。

参比化合物1A–合成1:

使用具有12个周边羧酸基团的单分散第2代三嗪树状聚体。它在达最高测试浓度下无细胞毒性效应，并且不会减少促炎细胞因子TNF-α或MIP-1β(图8)。

使用6当量的葡糖胺/三嗪树状聚体在pH8进行酰胺化反应。在达最高测试浓度下未观察到第2代三嗪树状聚体葡糖胺的细胞毒性效应。未发现促炎细胞因子TNF-α或MIP-1β一致性剂量相关减少。这种树状聚体葡糖胺不具有所需的生物活性(即促炎细胞因子产生减少)(图9)。

参比化合物1B–合成2:

使用具有12个周边羧酸基团的单分散第2代三嗪树状聚体。使用12当量的葡糖胺/三嗪树状聚体在pH8进行酰胺化反应。在达最高测试浓度下未观察到第2代三嗪树状聚体葡糖胺的细胞毒性效应。未发现促炎细胞因子TNF-α或MIP-1β一致性剂量相关减少。这种树状聚体葡糖胺不具有所需的生物活性(即促炎细胞因子产生减少)(图10)。

参比化合物1C–合成3:

使用具有12个周边羧酸基团的单分散第2代三嗪树状聚体。使用极大增量的120当量的葡糖胺/三嗪树状聚体在pH8进行酰胺化反应。在达最高测试浓度下未观察到第2代三嗪树状聚体葡糖胺的细胞毒性效应。未发现促炎细胞因子TNF-α或MIP-1β一致性剂量相关减少。这种树状聚体葡糖胺不具有所需的生物活性(即促炎细胞因子产生减少)(图11)。

参比化合物1D–合成4:

使用具有12个周边羧酸基团的单分散第2代三嗪树状聚体。使用120当量的葡糖胺/三嗪树状聚体、但在pH5进行酰胺化反应，使得：-(i)树状聚体表面葡糖胺载量最大化；和(ii)减少副反应。在达最高测试浓度下未观察到第2代三嗪树状聚体葡糖胺的细胞毒性效应。未发现促炎细胞因子TNF-α或MIP-1β一致性剂量相关减少。这种树状聚体葡糖胺不具有所需的生物活性(即促炎细胞因子产生减少)(图12)。

我们得出结论，尽管我们可以合成无毒性的单分散第2代(即具有12个周边羧酸基团)三嗪树状聚体葡糖胺分子，但是这些分子不会通过来自单核细胞和巨噬细胞的LPS减少促炎细胞因子产生。这意味着单分散树状聚体葡糖胺的所需生物活性必须随以下变化：(a)官能化的周边葡糖胺；(b)树状聚体的代。我们由此进行第3代(即具有24个周边羧酸基团)三嗪树状聚体葡糖胺的合成。

参比化合物2第3代三嗪树状聚体:

分支合成的第3代阴离子型羧酸封端的(即24个周边羧基)三嗪树状聚体的研究：

如上所述合成单分散第3代三嗪树状聚体[Crampton等人2007]。通过用琥珀酸酐处理胺封端的三嗪树状聚体来制备具有24个周边羧酸基团的树状聚体。使葡糖胺与表面羧酸基团共价结合。然后测试该分子的：-(a)其细胞毒性；(b)其减少促炎细胞因子产生的能力。

如下测定分子细胞毒性。通过密度梯度离心法从新鲜人血液中分离外周血单核(PBMN)细胞，重新混悬于生长培养基(RPMI1640,20mM L-谷氨酰胺、青霉素[250IU/ml]、链霉素[250μg/ml]和10%无内毒素人血清)。然后使细胞与14cm塑料组织培养板粘附1h。洗涤培养板，用细胞刮棒刮取粘附的单核细胞，将细胞密度调整至10⁶细胞/ml。将200μL这些单核细胞以10⁶细胞/ml的密度在96孔培养板中铺板。然后将第3代树状聚体葡糖胺(0－400μg/ml)加入到单核细胞中，温育24h。使用MTT测定法评估细胞存活率。

用基于人单核细胞/巨噬细胞的试验测定这种基于三嗪的糖基化树状聚体减少一组促炎细胞因子产生的能力，其中LPS用于刺激促炎细胞因子释放。将1ml人单核细胞的等分部分(10⁶细胞/ml)转入24-孔组织培养板，在37°C温育30min。向这些粘附单核细胞中加入50－200μg/ml浓度的无内毒素(即<0.01EU/ml)的三嗪第3代羧酸封端的树状聚体葡糖胺，在37°C温育1h。加入25ng/ml的LPS(明尼苏达沙门菌,Sigma.目录号L9764)。仅用LPS处理阳性对照。阴性对照是未处理的细胞或仅用树状聚体处理的细胞。然后将细胞在37°C和5%CO₂维持3h。然后除去培养基，在500μL Tri-试剂(Sigma)中裂解细胞，提取RNA。使用Qiagen RT试剂盒进行逆转录。然后使cDNA的等分部分进行用于TNF-α和MIP-1β的定量实时PCR。

参比化合物2A–合成5:

使用具有24个周边羧酸基团的单分散第3代阴离子型三嗪树状聚体。它无细胞毒性并且未发现减少IL-6、TNF-α、IL-8或MIP-1β(图13)。

然后使用导致树状聚体表面有12个葡糖胺的周边载量的葡糖胺进行酰胺化反应(即50%可利用的周边羧酸基团载量)。在达最高测试浓度下未注意到这种单分散第3代羧酸封端的三嗪树状聚体葡糖胺的细胞毒性效应。未发现IL-6、TNF-α、IL-8或MIP-1β的一致性剂量相关减少。这种树状聚体不具有所需的生物活性(即促炎细胞因子产生减少)(图14)。

参比化合物2B–合成6:

使用具有24个周边羧酸基团的单分散第3代三嗪树状聚体。使用导致树状聚体表面有14个葡糖胺的周边载量的葡糖胺进行酰胺化反应(即58%可利用的周边羧酸基团载量)。在达最高测试浓度下未注意到这种单分散第3代三嗪树状聚体葡糖胺的细胞毒性效应。未发现IL-6、TNF-α、IL-8或MIP-1β减少。这种树状聚体不具有所需的生物活性(即促炎细胞因子产生减少)(图15)。

总之，我们发现，尽管我们可以合成具有足够葡糖胺百分比的单分散第2代(即具有12个周边羧酸基团)和单分散第3代(即具有24个周边羧酸基团)的三嗪树状聚体葡糖胺，但是这些单分散分子不具有所需的生物活性(即它们不减少促炎细胞因子产生)。

因此，我们得出结论，树状聚体葡糖胺的所需生物活性必须随以下变化：(a)官能化的周边葡糖胺；(b)树状聚体的代；(c)基于PAMAM的化学在树状聚体自身表面上的周边涂层的绝对要求–基于在先Shaunak的著作，使用基于PAMAM的树状聚体葡糖胺，发现它减少促炎细胞因子产生(Shaunak S,Thomas S,Gianasi E,GodwinA,Jones E,Teo I,Mireskandari K,Luthert P,Duncan R,Patterson S,Khaw P&Brocchini S.Polyvalent dendrimer glucosamine conjugatesprevent scar tissue formation.Nature Biotechnology2004;22:977–985)。我们由此进行了另外的合成研究，其中制备了具有周边羧酸基团的杂化物三嗪PAMAM树状聚体葡糖胺。

因为第2代三嗪树状聚体没有任何结构化学缺陷，且可以易于将其制成千克等级的单分散分子(Chouai A&Simanek EE.Kilogram-scale synthesis of a second-generation dendrimer based on1,3,5-triazine using green and industrially compatible methods with asingle chromatographic step.J.Organic Chemistry2008;73(6):2357–2366)，所以我们使用第2代三嗪树状聚体作为起始分子进行三嗪PAMAM杂化物分子制备。由此设计了制备具有三嗪内芯和PAMAM外壳的杂化物树状聚体的合成策略。

参比化合物3三嗪和PAMAM杂化物树状聚体:

分支合成的具有羧酸封端的共价结合葡糖胺的第0.5代PAMAM外壳的的第2代阴离子型三嗪树状聚体的研究：

参比化合物3A–合成7:

如上所述，分支合成方法用于制备掺入第0.5代PAMAM外壳的第2代阴离子型三嗪树状聚体(Electrophoretic behaviour of anionictriazine and PAMAM dendrimers:methods for improving resolutionand assessing purity using capillary electrophoresis.Lalwani S,Venditto VJ,Chouai A,Rivera GE,Shaunak S,Simanek EE.Macromolecules2009;42:3152-3161.;Mimicking PAMAMdendrimers with ampholytic,hybrid triazine dendrimers:acomparison of dispersity and stability.Lalwani S,Chouai A,PerezLM,Santiago V,Shaunak S,Simanek EE.Macromolecules2009;42:6723–6732)。然后将杂化物树状聚体(152mg)溶于双重去离子水(1.5ml)，用盐酸(HCl)减小pH，从而将来自未反应羧酸钠(COO^-Na⁺)的表面基团转化成反应性羧酸(COO^-H⁺)。这种杂化物树状聚体包含24个反应性COOH基团。将200mg盐酸葡糖胺溶于双重去离子水(4ml)，将pH调整至pH5，将其加入到树状聚体溶液中。在反应过程中用HCl将pH维持在pH5。将缩合试剂EDC(279mg)溶于水(5.6ml)，加入到反应溶液中。在室温搅拌该混合物，注意，反应在环境室温下进行，无需施加外部能源。3h搅拌后，通过转移至透析箱纯化该反应混合物，然后在4°C4次使用改变的水在无内毒素水中进行18h透析。这导致除去未反应的葡糖胺，过量的EDC和反应过程中形成的N-酰基异脲。冷冻干燥终产物。MALDI-MS和1H和13NMR分析显示每个杂化物三嗪-PAMAM树状聚体的分子上有3个葡糖胺分子，得到葡糖胺百分比载量为12.5%。

如下测定分子的细胞毒性。通过密度梯度离心法从新鲜人血液中分离外周血单核(PBMN)细胞，重新混悬于生长培养基(RPMI1640,20mM L-谷氨酰胺、青霉素[250IU/ml]、链霉素[250μg/ml]和10%无内毒素人血清)。然后使单核细胞与14cm塑料组织培养板粘附1h。洗涤培养板，用细胞刮棒刮取粘附的单核细胞，将细胞密度调整至10⁶细胞/ml。将200μL这些单核细胞以10⁶细胞/ml的密度在96孔培养板中铺板。然后将杂化物第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺(0－400ug/ml)加入到单核细胞中，温育24h。使用MTT测定法评估细胞存活率。

使用这种分支合成的具有周边羧酸基团的杂化物第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺在达最高测试浓度下未注意到有细胞毒性效应(图16)。

用基于人单核细胞/巨噬细胞的试验测定这种基于三嗪的树状聚体葡糖胺减少一组促炎细胞因子产生的能力，其中LPS用于刺激促炎细胞因子释放。将1ml人单核细胞的等分部分(10⁶细胞/ml)转入24-孔组织培养板，在37°C温育30min。向这些粘附单核细胞中加入50－200μg/ml浓度的无内毒素(即<0.01EU/ml)第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺，在37°C温育1h。加入25ng/ml的LPS(明尼苏达沙门菌,Sigma.目录号L9764)。仅用LPS处理阳性对照。阴性对照是未处理的细胞或仅用树状聚体处理的细胞。然后将细胞在37°C和5%CO₂维持3h。然后除去培养基，在500μL Tri-试剂(Sigma)中裂解细胞，提取RNA。使用Qiagen RT试剂盒进行逆转录。然后将cDNA的等分部分进行用于IL-6、TNF-α、IL-8和MIP-1β的定量实时PCR。

未发现促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8或MIP-1β的一致性剂量相关减少。这种杂化物第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺不具有所需的生物活性(即促炎细胞因子产生减少)，不过，其12.5%的葡糖胺百分比表面载量与可以减少促炎细胞因子产生的第3.5代PAMAM树状聚体葡糖胺分子的葡糖胺百分比表面载量相同(图16)。

因此，我们得出结论，树状聚体葡糖胺的所需生物活性必须随以下变化：(a)官能化的周边葡糖胺；(b)基于PAMAM的化学在树状聚体自身表面上的较大的外周涂覆（larger peripheral coat）的绝对要求；和(c)较大代大小的树状聚体。我们由此进行了另外的合成研究，其中制备和测试了具有第二层PAMAM的另一种杂化物三嗪PAMAM树状聚体葡糖胺分子。

参比化合物3B–合成8:

通过如上所述的分支方法合成方法合成掺入了第1.5代PAMAM外壳的第2代三嗪阴离子型树状聚体(Chouai A&Simanek EE.Kilogram-scale synthesis of a second-generation dendrimer based on1,3,5-triazine using green and industrially compatible methods with asingle chromatographic step.J.Organic Chemistry2008;73(6):2357-2366)。然后将已知量的树状聚体(100mg)溶于双重去离子水(1ml)，用盐酸(HCl)减小pH，从而将来自不反应性羧酸钠(COO^-Na⁺)的硫酸基团转化成反应性羧酸(COO^-H⁺)。这种树状聚体包含48个羧酸基团。将已知量的盐酸葡糖胺(100mg)溶于双重去离子水(2ml)，将pH调整至pH5，然后加入到树状聚体溶液中。用HCl将pH维持在pH5。将260mg缩合试剂EDC溶于水(5.2ml)，加入到反应溶液中。在室温搅拌该反应混合物。注意，反应可以在环境室温下进行，无需施加外部能源。搅拌3h后，通过转入透析箱，然后在4°C无内毒素的水中进行18h透析纯化该反应混合物，其中4次改变水。这导致除去未反应的葡糖胺、过量EDC和在该反应中形成的N-酰基异脲。冷冻干燥终产物。终产物的毛细管电泳、MALDI-MS和1H和13NMR分析显示带有周边羧酸基团的每个杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM树状聚体葡糖胺上存在9个葡糖胺分子，得到的葡糖胺载量百分比为18.75%。将冷冻干燥的产物贮存在暗处和密闭条件下。

使用填充多粘菌素B珠的柱从化合物中除去内毒素。然后使用鲎阿米巴样细胞溶解物测定法测定内毒素水平。使用其内毒素水平<0.1EU/ml的化合物得到下述全部生物学数据。

使用达最高测试浓度的这种杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM羧酸封端的树状聚体葡糖胺未注意到细胞毒性效应(图17)。

在100μg/ml浓度的这种杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM羧酸封端的树状聚体葡糖胺的存在下发现促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8或MIP-1β显著减少(图17)。

尽管我们目前确立，分支合成的带有9个表面葡糖胺的杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM羧酸封端的树状聚体葡糖胺具有所需的生物活性且无毒性，但是其分析化学分析(毛细管电泳、MALDI-MS&NMR)显示它是几种密切相关的分子的混合物。这意味着它不适合于药物应用。

作为我们分支合成具有期望的生物活性的单分散的羧酸封端的树状聚体葡糖胺的多次失败的结果，我们对生物活性分子进行了详细的分子模型化研究并且将它们与无生物活性分子进行了比较。我们的目的在于确定关键的化学特征(例如大小、形状、密度、树状聚体芯的灵活性、树状聚体周边的灵活性、表面电荷分布、疏水性、亲水性、表面葡糖胺载量)，它们是合成具有周边羧酸基团的单分散的树状聚体葡糖胺必不可少的，所述的周边羧酸基团可以：-(a)是无毒性的；(b)减少来自单核细胞和巨噬细胞和树突细胞的LPS的促炎细胞因子产生；(c)是无细胞毒性、但可以减少促炎细胞因子的树状聚体葡糖胺分子的最小大小的外形尺寸；(d)适合于作为药物。

模型化研究

C.W von der Leith(2002)对15个糖树状聚体在其芯部分、空间群特征和末端碳水化合物单元类型方面进行了详细描述的几何和构象分析(Von der Lieth-W,Frank M,Lindhorst TK.Molecular dynamicssimulations of glycoclusters and glycodendrimers.Reviews inMolecular Biotechnology2002;90:311–337)。他们证实可进入的构象空间强烈地依赖于：-(1)芯树状聚体的结构特征；(2)其空间群部分；(3)末端糖的类型。他们还得出结论，较小的糖树状聚体的形状受空间群的化学构成和芯结构的几何学控制。相反，随末端糖单元数量的增加，根据进入的构象空间的形状逐步确定后者的相互作用。此外，在分子的空间群部分中包含芳香亚结构的群体的构象特性不同于不展示芳香亚结构的群体的构象特性。

在分子动态模拟中包含外在的溶剂分子是产生糖树状聚体的现实3-维结构绝对必不可少的。基于PAMAM的糖树状聚体与基于其他糖的糖树状聚体比较也使得如下情况更为明显：芯的几何性质是可进入构象空间的总体形状的重要决定因素(Barata TS,Shaunak S,Teo I,Zloh M,Brocchini S.Structural studies of biologically activeglycosylated polyamidoamine(PAMAM)dendrimers.J Mol Model.Epub ahead of print:doi10.1007/s00894-010-0907-1;Barata TS,Brocchini S,Teo I,Shaunak S,Zloh M.From sequence to3Dstructure of hyperbranched molecules:application to surfacemodified PAMAM dendrimers.J Mol Model.Epub ahead of print:doi10.1007/s00894-011-0966-y;Barata TS,Teo I,Brocchini S,Zloh M,Shaunak S.Partially glycosylated dendrimers block MD-2andprevent TLR4-MD-2-LPS complex mediated cytokine responses.PLoSComput Biol2011;7(6):e1002095.doi:10.1371/journal.pcbi.1002095)。

尽管糖树状聚体几乎始终使用长间隔臂设计，但是期望显著地降低这些间隔臂的灵活性(通过减小其长度)，因为仅那些确实满足多价受体几何要求的配体可增加对受体-配体相互作用的结合亲和力(Vonder Lieth-W,Frank M,Lindhorst TK.Molecular dynamicssimulations of glycoclusters and glycodendrimers.Reviews inMolecular Biotechnology2002;90:311–337)。

通过沿带有隐含溶剂的2ns分子动态模拟轨道测定每个分子的均方根偏差(RMSD)研究灵活性和构象差异。具有高RMSD值的外形意味着分子是灵活性的，且在模拟过程中其构象恒定改变。模型化的树状聚体葡糖胺结构显示可变程度的灵活性。沿带有隐含溶剂的2ns分子动态模拟轨道进行的树状聚体表面特性分析显示生物活性第3.5代PAMAM阴离子型树状聚体葡糖胺(17埃(A))和生物活性杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM树状聚体葡糖胺(12A)的RMSD相似。这些RMSD值明显大于无生物活性第3代阴离子型三嗪树状聚体葡糖胺(7A)和杂化物第2代阴离子型三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺(7A)的RMSD值。类似的观察结果适用于其表面积的研究；PAMAM第3.5代树状聚体葡糖胺(11,500平方埃(A²))；杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM树状聚体葡糖胺(9,000A²)；三嗪第3代葡糖胺(4,000A²)；杂化物第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺(4,000A²)。类似的观察结果适用于其极表面积的研究；PAMAM第3.5代树状聚体葡糖胺(8,000A²)；杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM树状聚体葡糖胺(6,000A²)；三嗪第3代葡糖胺(2,500A²)；杂化物第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺(2,500A²)。还进行了PAMAM树状聚体葡糖胺、三嗪树状聚体葡糖胺和杂化物三嗪PAMAM树状聚体葡糖胺分子的亲水性和疏水性表面的模型化(图18－29)。PAMAM第3.5代树状聚体葡糖胺的表面主要是亲水性的(图21)。发现无生物活性杂化物三嗪PAMAM树状聚体葡糖胺分子具有多个暴露的疏水性表面。这些观察结果使得我们得出结论，树状聚体葡糖胺的表面亲水性是LPS-MD2-TLR4细胞表面受体复合物的树状聚体葡糖胺的部分拮抗剂活性的重要性属性。这些模型化研究能够使我们确定倾向于表面亲水性对制备最小和最简单树状聚体葡糖胺分子的相对贡献，所述的树状聚体葡糖胺分子可以是生物活性的；即它可以减少促炎细胞因子应答。

还使用前线分子轨道理论，因为它推定了如下观察结果：反应剂的HOMO(最高占据分子轨道)与LUMO(最低分子占据轨道)之间的相互作用提供良好的针对反应性的近似性。因此，反应的方向应倾向于HOMO与LUMO轨道之间的较大重叠。发现当1个葡糖胺分子存在时，HOMO始终位于直接相对于树状聚体分支的方向上。这意味着第一和能量最有利的树状聚体葡糖胺分子可以形成，它们具有4个葡糖胺分子均等地分布于树状聚体表面上。这一过程是快速的，随后形成树状聚体葡糖胺分子，其具有8个葡糖胺分子，它们均等地分布于树状聚体表面上。考虑到电子和空间效应，发现在第3.5代PAMAM树状聚体上添加8个葡糖胺分子是可以形成的能量和空间最有利的分子。这种分子模型化观察结果与8个葡糖胺分子存在于树状聚体表面上的分析化学(即实验观察结果)一致。

低代数聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺分子的模型化研究

基于上述提出的理论，氧芯第3代聚丙基醚亚胺树状聚体是最小的聚丙基醚亚胺树状聚体，能够使用所述基于EDC的共轭法使它们被2个葡糖胺残基糖基化(图30和31)。由此进行分子模型化研究以确定它是否具有关键的化学特征(例如大小、形状、密度、树状聚体芯的灵活性、树状聚体周边的灵活性、表面电荷分布、疏水性、亲水性、表面葡糖胺载量)，这些是减少来自单核细胞和巨噬细胞和树突细胞的LPS的促炎细胞因子产生必不可少的。

首先，这些模型化研究显示，聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺在结构上与PAMAM树状聚体葡糖胺或三嗪树状聚体葡糖胺或杂化物三嗪PAMAM树状聚体葡糖胺极为不同。其次，它们显示聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺是简单的分子结构。第三，它们显示聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺的表面是完全亲水性的。来自这些分子模型化研究的重要结论在于在聚丙基醚亚胺树状聚体芯的附近不存在位阻。这种观察结果与使用三嗪树状聚体葡糖胺和杂化物第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺所进行的观察结果相反。

沿带有隐含溶剂的2ns分子动态模拟轨道进行的聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺表面特性分析显示其均方根偏差(RMSD)是12A。这使得它与生物活性杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM树状聚体葡糖胺(12A)极为相似。这反映出与PAMAM树状聚体或三嗪树状聚体相比聚丙基醚亚胺树状聚体芯远低的紧密性。这使得聚丙基醚亚胺树状聚体成为更具有灵活性的分子。此外，所有其周边基团都面向外，因为不存在疏水性芯意味着周边羧酸基团不存在位阻(图32和33)。

聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺的表面积远小于仅在3000平方埃下预计的值。这使得与已经研究的两种树状聚体葡糖胺分子相比并不有利：PAMAM第3.5代树状聚体葡糖胺(11,500A²；和杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM树状聚体葡糖胺(9,000A²)。这一结果表明在灵活性和构象方面，第3代阴离子型羧酸封端的(具有16个羧酸基团)树状聚体葡糖胺(12.5%载量)可能无法显示减少促炎细胞因子产生所需的生物特性。

实施例1:

第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺的研究:

实施例1A–合成9:

尽管分子模型化研究显示第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺(12.5%载量)可能无生物活性，但是我们进行了其化学合成及其生物学测试。第3代羧酸封端的聚丙基醚亚胺树状聚体的分支合成在先由Krishna TR&Jayaraman N.Synthesis of poly(propyl etherimine)dendrimers and evaluation of their cytotoxic properties.J.Organic Chemistry2003;68(25):9694-9704描述。

将50mg单分散的第3代聚丙基醚亚胺树状聚体(MWt2,667)溶于0.5ml水。将50mg葡糖胺溶于1mg/ml水，加入到树状聚体中，将pH调整至pH5。将EDC(208mg)溶于4.1ml水，加入到该混合物中，将pH调整至5.0。将该反应体系在室温搅拌3h，持续监测pH，将其调整至pH5.0。3h后，将该反应体系转入2,000MWt截止值透析箱，然后3次使用改变的水透析24h。在合成反应和透析中使用的全部的水都是无内毒素的。冻干透析的反应体系，再以50mg/ml混悬于水，使用鲎测定法证实无内毒素，<0.1EU/ml。

MALDI-MS和NMR研究显示单分散的第3代聚丙基醚亚胺树状聚体(具有16个周边羧酸基团)具有2个葡糖胺分子/树状聚体的载量(实测值MWt3,061；理论计算值3,061)。得到葡糖胺载量百分比为12.5%；即该树状聚体的16个周边羧酸基团上有2个葡糖胺分子。

实施例1B(可选方法)

为了准备无内毒素的溶液和玻璃器皿，将全部玻璃器皿和磁性蚤在123°C进行2次15分钟高压灭菌。使用无菌和无内毒素的一次性塑料组织培养级50ml通用试管进行合成。全部其他一次性塑料移液管、通用器皿和注射器均为经过检验无内毒素的(即内毒素<0.01内毒素单位(EU)/ml)。使用无内毒素的注射用水。这意味着内毒素污染从部分糖基化合成反应开始就被降至最低。为了消除所用pH探头的任何细菌污染，首先将其浸入1N HCl溶液15分钟，然后使用，然后用无内毒素的水洗涤4次，以除去任何残留的酸。

将150mg第3代聚丙基醚亚胺树状聚体溶于1.5ml无菌无内毒素的水中，得到100mg/ml浓度。将磁性蚤放入50ml Falcon试管，在磁性搅拌板上以低速搅拌。将来自Sigma UK(目录号G4875)的150mg D-葡糖胺盐酸盐溶于3ml无菌水，得到50mg/ml浓度。然后将其加入到溶解的树状聚体中。这与树状聚体上0.78个葡糖胺分子/周边羧酸基团相当。使用1N NaOH将得到的溶液的pH(相当的酸性)重新调整至5.0。然后将334mg的1-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI,Sigma UK)溶于6.7ml无菌水，得到50mg/ml浓度。这与树状聚体上1.94个EDCI分子/周边羧酸基团相当。然后将EDCI溶液即刻加入到包含树状聚体和葡糖胺的溶液中。用1N HCl将pH重新调整至5.0。通过在3小时反应过程中每隔15–30分钟添加一次1N HCl将该反应溶液的pH重新调整至5.0。最终反应体积约为12-12.5ml。

为了随后进行的透析步骤，将全部玻璃烧杯和磁性搅棒在123°C进行2次15分钟高压灭菌。使用无内毒素的水(Baxter Healthcare)。随后进行两种方法之一。第一种方法使用具有MWt截止值1kDa和10ml体积的Float-a-Lyzer透析箱(Spectrapor)。在这种情况中，使用无内毒素的水再水化透析试管，填充溶液，然后在4°C在1L无内毒素水中透析(同时搅拌)1小时。随后的全部透析在4°C进行。然后替换水，持续透析过夜。第二天，替换水，再持续透析24小时；即以3.5h间隔再进行4次水的改变，并且包括再透析过夜。总之，这意味着在4°C进行42小时透析与7次改变水。在第二种透析方法中，使用具有MWt截止值2kDa和3-12ml体积的Slide-a-Lyser透析箱(Pierce)。使用无内毒素水再水化透析箱，填充溶液，然后在4°C在1L无内毒素水中透析(同时搅拌)1小时。随后的全部透析在4°C进行。然后替换水，持续透析过夜。第二天，替换水，再持续透析24小时，同时以3.5h间隔再进行4次水的改变，并且包括再透析过夜。总之，这意味着在4°C进行42小时透析与7次改变水。然后从箱中用针头和注射器取出透析液，通过0.2μm无菌滤器过滤，放入预称重的无菌50ml Falcon试管。然后在-80°C冷冻至少1小时。用石蜡膜覆盖包含冷冻树状聚体葡糖胺的50ml试管开口，刺入针头。然后将试管置于冷冻干燥器(预先运转30min)内，使其内含物保持冷冻48小时。

使用鲎阿米巴细胞测定法证实冻干的产物是无内毒素的，<0.1EU/ml。当树状聚体葡糖胺是吸湿性的时，将其贮存在小的密闭容器内和氩气气氛中和4°C下，用铝箔包装。H-NMR和C-NMR和MALDI-MS研究显示第3代聚丙基醚亚胺树状聚体(具有16个周边羧酸基团)具有2个葡糖胺分子/树状聚体的载量。得到葡糖胺载量的百分比为12.5%；即该树状聚体的16个周边羧酸基团上有2个葡糖胺分子。此外，不存在产物被丙烯腈、丙烯酸、游离葡糖胺或脲的残留的小分子污染的情况。

实施例2:

使用第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺进行的生物 学研究:

实施例2A:

如下测定细胞毒性。通过密度梯度离心法从新鲜的人血液中分离外周血单核细胞，重新混悬于生长培养基(RPMI1640,20mM L-谷氨酰胺、青霉素[250IU/ml]、链霉素[250μg/ml]和10%无内毒素人血清)。然后使细胞与塑料组织培养板粘附1h。洗涤培养板，用细胞刮棒刮取粘附的单核细胞，将细胞密度调整至10⁶细胞/ml。将200μL这些单核细胞以10⁶细胞/ml的密度在96孔培养板中铺板。将第3代聚丙基醚亚胺树状聚体(0－400μg/ml)加入到单核细胞中，温育24h。使用MTT测定法评估细胞存活率。在达最高测试浓度下未发现第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体的细胞毒性效应。然后将第3代聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺(0－400μL/ml)加入到单核细胞中，温育24h。使用MTT测定法评估细胞存活率。在达最高测试浓度下未发现第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺的细胞毒性效应(图34)。

实施例2B:

在基于人单核细胞/巨噬细胞的试验中使用用于刺激促炎细胞因子释放的LPS测定第3代聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺减少促炎细胞因子产生的能力。

将1ml人单核细胞的等分部分(10⁶细胞/ml)转入24-孔组织培养板，在37°C温育30min。向这些粘附单核细胞中加入50－200μg/ml浓度的无内毒素的(即<0.01EU/ml)第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺，在37°C温育1h。加入25ng/ml的LPS(明尼苏达沙门菌,Sigma.目录号L9764)。仅用LPS处理阳性对照，阴性对照是未处理的细胞或仅与树状聚体一起温育的细胞。然后将细胞在37°C和5%CO₂维持3h。然后除去培养基，在500μL Tri-试剂(Sigma)中裂解细胞，提取RNA。使用Qiagen RT试剂盒进行逆转录。然后将cDNA的等分部分进行用于一组细胞因子的定量实时PCR。在100μg/ml浓度的第3代阴离子型聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺的存在下观察到促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8和MIP-1β合成显著减少。此外，未观察到抗炎细胞因子IL-10和干扰素-β中的改变(图34和35)。这是令人惊奇和出人意料的生物学结果。

实施例2C:

使用第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺进行的详细 生物学研究:

使用100μg/ml剂量的第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺与沙门氏菌属LPS观察到促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8和MIP-1β的产生减少是令人意外的结果，因为所有我们的分子模型化研究都表明第3代聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺(仅具有16个可利用的羧酸与葡糖胺共轭)：-(1)是过小的分子；(2)它不具有正确的物理-化学特征以起到MD2-TLR4-LPS介导的促炎细胞因子应答的有效拮抗剂的作用。

为了使用第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺进一步验证上述得到的生物学结果，进行另外的生物学实验。

实施例2D:

用志贺氏菌属野生型LPS和分子修饰的waaL突变体志贺氏菌属 LPS攻击后第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺对促炎细 胞因子产生的抑制作用试验:

使野生型M90和志贺氏菌属突变体(waaL–不具有O-抗原糖基化模式-参见图36且还参见West NP,Sansonetti P,Mounier J,ExleyRM,Parsot C,Guadagnini S,Prevost MC,Prochnicka-Chalufour A,Delepierre M,Tanguy M,Tang CM.Optimization of virulencefunctions through glucosylation of Shigella LPS.Science2005；307:1313–1317)增殖，通过酚提取提取其LPS。LPS来源于：-(1)野生型志贺氏菌属M90；(2)以25ng/ml加入waaL。

用分离自野生型和waaL志贺氏菌属突变体的LPS处理人单核细胞诱导相似水平的促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8或MIP-1β的表达。用25－100μg/ml的第3代阴离子型聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺预处理单核细胞导致在使用志贺氏菌属野生型LPS时(图37)和还在使用志贺氏菌属waaL突变体LPS时(图37)所有这些促炎细胞因子剂量依赖性减少。使用25μg/ml第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺观察到促炎细胞因子适度减少，其中在100μg/ml第3代阴离子型聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺剂量下观察到最大效应。

实施例2E:

家兔感染野生型志贺氏菌属感染攻击后，G3.5聚酰氨基胺树状聚 体葡糖胺和G3聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺对促炎细胞因子产生的 抑制作用试验:

如上所述对家兔实施生成回肠袢囊的手术(Perdomo等人1994)。已经证实这种家兔模型对感染性腹泻中的粘膜炎症和细菌侵害研究是非常重要的。志贺氏菌病(和沙门氏菌属的伤寒)导致上皮连接的淋巴样滤泡中的炎症改变；即派尔结(Perdomo OJ,Cavaillon JM,HuerreM,Ohayon H,Gounon P,Sansonetti PJ.Acute inflammation causesepithelial invasion和mucosal destruction in experimental shigellosis.J Exp Med.1994；180:1307-1319.；Sansonetti PJ,Arondel J,Cavaillon JM,Huerre SM.Role of interleukin-1in the pathogenesis ofexperimental shigellosis.J Clinical Investigation1995；96:884–892)。局部性、但随后的过度的IL-6和TNF-α介导的促炎细胞因子应答导致肠上皮破坏，因为：-(1)分离的回肠袢腔中生物倍增；(2)严重的宿主介导的促炎应答发生；(3)粘膜屏障受损；和(4)细菌侵害通过肠连接的淋巴组织发生(即派尔结)。这与如下浸润相关：-(a)分化成巨噬细胞的血液衍生的单核细胞；和(b)中性白细胞。这种基于家兔的回肠袢模型中的炎症改变直接依赖于存在的志贺氏菌属LPS和大量进入的血液单核细胞产生IL-6和TNF-α。

为了进行这些实验，使野生型M90弗氏志贺菌细菌生长在肉汤中，在仍然处于指数生长期中收集，稀释得到2x10⁷细菌/ml浓度。用2.5mg第3.5代聚酰氨基胺(PAMAM)树状聚体葡糖胺处理包含派尔结的家兔回肠袢，用2.5mg第3.5代聚酰氨基胺(PAMAM)树状聚体处理对照袢。给予在1ml水的体积中这些分子。然后将10⁷M90弗氏志贺菌细菌注入每一回肠袢。封闭腹部，将家兔放置16h。然后处死家兔，采集回肠袢和派尔结样品。将组织即刻浸入2ml TriReagent，使用Polytron匀化器匀化1min，提取RNA用于促炎细胞因子的基于定量实时RT-PCR的研究。

当将树状聚体葡糖胺给药入回肠袢时，未观察到不良反应。在这些实验中和使用野生型弗氏志贺菌(M90T菌株；10⁷微生物/袢)，证实：-(1)树状聚体、PAMAM树状聚体葡糖胺在给药入回肠袢时对弗氏志贺菌都没有抗微生物作用；(2)在树状聚体葡糖胺口服给药入肠腔后可以实现显著和治疗有益性的作用；(3)未观察到临床毒性；(4)PAMAM树状聚体葡糖胺减少了功能性组织损伤，正如根据志贺氏菌属感染过程中发生的血性腹泻体积减少90%所确定的；(5)组织-病理学研究显示仅接受树状聚体的感染动物在肠壁和肠腔中存在显著的组织促炎细胞浸润、淋巴样滤泡水肿(即派尔结)、与淋巴样滤泡连接的上皮过度破坏和炎症、血液浸润、膨胀、淋巴样滤泡(即派尔结)之间的绒毛缩短和破坏。相反，组织-病理学发现在树状聚体葡糖胺口服给药入肠腔治疗的感染动物中十分不同，即在粘膜绒毛和派尔结滤泡中的形态改变最小且存在基于组织的炎症细胞浸润不会导致上皮破裂；(6)促炎细胞因子产生显著减少，正如根据IL-6产生减少1,000-倍、IL-8产生减少100-倍和TNF-α产生减少100-倍所证实的。重要的是，对抗炎细胞因子IL-10而言，没有差异。就树突细胞成熟介体–干扰素-β–而言，也没有差异。就上皮细胞抗微生物肽β-防卫素而言，没有差异。这些基于动物模型的结果显示树状聚体葡糖胺甚至在这些实验过程中不共同给予抗生素时也基本上可以改变肠感染过程。

使用本发明的G3聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺重复上述实验。如上所述对家兔实施生成回肠袢囊的手术。为了进行这些实验，使野生型M90弗氏志贺菌细菌生长在肉汤中，在仍然处于指数生长期中收集，稀释得到2x10⁷细菌/ml浓度。用0.5mg G3聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺/袢处理包含派尔结的家兔回肠袢，用注射用水处理对照袢。在0.5ml水的体积中给予这些分子。然后将10⁷M90弗氏志贺菌细菌注入每一回肠袢。封闭腹部，将家兔放置16h。然后处死家兔，采集回肠袢和派尔结样品。将组织即刻浸入2ml TriReagent，使用Polytron匀化器匀化1min，提取RNA用于促炎细胞因子的基于定量实时RT-PCR的研究。

当将树状聚体葡糖胺给药入回肠袢时，未观察到不良反应。在这些实验中和使用野生型弗氏志贺菌(M90T菌株；10⁷微生物/袢)，证实：-(1)聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺在给药入回肠袢时对弗氏志贺菌没有抗微生物作用；(2)在聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺局部给药入肠腔后可以实现显著和治疗有益性的作用；(3)未观察到临床毒性；(4)聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺减少了功能性组织损伤，正如根据志贺氏菌属感染过程中发生的血性腹泻体积减少90%所确定的；(5)组织-病理学研究显示感染的未治疗的动物在肠壁和肠腔中存在显著的组织促炎细胞浸润、淋巴样滤泡水肿(即派尔结)、与淋巴样滤泡连接的上皮过度破坏和炎症、血液浸润、膨胀、淋巴样滤泡(即派尔结)之间的绒毛缩短和破坏。相反，使用视觉检查的感染并且用肠腔内给予G3 聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺的动物宏观发现组织-病理学发现十分 不同，即肠粘膜和淋巴样滤泡正常，无与感染相关的损害的证据；(6) 促炎细胞因子产生显著减少，正如根据IL-6产生减少260-倍和IL-8 产生减少55-倍所证实的。重要的是，对抗炎细胞因子IL-10而言，没 有差异。这些基于动物模型的结果显示树状聚体葡糖胺甚至在实验过程中不共同给予抗生素时也基本上可以改变肠感染过程。

实施例2F:

用LPS、活大肠杆菌细菌、活Klebsiella aeruginosa细菌、活金 黄色葡萄球菌细菌、活粪肠球菌细菌和活铜绿假单胞菌细菌攻击后， 第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺对促炎细胞因子产生 的抑制作用试验:

将1ml人单核细胞的等分部分(10⁶细胞/ml)转入24-孔组织培养板，在37°C温育30min。向这些粘附单核细胞中加入50－200μg/ml浓度的无内毒素的树状聚体葡糖胺，在37°C温育1h。加入来自过夜细菌培养物的活大肠杆菌、Klebsiella aeruginosa、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和铜绿假单胞菌，以10感染细菌/单核细胞(总体积50μL)的感染复数分离培养板的单核细胞，以780g离心7min，使细菌与单核细胞之间的接触最大化。然后将细胞维持在37°C与5%CO₂1h。然后加入庆大霉素(100μg/ml)，将组织培养板再温育2h。然后除去培养基，在500μL Tri-试剂(Sigma)中裂解细胞，提取RNA。使用QiagenRT试剂盒进行逆转录。然后将cDNA的等分部分进行用于促炎细胞因子的定量实时mRNA PCR。

在100μg/ml浓度的第3代聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体葡糖胺(12.5%载量)分子的存在下观察到促炎细胞因子IL-6(图39)、TNF-α(图40)和MIP-1β(图41)合成大量减少。

实施例3:

G3聚丙基醚亚胺羧酸封端的树状聚体6-硫酸葡糖胺的研究:

为了准备无内毒素的溶液和玻璃器皿，将全部玻璃器皿和磁性蚤在123°C进行2次15分钟高压灭菌。使用无菌和无内毒素的一次性塑料组织培养级50ml通用试管进行合成。全部其他一次性塑料移液管、通用器皿和注射器均为经过检验无内毒素的(即内毒素<0.01内毒素单位(EU)/ml)。使用无内毒素的注射用水。这意味着内毒素污染从部分糖基化合成反应一开始就被降至最低。为了消除所用pH探头的任何细菌污染，首先在使用前将其浸入1N HCl溶液15分钟，然后用无内毒素洗涤4次，以除去任何残留的酸。

将150mg第3代聚丙基醚亚胺树状聚体(即具有16个周边羧酸基团)溶于1.5ml无菌无内毒素水，得到100mg/ml浓度。将磁性蚤放入50ml Falcon试管，在磁性搅拌板上以低速搅拌。将来自Sigma UK(目录号G8641)的150mg6-硫酸D-葡糖胺溶于3ml无菌水，得到50mg/ml浓度。然后将其加入到溶解的树状聚体中。这与树状聚体上0.78个6-硫酸葡糖胺分子/周边羧酸基团相当。使用1N NaOH将得到的溶液的pH(相当的酸性)重新调整至5.0。然后将334mg1-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI,Sigma UK)溶于6.7ml无菌水，得到50mg/ml浓度。这与树状聚体上1.94个EDCI分子/周边羧酸基团相当。然后将EDCI溶液即刻加入到包含树状聚体和6-硫酸葡糖胺的溶液中。用1N HCl将pH重新调整至5.0。通过在3小时反应过程中每隔15–30分钟添加一次1N HCl将该反应溶液的pH重新调整至5.0。最终反应体积约为12-12.5ml。

为了随后进行的透析步骤。将全部玻璃烧杯和磁性搅棒在123°C进行2次15分钟高压灭菌。使用无内毒素的水(Baxter Healthcare)。使用具有MWt截止值2kDa和3-12ml体积的Slide-a-lyser透析箱(Pierce)。使用无内毒素的水再水化透析箱，填充溶液，然后在4°C在1L无内毒素水中透析(同时搅拌)1小时。随后的全部透析在4°C进行。然后替换水，持续透析过夜。第二天，替换水，再持续透析24小时，同时以3.5h间隔再进行4次水的改变，并且包括再透析过夜。总之，这意味着在4°C进行42小时透析与7次改变水。然后从箱中用针头和注射器取出透析液，通过0.2μm无菌滤器过滤，放入预称重的无菌50ml Falcon试管。然后在-80°C冷冻至少1小时。用石蜡膜覆盖包含冷冻树状聚体6-硫酸葡糖胺的50ml试管开口，刺入针头。然后将试管置于冷冻干燥器(预先运转30min)内，使其内含物保持冷冻48小时。

使用鲎阿米巴细胞测定法证实冻干的产物是无内毒素的，<0.06EU/ml。当树状聚体6-硫酸葡糖胺是吸湿性的时，将其贮存在小的密闭容器内和氩气气氛中和4°C下，用铝箔包装。H-NMR和C-NMR和MALDI-MS研究显示第3代聚丙基醚亚胺树状聚体(具有16个周边羧酸基团)具有2或3个葡糖胺分子/树状聚体的载量。此外，不存在产物被丙烯腈、丙烯酸、游离葡糖胺或脲的残留的小分子污染的情况。

首先测试这种分子：-(a)其细胞毒性；(b)其减少促炎细胞因子产生的能力。如下测定这种分子的细胞毒性。通过密度梯度离心法从新鲜的人血液中分离外周血单核(PBMN)细胞，重新混悬于生长培养基(RPMI1640,20mM L-谷氨酰胺、青霉素[250IU/ml]、链霉素[250μg/ml]和10%无内毒素人血清)。然后使细胞与14cm塑料组织培养板粘附1h。洗涤培养板，用细胞刮棒刮取粘附的单核细胞，将细胞密度调整至10⁶细胞/ml。将200μL这些单核细胞以10⁶细胞/ml的密度在96孔培养板中铺板。将第3代树状聚体6-硫酸葡糖胺(0－400μg/ml)加入到单核细胞中，温育24h。使用MTT测定法评估细胞存活率。

在基于人单核细胞/巨噬细胞的测定法中使用用于刺激促炎细胞因子释放的LPS测定第3代树状聚体6-硫酸葡糖胺减少一组促炎细胞因子产生的能力。将1ml人单核细胞的等分部分(10⁶细胞/ml)转入24-孔组织培养板，在37°C温育30min。向这些粘附单核细胞中加入50－200μg/ml浓度的无内毒素(即<0.06EU/ml)第3代树状聚体6-硫酸葡糖胺，在37°C温育1h。加入25ng/ml的LPS(明尼苏达沙门菌,Sigma.目录号L9764)。仅用LPS处理阳性对照，阴性对照是未处理的细胞。然后将细胞在37°C和5%CO₂维持3h。然后除去培养基，在500μL Tri-试剂(Sigma)中裂解细胞，提取RNA。使用Qiagen RT试剂盒进行逆转录。然后将cDNA的等分部分进行用于TNF-α和MIP-1β的定量实时PCR。

在MTT测定中这种第3代树状聚体6-硫酸葡糖胺在测试浓度下对单核细胞无细胞毒性。它不减少TNF-α细胞因子产生并且不减少MIP-1β趋化因子产生(图56)。

使用用50－150μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺6-硫酸预处理1h、然后用25ng/ml沙门氏菌属LPS攻击的10⁶人单核细胞在24-孔培养板中测定G3聚丙基醚亚胺树状聚体6-硫酸葡糖胺的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照组比较时，第3代聚丙基醚亚胺树状聚体6-硫酸葡糖胺不会导致促炎细胞因子TNF-α或促炎趋化因子MIP-1β减少。

图1:示例显示对激动剂(脂多糖[LPS]))与拮抗剂(树状聚体葡糖胺)之间的细胞表面Toll-样受体4(TLR4)的竞争。MD2是蛋白质且R1、R2、R3和R4是酰基链。

图2:第3.5代阴离子型羧酸封端的(即64个周边羧酸基团)PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有12.5%葡糖胺表面载量(即8个葡糖胺分子)与树状聚体与葡糖胺之间的0长度酰胺键。该葡糖胺分子均匀地间隔排列在树状聚体的表面上，正如每个黑色星所示例的。每个弧形物(n=8)表示共价连接葡糖胺分子之一的8个羧酸基团。这种分析化学观察结果与使用前线分子轨道理论进行的较高占据分子轨道和最低占据分子轨道计算一致。就第3.5代阴离子型羧酸封端的(即64个周边羧酸基团)PAMAM树状聚体而言，每个葡糖胺的递增添加以能量有利的方式进行，直到8个葡糖胺分子均匀地连接可利用的64个周边羧酸基团的8个为止，因此，较高占据分子轨道能量值快速地对任意另外的葡糖胺分子添加变成不利的。这表明树状聚体葡糖胺的分支合成方法导致在第3.5代阴离子型羧酸封端的PAMAM树状聚体的64个羧酸基团上添加8个葡糖胺分子是空间和能量最优的。这等同于1个葡糖胺分子/8个周边羧酸基团；它等于树状聚体表面上葡糖胺的表面载量为12.5%。

图3:使用用25－200μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶人单核细胞测定第3.5代PAMAM树状聚体葡糖胺在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3.5代PAMAM树状聚体葡糖胺导致如下的促炎细胞因子减少：-在200μg/ml，IL-6减少830-倍，TNF-α减少110-倍，IL-8减少10-倍，MIP-1β减少55-倍。相反，抗炎细胞因子IL-10和干扰素-β没有改变。

图4:使用用25－200μg/ml无内毒素的树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶人树突细胞测定第3.5代PAMAM树状聚体葡糖胺在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3.5代PAMAM树状聚体葡糖胺导致如下的促炎细胞因子减少：在200μg/ml，IL-6减少850-倍，TNF-α减少90-倍，IL-8减少600-倍，MIP-1β减少70-倍。相反，抗炎细胞因子IL-10和干扰素-β没有改变。

图5:使用用25－200μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶人树突细胞测定第3.5代PAMAM树状聚体葡糖胺在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3.5代PAMAM树状聚体葡糖胺导致如下的促炎细胞因子减少：在200μg/ml，IL-6减少125倍，TNF-α减少13-倍，IL-8减少175-倍，MIP-1β减少30-倍。相反，抗炎细胞因子IL-10和干扰素-β没有改变。

图6:具有PDB进入2E56的展示为其静电势表面的人MD-2的晶体结构。(A)残基Lys91、Arg96、Tyr102和Ser1187与部分糖基化树状聚体形成静电相互作用。方形黑色块表示MD-2的“右上”方向；(B)人MD2以其“右上”方向显示。残基Ser98、Tyr102、Arg106、Lys109、Thr112、Asn114和Thr116与部分糖基化树状聚体形成静电相互作用。将这些位于人MD2疏水袋入口边缘的残基标记在图中；(C)部分糖基化树状聚体表面与人MD2表面的相互作用。以红色显示的残基距离人MD-2表面<

。葡糖胺残基以球形和棒状构造显示，显示的是人MD-2袋的侧面图；(D)部分糖基化树状聚体表面与人MD2表面的相互作用。以红色显示的残基距离人MD2表面<

。葡糖胺残基以球形和棒状构造显示，显示的是人MD2袋的前面图。

图7:以两个方向显示树状聚体葡糖胺在结合MD2时的总体结构。当以这种方式结合MD2(暗色)时，树状聚体葡糖胺(亮色)可以作为TLR4-MD2-LPS复合物的部分拮抗剂起作用。

图8:使用0－800μg/ml无内毒素第2代三嗪羧酸封端的树状聚体通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用400－1,000μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定第2代三嗪羧酸封端的树状聚体在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第2代三嗪羧酸封端的树状聚体对促炎细胞因子例如TNF-α和MIP-1β没有显著作用。

图9:使用0－800μg/ml无内毒素第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用6当量的葡糖胺在pH8合成)通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用400－1,000μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用6当量的葡糖胺在pH8合成)在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用6当量的葡糖胺在pH8合成)对促炎细胞因子例如TNF-α和MIP-1β没有显著作用。

图10:使用0－800μg/ml无内毒素第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用12当量的葡糖胺在pH8合成)通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用400－1,000μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用12当量的葡糖胺在pH8合成)在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用12当量的葡糖胺在pH8合成)对促炎细胞因子例如TNF-α和MIP-1β没有显著作用。

图11:使用0－800μg/ml无内毒素第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用120当量的葡糖胺在pH7合成)通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用400－1,000μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用120当量的葡糖胺在pH7合成)在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用120当量的葡糖胺在pH7合成)对促炎细胞因子例如TNF-α和MIP-1β没有显著作用。

图12:使用0－800μg/ml无内毒素第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用120当量的葡糖胺在pH5合成)通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用400－1,000μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用120当量的葡糖胺在pH5合成)在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第2代三嗪羧酸封端的树状聚体(使用120当量的葡糖胺在pH5合成)对促炎细胞因子例如TNF-α和MIP-1β没有显著作用。

图13:使用0－400μg/ml无内毒素第3代三嗪羧酸封端的树状聚体通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用25－200μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定第3代三嗪羧酸封端的树状聚体在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3代三嗪羧酸封端的树状聚体对促炎细胞因子例如Il-6、TNF-α、Il-8和MIP-1β没有显著作用。

图14:使用0－400μg/ml无内毒素第3代三嗪羧酸封端的树状聚体葡糖胺(使用12当量葡糖胺合成)通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用25－200μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定第3代三嗪羧酸封端的树状聚体葡糖胺(使用12当量葡糖胺合成)在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3代三嗪羧酸封端的树状聚体葡糖胺(使用12当量葡糖胺合成)对促炎细胞因子例如IL-6、TNF-α、IL-8和MIP-1β没有显著作用。

图15:使用0－400μg/ml无内毒素第3代三嗪羧酸封端的树状聚体葡糖胺(使用14当量葡糖胺合成)通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用50－400μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定第3代三嗪羧酸封端的树状聚体葡糖胺(使用14当量葡糖胺合成)在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3代三嗪羧酸封端的树状聚体葡糖胺(使用14当量葡糖胺合成)对促炎细胞因子例如IL-6、TNF-α、IL-8和MIP-1β没有显著作用。

图16:使用0－400μg/ml无内毒素杂化物第2代三嗪第0.5代PAMAM羧酸封端的树状聚体葡糖胺通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用25－800μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定杂化物第2代三嗪第0.5代PAMAM羧酸封端的树状聚体葡糖胺在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，杂化物第2代三嗪第0.5代PAMAM羧酸封端的树状聚体葡糖胺对促炎细胞因子例如IL-6、TNF-α、IL-8和MIP-1β没有显著作用。

图17:使用0－600μg/ml无内毒素杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM羧酸封端的树状聚体葡糖胺通过对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法在96孔培养板中测定细胞的细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用25－200μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞测定杂化物第2代三嗪第1.5代PAMAM羧酸封端的树状聚体葡糖胺在24孔培养板中的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，杂化物第3代三嗪第1.5代PAMAM羧酸封端的树状聚体葡糖胺显著减少了促炎细胞因子：-在200μg/ml，IL-6减少105-倍，TNF-α减少190-倍，IL-8减少30-倍，MIP-1β减少70-倍。相反，抗炎细胞因子IL-10和干扰素-β没有改变。

图18:第3.5代阴离子型羧酸封端的(即64个周边羧酸基团)PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有12.5%的葡糖胺表面载量(即8个葡糖胺分子)与树状聚体和葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示树状聚体的两个亚片段。每个亚片段具有8个周边羧酸基团。在这两个亚片段各自上存在连接的1个周边葡糖胺分子。

图19:第3.5代阴离子型羧酸封端的PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有12.5%的葡糖胺表面载量(即8个葡糖胺分子)与树状聚体和葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示使用模拟退火方案与Xplor-NIH得到的溶剂化结构。

图20:第3.5代阴离子型羧酸封端的PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有12.5%的葡糖胺表面载量(即8个葡糖胺分子)与树状聚体和葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示使用模拟退火方案与Xplor-NIH得到的非溶剂化结构。

图21:第3.5代阴离子型羧酸封端的PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有12.5%的葡糖胺表面载量(即8个葡糖胺分子)与树状聚体和葡糖胺之间0长度的酰胺键。该模型化图显示这种树状聚体葡糖胺分子表面具有均匀分布的亲水性表面。

图22:第3.5代阴离子型羧酸封端的PAMAM树状聚体。该图显示内插入的电荷表面。暗色区域相当于带负电荷的残基，灰色区域相当于带正电荷的残基。

图23:第3.5代阴离子型羧酸封端的PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有12.5%的葡糖胺表面载量(即8个葡糖胺分子)与树状聚体和葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示内插入的电荷表面。暗色区域相当于带负电荷的残基，灰色区域相当于带正电荷的残基。箭头标记在这种2-D影像上可见的3个葡糖胺分子的位置。

图24:部分糖基化的第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有树状聚体与葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示树状聚体的两个亚片段。在这些亚片段各自上存在1个连接的周边葡糖胺分子。

图25:部分糖基化的第2代三嗪第1.5代PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有树状聚体与葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示树状聚体的两个亚片段。在这些亚片段各自上存在1个连接的周边葡糖胺分子。

图26:部分糖基化的第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有树状聚体与葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示其亲水性表面的模型化。

图27:部分糖基化的第2代三嗪第1.5代PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有树状聚体与葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示其亲水性表面的模型化。

图28:部分糖基化的第2代三嗪第0.5代PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有树状聚体与葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示内插入的电荷表面。暗色区域相当于带负电荷的残基，灰色区域相当于带正电荷的残基。

图29:部分糖基化的第2代三嗪第1.5代PAMAM树状聚体葡糖胺，其具有树状聚体与葡糖胺之间0长度的酰胺键。该图显示内插入的电荷表面。暗色区域相当于带负电荷的残基，灰色区域相当于带正电荷的残基。

图30:第3代阴离子型羧酸封端的(即16个周边羧酸基团)聚丙基醚亚胺树状聚体芯。完整和对称的树状聚体以2-维显示。这种树状聚体不具有内腔。因此不适合于作为递药树状聚体起作用。

图31:第3代阴离子型羧酸封端的(即16个周边羧酸基团)聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺，其具有12.5%的葡糖胺表面载量(即2个葡糖胺分子)与树状聚体和葡糖胺之间0长度的酰胺键。葡糖胺分子均匀地间隔排列在这种对称的树状聚体的表面上，正如每个黑色星所示例的。每个弧形物(n=2)表示8个羧酸基团，其中之一共价连接葡糖胺分子。这种分析化学观察结果与使用前线分子轨道理论进行的较高占据分子轨道和最低占据分子轨道计算一致。就第3代阴离子型羧酸封端的(即16个周边羧酸基团)聚丙基醚亚胺树状聚体而言，每个葡糖胺的递增添加以能量有利的方式进行，直到2个葡糖胺分子均匀地连接可利用的16个周边羧酸基团的2个为止。此后，较高占据分子轨道能量值快速地变为对任意另外的葡糖胺分子添加不利的。这表明树状聚体葡糖胺的分支合成方法导致在第3代阴离子型羧酸封端的聚丙基醚亚胺树状聚体的16个羧酸基团上添加2个葡糖胺分子是最优的。这等同于1个葡糖胺分子/8个周边羧酸基团。

图32:第3代阴离子型羧酸封端的聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺。该图显示其整体分子表面。这种树状聚体不具有内腔。因此，它不适合于递药目的。

图33:第3代阴离子型羧酸封端的聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺。这种树状聚体葡糖胺不具有内腔且由此不适合于递药目的。该图显示其亲水性表面的模型化。

图34:使用0－400μg/ml无内毒素第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺通过在96孔培养板中对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法测定细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用12.5－100μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶外周血单核细胞在24孔培养板中测定第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺导致如下的促炎细胞因子减少：-在100μg/ml，IL-6减少75-倍，TNF-α减少390-倍，IL-8减少75-倍，MIP-1β减少165-倍。相反，抗炎细胞因子IL-10和干扰素-β没有改变。

图35:使用0－400μg/ml无内毒素的第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺通过在96孔培养板中对10⁵人单核细胞进行的MTT测定法测定细胞毒性。未观察到细胞毒性效应。使用用50－200μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门菌属LPS攻击的10⁶单核细胞在24孔培养板中测定第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺导致如下的促炎细胞因子减少：-在100μg/ml，IL-6减少300-倍，TNF-α减少135-倍，IL-8减少5-倍，MIP-1β减少100-倍。相反，抗炎细胞因子IL-10和干扰素-β没有改变。

图36:志贺氏菌属LPS的可能截短的突变体的示意图。M90是野生型弗氏志贺菌。gtrA是具有还原糖基化的突变体。cld(链长决定子)和rfB是O-抗原截短的突变体。waal突变体仅具有脂质A和芯糖，无O-抗原。

图37:使用用25－200μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml志贺氏菌属LPS攻击的10⁶人单核细胞在24孔培养板中测定第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺导致如下的促炎细胞因子减少：-在100μg/ml，IL-6减少30-倍，TNF-α减少4-倍，IL-8减少15-倍，MIP-1β减少6-倍。相反，抗炎细胞因子IL-10和干扰素-β没有改变。

图38:使用用25－200μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml志贺氏菌属waaL LPS攻击的10⁶人单核细胞在24孔培养板中测定第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺导致如下的促炎细胞因子减少：-在200μg/ml，IL-6减少12-倍，TNF-α减少3-倍，IL-8减少4-倍，MIP-1β减少5-倍。相反，抗炎细胞因子IL-10和干扰素-β没有改变。

图39:使用用12.5－100μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用如下细菌攻击的10⁶人单核细胞在24孔培养板中测定第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺的生物效应：-(1)25ng/ml沙门氏菌属LPS；(2)活大肠杆菌细菌(感染复数(MOI)=10)；(3)活铜绿假单胞菌细菌(MOI=10)；(4)活肺炎克雷伯菌细菌(MOI=10)；(5)活金黄色葡萄球菌细菌(MOI=10)；(6)活粪肠球菌细菌(MOI=10)。1h温育后，向包含细菌的单核细胞培养物中加入庆大霉素(100μg/ml)，然后再持续温育2h，使得温育总时间为3小时。然后提取RNA，进行实时RT PCR。就每一使用的单一刺激剂而言，第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺导致促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-8显著减少。

该图概述了IL-6的结果。它们显示如下减少：-(1)沙门氏菌属LPS–在100μg/ml减少925-倍；(2)活大肠杆菌细菌–在100μg/ml减少30-倍；(3)活铜绿假单胞菌细菌–在100μg/ml减少23-倍；(4)活肺炎克雷伯菌细菌–在200μg/ml减少48-倍；(5)活金黄色葡萄球菌细菌–在100μg/ml减少17-倍；(6)活粪肠球菌细菌–在200μg/ml减少60-倍。

图40:使用用12.5－100μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用如下细菌攻击的10⁶人单核细胞在24孔培养板中测定第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺的生物效应：-(1)25ng/ml沙门氏菌属LPS；(2)活大肠杆菌细菌(感染复数(MOI)=10)；(3)活铜绿假单胞菌细菌(MOI=10)；(4)活肺炎克雷伯菌细菌(MOI=10)；(5)活金黄色葡萄球菌细菌(MOI=10)；(6)活粪肠球菌细菌(MOI=10)。1h温育后，向包含细菌的单核细胞培养物中加入庆大霉素(100μg/ml)，然后再持续温育2h，使得温育总时间为3小时。然后提取RNA，进行实时RT PCR。就每一使用的单一刺激剂而言，第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺导致促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-8显著减少。

该图概述了TNF-α的结果。它们显示如下减少：-(1)沙门氏菌属LPS–在100μg/ml减少20-倍；(2)活大肠杆菌细菌–在100μg/ml减少6-倍；(3)活铜绿假单胞菌细菌–在100μg/ml减少3-倍；(4)活肺炎克雷伯菌细菌–在200μg/ml减少12-倍；(5)活金黄色葡萄球菌细菌–在100μg/ml减少10-倍；(6)活粪肠球菌细菌–在200μg/ml减少45-倍。

图41:使用用12.5－100μg/ml无内毒素树状聚体葡糖胺预处理1h、然后用如下细菌攻击的10⁶人单核细胞在24孔培养板中测定第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺的生物效应：-(1)25ng/ml沙门氏菌属LPS；(2)活大肠杆菌细菌(感染复数(MOI)=10)；(3)活铜绿假单胞菌细菌(MOI=10)；(4)活肺炎克雷伯菌细菌(MOI=10)；(5)活金黄色葡萄球菌细菌(MOI=10)；(6)活粪肠球菌细菌(MOI=10)。1h温育后，向包含细菌的单核细胞培养物中加入庆大霉素(100μg/ml)，然后再持续温育2h，使得温育总时间为3小时。然后提取RNA，进行实时RT PCR。就每一使用的单一刺激剂而言，第3代聚丙基醚亚胺阴离子型羧酸封端的树状聚体葡糖胺导致促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-8显著减少。

该图概述了MIP-1β的结果。它们显示如下减少：-(1)沙门氏菌属LPS–在100μg/ml减少70-倍；(2)活大肠杆菌细菌–在300μg/ml减少5-倍；(3)活铜绿假单胞菌细菌–在100μg/ml减少3-倍；(4)活肺炎克雷伯菌细菌–在200μg/ml减少30-倍；(5)活金黄色葡萄球菌细菌–在100μg/ml减少5-倍；(6)活粪肠球菌细菌–在200μg/ml减少35-倍。

图42:显示具有16-COOH的聚丙基醚亚胺芯的1-D H-NMR光谱。

图43:显示具有16-COOH的聚丙基醚亚胺芯的2-D H-COSY光谱。

图44:显示具有16-COOH的聚丙基醚亚胺芯的¹³C-NMR光谱。

图45:显示具有16个末端羧酸的聚丙基醚亚胺芯的无畸变极化转移增益法135¹³CNMR光谱。

图46:显示具有16-COOH的聚丙基醚亚胺芯的MALDI质谱。

图47:显示具有16-COOH末端羧酸的聚丙基醚亚胺芯的HPLC带电荷气雾剂检测图。

图48:显示聚丙基醚亚胺与葡糖胺共轭的图示。

图49a:显示G3聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺的H-NMR光谱。

图49b:显示G3聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺的¹³C-NMR光谱。

图50:显示G3聚丙基醚亚胺树状聚体葡糖胺的HPLC-UV图。

图51:显示正如使用MTT方法所测定的G3聚丙基醚亚胺葡糖胺对初级人单核细胞无细胞毒性(参见实施例2A对方法的详细描述)。

图52:显示当使用人单核细胞和志贺氏菌属LPS测试时，高纯度(95%)G3聚丙基醚亚胺葡糖胺在50μg/ml具有生物活性(参见实施例2B的方法详细描述)。

图53:显示当使用人单核细胞和大肠杆菌细菌测试时，高纯度(95%)G3聚丙基醚亚胺葡糖胺在100μg/ml具有生物活性(参见实施例2D的方法详细描述)。

图54:显示当使用人单核细胞和沙门氏菌属LPS测试时，G3聚丙基醚亚胺葡糖胺在37°C和100%湿度下在密封小瓶中(在氩气气氛中和无湿气)贮存42天后在100μg/ml保持生物活性(参见实施例2D的方法详细描述)。

图55:显示G3聚丙基醚亚胺葡糖胺不具有抗微生物特性。

图56显示使用用50－150μg/ml无内毒素树状聚体6-硫酸葡糖胺预处理1h、然后用25ng/ml沙门氏菌属LPS攻击的10⁶人单核细胞在24孔培养板中测定G3聚丙基醚亚胺树状聚体6-硫酸葡糖胺的生物效应。3h后，提取RNA，进行实时RT PCR。当与LPS对照比较时，第3代聚丙基醚亚胺树状聚体6-硫酸葡糖胺不会导致促炎细胞因子TNF-α或促炎趋化因子MIP-1β减少。

有关US政府资助研究的声明:本发明部分使用来自NationalInstitutes of Health的美国政府基金得以实施。美国政府在本发明中享有一定权利。

Claims (42)

1.糖树状聚体，包含：

a)支持平均9－64个末端羧酸基团的无毒性树状聚体聚丙基醚亚胺芯；和

b)与所述芯共轭的2－8个氨基糖或硫酸氨基糖，其选自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、它们的任意一种的硫酸盐及其组合，

其中每个糖直接通过0长度的酰胺键与末端羧酸基团的残基连接。

2.权利要求1的糖树状聚体，其中该糖树状聚体是一代树状聚体。

3.权利要求2的糖树状聚体，其中树状聚体芯是第4代或以下，例如第3代或以下。

4.权利要求1－3任一项的糖树状聚体，其中末端羧酸数为12－48。

5.权利要求4的糖树状聚体，其中末端羧酸数为12－32，例如16－32，特别是16－32。

6.权利要求5的糖树状聚体，其中末端羧酸数约为9，约12，约16，约24，约32或约48，例如约16。

7.权利要求1－6任一项的糖树状聚体，其中氨基糖或硫酸氨基糖是葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、2-硫酸葡糖胺、3-硫酸葡糖胺、6-硫酸葡糖胺、2,6-二硫酸葡糖胺、3,6-二硫酸葡糖胺、3,4,6-三硫酸葡糖胺、2-硫酸N-乙酰葡糖胺、3-硫酸N-乙酰葡糖胺、6-硫酸N-乙酰葡糖胺、2,6-二硫酸N-乙酰葡糖胺、3,6-二硫酸N-乙酰葡糖胺或3,4,6-三硫酸N-乙酰葡糖胺或其组合。

8.权利要求1－7任一项的糖树状聚体，其中2－6、例如3、4或5个氨基糖与芯共轭。

9.权利要求1－7任一项的糖树状聚体，其中平均至少2、4、6或8个氨基糖与每个芯共轭，特别是2或3例如2个氨基糖与每个芯共轭。

10.权利要求9的糖树状聚体，其中氨基糖是葡糖胺。

11.权利要求1－7任一项的糖树状聚体，其中2－6、例如3、4或5个硫酸氨基糖与每个芯共轭，特别是2或3例如2个硫酸氨基糖氨基糖与每个芯共轭。

12.权利要求11的糖树状聚体，其中硫酸氨基糖是6-硫酸葡糖胺。

13.权利要求1－12任一项的糖树状聚体，其中树状聚体芯具有为氧的中心原子。

14.权利要求1－12任一项的糖树状聚体，其中树状聚体芯具有为氮的中心原子。

15.糖树状聚体群体，其中该群体的平均特性如权利要求1－14任一项所定义。

16.药物制剂，包含如权利要求1－14任一项所定义的糖树状聚体或如权利要求15所定义的群体及药学可接受的赋形剂。

17.权利要求16的制剂，用于局部给药。

18.权利要求16的制剂，用于输注或直接注射。

19.权利要求16的制剂，用于口服给药。

20.权利要求16－19任一项的制剂，其中在一个剂量中包含10μg－1g如权利要求1－14任一项所定义的糖树状聚体或权利要求15的群体。

21.如权利要求1－14任一项所定义的糖树状聚体、权利要求15所定义的群体或如权利要求16－20任一项所定义的药物制剂，用于治疗。

22.权利要求21的糖树状聚体或制剂，用于治疗或预防与宿主/患者的过度促炎细胞因子应答相关的疾病。

23.权利要求22的糖树状聚体或制剂，其中炎症应答由一种或多种细胞因子水平增加介导，所述细胞因子选自IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β和MIP-1β。

24.权利要求22或23的糖树状聚体或制剂，用于治疗或预防与革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌导致的感染相关的促炎细胞因子应答。

25.权利要求24的糖树状聚体或制剂，其中革兰氏阴性菌感染与腹泻相关，例如造成炎性腹泻的志贺菌属或沙门氏菌属或弯曲杆菌属或难辨梭菌或任意类型的大肠杆菌所导致的那些感染。

26.权利要求24的糖树状聚体或制剂，其中感染由大肠杆菌、Klebsiella aeruginosa、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌和/或任意其他感染性生物体导致。

27.权利要求21－23任一项的糖树状聚体或制剂，用于治疗或预防炎性肠病，例如克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。

28.权利要求21－23任一项的糖树状聚体或制剂，用于治疗或预防炎症呼吸应答，例如在过敏反应和/或哮喘中和/或细菌/病毒呼吸道感染后的应答。

29.权利要求21－23任一项的糖树状聚体或制剂，用于治疗或预防伤口愈合过程中的过度瘢痕形成、瘢痕疙瘩形成、湿疹和银屑病。

30.权利要求29的糖树状聚体或制剂，用于治疗或预防移植，例如角膜和/或皮肤移植。

31.治疗或预防的方法，包含对有此需要的患者给予治疗有效量的权利要求1－14任一项的糖树状聚体、权利要求15的群体或权利要求16－20任一项的制剂。

32.权利要求31的方法，其中给予所述的糖树状聚体、群体或制剂是为了治疗或预防与患者过度促炎细胞因子应答相关的疾病或病症。

33.权利要求32的方法，其中所述应答由一种或多种细胞因子水平增加介导，所述细胞因子选自IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β和MIP-1α和β。

34.权利要求32的方法，其中给予所述的糖树状聚体、群体或制剂是为了治疗或预防与革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染相关的促炎细胞因子应答。

35.权利要求34的方法，其中革兰氏阴性菌感染与腹泻相关，例如由志贺菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、难辨梭菌、大肠杆菌导致的那些。

36.权利要求34的糖树状聚体、群体或制剂，其中所述感染由大肠杆菌、klebsiella aeruginosa、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌和/或任意其他感染性生物体导致。

37.权利要求31－33任一项的方法，其中给予所述的糖树状聚体、其群体或制剂是为了治疗或预防炎性肠病，例如克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。

38.权利要求31－33任一项的方法，其中给予所述的糖树状聚体、其群体或制剂是为了治疗或预防那些肠易激疾病的形式，例如与肠细菌过度刺激Toll样受体相关的那些肠易激疾病的形式。

39.权利要求31－33任一项的方法，其中给予所述的糖树状聚体、其群体或制剂是为了治疗或预防炎症呼吸应答，例如在过敏反应和/或哮喘中和/或细菌/病毒呼吸道感染后的应答。

40.权利要求31－33任一项的方法，其中给予所述的糖树状聚体或其制剂是为了治疗或预防伤口愈合过程中的过度瘢痕形成、瘢痕疙瘩形成、湿疹和银屑病。

41.权利要求31－33任一项的方法，其中给予所述的糖树状聚体或其制剂是为了治疗或预防移植，例如角膜和/或皮肤移植。

42.权利要求31－33任一项的方法，其中给予所述的糖树状聚体、其群体或制剂是治疗或预防牙龈炎。

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