CN103153301A - 治疗方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了肾炎综合征的生化基础,并提供和解释了观察到的蛋白尿和其它效应。结果,本公开内容提供了用于治疗和/或预防肾病综合征的方法以及用于减轻与肾病综合征有关的征状的方法。本公开内容另外提供了用于减轻肾病综合征中的蛋白尿和本文讨论的其它疾病状态的方法。
Description
关于联邦资助研究的声明
联邦政府为本文所述的工作提供了资金支持,政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本公开内容涉及用于治疗和预防肾病综合征、糖尿病病症及其相关病症的方法。
背景技术
肾病综合征是由损伤损伤肾(特别是称作足细胞的专门化细胞和肾小球基膜)的各种障碍造成。糖尿病肾病和膜性肾小球肾炎(也称作膜性肾病)是成年人的常见原因,而轻微改变型肾病是儿童的最常见原因。肾病综合征的特征包括:尿中蛋白损失(蛋白尿)、高脂血症(高胆固醇血症和高甘油三酯血症)、低白蛋白血症(低血液白蛋白或蛋白水平)和水肿。蛋白尿被定义为,过量血清蛋白在尿中的存在。白蛋白尿(蛋白尿的一种特定类型)是这样的病理学状况:其中白蛋白存在于尿中。
足细胞(或内脏上皮细胞)是在肾的肾小球毛细血管袢中的细胞。肾小球过滤血液,阻挡大分子(诸如蛋白),并允许小分子(诸如水、盐和糖)穿过,作为形成尿的第一步。足细胞的长突或“足突”围绕毛细血管,并在它们之间形成缝隙。穿过这些缝隙来过滤血液。受肾病综合征影响的肾在足细胞中具有小孔,所述小孔大至足以允许蛋白经过,从而造成蛋白尿。
当蛋白损失在尿中时,它的血液浓度下降,因而允许水迁移进身体的其它部位,这导致肿胀(称作水肿)。水肿常见于脚和腿、腰部或腹部(腹水)和眼周围,但是可以发生在任何地方,特别是响应于重力。另外,因为这种停留在体内的额外流体,人们经常增加体重、经历疲劳,且可能发现他们经常排尿更少。
许多病症被归类为肾病综合征,包括轻微改变型肾病(MCD)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性肾病(MN)(也称作膜性肾小球肾炎,MGN)和膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。多年来,当在光学显微镜下观察样本时,病理学家没有发现MCD组织中的变化,因此得名轻微改变型肾病。随着电子显微术的出现,现在已知是该疾病的标志的变化包括:足细胞足突的扩散损失,足细胞足突的空泡形成,和微绒毛在内脏上皮细胞上的生长。在发达国家,糖尿病肾病是肾病综合征的最常见原因。
降解甘油三酯的酶(诸如脂蛋白脂肪酶)的活性的变化,可能引起高甘油三酯血症(2-4)。
肾病综合征的分子基础是未知的。此外,有待确立蛋白尿和糖皮质激素敏感性在肾病综合征中的联系以及蛋白尿和高甘油三酯血症(肾病综合征的2种关键组分)之间的关联。设计成减轻蛋白尿的疗法,进一步使疾病机理的研究复杂化。例如,用于治疗MCD中的蛋白尿的糖皮质激素会独立地升高血浆甘油三酯水平(5),且在某些形式的肾病综合征(诸如MCD)中,血浆甘油三酯水平的正常化落后于蛋白尿对糖皮质激素的应答(6)。
本公开内容披露了肾病综合征的生化基础(通过MCD模型来例证),并解释了观察到的蛋白尿和其它效应。结果,本公开内容提供了用于治疗和/或预防肾病综合征(诸如但不限于、糖尿病肾病、MCD、FSGS、MN/MGN和MPGN)的方法,以及减轻与肾病综合征有关的征状(包括、但不限于、蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低白蛋白血症和水肿)的方法。本公开内容另外提供了治疗和预防糖尿病病症及其生理效应的方法。
附图说明
图1A-1I显示了在实验MCD和人MCD中的Angptl4mRNA和蛋白表达。
图1A显示了肾毒血清(NTS)诱发的异相(heterologous phase)蛋白尿的诱导(n=4只大鼠/组);***P<0.001。
图1B表明,在图1A所示的肾毒血清(NTS)诱发的异相蛋白尿过程中,肾小球Angptl4mRNA表达被增量调节(n=4只大鼠/组);***P<0.001。
图1C表明,注射了NTS的Angptl4-/-小鼠(n=4小鼠/组)形成显著更低的白蛋白尿,这指示Angptl4在疾病过程中的作用;*P<0.05。
图1D表明,与Angptl4+/+小鼠中的扩散展平相比,注射了NTS的Angptl4-/-小鼠(n=4小鼠/组)形成仅30%的足突展平。
图1E通过共焦成像表明,在正常大鼠肾小球中的Angptl4与足细胞蛋白CD2AP共局部化,这指示在足细胞中的表达。用重组Angptl4吞并抗-Angptl4抗体的反应性,会消除免疫反应性。
图1F表明,在从第3天开始注射单次剂量的嘌呤霉素氨基核苷(PAN模型)以后,观察到Angptl4的显著的肾小球mRNA增量调节(在不同研究中,峰值最高达80倍增加)。在PHN中形成更少的增量调节,使用筛过的肾小球或通过激光捕获显微切割(LCM)分离的肾小球,在抗-Thy1.1肾炎或非-HIV塌陷性局灶性和节段性肾小球硬化症(CG)的大鼠模型中,没有检测到显著变化[显著性阈值是3倍变化(7)]。
图1G表明,在注射单次剂量的嘌呤霉素氨基核苷(PAN模型)以后第6天,肾小球具有增加的Angptl4表达(红色),所述表达与GBM类肝素硫酸蛋白聚糖(白色,PAN强度减小)和足细胞去氧肾上腺素(绿色)部分地重叠(白色箭头)。
图1H显示了PAN模型第6天肾的免疫金EM,证实了在足细胞(黄色箭头)和GBM(黑色箭头)中的金颗粒;放大率:EM40,000x。
图1I表明,得自MCD患者(n=5位患者)的肾活组织检查揭示增加的Angptl4肾小球表达(红色),所述表达与去氧肾上腺素和GBM层粘连蛋白大量重叠,与内皮PECAM1染色仅在边缘重叠;放大率:光学显微术400x。
图2显示了雄性Angptl4转基因大鼠的制备和表征。
图2A显示了对Angptl4在足细胞中的过表达而言特异性的足细胞的转基因的(TG)大鼠模型。
图2B显示了Angptl4mRNA的组织特异性的过表达(n=3只大鼠/组),其与在足细胞中的表达相一致;***P<0.001。
图2C显示了得自3月龄杂合TG大鼠(n=3只大鼠/组)的PAS染色的切片,并揭示了正常的形态学(放大率400x),在NPHS2-Angptl4TG大鼠中具有显著的足细胞(箭头)。
图2D显示了在NPHS2-Angptl4TG大鼠(n=3只大鼠/组)中的共焦成像和揭示的增加的Angptl4蛋白的肾小球表达(放大率400x),所述表达与足细胞去氧肾上腺素(放大率630x)和GBM层粘连蛋白(放大率630x)重叠。
图2E表明,在5个月龄之前,在纯合的NPHS2-Angptl4 TG大鼠中,在EM上观察到扩散的足突展平。
图2F显示了这些大鼠的免疫金EM分析,并揭示了从1个月龄时含有金颗粒簇和分散的GBM颗粒的完整足突(FP)的进展,至含有GBM金颗粒簇的部分展平,对面是达到内皮(ENDO)表面的展平足突(EFP),最后是在5个月龄之前在GBM中含有致密金颗粒簇的扩散展平。电子显微术放大率15,000x-40,000x。
图3显示了Angptl4过表达与蛋白尿的关联。
图3A表明,雌性纯合的NPHS2-Angptl4TG大鼠发展成显著的白蛋白尿(n=6只大鼠/组);*P<0.05;**P<0.01,***P<0.001。
图3B表明,雄性杂合的NPHS2-Angptl4TG大鼠发展成显著的白蛋白尿(n=6只大鼠/组);*P<0.05;**P<0.01,***P<0.001。
图3C表明,雄性纯合的NPHS2-Angptl4TG大鼠发展成显著的白蛋白尿(n=6只大鼠/组);**P<0.01。
图3D显示了尿蛋白的GelCode蓝染色的SDS PAGE评估(3μg/泳道,除了MCD缓解以外),随后进行条带的密度测定法(n=3次读出/值),并证实了白蛋白尿(在70kDa的完整白蛋白带,箭头)在与人MCD类似的NPHS2-Angptl4 TG大鼠中的优势。
图3E显示了使用抗-V5抗体来特异性地检测3个月的杂合TG雄性大鼠中的转基因蛋白的免疫金EM,并显示了在NPHS2-Angptl4 TG大鼠的展平的足突(EFP)和GBM中的金颗粒;EM40,000x。
图3F表明,与野生型同胞仔(n=8只大鼠/组)相比,PAN在杂合的雄性NPHS2-Angptl4中的诱导(低剂量)会恶化蛋白尿;*P<0.05;**P<0.01,***P<0.001。
图3G表明,从PAN诱导以后1天开始隔日用糖皮质激素(PAN-S)处理的大鼠表现出第6天蛋白尿的短暂下降(n=4只大鼠/组);*P<0.05;**P<0.01,
图3H是得自3G的研究的肾小球基因表达的研究,并证实,Angptl4是糖皮质激素敏感的基因。*P<0.05;**P<0.01
图4显示了Angptl4唾液酸化与蛋白尿的关联。
图4A显示了得自灌注的肾小球的蛋白质的二维凝胶电泳(200μg蛋白/凝胶)和蛋白质印迹(上图,对照;中图,PAN;下图,PAN+加入糖皮质激素)。在对照图中,分析揭示了少量的Angptl4的片段(红色箭头;1)和单体(黄色箭头;2)的存在,和更大量的迁移至中性或高pI的Angptl4的低阶寡聚体(粉红色箭头;3)的存在。在PAN第6天(中图),高和中性pI寡聚体形式增加(粉红色箭头,3;橙色箭头,4),而糖皮质激素处理(参见图3G)会钝化该增加(下图)。在迁移至中性pI处的Angptl4中,片段可与抗-磷酸苏氨酸抗体反应,而寡聚体可与结合唾液酸的凝集素MAA反应(为PAN例证,摘录自独立印迹)。
图4B显示了得自图4A的蛋白质印迹的密度测定法分析;**P<0.01;***P<0.001。
图4C显示了得自Angptl4-HEK293稳定细胞系的蛋白的二维凝胶电泳(150μg蛋白/凝胶)和蛋白质印迹,所述蛋白与对照一起温育,并用针对MAA卵磷脂的抗体(上图)、抗-Angplt4抗体(中上图)探测;与唾液酸前体ManNAc(25mM)一起温育Angptl4-HEK293稳定细胞系,并用抗-Angptl4抗体探测(中下图),与唾液酸前体ManNAc(25mM)一起温育Angptl4-HEK293稳定细胞系,并用针对MAA卵磷脂的抗体探测(下图)。浓缩上清液的分析揭示从高pI形式(在中上图中的绿色箭头和线)向中性pI形式(在中下图和下图中的蓝色箭头)的迁移,所述中性pI形式是MAA反应性的。
图4D表明,给NPHS2-Angptl4TG大鼠饲喂在自来水中的1mg/ml ManNAc12天(d),会造成18小时白蛋白尿的显著下降(在第12天的最低点是基线的59.4+3.3%),其在12天清除以后恢复至基线值,并在清除的第24天接近未处理的对照NPHS2-Angptl4 TG大鼠值(图6中的各个描记图和初步研究数据)。在图d中,所有*差异都是相对于基线值。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
图5显示了由HEK293稳定细胞系生产的重组Angptl4的表征。
图5A显示,用pcDNA-大鼠Angptl4-V5-His表达构建体系稳定转染的HEK293细胞表现出与对照空载体细胞系相比55,000倍的Angptl4mRNA表达增量调节。***P<0.001
图5B显示,在无血清条件下,Angptl4-HEK293细胞将基本上完整的蛋白分泌进上清液中(通过二维凝胶电泳和使用免疫前血清和抗-Angptl4抗体的蛋白质印迹证实)。
图5C显示了200μg人血浆的二维凝胶电泳(n=4患者/组),并证实,仅在具有MCD复发的患者中,观察到55-70kDa pI 8-8.5Angptl4蛋白的升高的循环水平(在MCD复发图中的椭圆形)。在MCD复发的患者中观察到中性PI单体和寡聚体的增加的循环水平(在MCD复发图中的箭头),在MN患者中仅观察到单体的增加的循环水平(MN图中的箭头)。
图6显示,ManNAc的施用会减轻大鼠模型的白蛋白尿。
图6A显示了得自重度白蛋白尿的NPHS2-Angptl4 TG大鼠的初步研究的白蛋白尿的代表性描记图,所述大鼠接受递增剂量的ManNAc(1-8mg/ml)。研究揭示,ManNAc会减轻这些动物的白蛋白尿。
图6B显示了得自完成了研究并用ManNAc(1mg/ml)治疗的NPHS2-Angptl4TG大鼠研究组的各个描记图。在研究开始之前,间隔12天收集2份尿,以确保这些大鼠形成随着时间增加的白蛋白尿。研究揭示,ManNAc(1mg/ml)会减轻这些动物的白蛋白尿。
图6C显示了使用抗-Angptl4抗体或凝集素SNA I,得自第12天ManNAc或对照TG大鼠的肾小球的二维电泳和蛋白质印迹法(200μg蛋白/凝胶)(n=3印迹/条件)。可再现的中性pI Angptl4斑点具有红色椭圆形框边(1),高pI Angptl4斑点具有绿色椭圆形框边(2)。中性pI斑点也可与结合唾液酸的凝集素SNA I反应。
图6D显示了图6C的Angptl4斑点的密度测定法,并指示ManNAC饲喂的大鼠中的中性pI形式的百分比的显著增加。***P<0.001。
图7显示了具有嘌呤霉素氨基核苷肾病(PAN模型)的ManNAc治疗的大鼠的肾病综合征参数的改善。在图7A-7D中,大鼠(n=5只大鼠/组)接受单次静脉内注射的嘌呤霉素氨基核苷(10mg/100克),并在第4天开始用在自来水中的ManNAC(80mg/Kg体重)治疗,这与蛋白尿的发作同时。
图7A显示了在嘌呤霉素氨基核苷施用后第6天,ManNAc治疗的大鼠中的蛋白尿的显著减轻。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
图7B显示了在嘌呤霉素氨基核苷施用后第6天,ManNAc治疗的大鼠中的血浆白蛋白水平的显著提高。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
图7C显示了在嘌呤霉素氨基核苷施用后第6天,ManNAc治疗的大鼠中的高胆固醇血症的显著减轻。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
图7D显示了在嘌呤霉素氨基核苷施用后第6天,ManNAc治疗的大鼠中的高甘油三酯血症的显著减轻。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
图8显示了ManNAc治疗对糖尿病动物的蛋白尿的影响。
图8A显示了得自糖尿病的db/db和对照db/m小鼠的肾小球的二维凝胶电泳和使用抗-Angptl4抗体的蛋白质印迹分析。结果表明糖尿病小鼠肾小球中的Angptl4表达与对照相比增加,包括涉入蛋白尿的发病机制中的高pI形式。
图8B显示了得自Zucker糖尿病肥胖大鼠和对照血糖正常大鼠的肾小球的二维凝胶电泳和使用抗-Angptl4抗体的蛋白质印迹分析。结果表明得自Zucker糖尿病肥胖大鼠的大鼠肾小球中的Angptl4表达与对照相比增加,包括涉入蛋白尿的发病机制中的高pI形式。
图8C表明,ManNac治疗会减轻Zucker糖尿病肥胖大鼠的蛋白尿。以70和140mg/Kg,用在自来水中的ManNAc或用纯自来水,治疗13周龄雄性Zucker糖尿病肥胖大鼠(n=4只大鼠/组)。在ManNAc治疗组中观察到蛋白尿的显著减轻。*P<0.05;**P<0.01。
图9显示了来自不同物种的Angptl4的氨基酸和cDNA序列。SEQ ID NO.1和2显示了来自人的氨基酸和cDNA序列(蛋白变体1同种型a,长形式;在位置40和161-164处的标有下划线的氨基酸序列);SEQ ID NO.3和4显示了来自人的氨基酸和cDNA序列(蛋白变体3同种型b,短形式;在位置40和161-164处的标有下划线的氨基酸序列);SEQ ID NO.5和6显示了来自大鼠的氨基酸和cDNA序列;SEQ ID NO:7和8显示了来自小鼠的氨基酸和cDNA。
发明内容
在第一个方面,本公开内容提供了受试者的肾病综合征的治疗和/或预防的方法。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为轻微改变型肾病(MCD)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性肾病(MN)/膜性肾小球肾炎(MGN)膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。所述方法包括下述步骤:给受试者施用唾液酸或唾液酸前体。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用,单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的施用会恢复在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化,从而治疗或预防所述受试者的肾病综合征。
在第二个方面,本公开内容提供了治疗和/或预防受试者的MCD的方法。所述方法包括下述步骤:给受试者施用唾液酸或唾液酸前体。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用,单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的施用会恢复在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化,从而治疗或预防所述受试者的肾病综合征。
在第三个方面,本公开内容提供了减轻肾病综合征的一种或多种征状(例如,但不限于、蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和水肿)的方法。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。所述方法包括下述步骤:给受试者施用唾液酸或唾液酸前体。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用,单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的施用会恢复在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化,从而减轻所述受试者的肾病综合征的一种或多种征状。
在第四个方面,本公开内容提供了用于减轻受试者中的蛋白尿的方法。在一个实施方案中,所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中,所述受试者正在遭受糖尿病病症,例如,但不限于,糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中,所述蛋白尿是由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。所述方法包括下述步骤:给受试者施用唾液酸或唾液酸前体。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用,单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的施用会恢复在蛋白尿的诱导中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化,从而减轻所述受试者的蛋白尿。
在第五个方面,本公开内容提供了减轻受试者的水肿的方法。在一个实施方案中,所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个具体的实施方案中,所述水肿是由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。所述方法包括下述步骤:给受试者施用唾液酸或唾液酸前体。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用,单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的施用会恢复在水肿的诱导中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化,从而减轻所述受试者的水肿。
在第六个方面,本公开内容提供了减轻受试者的高胆固醇血症的方法。在一个实施方案中,所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个具体的实施方案中,所述高胆固醇血症是至少部分地由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。所述方法包括下述步骤:给受试者施用唾液酸或唾液酸前体。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用,单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的施用会恢复在高胆固醇血症的诱导中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化,从而减轻所述受试者的高胆固醇血症。
在第七个方面,本公开内容提供了减轻受试者的高甘油三酯血症的方法。在一个实施方案中,所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个具体的实施方案中,所述高甘油三酯血症是由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。所述方法包括下述步骤:给受试者施用唾液酸或唾液酸前体。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用,单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的施用会恢复在高甘油三酯血症的诱导中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化,从而减轻所述受试者的高甘油三酯血症。
在第八个方面,本公开内容提供了治疗和/或预防糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病的方法。在一个具体的实施方案中,前述病症是由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。所述方法包括下述步骤:给受试者施用唾液酸或唾液酸前体。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用,单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的施用会恢复多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化,从而治疗或预防所述受试者的前述病症。
在第九个方面,本公开内容提供了一种组合物,所述组合物用于第一个至第八个方面的方法中。所述组合物包含唾液酸或一种或多种唾液酸前体。在一个实施方案中,所述唾液酸前体是ManNAc。在一个替代实施方案中,所述唾液酸前体是ManNAc的衍生物。这样的组合物可以含有ManNAc和一种或多种ManNAc衍生物以及第二种药剂。
在第十个方面,本公开内容提供了针对肾病综合征或糖尿病病症来测定受试者的状态的方法。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病。在一个实施方案中,这样的方法测定所述受试者中的:与肾病综合征或糖尿病病症有关的多肽(例如,但不限于,Angptl4)的水平,与肾病综合征或糖尿病病症有关的多肽(例如,但不限于,Angptl4)的唾液酸化水平,或前述水平的组合。从所述受试者测得的所述多肽的量和/或唾液酸化水平,可以与得自被诊断为未患肾病综合征或糖尿病病症的受试者(对照受试者)的对应量和水平进行对比。这样的量和水平也可以与参比标准进行对比。与对照受试者或参比标准相比唾液酸化水平的降低,指示所述受试者正在遭受肾病综合征或糖尿病病症或处于所述病症的风险中;可以针对高pI形式的多肽(其被低唾液酸化)来测定唾液酸化水平。
在第十一个方面,本公开内容提供了在接受肾病综合征或糖尿病病症治疗的受试者中测定肾病综合征或糖尿病病症的治疗效力的方法。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病。在治疗过程中从所述受试者测得的所述多肽的量和/或唾液酸化水平,可以与开始治疗之前得自所述受试者的对应量和/或水平进行对比。与开始治疗之前测得的唾液酸化水平相比,所述接受治疗的受试者中的唾液酸化水平的增加,指示所述治疗具有希望的作用;可以针对高pI形式的多肽(其被低唾液酸化)来测定唾液酸化水平。此外,在治疗过程中从所述受试者测得的多肽的量和/或水平,可以与被诊断为未患肾病综合征或糖尿病病症的受试者(对照受试者)的对应量和/或水平进行对比。这样的量和水平也可以与参比标准进行对比。在治疗过程中从所述受试者得到的等于或接近得自对照受试者的唾液酸化水平或参照的唾液酸化水平,指示所述治疗具有希望的作用;可以针对高pI形式的多肽(其被低唾液酸化)来测定唾液酸化水平。
在第十二个方面,本公开内容提供了鉴别化合物的方法,所述化合物可有效地治疗或预防肾病综合征、糖尿病病症或与其有关的病症。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病。一般而言,这样的筛选方法包括下述步骤:提供试验系统(在下面更详细地描述),所述试验系统表达在肾病综合征或糖尿病病症的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于,Angptl4),向所述试验系统中引入要测试的实验化合物,并测定所述实验化合物对所述多肽的唾液酸化水平的影响。
具体实施方式
在下面的讨论中,将为了背景和介绍目的而描述某些物品和方法。本文包含的任何内容都不应解释为现有技术的“承认”。申请人明确地保留下述权利:在适当时,在适用的法律允许下,证实在本文中提及的物品和方法不构成现有技术。
在研究肾病综合征和与其有关的蛋白尿的发病机制时,将γ2-肾毒血清(NTS,针对完整的肾小球产生的血清)注射进大鼠中,并鉴别出一组差别地表达的肾小球基因(7)。鉴别出了以前不知道涉入肾病综合征和蛋白尿的发病机制中的2个基因。这些基因之一编码在足细胞中表达的转录因子锌指和同源框3(ZHX3),且现在已经被证实在MCD的发病机制中起关键作用(7)。第二个基因(血管生成素-样4,ANGPTL4)在足细胞中显著地增量调节。在人肾小球疾病的动物模型中,分析了ANGPTL4基因的表达,所述动物模型包括:嘌呤霉素肾病(PAN),即一种MCD模型,被动海曼肾炎(PHN),即一种膜性肾病(MN)模型,和抗-Thy1.1肾炎,即一种肾小球系膜损伤模型。
血管生成素-样蛋白已经涉入高甘油三酯血症的形成和肿瘤转移,且在功能上不同于血管生成素。Angptl4是在肝和脂肪组织中高度表达的PPARγ(8)和PPARα(9)靶基因,在白脂肪组织和肝中被禁食强烈诱导,且是在含氧量正常条件下血管内皮细胞的细胞凋亡存活因子(10)。Angptl4是的一种有效的LPL抑制剂(11),其在静脉内注射或腺病毒介导的表达以后,诱导显著的高甘油三酯血症(12,13)。其它研究证实了Angptl4在心肌细胞和骨骼肌中的更少表达,并通过RNA印迹分析证实了在全肾中的低水平表达(8)。最近的基于人群的ANGPTL4基因研究揭示了影响人类的甘油三酯水平的变体(14,15)。
以前尚未报道Angptl4在蛋白尿中的作用。本公开内容证实了足细胞分泌的Angptl4在肾病综合征和糖尿病病症的病原学中的确定作用。本公开内容首次证实,大部分足细胞分泌的Angptl4在一种实验形式的肾病综合征中被低唾液酸化,并且提高唾液酸化会显著减轻蛋白尿、水肿、高胆固醇血症和高甘油三酯血症,并使Angptl4的电泳迁移正常化。Angptl4是直接涉入肾病综合征的发病机制中的第一种糖皮质激素敏感的基因,也是肾病综合征中的蛋白尿和高甘油三酯血症之间的第一直接联系。在图8中显示了得自人(蛋白变体1同种型a,长形式,和蛋白变体3同种型b,短形式)、大鼠和小鼠的Angptl4氨基酸和cDNA序列。
定义
本文使用的术语“预防”、“抑制”表示,在疾病或病症的征状、表现或特征出现之前,开始动作过程(诸如施用化合物或药物组合物),从而预防或减轻这样的征状、表现或特征。这样的预防和抑制不需要是绝对有用的。
本文使用的术语“治疗”表示,在疾病或病症的征状、表现或特征出现之后,开始动作过程(诸如施用化合物或药物组合物),从而消除或减轻这样的征状、表现或特征。这样的治疗不需要是绝对有用的。
本文使用的术语“需要治疗”表示,看护人员做出的患者需要治疗或将受益于治疗的判断。该判断是基于多种因素而做出,所述因素是在看护人员经验范围内,但是所述经验包括患者患病或将患病的知识,所述患病是本公开内容的方法或化合物可治疗的疾病或病症的结果。
本文使用的术语“需要预防”表示,看护人员做出的患者需要预防或将受益于预防的判断。该判断是基于多种因素而做出,所述因素是在看护人员经验范围内,但是所述经验包括患者患病或将患病的知识,所述患病是本公开内容的方法或化合物可治疗的疾病或病症的结果。
本文使用的术语“个体”、“受试者”或“患者”表示任意动物,包括哺乳动物,诸如小鼠、大鼠、其它啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物和人类。该术语可以特指雄性或雌性或二者,或排除雄性或雌性。
本文使用的术语“治疗有效量”表示,单独的或作为药物组合物的一部分的化合物的量,所述量能够对疾病或病症的任何征状、表现或特征产生任何可检测的积极作用。这样的作用不需要是绝对有益的。当提及唾液酸或唾液酸前体时,术语“治疗有效量”表示,足以恢复多肽(例如,但不限于,Angltl4)的正常唾液酸化模式的唾液酸或唾液酸前体的量,或者足以减轻受试者的蛋白尿或其它肾病综合征征状的唾液酸或唾液酸前体的量。
术语“药学上可接受的衍生物”是指,本公开内容的唾液酸或唾液酸前体的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐、溶剂化物或其它衍生物,其在施用给受试者以后,能够(直接地或间接地)提供本公开内容的唾液酸或唾液酸前体或其代谢物或残余物。特别有利的衍生物是这样的衍生物:当被施用给受试者时,其会增加本公开内容的唾液酸或唾液酸前体的生物利用度(例如,通过允许口服施用的化合物更容易地吸收进血液中),增强唾液酸前体向给定的生物学隔室的递送,增加溶解度以允许注射给药,改变代谢或改变排泄速率。在一个实施方案中,所述衍生物是前体药物。
除非另有说明,否则术语“药学上可接受的盐”包括,可能存在于本公开内容的唾液酸或唾液酸前体中的酸性或碱性基团的盐。
术语“约”和“大约”应通常表示,对于描述测量的属性和精密度的测量的量而言,可接受程度的误差或变异。通常,误差或变异的示例性程度是在给定值或者数值范围的20%以内,优选10%以内,更优选在5%以内。对于生物学系统,术语“约”表示可接受的误差标准差,优选地不超过给定值的2倍。除非另有说明,否则本文给出的数值的量都是近似的,这意味着,在没有明确地表明时,也可以推测术语“约”或“大约”。
治疗和预防方法
本公开内容提供了治疗和/或预防肾病综合征的方法。本公开内容另外提供了治疗和/或预防MCD的方法。本公开内容另外提供了减轻肾炎综合征的一种或多种征状(例如,但不限于、蛋白尿,高胆固醇血症,高甘油三酯血症和水肿)的方法。此外,本公开内容提供了减轻蛋白尿的方法。此外,本公开内容提供了减轻水肿的方法。本公开内容也提供了用于减轻高胆固醇血症和高甘油三酯血症的方法。本公开内容也提供了用于治疗和/或预防糖尿病病症或与其有关的生理状况的方法。本公开内容另外提供了药物组合物,其包含唾液酸或一种或多种唾液酸前体或前述的组合。
在一个实施方案中,本公开内容的教导提供了需要这种治疗或预防的受试者的肾病综合征的治疗和/或预防。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。这样的方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸或唾液酸前体。这样的施用会恢复在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化。这样的施用由此治疗和/或预防所述受试者的肾病综合征。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用。此外,所述唾液酸或唾液酸前体可以单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的方法可以另外包括:鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。
在一个替代实施方案中,本公开内容的教导提供了需要这种治疗或预防的受试者的MCD的治疗和/或预防。这样的方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸或唾液酸前体。这样的施用会恢复在MCD的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化。这样的施用由此治疗和/或预防所述受试者的MCD。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用。此外,所述唾液酸或唾液酸前体可以单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的方法可以另外包括:鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。
在其它实施方案中,本公开内容的教导提供了减轻肾病综合征的一种或多种征状(例如,但不限于、蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和水肿)的方法。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。这样的方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸或唾液酸前体。这样的施用会恢复在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化。这样的施用由此减轻肾病综合征的一种或多种征状,例如,但不限于、蛋白尿和水肿,所述受试者的肾病综合征。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用。此外,所述唾液酸或唾液酸前体可以单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的方法可以另外包括:鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。
在另一个实施方案中,本公开内容的教导提供了用于减轻受试者中的蛋白尿的方法。在一个实施方案中,所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中,所述受试者正在遭受以蛋白尿为特征的病症,例如,但不限于,糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中,所述蛋白尿至少部分地由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。这样的方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸或唾液酸前体。这样的施用会恢复在蛋白尿的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化。这样的施用由此减轻所述受试者中的蛋白尿。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用。此外,所述唾液酸或唾液酸前体可以单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的方法可以另外包括:鉴别需要这种减轻的受试者。
在另一个实施方案中,本公开内容的教导提供了用于减轻受试者中的水肿方法。在一个实施方案中,所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个具体的实施方案中,所述水肿至少部分地由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。这样的方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸或唾液酸前体或前述的组合。这样的施用会恢复在蛋白尿的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化。这样的施用由此减轻所述受试者中的蛋白尿。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用。此外,所述唾液酸或唾液酸前体可以单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的方法可以另外包括:鉴别需要这种减轻的受试者。
在另一个实施方案中,本公开内容的教导提供了用于减轻受试者的高胆固醇血症的方法。在一个实施方案中,所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个具体的实施方案中,所述高胆固醇血症至少部分地由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。这样的方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸或唾液酸前体。这样的施用会恢复在高胆固醇血症的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化。这样的施用由此减轻所述受试者中的高胆固醇血症。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用。此外,所述唾液酸或唾液酸前体可以单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的方法可以另外包括:鉴别需要这种减轻的受试者。
在另一个实施方案中,本公开内容的教导提供了用于减轻受试者的高甘油三酯血症的方法。在一个实施方案中,所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个具体的实施方案中,所述高甘油三酯血症至少部分地由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。这样的方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸或唾液酸前体。这样的施用会恢复在高甘油三酯血症的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化。这样的施用由此减轻所述受试者中的高甘油三酯血症。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用。此外,所述唾液酸或唾液酸前体可以单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的方法可以另外包括:鉴别需要这种减轻的受试者。
在另一个实施方案中,本公开内容的教导提供了用于治疗和/或预防受试者的糖尿病病症或与其有关的生理状况的方法。在一个实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病。在一个实施方案中,所述与糖尿病病症有关的生理状况是蛋白尿。在一个具体的实施方案中,所述糖尿病病症至少部分地由多肽(例如,但不限于,Angptl4)的低唾液酸化造成。这样的方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸或唾液酸前体。这样的施用会恢复在糖尿病病症的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的正常唾液酸化。这样的施用由此治疗和/或预防所述受试者的糖尿病病症。所述唾液酸或唾液酸前体可以以治疗有效剂量施用。此外,所述唾液酸或唾液酸前体可以单独地施用,作为药物组合物的一部分施用,或与第二种药剂联合施用。这样的方法可以另外包括:鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。
诊断方法
本公开内容也提供了针对肾病综合征或糖尿病病症来测定受试者的状态的方法。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病。
在一个实施方案中,这样的方法测定所述受试者中的:与肾病综合征或糖尿病病症有关的多肽(例如,但不限于,Angptl4)的水平,与肾病综合征或糖尿病病症有关的多肽(例如,但不限于,Angptl4)的唾液酸化水平,或前述水平的组合。在一个具体实施方案中,测定高pI形式的多肽的水平。该形式已经被证实低唾液酸化,且指示肾病综合征或糖尿病病症。从所述受试者测得的所述多肽的量和/或唾液酸化水平,可以与得自被诊断为未患肾病综合征或糖尿病病症的受试者(对照受试者)的对应量和水平进行对比。这样的量和水平也可以与参比标准进行对比。与对照受试者或参比标准相比唾液酸化水平的降低,指示所述受试者正在遭受肾病综合征或糖尿病病症或处于所述病症的风险中;如以上所讨论的,可以针对高pI形式的多肽(其被低唾液酸化)来测定唾液酸化水平。
本公开内容另外提供了在接受肾病综合征或糖尿病病症治疗的受试者中测定肾病综合征或糖尿病病症的治疗效力的方法。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病。
在一个实施方案中,这样的方法测定所述受试者中的:与肾病综合征或糖尿病病症有关的多肽(例如,但不限于,Angptl4)的水平,与肾病综合征或糖尿病病症有关的多肽(例如,但不限于,Angptl4)的唾液酸化水平,或前述水平的组合。在一个具体实施方案中,测定高pI形式的多肽的水平。该形式已经被证实低唾液酸化,且指示肾病综合征或糖尿病病症。在治疗过程中从所述受试者测得的所述多肽的量和/或唾液酸化水平,可以与开始治疗之前得自所述受试者的对应量和/或水平进行对比。与开始治疗之前测得的唾液酸化水平相比,所述接受治疗的受试者中的唾液酸化水平的增加,指示所述治疗具有希望的作用;如以上所讨论的,可以针对高pI形式的多肽(其被低唾液酸化)来测定唾液酸化水平。此外,在治疗过程中从所述受试者测得的多肽的量和/或水平,可以与被诊断为未患肾病综合征或糖尿病病症的受试者(对照受试者)的对应量和/或水平进行对比。这样的量和水平也可以与参比标准进行对比。在治疗过程中从所述受试者得到的等于或接近得自对照受试者的唾液酸化水平或参照的唾液酸化水平,指示所述治疗具有希望的作用;如以上所讨论的,可以针对高pI形式的多肽(其被低唾液酸化)来测定唾液酸化水平。
在这样的方法中可以使用本领域已知的用于测定蛋白水平和唾液酸化水平的任意方法,包括、但不限于,本文所述的任意方法。
图5C显示了该方案的实用性。通过二维凝胶电泳,分析了得自具有不同病症的患者(n=4患者/组)的200μg人血浆,并使用抗-Angptl4抗体制备了蛋白质印迹。该图证实,仅具有MCD复发的患者具有循环的低唾液酸化形式的Angptl4多肽(用椭圆形指示该55-70kDa pI8-8.5形式的Angptl4多肽);该多肽在具有MCD缓解的患者中不存在。在MCD复发患者中观察到增加的循环的中性pI单体和寡聚体(箭头),在MN中仅观察到增加的循环的中性pI单体(箭头)。
任一种上述治疗方法可以与在美国临时申请号61/351,866和61/483,854(它们通过引用整体并入本文中)中描述的测定多肽的方法结合使用。
筛选方法
本公开内容也涉及一种用于鉴别化合物的方法,所述化合物可有效地治疗或预防肾病综合征、糖尿病病症或与其有关的病症,例如,但不限于,蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症或水肿。在一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN或MGN。在另一个实施方案中,所述肾病综合征被表征为MCD。在一个实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中,所述糖尿病病症是糖尿病肾病。这样的化合物可以用作被包含在药物组合物中的活性成分,或用于单独施用。在一个实施方案中,所述方法包括:测定在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于,Angptl4)的唾液酸化水平。
一般而言,这样的筛选方法包括下述步骤:提供试验系统(在下面更详细地描述),所述系统会表达在肾病综合征或糖尿病病症的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于,Angptl4),向所述试验系统中引入要测试的实验化合物,并测定所述实验化合物对所述多肽的唾液酸化水平的影响。所述方法包括:鉴别会影响所述多肽的唾液酸化水平的候选物或实验化合物或药剂(多肽、功能核酸、碳水化合物、抗体、小分子或其它分子)。然后可以在适当的系统(例如,但不限于,本文所述的动物模型系统)中进一步测试这样的化合物,以测定鉴别的化合物的活性。
使用多种试验来鉴别候选化合物,例如,但不限于,采用表达在肾病综合征或糖尿病病症的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于,Angptl4)的细胞的试验。或使用分离的多肽的试验。各种试验可以采用这种多肽的多种变体(例如,全长、生物活性片段或包括目标多肽的全部或一部分的融合蛋白)。此外,这种多肽可以源自任意合适的哺乳动物物种(例如,人、大鼠或小鼠);在一个具体的实施方案中,所述多肽源自人类。
在试验包括使用完整细胞的情况下,所述细胞可以天然地表达在肾病综合征或糖尿病病症的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于,Angptl4),或可以修饰成来表达它们。在后一种情况下,通过常规分子生物学技术,诸如通过用包含这种多肽的病毒感染细胞,可以修饰细胞来表达所需多肽。所述细胞也可以是已经用编码这种多肽的核苷酸序列转染的原核或真核细胞。在前一种情况下,可以使用全长多肽、片段或含有这种多肽的至少一部分的融合蛋白。在本说明书中描述了示例性的试验系统。
各种筛选试验可以与体内试验相组合,所述体内试验需要测量实验化合物对本文讨论的疾病状态和病症的征状的影响。在这样的一个实施方案中,可以评价化合物,以确定它们是否影响与肾病综合征或糖尿病病症或其相关病症(例如,但不限于,蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症或水肿)有关的参数。这样的参数包括、但不限于:1)测定在高胆固醇血症、高甘油三酯血症或有关病症的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于Angptl4)的唾液酸化水平,和2)测定在高胆固醇血症、高甘油三酯血症或有关病症的病原学中涉及的高pI形式(这些形式被低唾液酸化)的多肽(例如,但不限于Angptl4)的量;3)测定蛋白排泄的水平,无论是总水平还是关于特定组分;和4)测定实验化合物对肾形态学(例如,但不限于,足细胞)的影响。
在一个实施方案中,这样的筛选试验可以如下进行:例如,通过测定在高胆固醇血症、高甘油三酯血症的病原学中涉及的多肽(例如,但不限于,Angptl4)的唾液酸化水平,并检测与实验化合物不存在相比,在有实验化合物存在下,这种多肽的唾液酸化水平的差异。在一个具体实施方案中,特别地检查这种多肽的高pI形式(该形式被低唾液酸化)。这样的筛选试验可以是体外的、体内的或离体的,且可以以细胞培养物为基础(使用完整细胞或裂解物),或可以以动物模型为基础。本公开内容的任何试验可以用于前述方法中。
适用于所述筛选方法中的实验化合物,可以从任意合适的来源(诸如常规化合物文库)得到。使用本领域已知的组合文库方法的众多方案中的任一种,也可以得到实验化合物,所述方案包括:生物学文库,空间上可接近的平行固相或溶液相文库,需要解卷积的合成文库方法,“一个珠子一种化合物”文库方法,和使用亲和色谱法选择的合成文库方法。所述生物学文库方案限于肽文库,而其它4种方案适用于肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库。在本领域中可以找到用于合成分子文库的方法的实例。化合物文库可以存在于溶液中或珠子、细菌、孢子、质粒或噬菌体上。
在前述方法中,高pI形式的Angptl4是指,迁移至55-70kDa且具有8-8.5的pI的多肽。
本公开内容也提供了用于实现本公开内容的任意方法的试剂盒,所述试剂盒可以含有本文公开的任意化合物和/或组合物,或以其它方式用于实现本公开内容的方法。
唾液酸前体
本公开内容提供了唾液酸(N-乙酰基神经氨酸)或唾液酸前体的多种用途。
在一个实施方案中,所述唾液酸前体是N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc;也称作2-乙酰氨基-2-脱氧-D-甘露糖或N-乙酰基-D-甘露糖胺)。ManNAc的结构如下面式I所示。
在一个替代实施方案中,所述唾液酸前体由下面式Ia定义。
其中:
A是CH2或NH;
B、C、D和E各自独立地选自:H、OH、X、O-CO-X或O-X,其中X是取代的或未取代的烷基或烯基,X(当存在时)为每个基团B、C、D和E独立地选择;
G是H、OH、Y或O-Y,其中Y是取代的或未取代的烷基或烯基。
应当理解,式I和Ia的化合物还可以以椅构型的形式表示。
在一个实施方案中,X和/或Y独立地是C1至C5烷基。在一个具体实施方案中,X和/或Y是丙基;在另一个实施方案中,X和/或Y是丁基。
在一个实施方案中,B、C、D、E或G中的至少1个不是H或OH。在另一个实施方案中,B、C、D、E或G中的至少2个不是H或OH。在另一个实施方案中,B、C、D、E或G中的至少3个不是H或OH。在另一个实施方案中,B、C、D、E或G都不是H或OH。
在一个具体实施方案中,G是CH3,A是CH2,且B、C、D或E中的至少1个不是H或OH。在另一个具体实施方案中,G是CH3,A是CH2,且B、C、D或E中的至少2个不是H或OH。在另一个具体实施方案中,G是CH3,A是CH2,且B、C、D或E中的至少3个不是H或OH。在另一个具体实施方案中,G是CH3,A是CH2,且B、C、D或E都不是H或OH。在前述内容中,在一个实施方案中,B、C和D可以各自独立地是CO-X。
应当指出,当G是CH3、A是CH2且B、C、D和E每个是OH时,所述化合物是ManNAc(式I)。
在式I下的代表性的衍生物包括、但不限于:Bu4ManNAc,3,4,6-0-Bu3ManNAc或1,3,4-0-Bu3ManNAc(这样的化合物参见:Aich,等人,Glycoconj J.DOI10.1007/s10719-010-9292-3,于2010年4月14日接受)。
其它唾液酸前体包括N-乙酰丙酰基唾液酸(SiaLev)和N-乙酰丙酰基甘露糖胺(ManLev)(Charter等人Glycobiology.2000Oct;10(10):1049-56)。
在上面的描述中,包括前述化合物的所有对映异构形式。
组合物
本公开内容的有用组合物包含一种或多种可用于本公开内容的治疗和预防方法中的化合物,例如,但不限于,唾液酸、唾液酸前体、在本公开内容中鉴别出的或通过本公开内容的筛选方法鉴别出的那些化合物。在一个实施方案中,这样的化合物会增加多肽(例如,但不限于,Angptl4)的唾液酸化。在一个具体实施方案中,所述化合物是唾液酸前体。示例性的唾液酸前体包括、但不限于:ManNAc和ManNAc衍生物。
公开的组合物可以包含与药学上可接受的载体相组合的一种或多种这样的化合物。这样的载体和配制方法的实例,可以参见:Remington:The Science andPractice of Pharmacy(第20版,Lippincott,Williams & Wilkins,Daniel Limmer编)。为了形成适合施用的药学上可接受的组合物,这样的组合物将含有治疗有效量的化合物。
本公开内容的药物组合物可以用于本公开内容的治疗和预防方法中。这样的组合物以下述量施用给受试者:所述量足以递送治疗有效量的化合物,因而在本文公开的治疗和预防方法中是有效的。所述治疗有效量可以根据多种因素而变化,所述因素例如,但不限于,受试者的病症、体重、性别和年龄。其它因素包括:给药模式和部位。本公开内容的组合物可以给受试者仅施用1次,或者给受试者施用超过1次。此外,当所述组合物给受试者施用超过1次时,可以使用多种方案,例如,但不限于,每天1次,每周1次,或每月1次。所述组合物也可以每天给受试者施用超过1次。通过常规测试,可以鉴别治疗有效量和适当的给药方案,以便获得最佳活性,同时使任何潜在副作用最小化。另外,其它药剂的共同施用或先后施用可以是合乎需要的。
本公开内容的组合物可以以本文公开的多种剂型和方案来施用。示例性的剂量包括、但不限于:至少约0.1mg/kg至约750mg/kg,至少约1mg/kg至约500mg/kg,至少约1mg/kg至约200mg/kg,或至少约1mg/kg至约100mg/g体重。唾液酸前体的日剂量范围可以是:约0.1g/天至约75g/天,约0.5g/天至约50g/天,约1g/天至约10g/天,约0.1g/天至约5g/天,约0.1g/天至约3g/天,和约0.1g/天至约1g/天。
可以以本领域已知的任意方法,将药物组合物提供给受试者。示例性的给药途径包括、但不限于:口服的、皮下的、直肠的、肠胃外的、皮下的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的、外用的、皮内的、骨内的、肌肉内的、真皮的、透皮的、胸腔内的、肺内的、鼻内的或肺的途径。
本公开内容的组合物可以另外包含提高所述化合物的溶解度、半衰期、吸收等的试剂。此外,本公开内容的组合物可以另外包含减弱不希望的副作用和/或降低所述化合物的毒性的试剂。这样的试剂的实例描述在多种教科书中,例如,但不限于,Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版,Lippincott,Williams & Wilkins,Daniel Limmer编)。
本公开内容的组合物可以在多种施用剂型中施用。例如,所述组合物可以以下述形式施用:例如,但不限于,片剂、胶囊剂、药囊、锭剂、糖锭、丸剂、散剂、颗粒、酏剂、酊剂、溶液、混悬液、酏剂、糖浆剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、乳剂或用于静脉内给药或注射的溶液。其它剂型包括透皮施用、经由贴剂机理或软膏剂。可以改进前述任一种,以提供定时释放和/或持续释放制剂。
在本公开内容中,所述药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体,包括、但不限于:媒介物、佐剂、表面活性剂、助悬剂、乳化剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂和载体,以及助剂,例如,但不限于,着色剂和矫味剂(在本文中统称为载体)。通常,所述药学上可接受的载体对活性化合物而言是化学惰性的,且在使用条件下没有有害的副作用或毒性。所述药学上可接受的载体可以包括聚合物和聚合物基质。所述药学上可接受的载体的性质,可以随采用的特定剂型和组合物的其它特征而变化。
例如,就固体形式(诸如但不限于,片剂、胶囊剂、药囊、锭剂、糖锭、丸剂、散剂或颗粒)的口服给药而言,所述化合物可以与口服的、无毒的药学上可接受的惰性载体相混合,所述载体例如,但不限于,惰性填充剂、合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和助剂。合适的粘合剂包括、但不限于:淀粉、明胶、天然糖(诸如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然的和合成的树胶(诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡类等等。用于这些剂型中的润滑剂包括、但不限于:油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠等等。崩解剂包括、但不限于:淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂粘土、黄原胶等等。片剂形式可以包括下述的一种或多种:乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸,以及本文描述的其它载体。锭剂形式可以包括:在矫味剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性成分,以及包含在惰性基质(诸如明胶和甘油或蔗糖和acadia)中的活性成分的软锭剂,乳剂和凝胶,所述凝胶除了含有活性成分以外,还含有本领域已知的载体。
就口服液体形式(诸如但不限于,酊剂、溶液、混悬液、酏剂、糖浆剂)而言,本公开内容的核酸分子可以溶解在稀释剂(诸如水、盐水或醇)中。此外,所述口服液体形式可以包括适当矫味的助悬剂或分散剂,诸如合成的和天然的胶,例如,黄蓍胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等等。此外,当需要或必要时,也可以将合适的着色剂或其它助剂掺入混合物中。可以采用的其它分散剂包括甘油等等。
适于肠胃外给药的制剂包括:水性的和非水性的、等渗的无菌注射溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使制剂与患者血液等渗的溶质),以及水性的和非水性的无菌混悬液(其可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。所述化合物可以在生理上可接受的稀释剂中给药,这些稀释剂例如无菌液体或液体的混合物,所述液体包括:水,盐水,葡萄糖水溶液和相关的糖溶液,醇(诸如乙醇、异丙醇或十六醇),二醇(诸如丙二醇),或聚乙二醇(诸如聚乙二醇400),甘油缩酮(诸如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇),醚,油,脂肪酸,脂肪酸酯或甘油酯,或乙酰化的脂肪酸甘油酯,加入或不加入药学上可接受的表面活性剂(例如,但不限于,肥皂、油或去污剂)、助悬剂(例如,但不限于,果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其它药物佐剂。
可以用于肠胃外制剂的油包括:石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括:花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。适用于肠胃外制剂的脂肪酸包括:聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(诸如脱水山梨糖醇单油酸酯),环氧乙烷与疏水基质的高分子量加合物(通过环氧丙烷与丙二醇缩合而形成),油酸,硬脂酸,和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。适用于肠胃外制剂的肥皂包括:脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐,适当的去污剂包括:(a)阳离子去污剂,例如,二甲基二烷基铵卤化物,和烷基吡啶鎓卤化物,(b)阴离子去污剂,例如,烷基、芳基和烯烃磺酸盐,烷基,烯烃,醚,和单酸甘油酯硫酸盐,和磺基丁二酸盐,(c)非离子去污剂,例如,脂肪胺氧化物,脂肪酸烷醇酰胺,和聚氧乙烯聚丙烯共聚物,(d)两性去污剂,例如,β-氨基丙酸烷基酯,和2-烷基-咪唑啉季铵盐,和(e)它们的混合物。
合适的防腐剂和缓冲剂可以用于这样的制剂中。为了减少或消除在注射部位处的刺激,这样的组合物可以含有一种或多种非离子表面活性剂,所述非离子表面活性剂具有约12至约17的亲水亲油平衡值(HLB)。在这样的制剂中的表面活性剂的量的范围通常是约5重量%至约15重量%。
含有本公开内容的核酸分子的外用剂型(例如,但不限于,软膏剂、乳膏剂、糊剂、乳剂)可以与本领域众所周知的多种载体材料(例如,醇、真芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、PPG2、丙酸肉豆蔻酯等等)相混合,以形成醇溶液、表面清洁剂、清洁霜、皮肤凝胶、皮肤洗剂以及乳膏剂或凝胶制剂形式的洗发剂。也可以包括皮肤脱落剂或皮肤磨擦制品。这样的表面制品可以应用于透皮递送的贴剂、绷带或敷药,或可以应用于直接向伤口或皮肤损伤部位递送的绷带或敷药。
本公开内容的化合物还可以以脂质体递送系统(诸如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡)的形式施用。脂质体可以从多种磷脂(诸如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱)形成。这样的脂质体还可以含有单克隆抗体,以指导脂质体向特定细胞类型或细胞类型群体的递送。
本公开内容的化合物还可以与作为可靶向的药物载体的可溶性聚合物相偶联。这样的聚合物可以包括、但不限于:聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、多羟乙基天冬氨酰胺苯酚或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外,本发明的化合物可以与可用于实现药物控释的可生物降解的聚合物类型相偶联,所述聚合物例如:聚乳酸、聚ε己内酯、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或两亲的水凝胶嵌段共聚物。
此外,本文公开的唾液酸或唾液酸前体可以作为食品添加物来施用,或掺入食物或饮品中。
结果
在下述结果中,使用的方法是在本公开内容的方法部分和其中引用的参考文献中指出的那些方法。
在实验和人肾小球疾病中的足细胞Angptl4表达的增量调节
在注射NTS以后24小时,在不依赖于补体的和不依赖于白细胞的异相蛋白尿的峰值处,大鼠肾小球中的Angptl4 mRNA表达被增量调节(70倍)(图1A和1B)。NTS向Angptl4-/小鼠中的注射,会造成蛋白尿(图1C)和足突展平(图1D)的显著减轻,这提示Angptl4在肾小球疾病中的关键作用。正常大鼠肾小球以毛细血管袢模式表达Angptl4,其与足细胞蛋白CD2AP共局部化(图1E)。进一步研究揭示了在静脉内注射单次剂量的嘌呤霉素氨基核苷(PAN模型)以后,在幼大鼠中的Angptl4 mRNA表达的早期(在蛋白尿发作之前第3天)和渐进性增量调节(图1F),且原位杂交证实了周围毛细血管袢模式的增量调节(数据未显示),没有伴随近端管信号的变化。在被动海曼肾炎中,观察到Angptl4表达的更少增加,从蛋白尿发作以后开始(图1F)。相反,Angptl4mRNA表达在抗-Thy1.1肾炎中或在塌陷性局灶性和节段性肾小球硬化症中没有变化(图1F),所述病症通过注射得自患有该疾病的患者的血清来诱发(18)。在诱导PAN以后,足细胞中的Angptl4蛋白表达急剧增加(图1G),与肾小球基膜(GBM)发生大量额外的重叠,这通过免疫金电子显微术(EM)来证实(图1H)。得自具有糖皮质激素敏感的MCD的患者和年龄与性别匹配的对照的活组织检查(图1I),揭示了在对照肾活组织检查中的模糊足细胞模式以及在足细胞中的增加的表达,具有额外的GBM重叠和在边缘处与内皮的少许斑点状重叠。
Angptl4的足细胞特异性的过表达导致选择性的蛋白尿和足细胞足突展平
开发了足细胞特异性的Angptl4过表达的转基因大鼠模型,并显示在图2A中(NPHS2-Angptl4TG)。正常地表达Angptl4的器官中的mRNA表达分析,证实了表达的特异性(图2B)。3月龄杂合的雄性NPHS2-Angptl4TG大鼠的组织学评估,揭示了具有突出的足细胞的正常形态的肾小球(图2C)(通过光学显微术)和增加的足细胞Angptl4表达(通过共焦成像)(图2D)。5月龄纯合的和大多数杂合的TG大鼠的电子显微术(图2E)揭示了扩散的足突展平。免疫金EM纯合的TG大鼠(在1-5个月龄之间)揭示了GBM中的Angptl4积累和足突展平的渐进性发展之间的关联性(图2F)。NPHS2-Angptl4TG大鼠的2个原始系都发展成显著的白蛋白尿。雌性纯合的和雄性杂合的大鼠早在1个月龄就发展成白蛋白尿(图3A-3C)。随着时间逝去,纯合的雌性动物发展成增加最高达100倍的白蛋白尿,杂合的雄性动物发展成增加最高达20倍的白蛋白尿,纯合的雄性动物发展成增加超过500倍的白蛋白尿。杂合的雌性动物没有白蛋白尿。超过90%的尿蛋白包含完整的白蛋白(图3D),由此使得这些大鼠成为选择性的蛋白尿的首选模型。免疫金EM(其使用抗-V5抗体来特异性地检测转基因表达的蛋白)揭示了在足细胞中的金颗粒和在NPHS2-Angptl4TG大鼠中的GBM(图3E)。与足细胞分泌的Angptl4的促蛋白尿效应相一致,在诱导PAN以后,NPHS2-Angptl4TG大鼠形成比野生型同胞仔更多的蛋白尿(图3F)。与野生型对照相比,在蛋白尿的杂合的NPHS2-Angptl4大鼠中的血压明显更低(数据未显示)。也如以前公开的(20),在第6天,在PAN中的蛋白尿部分地是糖皮质激素敏感的(图3G),且有些该糖皮质激素敏感性与Angptl4有关(图3H)。
足细胞分泌的和重组的Angptl4的表征
肾小球蛋白的蛋白质印迹通常会低估Angptl4生成,因为所述蛋白被快速地分泌。在得自对照的肾小球(上图)、第6天的PAN模型(中图)和共同施用糖皮质激素的第6天的PAN模型(下图)中,通过二维电泳和蛋白质印迹法(图4A)分析了Angptl4。在二维凝胶电泳以后,在正常肾小球中的大部分Angptl4作为糖基化的低阶寡聚体迁移至中性pI(粉红色箭头;3),尽管也观察到糖基化的完整的70KDa和切割的形式(红色箭头;1)和未糖基化的45KDa单体形式(黄色箭头;2)的更少突出的斑点(图4A和4B)。在PAN中,中性pI寡聚体(其可与结合唾液酸的凝集素朝鲜槐(MAA)反应)和高pI寡聚体(其不是MAA反应性的)都增加(粉红色箭头,3和橙色箭头,4)(图4A和4B)。在用糖皮质激素治疗的PAN中,该增加被钝化,尽管观察到不匀称地更高量的高pI寡聚体。蛋白质印迹的密度计分析显示在图4B中。
图5A显示,用pcDNA-大鼠Angptl4-V5-His表达构建体系稳定转染的HEK293细胞表现出与对照空载体细胞系相比55,000倍的Angptl4 mRNA表达增量调节。***P<0.001
图5B显示,在无血清条件下,Angptl4-HEK293细胞将基本上完整的蛋白分泌进上清液中(通过二维凝胶电泳和使用免疫前血清和抗-Angptl4抗体的蛋白质印迹证实)。
使用Angptl4-HEK293稳定细胞系,在体外研究了Angptl4的唾液酸化(图4C)。HEK293细胞通常不表达或表达极少的Angptl4多肽;在用pcDNA-大鼠Angptl4-V5-His表达构建体转染以后,该细胞系表现出与对照空载体细胞系相比55,000倍的Angptl4 mRNA表达增量调节(图5A)。此外,该细胞系通常分泌由HEK293-Angptl4细胞系表达的Angptl4多肽,其仅在低pI末端处是少量MAA反应性的(图4C上图和中上图,绿色箭头1和图5B),因此在很大程度上被低唾液酸化。与唾液酸前体N-乙酰基-D-甘露糖胺(ManNAc;图4C,中下图和下图)一起温育该细胞系,会导致所述蛋白向中性pI迁移,增加对MAA的反应性(蓝色箭头,2),因此增加唾液酸化,这表明唾液酸化在Angptl4的差别电泳迁移中起关键作用。
因为在PAN中观察到低唾液酸化的Angptl4的增加,研究了这种唾液酸化缺少在蛋白尿的发病机制中的作用。图6A显示了得自重度白蛋白尿的大鼠的初步研究的白蛋白尿的代表性描记图,所述大鼠接受递增剂量的ManNAc。研究揭示,ManNAc会减轻这些动物的白蛋白尿。但是,在这些大鼠中,减轻白蛋白尿需要大剂量。为了进行更有效的且预示性的研究,使用具有比野生型大鼠高15-25倍的白蛋白尿的大鼠,用于进一步分析。
接受在自来水中的ManNAc(1mg/ml)的NPHS2-Angptl4 TG大鼠(图4D)在12天时段内具有比基线下降了超过40%的白蛋白尿,而在接受自来水的对照NPHS2-Angptl4 TG大鼠中的白蛋白尿在研究期间增加了2.5倍。图6B显示了得自完成了研究并用ManNAc(1mg/ml)治疗的NPHS2-Angptl4 TG大鼠研究组的各个描记图。在研究开始之前,间隔12天收集2份尿,以确保这些大鼠形成随着时间增加的白蛋白尿。研究揭示,ManNAc(1mg/ml)会减轻这些动物的白蛋白尿。
得自在第12天安乐死的大鼠的肾小球Angptl4的蛋白质印迹的密度测定法分析(图6C和6D)表明,中性pI Angptl4级分从对照大鼠中的48.3+5%增加至ManNAc治疗的大鼠中的72.9+1.4%(图6D)。所述中性pI级分也可与结合唾液酸的凝集素西泽接骨木(SNA I)反应,这证实了ManNAc治疗的大鼠中的Angptl4的增加的唾液酸化(图6C)。
图7显示了具有PAN(一种MCD模型)的ManNAc治疗的大鼠的肾病综合征参数的改善。大鼠(n=5只大鼠/组)接受单次静脉内注射的嘌呤霉素氨基核苷(10mg/100克),并在第4天开始用在自来水中的ManNAC(80mg/Kg体重)治疗,这与蛋白尿的发作同时。显示了得自第6天的数据。与对照PAN大鼠相比,在ManNAc治疗的大鼠中,观察到:蛋白尿的显示减轻(图7A)、血浆白蛋白水平的改善(图7B)、胆固醇的下降(图7C)和甘油三酯的下降(图7D)。这些数据与上述结果相一致。
已经在本文讨论的其它疾病(包括糖尿病)中观察到蛋白尿,包括白蛋白尿。还使用db/db小鼠,分析了Angptl4在糖尿病中的作用。最初,在1966年,在Jackson Labs将db/db鉴别为在断奶后不久就食欲过盛的肥胖小鼠。糖尿病基因(db)作为常染色体隐性遗传特性进行传递。db基因编码瘦素受体的G-至-T点突变,这会导致脂肪细胞-衍生的激素瘦素的异常剪接和有缺陷的信号传递。下丘脑中瘦素信号传递的缺乏,会导致持续的食欲过盛和肥胖,从而导致高瘦素和胰岛素水平。几项研究确认,在db/db小鼠中,从8周龄开始,白蛋白排泄率增加了8-62倍。在db/db雄性小鼠中,白蛋白尿的范围是在68-303μg/24h之间,而在年龄匹配的杂合的同胞仔中,它是在4-21μg/24h之间。
图8A-C显示了ManNAc治疗对糖尿病动物的蛋白尿的影响。图8A显示了得自糖尿病的db/db和对照db/m小鼠的肾小球的二维凝胶电泳和蛋白质印迹分析。该分析表明,糖尿病的db/db小鼠肾小球中的Angptl4表达增加,包括涉入蛋白尿的发病机制中的高pI低唾液酸化形式。这些高pI低唾液酸化形式的Angptl4对唾液酸前体(包括ManNAc和ManNAc衍生物)治疗是敏感的。
图8B显示了得自Zucker糖尿病肥胖大鼠的肾小球的二维凝胶电泳和蛋白质印迹分析。该分析表明Zucker糖尿病肥胖大鼠肾小球中的Angptl4表达增加,包括涉入蛋白尿的发病机制中的高pI低唾液酸化形式。这些高pI低唾液酸化形式的Angptl4对唾液酸前体(包括ManNAc和ManNAc衍生物)治疗是敏感的。图8C表明,唾液酸前体治疗会减轻该模型的蛋白尿。在图8C中,用在自来水中的ManNAc或用纯自来水,治疗13周龄雄性Zucker糖尿病肥胖大鼠(n=4只大鼠/组)。在70mg/Kg和在增加的剂量140mg/Kg,在ManNAc治疗组中观察到蛋白尿的显著减轻,持续最多20天。
这些结果表明,唾液酸前体的施用,会通过恢复Angptl4的正常唾液酸化而治疗糖尿病。如图8C所示,唾液酸前体的施用,会通过恢复Angptl4多肽的正常唾液酸化(如本文所述)而减轻在糖尿病中观察到的蛋白尿。
本公开内容显示了足细胞分泌的Angptl4在肾病综合征的发病机制中的关键作用(使用MCD模型来例证),和Angptl4在与肾病综合征有关的病症(例如,但不限于,蛋白尿)中的作用。本公开内容显示了:人肾活组织检查中Angptl4的增加的足细胞表达、选择性的蛋白尿(NPHS2-Angptl4TG大鼠中的白蛋白尿增加了超过500倍)、Angptl4基因的糖皮质激素敏感性、以及与人MCD相一致的光学和电子显微镜下发现。通过注射了NTS的Angptl4-/-小鼠中的蛋白尿和足突展平的显著下降,进一步证实了Angptl4在蛋白尿和足突展平的发展中的作用。可靠的MCD模型在小鼠中的缺失,需要使用NTS。
在MCD中足细胞对高pI Angptl4的分泌,可能会促进Angptl4与GBM的结合,先前的研究已经证实了Angptl4与类肝素硫酸蛋白聚糖的结合(21)。这将啮齿类动物中减少的GBM电荷(MCD的标志)与足细胞对Angptl4的TG表达恰当地关联起来。所述电荷可能会促进高pI Angptl4在流体流动的相反反向沿着GBM转移。唾液酸化的变化会解释pI的主要变化和Angptl4在蛋白尿中的生物学作用,因为从足细胞分泌的有活性的寡聚体形式的Angptl4不是苏氨酸磷酸化的,并且增加Angptl4的唾液酸化会减轻蛋白尿。在大鼠和人Angptl4中分别存在2个预测的唾液酸残基可以掺入其中的O-和N-糖基化位点。唾液酸前体治疗构成用于减轻肾病综合征(例如,但不限于,MCD,以及可能Angptl4在其中起作用的常见的多系统障碍如糖尿病)中的蛋白尿的一种新的潜在的治疗工具。
其它的、尚不确定的、足细胞或内皮细胞分泌的因子可能与Angptl4协同地在MCD的发病机制中起作用。在NPHS2-Angptl4 TG大鼠中,足细胞分泌的Angptl4保持与肾小球毛细血管袢结合,或逃离进尿空间中,其在所述尿空间中被近端小管吸收。在这些大鼠中诱导低剂量PAN(这会提供这些其它的透化因子)以后,足细胞分泌的Angptl4逃离进循环中。
其它透化因子在NPHS2-Angptl4 TG大鼠中的缺乏,也可能解释与在PAN或MCD患者中相比更逐渐的蛋白尿发作。
前述内容表明,唾液酸前体的施用会恢复Angplt4多肽的正常唾液酸化,并减轻与肾病综合征(包括、但不限于,MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病)、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病有关的生理异常。因此,本公开内容提供了这样的病症的治疗。
方法
克隆全长大鼠Angptl4,制备针对全长重组Angptl4的抗体
将来自我们的先前实验(7)的1218bp的全长大鼠Angptl4开放读码框(不包括终止密码子)克隆进pcDNA3.1/V5-HisB中(就真核表达而言和pET28a中(就原核表达而言)。使用表达纯化的全长蛋白的大肠杆菌在兔子中产生多克隆抗体(Proteintech group,Inc.Chicago IL USA),并通过ELISA和蛋白质印迹进行测试。从GelCode蓝染色的凝胶切离抗体反应带,用胰蛋白酶消化,并通过MALDI-TOF/TOF证实Angptl4肽序列的存在。针对抗原亲和纯化一部分抗血清。除非另外指出,否则描述的所有研究都使用该抗体。类似地,在兔中制备针对大鼠Angptl4的N-端部分(氨基酸7-86,不包括信号肽)的其它多克隆抗体。
在人肾小球疾病动物模型中诱导蛋白尿
所有动物研究都得到动物实验管理小组(institutional IACUC)的批准。在括号内的先前出版物中,描述了在野生型大鼠中诱导蛋白尿的动物模型(n=4只大鼠/组):PAN(7),PHN(7),使用糖皮质激素的PAN(20),非-HIV塌陷性肾小球病(18),肾毒血清诱导的异相蛋白尿(7),前述参考文献通过引用并入本文,用于这样的教导。通过将200微克抗-Thy1.1(Ox-7杂交瘤)或对照IgG静脉内地注射进不同组的雄性Wistar大鼠(100-125克,n=4只大鼠/组)中,诱导抗-Thy1.1肾炎,并在24和72小时以后将大鼠安乐死。
下述技术描述在先前的出版物中:Taqman实时PCR(26),共焦成像(7),原位杂交(27),启动子-报告基因研究(7),免疫金EM(26),用于蛋白质印迹的肾小球提取和处理(26),通过PEI方法评估电荷(28),前述参考文献通过引用并入本文,用于这样的教导。为了阿辛蓝染色,使用醋酸,将染色溶液的pH调至2.5,并使用0.1%核坚牢红溶液作为复染剂。使用Image-Pro软件(MediaCybernetics,Inc.,Bethesda MD,USA),评估肾小球基膜阿辛蓝染色剂的光密度测定法(20个肾小球/大鼠,3只大鼠/组)。使用Gel-Pro Analyzer软件(MediaCybernetics,Inc.),评估二维凝胶蛋白质印迹的光密度测定法。Taqman实时PCR引物和探针列出在表1中。为了原位杂交,大鼠Angptl4的地高辛配基标记的探针包括ORF的碱基对1-548。
为了得到用于肝素后LPL活性的样品,给大鼠静脉内地注射10单位/100克体重的猪肝素,在15分钟以后安乐死,并使用来自Roar Biomedical,Inc(NewYork NY)的试验,测量活性。在禁食状态,测量血清甘油三酯。
将NTS注射进Angptl4-/-小鼠中
Angptl4-/-小鼠是由Eli Lily Corporation(Indianapolis IN USA)提供给SanderKersten的友情赠品。研究方案得到Wageningen大学的动物研究委员会的批准。给11周龄的雄性Angptl4-/-或+/+小鼠(n=4小鼠/组)静脉内地注射1.5mgγ2-NTS或标准绵羊血清(SigmaAldrich St.Louis MO USA),在48小时时收集尿斑样品,在72小时时将小鼠安乐死,收集血浆用于生化测量,并保存肾用于组织学分析。通过ELISA(Bethyl laboratories,Montgomery TX USA)评估尿白蛋白,并通过质谱法测量尿肌酸酐。为了评估足突展平,首先在对照治疗的Angptl4+/+小鼠透射电子显微照片中测量足突的平均宽度(10个均匀间隔的读数/环,3环/肾小球,3个肾小球/肾,3个肾/组)。将展平描述为,平均宽度的超过2.5倍增加。在NTS治疗的或对照治疗的Angptl4-/-小鼠中,计数总足突和展平的足突。
使用保藏的人样品的研究
在墨西哥城的Instituto Nacional de Cardiologia,对经由IRB批准的方案得到的样品,进行保藏的人肾活组织检查样品的免疫染色(n=5活组织检查样品/条件)。用于这些研究的对照肾活组织检查是性别和年龄匹配的方案移植前活组织检查。从以前公开的研究(29),得到用于二维凝胶电泳和蛋白质印迹的存档的人血清(n=4样品/条件)。
转基因大鼠的制备
如下制备NPHS2-Angptl4TG大鼠:用Stul和EcoRI消化载体pTRE-tight,以除去在碱基对278至324之间的最小CMV启动子,用T4DNA聚合酶将5’突出端钝化,并重新连接,以制备pTRE-tight MP(负启动子)。对于足细胞特异性的表达,将含有C-端V5标签的大鼠Angptl4 cDNA构建体(包括信号序列)置于SV40聚腺苷酸尾巴的上游。使用公开的人NPHS2启动子构建体作为模板(gi22652661),通过PCR将人NPHS2启动子克隆在上游,其中不使用DMSO,以排除在碱基对2343和2568之间的天然存在的环,从而提高表达。
如下制备转基因大鼠:将消化过的DNA构建体显微注射进受精的SpragueDawley卵子中(在Michigan大学进行),植入假妊娠的宿主Sprague Dawley雌性动物中,通过常规PCR和TaqMan基因组DNA实时PCR策略(使用构建体特异性的和对照基因组催乳素的引物和探针组合),测定得到的后代的基因型。制备了用于足细胞特异性表达的2个原始系。显示了来自NPHS2-Angptl4TG大鼠系740的数据(5个转基因拷贝),都稳定超过4代。使用Bradford方法(Bioradlaboratories,Hercules CA USA),评估尿总蛋白,并通过ELISA(Bethyl laboratories,Montgomery TX USA),评估白蛋白尿。
大鼠血压的测量
使用得自Hetteras Instruments,Inc.(Cary NC USA)的SC-1000装置,通过套尾法,在6只5月龄野生型和蛋白尿的杂合NPHS2-Angptl4 TG大鼠中,测量血压和脉率。每组分析最少80个读数。
稳定细胞系和重组Angptl4蛋白的开发和表征
使用大鼠Angptl4pcDNA3.1-V5/His构建体以及对照空载体稳定细胞系,开发了稳定细胞系。Angptl4稳定细胞系形成55,253+5,155倍大鼠Angptl4mRNA增量调节(不检测的基线作为参照值1),并分泌70kDa蛋白(在无血清条件下)和55kDa蛋白(在有血清存在下)。使用镍亲和柱,从无血清培养基中亲和纯化全长V5-His标记的蛋白。在二维凝胶上进行的蛋白质印迹研究揭示,大部分重组Angptl4作为高等电点(8.3-8.5)蛋白迁移,且未磷酸化。
启动子-报告基因研究。
以前公开的小鼠Angptl4启动子(31)在肝中具有在ATG上游-183 bp处的转录起始位点。我们使用小鼠肾mRNA进行了5’RACE和引物延伸分析,并证实了在肾中的相同的转录起始位点。接着,使用BAC克隆RP23-27D5作为模板,将在转录起始位点上游的2Kb片段克隆进pSEAP2基体中。类似地,使用BAC克隆RP11-886P16,制备2Kb人Angptl4启动子构建体。
与地塞米松(10-3M)一起温育HEK293细胞和GEC(其用Angptl4-pSEAP或小鼠Angptl4的空载体启动子-报告基因构建体转染过),显示出在48小时时SEAP活性的下降。该活性下降是通过糖皮质激素受体来介导,因为受体拮抗剂米非司酮(2x10-5M)会逆转它。还评估了人启动子的糖皮质激素敏感性(地塞米松10-4M)。使用pf3gal载体(Clontech,Mountain View CA USA),将所有转染反应标准化。
ManNAc的体外和体内研究
为了研究ManNAc对重组蛋白的唾液酸化的影响,在15cm培养皿中将Angptl4-HEK293稳定的或pcDNA3.1-HEK293对照稳定细胞系培养至汇合,用温PBS洗涤2次,然后用无血清DMEM(没有酚红,含有或没有25mM ManNAc)温育48小时,此后收获培养基,浓缩,进行蛋白测定,并加载上二维凝胶(200μg/凝胶)。使用兔抗-Angptl4(全长)抗体,预免疫兔血清和凝集素SNA I-HRP和MAA-HRP(E-Y laboratories,San Mateo CA USA),进行肾小球或重组蛋白的蛋白质印迹。
随后使用中性pI Angptl4(ManNAc处理过)或高pI Angptl4(未处理)进行体外研究,以相同的方式使用His标签纯化的蛋白或得自稳定的Angptl4-HEK293的浓缩上清液。从对照稳定细胞系上清液,浓缩对照蛋白。
在重度白蛋白尿的NPHS2-Angptl4大鼠中的中试研究揭示,维持白蛋白尿的20-30%下降需要大ManNAc剂量需求(8mg/ml自来水)。为了使该研究是可承受的,给7只纯合的雄性NPHS2-Angptl4大鼠(3-3.5个月龄,具有比野生型大鼠高15-25倍的白蛋白尿)施用含ManNAc(1mg/ml)的自来水,持续12天(ManNAc期),此后将3只安乐死,其它大鼠则恢复纯自来水,持续另外24天(清除期)。在研究之前,进行2次18小时尿收集(第-12天和第0天),以证实升高的白蛋白尿,并在研究期间定期收集。对另外7只类似年龄的雄性NPHS2-Angptl4大鼠评估基线白蛋白尿水平,施用普通自来水(对照组),在第12将3只安乐死,对其它大鼠随访至第36天,此后重新评估白蛋白尿,并将动物安乐死。记录每只大鼠的每天水摄入。在每个安乐死时间点,在灌注后取出肾,分离肾小球,并处理,用于二维凝胶电泳。将每只大鼠在第0天的白蛋白尿指定为100%,相对于第0天表示所有随后的白蛋白尿值。
统计分析
使用GraphPad InStat软件3.05版,通过具有分析后检验的ANOVA,分析涉及3个或更多个组的蛋白尿或基因表达差异。为了对比2个组,在MicrosoftExcel2003中使用不成对的Students t检验。
前述描述解释了和描述了本公开内容的方法和其它教导。另外,本公开内容仅显示和描述了公开的方法和其它教导的某些实施方案,但是,如上所述,应当理解,本公开内容的教导能够用于各种其它组合、改进和环境中,且能够在本文所述的教导的范围内变化或改进,这与相关领域的普通技术人员的技能和/或知识相称。上文所述的实施方案进一步意图解释已知用于实践本公开内容的方法和其它教导的最佳模式,并使得本领域的技术人员能够在这些或其它实施方案中利用本公开内容的教导,并根据实际用途或应用的需要做出各种改进。因此,本公开内容的方法和其它教导无意限制本文公开的具体实施方案和实施例。在本文中引用的所有参考文献都通过引用并入,如同在本公开内容中完整地阐述。
表1-用于Taqman实时PCR的引物和探针的列表
参考文献
1.Falk R,Jennette C,Nachman PH.Primary glomerular disease.In The Kidney,Brenner BM编,第6版,1263-1349(2000).
2.Gutman,A.和Shafrir,E.Adipose tissue in experimental nephrotic syndrome.Am.J.Physiol.205,702-706(1963).
3.Vaziri,N.D.Molecular mechanisms of lipid disorders in nephrotic syndrome.KidneyInt.63,1964-1976(2003).
4.Shearer,G.C.和Kaysen GA.Endothelial bound lipoprotein lipase(LpL)depletion in hypoalbuminemia results from decreased endothelial binding,notdecreased secretion.Kidney Int.70,647-653(2006).
5.Reaven,E.P.,Kolterman,O.G.和Reaven,G.M.Ultrastructural andphysiological evidence for corticosteroid-induced alterations in hepatic production ofvery low density lipoprotein particles.J.Lipid Res.15,74-83(1974).
6.Tsukamoto,Y.,Kokubo,T.,Horii,A.,Moriya,R.和Kobayashi,Y.Lipoproteinderangement during steroid treatment in minimal-change nephrotic syndrome.Nephron73,606-612(1996).
7.Liu,G.,Clement,L.,Kanwar,Y.S.,Avila-Casado,C.和Chugh,S.S.ZHXproteins regulate podocyte gene expression during the development of nephroticsyndrome.J.Biol.Chem.281,39681-39692(2006).
8.Yoon,J.C.等人,Peroxisome proliferator-activated receptor gamma targetgene encoding a novel angiopoietin-related protein associated with adiposedifferentiation.Mol.Cell.Biol.20,5343-5349(2000).
9.Kersten,S.等人,Characterization of the festing-induced adipose factor FIAF,a novel peroxisome proliferator-activated receptor target gene.J.Biol.Chem.275,28488-28493(2000).
10.Kim,I.等人,Hepatic expression,synthesis and secretion of a novelfibrinogen/angiopoietin-related protein that prevents endothelial-cell apoptosis.Biochem.J.346,603-610(2000).
11.Yoshida,K.,Shimizugawa,T.,Ono,M.和Furukawa,H.Angiopoietin-likeprotein 4 is a potent hyperlipidemia-inducing factor in mice and inhibitor oflipoprotein lipase.J.Lipid Res.43,1770-1772(2002).
12.Ge,H.,等人,Oligomerization and regulated proteolytic processing ofangiopoietin-like protein4.J.Biol.Chem.279,2038-2045(2004).
13.Ge,H.,Yang,G.,Yu,X.,Pourbahrami,T.和Li,C.Oligomerizationstate-dependent hyperlipidemic effect of angiopoietin-like protein4.J.LipidRes.45,2071-2079(2004).
14.Romeo,S.,等人,Population-based resequencing of ANGPTL4 uncoversvariations that reduce triglycerides and increase HD L.Nat.Genet.39,513-516(2007).
15.Romeo,S.等人,Rare loss-of-function mutations in ANGPTL familymembers contribute to plasma triglyceride levels in humans.J. Clin.Invest.119:70-79(2009).
16.Eremina,V.,等人,VEGF inhibition and renal thrombotic microangiopathy.NEngl.J. Med.358,1129-1136(2008).
17.Davis,B.,等人,Podocyte-specific expression of angiopoietin-2 causesproteinuria and apoptosis of glomerular endothelia.J. Am.Soc.Nephrol. 18,2320-2329(2007).
18.Avila-Casado,C.,等人,Proteinuria in rats induced by serum from patientswith collapsing glomerulopathy.Kidney Int 66,133-143(2004).
19.Mandard,S.,等人,The fasting-induced adipose factor/angiopoietin-likeprotein 4 is physically associated with lipoproteins and governs plasma lipid levelsand adiposity.J. Biol.Chem.281:934-944(2006).
20.Clement,L.,等人,Early changes in gene expression that influence thecourse of primary glomerular disease.Kidney Int.72,337-347(2007).
21.Cazes,A.等人,Extracellular matrix-bound angiopoietin-like 4 inhibitsendothelial cell adhesion,migration,and sprouting and alters actin cytoskeleton.Circ.Res.99,1207-1215(2006).
22.Malicdan,M.C.,Noguchi,S.,Hayashi,Y.K.,Nonaka,I.和Nishino,I.Prophylactic treatment with sialic acid metabolites precludes the development of themyopathic phenotype in the DMRV-hIBM mouse model.Nat.Med.15,690-695(2009).
23.Galeano,B.等人,Mutation in the key enzyme of sialic acid biosynthesiscauses severe glomerular proteinuria and is rescued by N-acetylmannosamine.J.Clin.Invest.117,1585-1594(2007).
24.Ruge,T.等人,Lipoprotein lipase in the kidney:activity varies widelyamong animal species.Am.J. Physiol.Renal Physiol.287,F1131-F1139(2004).
25.Koliwad,S.K.等人,Angiopoietin-like 4(ANGPTL4/FIAF)is a directglucocorticoid receptor target and participates in glucocorticoid-regulated triglyceridemetabolism.J.Biol.Chem.284,25593-25601(2009).
26.Liu,G.等人Nephl and nephrin interaction in the slit diaphragm is animportant determinant of glomerular permeability.J. Clin.Invest.112,209-221(2003).
27.Dijkman,H.B.P.M.,Mentzel,S.,de Jong,A.S.和Assmann,K.J.M.RNA insitu hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes.Biochemica2,23-27(1995).
28.Isogai,S.,Mogami,K.,Shiina,N.和Yoshino,G. Initial ultrastructuralchanges in pore size and anionic sites of the glomerular basement membrane instreptozotocin-induced diabetic rats and their prevention by insulin treatment.Nephron.83,53-58(1999).
29.Bakker,W.W.等人,Altered activity of plasma hemopexin in patients withminimal change disease in relapse.Pediatr. Nephrol.20,1410-1415(2005).
30.Graves,R.A.,Tontonoz,P.,Platt,K.A.,Ross,S.R.和Spiegelman,B.M.Identification of a fat cell enhancer:analysis of requirements for adiposetissue-specific gene expression.J Cell Biochem.49,219-224(1992).
31.Yoshida,K.,Ono,M.,Koishi,R.和Furukawa,H.Characterization of the5’regulatory region of the mouse angiopoietin-like protein4.Vet.Res.Commun.28,299-305(2004).
32.Zeng,L.等人,HMG CoA reductase inhibition modulates VEGF-inducedendothelial cell hyperpermeability by preventing RhoA activation and myosinregulatory light chain phosphorylation.FASEB J19,1845-1847(2005)。
Claims (23)
1.用于治疗或预防受试者的糖尿病病症的方法,所述方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸、唾液酸前体或前述物质的组合。
2.根据权利要求2所述的方法,其中所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述唾液酸前体具有下述结构
。
5.根据权利要求3所述的方法,其中X和Y各自独立地是C1至C5烷基。
6.根据权利要求3所述的方法,其中所述唾液酸前体是Bu4ManNAc、3,4,6-O-Bu3ManNAc、1,3,4-O-Bu3ManNAc N-乙酰丙酰基唾液酸或N-乙酰丙酰基甘露糖胺。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述唾液酸化合物以治疗有效量施用。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述施用恢复在肾病综合征的病原学中涉及的多肽的唾液酸化。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述多肽是Angptl4。
10.一种用于治疗或预防受试者的肾病综合征的方法,所述方法包括下述步骤:给所述受试者施用唾液酸、唾液酸前体或前述物质的组合。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述肾病综合征被表征为:轻微改变型肾病、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病/膜性肾小球肾炎、膜性增生性肾小球肾炎或糖尿病肾病。
14.根据权利要求12所述的方法,其中X和Y各自独立地是C1至C5烷基。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述唾液酸前体是Bu4ManNAc、3,4,6-O-Bu3ManNAc、1,3,4-O-Bu3ManNAc N-乙酰丙酰基唾液酸或N-乙酰丙酰基甘露糖胺。
16.根据权利要求10所述的方法,其中所述唾液酸化合物以治疗有效量施用。
17.根据权利要求10所述的方法,其中所述施用:减轻水肿、减轻蛋白尿、增加血浆白蛋白水平、减轻高胆固醇血症、减轻高甘油三酯血症或前述功能的组合。
18.根据权利要求10所述的方法,其中所述施用会恢复在肾病综合征的病原学中涉及的多肽的唾液酸化。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述多肽是Angptl4。
20.一种针对肾病综合征或糖尿病病症来测定受试者的状态的方法,所述方法包括下述步骤:测定所述受试者中的与肾病综合征或糖尿病病症有关的多肽的唾液酸化水平,将这样的唾液酸化水平与对照中的唾液酸化水平进行对比,如果所述受试者中的唾液酸化水平小于所述对照中的唾液酸化水平,那么确定所述受试者正在遭受肾病综合征或糖尿病病症或处于肾病综合征或糖尿病病症的风险中。
21.根据权利要求24所述的方法,其中所述多肽是Angptl4。
22.一种在接受肾病综合征或糖尿病病症治疗的受试者中测定治疗效力的方法,所述方法包括下述步骤:测定所述受试者中的与肾病综合征或糖尿病病症有关的多肽的唾液酸化水平,将这样的唾液酸化水平与对照中的唾液酸化水平或开始治疗之前所述受试者中的唾液酸化水平进行对比,如果所述受试者中的唾液酸化水平等于或接近所述对照中的唾液酸化水平,或者如果所述受试者中的唾液酸化水平与开始治疗之前测得的所述受试者中的唾液酸化水平相比增加,那么确定所述治疗是有效的。
23.根据权利要求26所述的方法,其中所述多肽是Angptl4。
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WO2008150477A2 (en) | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health | N-acetyl mannosamine as a therapeutic agent |
US9139629B2 (en) | 2010-06-05 | 2015-09-22 | The Uab Research Foundation | Methods for treatment of nephrotic syndrome and related conditions |
AU2014233219B2 (en) * | 2013-03-15 | 2018-02-22 | Sumant S. CHUGH | Methods for treatment of nephrotic syndrome and related conditions |
US10493087B2 (en) | 2015-02-25 | 2019-12-03 | The United States of America, as represented by National Institute of Health | Sialylation-increasing therapies for diseases associated with oxidative stress |
EP3278806A4 (en) * | 2015-04-03 | 2018-08-08 | The University of Tokyo | Glucose-sensitive cell protecting agent |
EP4232147A4 (en) * | 2020-10-22 | 2024-08-21 | Brigham & Womens Hospital Inc | METHODS FOR IDENTIFYING AND TREATMENT OF ANTIBODY-MEDIATED ACQUIRED PRIMARY OR RECURRENT IDIOPATHIC NEPHROTIC SYNDROME |
CN116558929B (zh) * | 2023-07-07 | 2023-09-19 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 一种足细胞免疫荧光染色的方法及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008150477A2 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health | N-acetyl mannosamine as a therapeutic agent |
CN101600438A (zh) * | 2007-02-08 | 2009-12-09 | 日本脏器制药株式会社 | 疼痛疾病治疗剂 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04112829A (ja) * | 1990-08-30 | 1992-04-14 | Mect Corp | 腎疾患治療薬 |
US20020137890A1 (en) | 1997-03-31 | 2002-09-26 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6274568B1 (en) * | 1998-08-06 | 2001-08-14 | Ronald L. Schnaar | Compounds for altering cell surface sialic acids and methods of use therefor |
EP1463752A4 (en) | 2001-12-21 | 2005-07-13 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
US7915008B2 (en) * | 2006-04-27 | 2011-03-29 | Syddansk Universitet | Methods for isolation and analysis of sialylated and phosphorylated peptides |
JP5597130B2 (ja) * | 2007-07-03 | 2014-10-01 | チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド | ポリシアル酸脱n−アセチラーゼの阻害剤及びその使用方法 |
US8916544B2 (en) * | 2007-08-08 | 2014-12-23 | The Johns Hopkins University | Hybrid SCFA-hydroxyl-derivatized monosaccharides, methods of synthesis, and methods of treating disorders |
WO2010027028A1 (ja) * | 2008-09-04 | 2010-03-11 | 国立大学法人 東京大学 | 脳機能低下の改善剤 |
CN102427817B (zh) * | 2009-05-15 | 2015-02-11 | 财团法人日本健康科学振兴财团 | 起因于gne蛋白质功能降低的疾病的治疗用药物、食品组合物、食品添加剂 |
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Patent Citations (2)
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---|---|---|---|---|
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WO2008150477A2 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health | N-acetyl mannosamine as a therapeutic agent |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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