CN103170008A

CN103170008A - 一种生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体及其制备方法

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Publication number: CN103170008A
Application number: CN2013100358676A
Authority: CN
Inventors: 杜智; 韩涛; 于美丽; 王瑞
Original assignee: Tianjin Third Central Hospital
Current assignee: Tianjin Third Central Hospital
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2033-01-30
Also published as: CN103170008B

Abstract

本发明提供了一种生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体及其制备方法，所述生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体为PNIPA-AM-OSA，其制备方法为：（1）制备大孔PNIPA-AM；（2）大孔PNIPA-AM与醛基化海藻多糖OSA席夫碱交联反应得到PNIPA-AM-OSA；所述生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体适宜细胞生长、分化，细胞相容性好，通过物理方式脱细胞，对细胞活性及数量无损伤。

Description

一种生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其是一种生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体及其制备方法。

背景技术

在生物人工肝和肝细胞移植研究中，如何获得足够数量、活性优良、可维持细胞特异性功能表达的肝细胞已经成为主要问题。细胞三维培养作为体外高密度细胞培养技术已广泛用于生物医学领域，细胞三维培养技术(three-dimensional cell culture,TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞载体复合物。

与单层和二维细胞培养相比，细胞三维培养的主要优点是具有良好的结构，能直接反映结构与功能的关系，并且细胞的形态和微环境近似于体内的状态，因此近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。

可见，在细胞三维培养技术中，对于细胞载体的选择对于获得足够数量、活性优良、可维持细胞特异性功能表达的肝细胞至关重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体，为PNIPA-AM-OSA共聚物，具有附图4的红外光谱结构，除保留OSA的特征谱带外，在1645.21cm^-1及1552.46cm^-1处为酰胺键的特征吸收，1175cm^-1和1132cm^-1处的异丙基骨架振动吸收反映了异丙基的特征吸收。

优选的，上述生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体，是由下述方法得到的：

（a）将N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸甲酯(MA)和偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）溶于无水乙醇，其中N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）：丙烯酸甲酯(MA)：偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）的摩尔比为70-90∶15-30∶0.3-0.7，且N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸甲酯(MA)和偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）总量与无水乙醇的体积比为1：5-20；

（b）将每0.75g海藻酸钠（致孔剂）溶于15ml0.9%生理盐水溶液中,加入步骤（a）的反应体系中混合均匀，使得制孔率在30%-60%，通氮气（N2）30min,置于冰水浴中反应24h，升温至50℃条件下反应16h，后将温度升高到65℃，搅拌，并开始滴加联胺溶液，其中联胺溶液与丙烯酸甲酯(MA)的摩尔比为5：1，12h后停止反应，除去溶剂，所得产物在45℃热水浴中浸泡24h，并且每隔2h换一次水.产物大孔PNIPA-AM共聚物真空干燥至恒重；

（c）将10%的24%氧化度的OSA和18%的步骤（b）所得大孔PNIPA-AM共聚物溶于0.1M四硼酸钠与pH7.4的PBS溶液中，经席夫碱交联反应1h,得到PNIPA-AM-OSA共聚物。

上述生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体的制备方法，具体制备步骤如下：

（1）合成大孔PNIPA-AM共聚物：

（2）合成PNIPA-AM-OSA：

将10%的24%氧化度的OSA和18%的步骤（1）所得大孔PNIPA-AM共聚物溶于0.1M四硼酸钠与pH7.4的PBS溶液中，经席夫碱交联反应1h,得到目标产物生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体PNIPA-AM-OSA共聚物（大孔三维支架）。

优选的，上述生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体的制备方法，所述步骤（1）（a）中N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）：丙烯酸甲酯(MA)：偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）的摩尔比为80∶20∶0.5。

优选的，上述生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体的制备方法，所述步骤（1）（a）中N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸甲酯(MA)和偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）总量与无水乙醇的体积比为1：10。

本发明的有益效果是：

上述生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体，适宜细胞生长、分化，细胞相容性好，通过物理方式脱细胞，对细胞活性及数量无损伤；其制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。

附图说明

图1是实施例1中合成大孔PNIPA-AM共聚物的合成路线图；

图2是实施例1中合成PNIPA-AM-OSA共聚物的合成路线图；

图3是海藻多糖和醛基化海藻多糖OSA红外光谱图，其中（a）为海藻多糖红外谱图，(b)为醛基化海藻多糖OSA；

图4是大孔三维支架PNIPA-AM-OSA红外谱图，其中（a）为OSA，(b)为PNIPA-AM-OSA；

图5是大孔三维支架PNIPA-AM-OSA扫描电镜照片；

图6是大孔三维支架PNIPA-AM-OSA上细胞光镜观察图；

图7是大孔三维支架PNIPA-AM-OSA温敏反应试验结果图；

图8是席夫碱交联反应的合成路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

下述实施例所用仪器与材料为：N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)AR，Aldrich公司；丙烯酸甲酯(MA)AR，Aldrich公司；高G单元海藻酸钠药用级挪威FMC公司；高碘酸钠,AR天津联星生物技术有限公司；电子天平美国OHAUS奥豪斯；恒温磁力搅拌器81-2型上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；傅立叶变换红外变换吸收光谱仪Bio-Rad Fts6000美国；冷冻干燥机日本YAMATO立式冷冻干燥机等。

下述实施例所用到的醛基化海藻多糖OSA，可通过参考文献（Ducatti DR,Massi A,Noseda MD,et.al.Production of carbohydrate building blocks from redseaweed polysaccharides.Efficient conversion of galactans into C-glycosyl aldehydes.Org Biomol Chem.20097(3):576-88）的方法制备，具体为：配质量分数为2%的海藻酸钠水溶液100mL，然后按不同摩尔比（1:1、1:2、1:4、1:8、1:10、1:12）加入高碘酸钠，避光磁力搅拌下反应24小时，24小时后加入0.4mL乙二醇终止反应15分钟，终止液加入4gNaCl，混匀5分钟，按体积比1:5倒入无水乙醇中沉淀、析出，将沉淀物取出，真空抽吸，自然干燥。干燥后样品再次溶于去离子水中，用3500Da孔径透析袋进行透析，过夜，透析后样品液经冷冻干燥后得终产物OSA。

对于OSA氧化度的测定方法，可通过参考文献（何淑兰、张敏、耿占杰等，部分氧化海藻酸钠的制备与性能，应用化学2005,22（9）:1007-1011）的方法，采用碘化钠-淀粉糊精法建立标准曲线y=675.15x-0.1417（R2=0.9761），取氧化24小时的海藻酸钠溶液2.5mL，迅速加入工作液2.5mL，避光作用50分钟后在480nm处测定吸光度值，最后根据标准曲线计算出高碘酸钠消耗量。氧化度(％)=(198×N)/M0×100%，式中，N为高碘酸钠消耗量(mol)，M0为样品质量(g)，198为海藻酸钠单元分子量(g/mol)。

如图8所示，所述席夫碱交联反应中席夫碱主要是指含有亚胺或甲亚胺特性基团（－RC=N－）的一类有机化合物，通常希夫碱是由胺和活性羰基缩合而成。C=N键长约0.124～0.128nm，偶极矩约0.90D。有顺(Z)-、(E)-两种构型。亚胺是由醛或酮与氨或胺缩合而成的，又可分为醛亚胺和酮亚胺。亚胺基是极活泼的基团。与氰氢酸反应生成α-氨基酸，与丙二酸二乙酯反应生成β-氨基酸，还原反应生成胺，与格利雅试剂反应生成胺的衍生物，水解生成醛或酮和胺。醛酮与伯胺（RNH2）生成含碳氮双键的亚胺：R2C=O+R'NH2——R2C=NR'+H2O，其中R、R’都是脂肪族烃基的亚胺不稳定。R、R’其中一个为芳基的亚胺为稳定的晶体，由于平衡偏右，制备相对容易。

实施例1

一种生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体，是由下述方法制备得到的：

（1）如图1所示，合成大孔PNIPA-AM共聚物：

（a）将N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸甲酯(MA)和偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）溶于无水乙醇，其中N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）：丙烯酸甲酯(MA)：偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）的摩尔比为80∶20∶0.5，且N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸甲酯(MA)和偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）总量与无水乙醇的体积比为1：10；

（b）将每0.75g海藻酸钠（致孔剂）溶于15ml0.9%生理盐水溶液中,加入步骤（a）的反应体系中混合均匀，使得致孔率在45%，通氮气（N₂）30min,置于冰水浴中反应24h，升温至50℃条件下反应16h，后将温度升高到65℃，搅拌，并开始滴加联胺溶液，其中联胺溶液与丙烯酸甲酯(MA)的摩尔比为5：1，12h后停止反应，除去溶剂，所得产物在45℃热水浴中浸泡24h，并且每隔2h换一次水.产物大孔PNIPA-AM共聚物真空干燥至恒重.产率为73.2%；

（2）如图2所示，合成PNIPA-AM-OSA：

实施例2

（1）合成大孔PNIPA-AM共聚物：

（a）将N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸甲酯(MA)和偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）溶于无水乙醇，其中N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）：丙烯酸甲酯(MA)：偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）的摩尔比为70∶15∶0.7，且N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸甲酯(MA)和偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）总量与无水乙醇的体积比为1：20；

（b）将每0.75g海藻酸钠（致孔剂）溶于15ml0.9%生理盐水溶液中,加入步骤（a）的反应体系中混合均匀，使得制孔率在60%，通氮气（N2）30min,置于冰水浴中反应24h，升温至50℃条件下反应16h，后将温度升高到65℃，搅拌，并开始滴加联胺溶液，其中联胺溶液与丙烯酸甲酯(MA)的摩尔比为5：1，12h后停止反应，除去溶剂，所得产物在45℃热水浴中浸泡24h，并且每隔2h换一次水.产物大孔PNIPA-AM共聚物真空干燥至恒重；

（2）合成PNIPA-AM-OSA：

实施例3

（1）合成大孔PNIPA-AM共聚物：

（a）将N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸甲酯(MA)和偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）溶于无水乙醇，其中N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）：丙烯酸甲酯(MA)：偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）的摩尔比为90∶30∶0.3，且N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸甲酯(MA)和偶氮二异丁腈（AIBN）（引发剂）总量与无水乙醇的体积比为1：5；

（b）将每0.75g海藻酸钠（致孔剂）溶于15ml0.9%生理盐水溶液中,加入步骤（a）的反应体系中混合均匀，使得制孔率在30%，通氮气（N2）30min,置于冰水浴中反应24h，升温至50℃条件下反应16h，后将温度升高到65℃，搅拌，并开始滴加联胺溶液，其中联胺溶液与丙烯酸甲酯(MA)的摩尔比为5：1，12h后停止反应，除去溶剂，所得产物在45℃热水浴中浸泡24h，并且每隔2h换一次水.产物大孔PNIPA-AM共聚物真空干燥至恒重；

（2）合成PNIPA-AM-OSA：

实施例4

实施例1所合成的大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物的表征

如图3所示，海藻多糖醛基化后在1737cm^-1处出现了醛基C=O振动吸收峰。由于邻二醇结构被部分氧化为醛或酮结构，使羟基缔合程度减弱。结果，-OH伸缩振动频率有所升高，波数由3325cm^-1升高到3363cm^-1。因此，通过红外谱图分析，可以看出海藻多糖经过高碘酸钠氧化后确实生成了醛基。

如图4所示，(b)除保留OSA的特征谱带外，在1645.21cm^-1，及1552.46cm^-1处为酰胺键的特征吸收，1175cm^-1、1132cm^-1处的异丙基骨架振动吸收反映了异丙基的特征吸收。(b)中3508.26cm^-1和3431.20cm^-1处的峰消失，表明-NHNH₂基团参与了反应。红外分析结果证明PNIPA-AM共聚物与OSA反应,-NHNH2与-CHO脱水形成席夫碱。

实施例5

实施例1所合成的大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物扫描电镜观察（SEM）

将制备的大孔三维支架PNIPA-AM-OSA在-20℃冷冻48h，然后用冷冻干燥机干燥。经离子溅射仪喷金后，用扫描电镜观察支架形貌。在扫描电镜照片中随机取20个孔计算支架孔径。

如图5所示，结果显示PNIPA-AM-OSA支架具有相互联通且孔径在100μｍ至300μｍ的大孔结构，这种结构有利于水分和营养物质的输送，且通过水分对流的方式，能使支架具有较快的溶胀和去溶胀速度。

实施例6

实施例1所合成的大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物孔隙率测定

采用无水乙醇替代法测定多孔支架的孔隙率。取出支架，测量其体积V1，称重W，然后将材料放入一定体积的无水乙醇中，使乙醇进入材料内部，使其达到饱和不再有气泡逸出，取出称重W2，无水乙醇的密度记为

多孔支架的孔隙率P为：

P = \frac{(W_{2} - W_{1}) / ρ}{V_{1}} \times 100 % .

测定结果：孔隙率（%）为89.67±2.4；平均孔径（μｍ）为180.23±62.3。

实施例7

实施例1所合成的大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物细胞毒性实验

细胞毒性实验（四唑盐比色法）

将配制好的ATCC CCL1(NCTC clone929小鼠成纤维细胞)1×10⁴个/ml的细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，设空白对照、阴性对照、阳性对照和样品组，每组8孔，每孔加入100μl细胞悬液。在37℃、5%CO₂、100%相对湿度的恒温培养箱中培养24h，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入商品化的高密度聚乙烯片浸提液，阳性对照组加入聚氯乙烯片浸提液，样品组加入大孔三维支架PNIPA-AM-OSA浸提液，每孔100μl，置恒温培养箱中继续培养72h。每孔加入20μl,5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入150μl二甲亚砜（DMSO），利用酶标仪在570nm波长下测定吸光度，按下式计算细胞相对增殖率（RGR）。RGR=A/A₀×100%;（RGR-相对增殖度、A-阴性、阳性或样品组吸光度、A₀-空白对照组吸光度）

MTT检测结果显示，大孔三维支架PNIPA-AM-OSA样品的提取液对ATCC CCL1细胞的相对增殖率在89%以上，没有表现出细胞毒性。用DMEM浸泡处理3次（10min/次）后，对ATCC CCL1细胞的相对增殖率达到98%。证明该大孔三维支架PNIPAAM-OSA共聚物生物相容性良好。

实施例8

实施例1所合成的大孔三维支架PNIPAAM-OSA共聚物不同脱细胞方法比较

将培养到第3代ATCC CCL15×10⁴/ml密度细胞，分别接种到盛有PNIPA-AM-OSA支架的6孔板中，实验组与对照组各6孔，隔2天进行换液，换液前倒置显微镜下观察两组细胞的生长状况。所培养的细胞在增殖到一定数量，实验组通过降温至20℃至22℃脱附，回收细胞；对照组按常规酶消化加入0.25％胰蛋白酶2ml消化，吸弃胰蛋白酶液，使用加有10%胎牛血清的培养液终止消化，回收细胞。用血细胞计数板计数和MTT比色法检测细胞增殖活力，比较两组细胞数量和活性程度。

采用SPSS17.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，统计学差异检验标准p＜0.05。

该大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物不同脱细胞方法比较结果见表1。

表1实验组与对照组不同时间收获细胞数量均值

（各时间点实验组与对照组相比P＜0.050）

此外，如图6所示，在培养过程中，在光镜下观察细胞在大孔三维支架PNIPA-AM-OSA呈紧密排列。

MTT比色法检测细胞增殖活力，利用酶标仪测定570nm处的吸光度OD值，各个时间点实验组与对照组收获细胞增殖活力比较见表2，由表2可见实验组比对照组细胞增殖活力稍高，但无显著性差异P＞0.05。

表2各组不同时间点细胞MTT比色法吸光度均值

（各时间点与对照组比P＞0.05）

实施例9

实施例1所合成的大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物温敏反应试验

表征与测定方法

①红外光谱（IR）

将完全干燥的样品与溴化钾充分碾磨，压片后在红外光谱仪测定其红外光谱图。

②热重/差热分析（TG/DSC）

在PNIPA-AM-OSA凝胶37℃溶胀平衡的状态下，切下约30mg样品，用综合热分析仪进行热重/差热分析，以升温速率10℃/min测试其体积相转变行为过程。

③比表面积分析

将冷冻干燥的样品用吸附法做比表面积分析，佐证其多孔结构。

④扫描电镜(SEM)

将37℃下达到吸水平衡的PNIPA-AM-OSA凝胶样品用湿润滤纸拭干其表面，切成厚度约1.5mm的薄片。冷冻干燥后切下小块，扫描电镜观察其形貌。

温敏反应试验步骤如下：

将实施例1所述大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物放入25℃恒温水浴中，呈液体溶胶状态；将其放入37℃恒温水浴中，呈固体胶状态。温敏反应试验结果见图7。

如图7所示，利用该大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物的温敏特性，在37℃细胞培养条件下，使细胞在三维支架中培养，由于该支架材料具有细胞基质特性，非常适合细胞增殖，当达到一定细胞数量时，通过降低温度至30℃以下，支架材料呈液体溶胶状态，将所培养的活性细胞分离出来，该方法克服了传统酶消化分离细胞对细胞活性和细胞数量产生的不利影响。

综上，本发明所述大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物在正常的细胞培养条件37℃下具有疏水性；细胞在其上的粘附与生长与多层普通培养皿相似。而当培养温度降低于30℃-32℃时，其表面变成亲水性并且开始膨胀，在表面和培养的细胞之间形成了水化隔层，促使细胞脱附。而这个过程并不需要酶的消化处理，从而保持重要的细胞表面蛋白质不受损伤。实验证明PNIPA-Am-OSA共聚物培养第15天非酶温控脱细胞与酶消化脱细胞相比细胞获得率增加26.24%，而且细胞活性有所提高。

本发明所述大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物模拟自然对应物体内的细胞外基质,既起物理支架的作用,又是细胞在体外培养粘附物质。其贯通性有利于细胞生长和培养液的进入,接触面积增加,细胞可以在孔内生长,以保证材料深部的细胞有营养供给,同时起到支撑作用。

本发明所述大孔三维支架PNIPA-AM-OSA共聚物具有无毒、生物相容性好和生物可降解等特点,经细胞毒性试验证明该PNIPA-AM-OSA对ATCCCCL1细胞的相对增殖率达可到98%，再次证明其生物相容性极好。

上述参照实施例对该一种生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体，其特征在于：为PNIPA-AM-OSA共聚物，具有附图4的红外光谱结构，除保留OSA的特征谱带外，在1645.21cm^-1及1552.46cm^-1处为酰胺键的特征吸收，1175cm^-1和1132cm^-1处的异丙基骨架振动吸收反映了异丙基的特征吸收。

2.根据权利要求1所述的生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体，其特征在于：是由下述方法得到的：

（a）将N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇，其中N-异丙基丙烯酰胺：丙烯酸甲酯：偶氮二异丁腈的摩尔比为70-90∶15-30∶0.3-0.7，且N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯和偶氮二异丁腈总量与无水乙醇的体积比为1：5-20；

（b）将每0.75g海藻酸钠溶于15ml0.9%生理盐水溶液中,加入步骤（a）的反应体系中混合均匀，使得制孔率在30%-60%，通氮气30min,置于冰水浴中反应24h，升温至50℃条件下反应16h，后将温度升高到65℃，搅拌，并开始滴加联胺溶液，其中联胺溶液与丙烯酸甲酯的摩尔比为5：1，12h后停止反应，除去溶剂，所得产物在45℃热水浴中浸泡24h，并且每隔2h换一次水.产物大孔PNIPA-AM共聚物真空干燥至恒重；

3.权利要求1或2所述生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体的制备方法，其特征在于：具体制备步骤如下：

（1）合成大孔PNIPA-AM共聚物：

（2）合成PNIPA-AM-OSA：

将10%的24%氧化度的OSA和18%的步骤（1）所得大孔PNIPA-AM共聚物溶于0.1M四硼酸钠与pH7.4的PBS溶液中，经席夫碱交联反应1h,得到目标产物生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体PNIPA-AM-OSA共聚物。

4.根据权利要求3所述的生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）（a）中N-异丙基丙烯酰胺：丙烯酸甲酯：偶氮二异丁腈的摩尔比为80∶20∶0.5。

5.根据权利要求3所述的生物人工肝三维多孔非酶脱细胞载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）（a）中N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯和偶氮二异丁腈总量与无水乙醇的体积比为1：5-20。