CN103160494A - 一种提高小球藻光合作用效率的化学复合诱变方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高小球藻光合作用效率的化学复合诱变方法，将从自然水源中分离出的出发小球藻株，采用无菌光照培养箱，在25℃±1℃，光照强度3000Lux条件下，于液体培养基A中活化培养12-14h；选取生长相对较好，呈墨绿色的藻株作为诱变藻株，挑选后于液体培养基A₂中纯培养，作诱变原藻液，然后采用长春花碱与秋水仙碱（1:4）协同诱导，使自然界淡水普生性单细胞类小球藻（Chlorella Vulgaris Beijerinck）核和叶绿体DNA均加倍，提高光合作用效率，使受有机物源污染的水质净化，又可显著改善高含N、P、K水质的状态；通过化学复合诱变获得一种既能应用改善淡水水源品质，又可培育为鱼饲料的藻株。

Description

一种提高小球藻光合作用效率的化学复合诱变方法

技术领域

本发明涉及一种对生活用水、有机物及N、P、K所污染水净化的小球藻进行化学复合诱变方法，具体地说是一种通过化学复合诱变提高小球藻光合作用效率的方法。 

背景技术

小球藻(Chlorella spp)为绿藻门(Chlorophyceae)小球藻属(chlorella)单细胞藻，含有蛋白质、小球藻多糖、脂肪酸等多种营养成分，具有多种保健和药理作用，如小球藻多糖具有抗肿瘤，抗病毒，抗血栓及增强机体的免疫作用。经热处理或破壁处理的小球藻，可直接制成小球藻片，小球藻颗粒制剂及小球藻胶囊，适用于预防和辅助治疗高血压、高血脂、动脉粥样硬化、冠心病、消化性溃疡、免疫功能低下等疾病，还可以适用于肿瘤放疗和化疗副反应。在化工上还可应用于污水处理；由于小球藻是光能自养型生物，可和人形成循环系统，即人和动物呼出的CO₂可供小球藻增长，而小球藻产生的O₂可供任何动物呼吸作用，从而使小球藻在航天方面开发利用提供了依据；由于小球藻结构的特殊性能，在光合作用机理、跨膜转运机理等研究方面成为良好的模式生物。因此小球藻不仅具有优越的营养保健作用，成为人们的食品、制药和生物燃料的开发资源，而且成为植物学家们研究光合作用机理、跨膜运输等重大理论课题的宝贵材料。 

发明内容

本发明的目的是提供一种提高小球藻光合作用效率的方法，用于对生活用水、有机物及N、P、K所污染水进行高效净化治理。 

本发明实现发明目的采用如下方案： 

一种对生活用水、有机物及N、P、K所污染水净化的小球藻进行化学复合诱变方法，其特点在于包括如下步骤： 

(1)将从自然水源中分离出的出发小球藻株，采用无菌光照培养箱，在25℃±1℃，光照强度3000Lux条件下，于液体培养基A₂中活化培养1214h；选取生长相对较好，呈墨绿色的藻株作为诱变藻株，挑选后于液体培养基A中纯培养，并作诱变原藻液；所述的液体培养基A₂为每升水中含(NH₄)₂SO₄或NH₄Cl或(NH₄)₂CO₃500mg，MgSO₄·7H₂O或MgCl₂20mg，CaCl₂或CaCO₃10mg，K₂HPO₄1.44g，KH₂PO₃720mg，FeSO₄·7H₂O5mg，CoCl₂·6H₂O2mg，(NH₄)₆MoO₂·4H₂O2mg，H₃PO₃1000mg；pH为6.57.2； 

(2)按长春花碱：秋水仙碱=1∶4质量比混合作为诱导剂，加入到步骤(1)的原藻液 中，诱导剂的加入量为终浓度0.01wt0.05wt％，加入后将原藻液于3000Lux、27℃±1℃下培养12120h；诱导结束后，将原藻液离心去上清液后取沉淀，并立即加入无菌液体培养基进行自我修复，先避光5h，然后于25℃±1℃、3000Lux下无菌培养4d至稳定期，经固体培养基纯化培养后得到遗传稳定性好的小球藻突变型稳定的纯种系；所述固体培养基由液体培养基A₂+1.0wt％琼脂得到。 

作为优选，所述步骤(2)诱导剂的加入量为终浓度0.03wt％；诱导培养时间为48h。 

本发明采用内地淡水小球藻为出发藻株，长春花碱和秋水仙素或以甲基硫酸乙酯为诱变剂，培养出比原藻株蛋白含量高出20％56.1％和氧释放量高75％80％，并显著改善自然水系中水华现象。 

本发明有益效果体现在： 

1、本发明用显微多维分光光度法在BDFACSCalibur流式细胞仪或显微多道分光光度系统装置上，再用细胞周期试剂盒做DNA含量测定，测定核DNA含量为对照组2倍，丰度提高1.82倍，叶绿体DNA含量同为对照组2倍，丰度1.7倍，诱导突变最佳时间48h；诱变株蛋白质含量采用考马斯亮蓝G250分光光度法检测，结果表明，试验组比对照组升高27％；叶绿素含量采用Lichtenaler等人改良法测定表明，除叶绿素b有降低外，实验组也比对照组叶绿素a，类胡萝卜素分别提高70％和3.4倍，但叶绿素b的降低可通过培养基中添加(NH₄)₂CO₃200mg而补偿。 

2、本项发明为保证突变藻株DNA不发生回复突变及叶绿体不再聚合；连续高效率促进CO₂的还原而释放氧气，在诱变停止后，除撤去原诱变液，加入新A₂’培养液，在无光照条件下保存5h再光照培养予以解决。 

3、本发明采用质量长春花碱(vinblastine，VLB)和秋水仙碱(colchicine，CCC.)为诱变剂，协同诱导小球藻突变，使小球藻产生的突变能保持叶绿体稳定遗传性，不致因世代传递而产生叶绿体重聚和的回复突变而退化。经15代接种无光培育并野外放养，再取样观察和对水质分析，结果表明，其形态未发生明显改变，水质数据原试验藻株35代接近。 

4、本项发明为了保证所获诱变小球藻的质量，进行了推广应用并检测，采用常规化学分析方法和碘量法对水中N、P、K及含溶氧量进行测定，结果发现该藻株对所测定项目(氮磷钾等)污染水的治理效果不但比对照组提高1-1.3.4倍，而且还能消除恶臭及化学农药污染的整治也有显著效果。 

5、本发明诱变的小球藻，其小球藻核和叶绿体封闭式DNA加倍，提高其自主释放负氧， 达到净化水质和大气生态环境效果，避免或减少生活工业排泄物对水、大气的污染和太阳紫外辐射，净化生态环境，增进人体健康。 

附图说明

图1是本发明采用显微多维快速图像分析法测定的DNA含量。 

图2a、2b是本发明采用显微多维快速图像分析法测定的叶绿体的DNA含量。 

以下通过具体实施方式对本发明技术方案做进一步说明。 

具体实施方式

一、最佳培养基确定 

如表1所示，设常规HB4培养基为对照(Ck)，A₂、A₃、为试验组培养所筛选培养基。Ck中的土壤水所用土壤为没有施过化肥、农药的土壤在三角烧瓶(1.0L)底部铺上1cm厚的土层，随后加入1L蒸馏水高压灭菌30min后，静置24h倾倒出清液即可使用。 

表1小球藻培养基 

将从自然界分离的小球藻出发藻株分别通过以上平板固体培养基光照4天，比较不同培养基上的小球藻生长状况，确定最佳培养基，以A₂所示液体为最优，所生长的小球藻水体4d呈深(翠)绿色；固体培养基所长小球藻在点样处除颜色呈翠绿光泽外，藻落方向为浓密装。对照组为鲜绿色，点样处藻落较小而稀疏，比A₂迟1d2d才长出类似A₂。 

二、小球藻诱变处理 

(1)将从自然水源中分离出的出发小球藻株，采用无菌光照培养箱，在25℃±1℃，光照强度3000Lux条件下，于液体培养基A₂中活化培养1214h；选取生长相对较好，呈墨绿色的藻株作为诱变藻株，挑选后于液体培养基A中纯培养，并作诱变原藻液；所述的液体培养基A₂为每升水中含(NH₄)₂SO₄或NH₄Cl或(NH₄)₂CO₃500mg，MgSO₄·7H₂O或MgCl₂20mg，CaCl₂或CaCO₃10mg，K₂HPO₄1.44g，KH₂PO₃720mg，FeSO₄·7H₂O5mg，CoCl₂·6H₂O2mg，(NH₄)₆MoO₂·4H₂O2mg，H₃PO₃1000mg；pH为6.57.2； 

(2)按长春花碱：秋水仙碱=1∶4质量比混合作为诱导剂，加入到步骤(1)的原藻液中，诱导剂的加入量为终浓度0.01wt0.05wt％，加入后将原藻液于3000Lux、27℃±1℃下培养12120h；诱导结束后，将原藻液离心去上清液后取沉淀，并立即加入无菌液体培养基进行自我修复，先避光5h，然后于25℃±1℃、3000Lux下无菌培养4d至稳定期，经固体培养基纯化培养后得到遗传稳定性好的小球藻突变型稳定的纯种系；所述固体培养基由液体培养基A₂+1.0wt％琼脂得到。其中，长春花碱和秋水仙碱均为市售。 

(3)最佳诱变浓度及诱变时间的选择 

将诱变剂按质量分数0.0％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％分为7个水平，每个水平设置9个因素，利用9因素8水平的正交试验，两种诱变剂相互协同诱导小球藻突变(表2、3)，通过结合小球藻DNA和叶绿体DNA测定吸光谱增加值，筛选出诱变最佳时间并以最佳时间确定最佳诱变剂量。根据对吸收峰积分获得以0.04％0.06％三处吸收峰较高，0.05％为峰尖，最高组是诱变最佳时间，60h以后吸收峰呈下降趋势，96h时的吸收峰值与对照组相近。 

将诱变后的培养物于常温下用8000r离心15min，去清夜，然后各样瓶分别加2mLA₂培养液洗涤，离心去清夜后，再用A₂培养液洗涤离心二次，将不同诱变条件(诱变剂浓度及时间)得出藻株进行诱变后于A₂中进行第一代培养，在设置平行试验的前提下，定时测定生长中藻液的浓度即OD₆₈₀，根据诱变的增长速度及稳定期细胞密度等所获连续数据进行方差分析得到表3，比较行列最后结果的大小得到四种优势诱变藻株，分别是96h0.05％(诱变剂浓度 为0.05％，作用96h，下同，简称M₄)；48h0.05％，，(简称M3)；48h0.03％，(简称M2)；24h0.01％，(简称M1)；对照藻株，即为M0.其中以48h诱变的0.03％浓度最为理想，与细胞周期理论推想一致。 

表2小球藻诱变处理数据表 

表3方差分析结果 

三、诱变后的小球藻生物学特征检测 

(1)叶绿素的测定：叶绿素(chlorophyll)是高等植物及某些低等植物(如绿藻类)进行光合作用的重要物质，同时也是绿色植物主要色素。小球藻主要色素有叶绿素a和叶绿 素b两种。有些藻类植物还含有叶绿素c和叶绿素d。叶绿素a和b的含量比级为3：1，前者呈蓝绿色，后者呈黄绿色。在藻类培养过程中，跟踪测叶绿素含量有助于了解小球藻生长状况。本发明中为快速了解小球藻的生长的状况，测定叶绿素含量采用分光光度法。计算方法是根据朗伯比尔(Lambert Beer)定律，有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度c和液层厚度L成正比。分别以提取溶剂作空白，测定叶绿素提取液吸光度A₆₄₅，A₆₄₃和A₄₇₀然后根据下面公式计算。 

A＝αcL 

其中α为比例常数。当溶液浓度次百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α则为该物质的吸光系数，各种有色物质溶液在不同浓度下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。测定叶绿素时，采用Amion法，以80％的丙酮提取的叶绿素a、b混合液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在663nm下，叶绿素a和b在该溶液中的吸收光系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，即可根据加和性原则列出以下关系式： 

A₆₆₃＝82.04Ca+9.27C_b   (1) 

A=16.75Ca+45.60C_b   (2) 

解方程组(1)、(2)得： 

Ca=12.72A63-4.67A645   (3) 

C_b=22.88A645—4.67A663   (4) 

再Ca与C_b相加，即得小球藻叶绿素总量Cr： 

Cr=Ca+C_b＝20.24+8.05A₆₆₃   (5) 

此外，因叶绿素a、b在652nm处的吸收峰相等，两者有相同的吸收系数(均为34.5)，可以在此波长下测吸光度(A₆₄₂nm)而求出叶绿素总量： 

Cr=A₆₅₂×1000/34.5   (6) 

然而，在叶绿素存在条件下，根据Lichtenaler等对80％丙酮提取液中的三种色素含量的计算公式，用分光光度法还可以同时测定小球藻溶液中的类胡萝卜素的含量。 

Ca=12.214A663-7.18A646   (7) 

C_b=20.134A646-5.03A663   (8) 

Cx=(1000A47-3.27Ca-104Cb)/229   (9) 

上述式中Ca、C_b分别为小球藻一定时间内叶绿素a、b的浓度，Cx为类胡萝卜素的总浓度， A₆₆₃、A₆₆₄和A₄₇₀分别为叶绿体色素提取液于波长在663nm、646nm和470nm时的吸光度。 

但是，有时为了节约费用和方便，根据叶绿体色素在不同提取溶剂中吸收光谱存在差异。计算公式有所不同，叶绿素a、b在95％乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm。类胡萝卜素的最大吸收峰波长不变，据此列出下列关系式： 

Ca=13.95A665—6.88A649   (10) 

C_b＝24.96A649—7.32A665   (11) 

Cx＝(1000A470—2.05Ca-114.8Cb)/245   (12) 

使用何种分光光度计合适？看应用于何种场合，一般采用国产可见光分光度计即可，本项发明采用UV-3000型(日本)分光光度计。实验组的叶绿素a比对照组提高70％，类胡萝卜素提高3.4倍。 

(2)小球藻生长中蛋白质合成高高峰的跟踪测定 

蛋白质是活细胞生命活动的重要标志，反映细胞在不同发育分化阶段大分子拥挤环境的变化规律，从而能准确把握细胞生长所处的状态，达到节省培养时间和营养消耗。结合显微多道分光光度计法采用动态激光散射仪应用于对脱壁后细胞通过对细胞内粒子线径经大小、种类及分布的观察，测定细胞M1M4的每个时期蛋白质合成，然后确定静止细胞培养进入后期处理。试验的蛋白质比对照组提高27％。 

(3)单个全功能细胞水平的核酸测定，发现核和叶绿体DNA显著提高 

细胞是生物组织基本结构单元和生命活动的基础，其生命活动与整个细胞运动状态有关，异质性导致细胞在化学组成、生理响应时间等方面的差异，这种异质性群体细胞中单个特异细胞的结构和功能的分析测定，则既是了解单个细胞和群体细胞间的协同效应、细胞之间的关系及进行生物模拟研究的重要基础，又是为了解DNA量变化通过快速显微用来分析提供极为重要的依据。本发明即采用显微多维快速图像分析法，直接对活的完整细胞通过DNA特征吸收光谱的测定发现试验组核DNA含量提高1.82倍(图1)，叶绿体的DNA含量提高1.70倍(图2)。 

四、诱变后的小球藻的培养与应用 

将诱变的突变藻株转移至装有含有132mg/L市面供应的(NH₄)₂CO₃的A₂作为叶绿素合成的原料，增强光合作用效率，提高O₂释放量。发酵罐里进行无光下扩大培养，供作对水质净化使用，若用于高磷化合物污水治理，则将A₂培养基中的磷酸盐予以降低一半进行配制。 

五、诱变后的小球藻进化污染水效果的测试 

设水池7个，其中一个作为对照组。氮磷钾含量试验测定都设2个作为实验平行组。面积规格均为10×5m²，深80cm；小球藻施放量分别为1.875×10⁶cell/mL、3.75×10⁷cell/mL、7.50×10⁸cell/mL；试验时间19d，试验前一天测定本底水质指标；试验期间，测定水温、pH、DO、透明度、总氮、总磷、氨氮、硝酸氮、亚硝酸氮、高锰酸钾盐指数；将显微镜与血液平板计数器组合观察藻株种类并计数【线状体以条数统计，其他均以细胞计，优势种类生物量按测试体积(比重为1)计算，一般种类依公式Y=1.02X-0.068计算生物量(Y为生物鲜重，mg/L；X为藻类细胞密度，cell/L)浮游生物分类计数后查表计算】；总氮、总磷、硝酸氮、亚硝酸氮、高锰酸钾盐指数测定均按水质常规分析法进行。 

(1)试验设计 

表4藻株浓度梯度实验设计 

(2)藻株对水体氨氮的影响 

表5藻株对水体氨氮的影响(单位：mg，日期：d) 

(3)藻株对水体亚硝酸氮的影响 

表6藻株对水体亚硝酸氮的影响(单位：mg，日期：d) 

(4)藻株对水体硝酸氮的影响 

表7藻株对水体硝酸氮的影响(单位：mg，日期：d) 

(5)藻株对水体总氮的影响 

表8藻株对水体总氮的影响(单位：mg，日期：d) 

(6)绿藻对水体总磷的影响 

表9藻株对水体总磷的影响(单位：mg，日期：d) 

(7)绿藻对水体高锰酸钾指数的影响 

表10藻株对水体高锰酸钾指数的影响(单位：mg，日期：d) 

(8)溶解氧含量测定 

采用GB748987即碘量法(Iodometric)，与国际标准ISO5813-1983等效。该方法是测定水中溶解氧基准方法，使用化学检测方法是最早用于检测溶解氧的方法。其原理是在水样中加入硫酸锰和碱性碘化钾，生成氢氧化锰沉淀，反应式如下： 

4MnSO₄+8NaOH→Mn(OH)₂+Na₂SO₄(1) 

2Mn(OH)₂+O₂＝2H₂MnO₃↓(2) 

2H₂MnO₃+2Mn(OH)₃＝2Mn₂O₃＝4H₂O(3) 

藻株对水体溶氧量的影响见表11 

表11绿藻对水体溶氧量的影响(单位：mg，日期：d) 

上述实验结果表明，用化学方法诱变的小球藻可以对氮磷钾污染(尤其是含氮较高的水质)治理，消除恶臭，此外还可以对重金属污染的水质整治及化学农药的降解有较好的治理效果。体现了突变小球藻对水质污染治理有较好的应用前景。 

发明人根据本发明诱导方法保存了其中一株小球藻株CP2012(即M₄)，该菌株目前保藏在安徽农业大学生命科学院实验室内，申请人可以在该申请受理之日起20年内向社会公众提供该存活菌株，当然科研人员也可以通过本发明方法直接获得与该菌株功能相同的且遗传稳定性好的核和叶绿体DNA均加倍小球藻(Chlorella Vulgaris Beijerinck)。 

Claims (2)

1.一种提高小球藻光合作用效率的化学复合诱变方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将从自然水源中分离出的出发小球藻株，采用无菌光照培养箱，在25℃±1℃，光照强度3000Lux条件下，于液体培养基A₂中活化培养12-14h；选取生长相对较好，呈墨绿色的藻株作为诱变藻株，挑选后于液体培养基A中纯培养，并作诱变原藻液；所述的液体培养基A₂为每升水中含(NH₄)₂SO₄ 或NH₄Cl或(NH₄ )₂CO₃ 500mg，MgSO₄·7H₂O或MgCl₂ 20mg，CaCl₂或CaCO₃ 10mg，K₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₃720mg，FeSO₄·7H₂O 5mg， CoCl₂·6H₂O 2mg，(NH₄)₆MoO₂·4H₂O 2mg，H₃PO₃ 1000mg；pH为6.5-7.2；

（2）按长春花碱：秋水仙碱=1:4质量比混合作为诱导剂，加入到步骤（1）的原藻液中，诱导剂的加入量为终浓度0.01wt-0.05wt%，加入后将原藻液于3000Lux、27℃± 1℃下培养12-120h；诱导结束后，将原藻液离心去上清液后取沉淀，并立即加入无菌液体培养基进行自我修复，先避光5h，然后于25℃±1℃、3000Lux下无菌培养4d至稳定期，经固体培养基纯化培养后得到遗传稳定性好的小球藻突变型稳定的纯种系；所述固体培养基由液体培养基A₂+1.0wt%琼脂得到。

2.根据权利要求1所述的一种提高小球藻光合作用效率的化学复合诱变方法，其特征在于，所述步骤（2）诱导剂的加入量为终浓度0.03wt%；诱导培养时间为48h。

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