CN103173433A - 一种dna低温保存溶剂及其保存方法 - Google Patents

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郜恒骏
盛海辉
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Abstract

本发明公开了一种DNA低温保存溶剂及其保存方法，该DNA保存溶剂的组分包括：小牛血清、甘油、TE缓冲液、二甲基亚砜、甜菜碱。其中，小牛血清的终体积为0.1％～1％，甘油的终体积为10％～24％，二甲基亚砜终浓度为30％～50％、甜菜碱的终浓度为1M～7M，DNA保存溶剂pH范围为6.0～8.0。该DNA保存方法，包括步骤：(1)提取DNA；(2)将DNA溶于DNA保存溶剂中进行保存。本发明操作简单、成本低廉，而且DNA保存效果好、保存期长，并能避免反复冻融，为科学研究、身份鉴别、医疗诊断提供最完整的DNA。

Description

一种DNA低温保存溶剂及其保存方法
技术领域
本发明涉及一种DNA(deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)的保存，特别是涉及一种DNA低温保存溶剂及其保存方法。
背景技术
DNA是染色体的重要组成充分，是遗传信息的载体，含有物种个体的遗传信息，是最重要的生物信息分子，可用于构建基因组文库、分离所需的基因和检测相关的分子标记等。基因组DNA是没有组织特异性的，即无论从何种生物组织制得的DNA都是一样的。由于DNA所含的遗传信息量大，并且容易获取，具有极其稳定的化学性质，是目前种质资源和遗传资源收集和保存的主要内容之一。
DNA分子的序列结构具有三个重要特性：(1)不同个体序列不一样；(2)终生不变；(3)同一生物各不同部位细胞中的DNA序列相同。因此DNA分子本身具备档案的特性，即具有长期稳定性、信息属性、个体特异性和可以备查的属性。
实际上，在疾病基因组学、药物基因组学、群体遗传学和进化等研究领域，DNA是最可靠的证据和研究过程的基本材料，被广泛应用。同时生命科学研究者日益认识到保存DNA对于今后系统生物医学的发展的重要性，各国纷纷开始保存DNA。世界上最早开始实施大规模DNA保存的是冰岛的Decode公司，全部DNA样本极其相关资料来自于将近1/3的冰岛成年人和90％以上的冰岛老年人。利用其建立的生物样本库，Decode找到了心肌梗塞等20多种疾病的致病基因。随后英国、美国、以色列等国家研究单位建立了类似的遗传资源样本库，并且以色列对外销售这些资料齐全的人DNA样本。
为了维持DNA结构的完整性，避免DNA大规模断裂和降解，DNA最佳保存方法是干粉-80℃或者液氮低温保存，但要制成干粉则需要大量的DNA，取材困难，在实际DNA样本资源收集中不具有操作性。而用无水乙醇保存DNA，虽然可以事先分装保存，但也存在反复冻融问题。而固相DNA保存技术是最近提出的新概念，适用于永久保存，并且这种方法的保存基质是否影响DNA后续实验、保存具体效果，目前无这方面的任何数据，尚有待时间考验。并且对于保存期间需要多次使用的样本，需要重新提取DNA，操作复杂，并且容易导致DNA断裂，将导致一些对DNA质量要求高的检测实验无法进行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种DNA保存溶剂及其保存方法。利用该DNA保存溶剂，可以很简单地、长期保存DNA，并且DNA提取方便、避免DNA的反复冻融、成本低廉，为今后基因组学研究、身份鉴别、基因诊断、基因治疗、器官移植等提供最原始的DNA记录。
为解决上述技术问题，本发明的DNA保存溶剂，其组分包括：所述小牛血清的终体积为0.1％～1％；甘油的终体积为10％～24％，优选15％；二甲基亚砜终浓度为30％～50％，优选30％；甜菜碱的终浓度为1M～7M，优选5M；TE缓冲液的终浓度为1×～5×TE，pH是6～8。
上述甘油、二甲基亚砜和甜菜碱作用主要是维持液态环境。
另外，本发明的DNA保存方法，包括步骤：
(1)提取DNA；
其中，该DNA可从生物的任何细胞、按照常规的提取方法进行提取及纯化；
(2)将DNA溶于如上所述的DNA保存溶剂中进行保存。
其中，DNA保存的最终浓度可以为0.1～10μg/L，如6μg/L左右，优选1～3μg/L。如DNA保存浓度很低，如直接大用量实验，保存溶剂中高浓度的二甲基亚砜和甘油有可能影响后续的实验，而高保存浓度的DNA在实际应用中需要进一步稀释后才能实验，不影响后续实验。
所述保存温度可以为-20℃～-196℃。
与传统的DNA保存技术相比较，本发明具有如下优点：
(1)制作简单、成本低廉，只需要低温冰冻保存即可；
(2)由于含有保护溶剂，使得DNA一直处于液态环境中，避免机械切割力损害，从而能有效地防止DNA降解，因此，DNA保存效果好、保存期长。
(3)由于DNA保存于液态环境中，从冰箱或液氮中拿出来后，不需溶解，就可直接取样或分装，从而避免了反复冻融。
因此，本发明能长期低温保存DNA，如20年以上。
具体实施方式
以下实施例中的甘油、二甲基亚砜、TE中的组分(Tris碱、HCl、EDTA)、甜菜碱都是市售产品。
附图说明
附图是实施例3的基因组DNA电泳图，其中，孔1为实施例3中按照实施例1保存的DNA，孔2为实施例3中按照实施例1保存的DNA，孔3为DNA分子标记。
实施例1
一、样本DNA的提取
采用FlexiGene DNA Kit(QIAGEN，Cat.No.51206)试剂盒抽提小鼠外周血中的基因组DNA。具体步骤如下：
向300μl血液样本中加入750μl Buffer FG1，上下颠倒5次使其混匀。接着在12,000rpm转速下离心1min。离心后倒掉上层清液，再加入150μlBuffer FG2及1.5μl蛋白酶溶液，立即振荡，直至沉淀完全溶解。接下来离心3～5s，然后65℃水浴5min。当溶液从红色变为橄榄绿色后，加入150μl 100％异丙醇，上下充分颠倒离心管，使其混合，直至DNA析出，呈肉眼可见的线状或块状。然后在12,000rpm转速下离心3min。离心后倒掉上层清液，再加入150μl 70％乙醇，并振荡5s。接着重新在12,000rpm转速下离心3min，离心后倒掉上层清液，自然风干沉淀，直至所有的液体都蒸发掉。
二、保存
向上述含有DNA的离心管中加入500μl的DNA冰冻保存溶剂后，37℃过夜，保证DNA充分溶解，然后于-80℃冰箱保存。
其中，DNA冰冻保存溶剂的组成为：终体积为15％的甘油、终浓度为1×TE(pH7.6)、终浓度为5mol/L的甜菜碱、终浓度为30％的二甲基亚砜。
实施例2
采用实施例1中的DNA抽提方法，抽取实施例1的小鼠外周血300μl进行DNA抽提，然后向含有该DNA的离心管中加入500μl的1×TE(pH7.6)，37℃过夜，保证充分溶解后，于-80℃冰箱保存。
实施例3
实施例1和实施例2中的DNA保存1个月后，每个工作日的10点和16点将实施例1和实施例2保存的DNA取出，置于37℃温箱15分钟，使实施例1和实施例2中的DNA充分溶解后，然后-80度保存，连续反复冻融4月，进行加速实验。
各取反复冻融4个月后，取按照实施例1和实施例2保存的DNA 3μl，用0.8％(0.8g/100ml)琼脂糖进行电泳鉴定，电泳结果如说明书附图所示。从电泳图中看出，实施例1保存的DNA经过连续4个月反复冻融后，孔1电泳结果显示基因组DNA未降解；而实施例2保存的DNA经过连续3个月反复冻融后，孔2电泳结果显示基因组DNA一片弥散，降解明显。
实施例4
采用实施例1中的DNA抽提方法，将得到的小鼠肝脏DNA中加入DNA冰冻保存溶剂，使DNA的最终浓度为2μg/L，37℃过夜，保证DNA充分溶解，然后于-20℃冰箱保存。
其中，DNA冰冻保存溶剂的组成为：终体积为25％的甘油、终浓度为1×TE(pH6)、终浓度为6mol/L的甜菜碱。
本实施例中所保存的DNA分子结构无破坏，能满足下游实验(如PCR、基因芯片等)需要。
实施例5
采用实施例1中的DNA抽提方法，将得到的培养皿细胞DNA中加入DNA冰冻保存溶剂，使DNA的最终浓度为3μg/L，37℃过夜，保证DNA充分溶解，然后于-196℃保存。
其中，DNA冰冻保存溶剂的组成为：终体积为80％的甘油、终浓度为5×TE(pH8)、终浓度为1mol/L的甜菜碱。
本实施例中所保存的DNA分子结构无破坏，能满足下游实验(如PCR、基因芯片等)需要。
实施例6
采用实施例1中的DNA抽提方法，将得到的人肝脏DNA中加入DNA冰冻保存溶剂，使DNA的最终浓度为10μg/L，37℃过夜，保证DNA充分溶解，然后于-120℃保存。
其中，DNA冰冻保存溶剂的组成为：终体积为60％的甘油、终浓度为2×TE(pH7.5)、终浓度为5mol/L的甜菜碱。
本实施例中所保存的DNA分子结构无破坏，完全能满足下游实验(如PCR、基因芯片等)需要。

Claims (10)

1.一种DNA保存溶剂，其特征在于：该DNA保存溶剂的组分包括：小牛血清、甘油、TE缓冲液、二甲基亚砜、甜菜碱。
2.如权利要求1所述的DNA保存溶剂，其特征在于：所述小牛血清的终体积为0.1％～1％，甘油的终体积为10％～24％，二甲基亚砜终浓度为30％～50％，甜菜碱的终浓度为1M～7M，TE缓冲液的终浓度为1×～5×TE，pH是6～8。
3.如权利要求1和2所述的DNA保存溶剂，其特征在于：所述TE缓冲液的终浓度为1×TE，pH值为7.6。
4.如权利要求1和2所述的DNA保存溶剂，其特征在于：所述甜菜碱的终浓度为5mol/L。
5.如权利要求1和2所述的DNA保存溶剂，其特征在于：所述甘油的终浓度为15％。
6.如权利要求1和2所述的DNA保存溶剂，其特征在于：所述二甲基亚砜的终浓度为30％。
7.如权利要求1-6任意一项所述的DNA保存方法，包括步骤：
(1)提取DNA；
(2)将DNA溶于如权利要求1所述的DNA保存溶剂中进行保存。
8.如权利要求5所述的DNA保存方法，其特征在于：所述保存温度为-20℃～-196℃。
9.如权利要求5所述的DNA保存方法，其特征在于：所述DNA保存的最终浓度为0.1～10μg/L。
10.如权利要求9所述的DNA保存方法，其特征在于：所述DNA保存的最终浓度为1～3μg/L。
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