CN103146805A - 一种基于整合生物标志物法的海洋溢油污染的贝类监测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物监测环境技术领域，具体涉及一种海洋溢油污染的贝类监测方法，使用我国典型双壳贝类如菲律宾蛤仔、栉孔扇贝，测定贝类内脏团抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性等，并将这些酶活进行整合形成整合生物标志物响应指数(IBR)，建立IBR与石油浓度之间的剂量-效应关系，采用一维方差分析法(ANOVA)进行显著差异性分析，确定石油污染对生物的胁迫程度，最终判定海洋溢油的污染水平。

Description

一种基于整合生物标志物法的海洋溢油污染的贝类监测方法

技术领域

本发明属于生物监测环境技术领域，具体涉及一种海洋溢油污染的贝类监测方法。

背景技术

21世纪是“海洋的世纪”。如何有效地保护海洋环境，维护近海海域生态平衡己成为各国制定本国可持续发展战略的重要组成部分。引起海洋污染的途径很多，其中海洋溢油被认为是最严重、最广泛的海洋污染类型之一，已引起当前世界各国的普遍关注。近年来，世界各地油田漏油、油船泄露等重大溢油事故频发，如2010年墨西哥湾溢油事件，2011年渤海的“蓬莱19-3”溢油事件等。我国海洋环境质量监测表明，石油类是我国海洋环境中三种主要超标污染物中唯一的有机污染物；部份站位沉积物中的石油类含量劣于第三类海洋沉积物质量标准；受石油烃等的影响，12％监测站位的生物质量劣于第三类海洋生物质量标准。石油污染不仅会影响海洋生物的生长、发育和繁殖，而且会通过食物链进入人体对人类健康造成潜在威胁。严重的溢油事故会对局部海域的生态系统造成毁灭性破坏。因此，加强海洋溢油污染的有效监测体系的建设，深入研究石油污染的生物累积效应及毒性影响，对于保护海洋渔业资源的健康和可持续发展具有重要的意义。

目前，对海洋溢油污染进行监测，主要采用物理化学分析的方法。但是低剂量的石油污染化学方法常常无法检出，并且理化监测只能代表取样期间的石油污染情况，而生物监测更加敏感，可以将长期的污染状况反映出来。石油烃污染进入水生生物体内后经过生物转化，在氧化还原循环中产生大量活性氧自由基(ROS)，这些ROS具有很高的活性，可攻击各种生物大分子，造成酶失活、蛋白质变性、脂质过氧化、DNA损伤等氧化损伤。而抗氧化酶在ROS的产生和消除过程中起着重要的作用，而且对于这些可能产生ROS的污染物的暴露，既可由于适应性反应而被诱导，也可由于中毒反应而受到抑制。因此抗氧化系统可以作为监测海洋溢油污染的生物标志物。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷胱甘肽转硫酶(Glutathiones-transferase，GST)和过氧化物酶(Peroxidase，POD)是生物体重要的抗氧化酶，能够控制机体代谢的活性氧，在防御过氧化损害方面起到重要作用，能较全面地反映机体受氧化胁迫和生物的应激响应程度。这些抗氧化酶活性在石油污染条件下，既有抑制，又有诱导，而且各种酶在生物毒性暴露响应的不同步性，表明不同的酶对污染物刺激的敏感程度有所差异，若将各种酶活性用于海洋环境监测还不能很好地定量评价污染状况，我们发现应该将这几种酶结合起来分析，才能较准确客观的评估海洋环境的污染状况。因此，建立一种方法将一系列不同量纲的生物标志物进行整合，反映污染的综合效应，以此来比较不同污染状况间的差异。

Beliaeff和Burgeot(Beliaeff B，Burgeot T.Integrated biomarker response：A useful toolfor ecological risk assessment.Environmental Toxicology and Chemistry，2002，21(6)：1316-1322)将所测定的所有生物标志物整合为统一的参数——整合生物标志物响应指数(IBR)。IBR的大小能够直接指示一定暴露状况下多个生物标志物的综合响应。该方法最近已经开始用于河流海域生物效应评价。但是基于IBR法进行海洋溢油污染评价的贝类生物监测方法尚未见报道。

海洋双壳贝类，栖息在在沿海或河口地区，移动能力差，活动范围小，容易暴露于各种海洋污染物中，并且由于其独特的滤食习性，对污染物的富集能力更强和敏感性更高，在世界范围内被广泛用作海洋和河口污染的指示生物。所以，合适指示生物的选择和先进监测方法的建立是本发明的关键所在。

发明内容

本发明的目的是在于克服已有技术使用化学分析方法对海洋溢油污染进行检测时精确度不高，尤其是低剂量长期石油污染常常无法检出，不能真实全面的反映海洋溢油对海洋环境的污染状况，同时单一生物分子指标与石油污染的剂量-效应关系不理想等问题，从而提供一种先进全面准确的海洋溢油污染的生物监测方法，使用我国典型双壳贝类如菲律宾蛤仔、栉孔扇贝，测定贝类内脏团抗氧化酶活性，并将这些酶活进行整合形成整合生物标志物响应指数(IBR)，建立IBR与石油浓度之间的剂量-效应关系，采用一维方差分析法(ANOVA)进行显著差异性分析，确定石油污染对生物的胁迫程度，最终判定海洋溢油的污染水平。

本发明的目的是由如下技术方案实现的：

一种用于判断海洋溢油污染水平的贝类监测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)贝类生物培养：受试生物贝类实验前洗刷干净，取回后置实验室内水族箱中暂养5～7d备用；

(2)石油烃暴露实验：配置一定浓度梯度的石油烃试验液，采用半静水接触染毒法，将暂养过的贝类分成7组，其中1组为对照组，另外6组为试验组，同时每组设定3个平行组，分别放入玻璃缸中，在整个实验过程中持续充气，每隔24h换相同浓度的新鲜试验液，于第15d取样；

(3)抗氧化酶活性的测定：将贝类活体解剖，取出内脏团，于液氮中研磨后称重，经灭菌生理盐水润洗，用滤纸吸干表面水分，迅速称取适量加入组织块重9倍体积的生理盐水中，冰浴匀浆后于4℃条件下3000r/min离心10min，然后取上清用生理盐水配成体积比10％组织匀浆，直接用于超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶和过氧化物酶活性的测定，然后分别稀释成体积比5％组织匀浆用于谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性的测定；1％组织匀浆用于蛋白含量的测定；

(4)整合生物标志物响应与石油烃浓度的剂量-效应关系：将超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性进行整合，形成整合生物标志物响应指数IBR：

计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X；

数据标准化：X标准化得到Y，Y＝(X-m)/s，其中m和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；

当生物标志物的响应为受活化时，Z＝Y；当生物标志物的响应为受抑制时，Z＝-Y；

对于每一个生物标志物所有试验水平的Z值最小值为Min，将其绝对值与Z相加得到得分S，S＝Z+|Min|，S≥0；利用星状图表示生物标志物的结果，星状图的每个半径坐标对应每次试验水平的一个生物标志物的得分S；以Si和Si+1代表星状图中顺时针方向上的两个连续得分，n为半径的数目，也就是测定的生物标志物的个数；Ai为第i个和第i+1个半径相连形成的面积，可通过下式计算：

其中

α＝2π/n，S_n+1＝S₁；总面积即为整合生物标志物响应(IBR)， $\mathrm{IBR}=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{A}_i;$

绘制IBR与石油烃含量的剂量-效应关系，结果呈现出显著的线性关系；

(5)海洋溢油污染贝类监测评价：海洋溢油事故发生后，根据溢油扩散的范围设置一定数量的站位S1，S2，....St，同时在清洁海域设定对照站位S0，将已经暂养驯化的贝类转移至溢油海域的站位S1，S2，....St和对照站位S0，放置15d后取出，迅速测定溢油海域站位S1，S2，....St和对照站位S0贝类生物体超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性，并将这些抗氧化酶整合形成IBR，进行方差分析，并用均值多重比较分析法分析对照组S0与溢油站位S1，S2，....St贝类IBR的差异显著性，当P＞0.05为差异不显著，表明溢油污染对贝类没有产生明显胁迫，基本没有石油污染；当P＜0.05为差异显著，表明溢油污染对贝类中度胁迫，石油污染程度较重；当P＜0.01为差异极显著，表明溢油污染对贝类重度胁迫，石油污染程度严重。

优选的，步骤(1)实验用水为沿海自然海水，经砂滤处理，盐度为29.08±0.18，pH为7.85±0.03，温度为21.05±0.43℃，暂养期间连续充气，每24h换水一次；投喂小球藻2次/日。

优选的，步骤(3)中谷胱甘肽过氧化物酶活性定义每毫克蛋白质每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中谷胱甘肽浓度降低1μmol/L为一个酶活性单位；谷胱甘肽转硫酶活性定义每毫克组织蛋白在37℃反应1分钟扣除非酶促反应，使反应体系中谷胱甘肽浓度降低1μmol/L为一个酶活性单位；超氧化物歧化酶活性定义每毫克组织蛋白在1mL反应液中超氧化物歧化酶抑制率达50％时所对应的超氧化物歧化酶量为一个酶活性单位；过氧化氢酶活性定义每毫克组织蛋白每秒钟分解1pmol的H₂O₂的量为一个酶活性单位；过氧化物酶活性定义37℃条件下每毫克组织蛋白每分钟催化产生1μg的底物的酶量为一个酶活性单位。

本发明与已有技术相比具有以下优点：

本发明选用向海洋溢油水域和清洁水域移植的同一批次、规格大小一致的双壳贝类为检测对象，着眼于分析海洋溢油水域与对照清洁水域下贝类IBR之间的差异显著性。用于监测海洋溢油污染的贝类抗氧化酶活性对石油污染响应敏感，可准确评价低剂量海洋溢油污染的程度，能较好的反应海洋溢油污染对海洋环境的客观影响，且标本前处理方法简单，可以运用市场化的试剂盒进行规范化、快速而准确的测定。该方法所取得的结果稳定性好，可重复性高、可比性强，系统误差小，可以准确评估及预测海洋溢油污染的风险和发展趋势，提供一种海洋溢油早期预测预警技术。同时，与仅采集野生贝类分析，应用本发明的移植监测法具有样本规格一致、背景水平相同、环境特征清晰、污染指示效应明显等优势。所有这些均显示出运用整合生物标志物法对海洋溢油污染开展贝类监测方法的良好功能。

附图说明

图1为菲律宾蛤仔内脏团整合生物标志物响应指数(IBR)与石油烃浓度之间的剂量-效应关系，可以看出贝类IBR与石油烃之间呈现显著的相关性。

图2为胶州湾海洋溢油污染区域与对照站位菲律宾蛤仔内脏团IBR的显著差异性分析，其中S0为对照站位，S1、S2、S3、S4和S5是海洋溢油污染区域站位，a表示呈显著差异(P＜0.05)，b表示呈极显著差异(P＜0.01)。所以可以看出S1站位海洋污染等级为1级(较轻)，S3和S4站位海洋溢油污染等级为2级(中度)，S2和S5站位海洋溢油污染等级为3级(重度)。

图3为山东长岛海洋溢油污染区域与对照站位栉孔扇贝内脏团IBR的显著差异性分析，其中S0为对照站位，S1、S2、S3、S4、S5和S6是海洋溢油污染区域站位，a表示呈显著差异(P＜0.05)，b表示呈极显著差异(P＜0.01)。所以可以看出S6站位海洋污染等级为1级(较轻)，S3和S4站位海洋溢油污染等级为2级(中度)，S1、S2和S5站位海洋溢油污染等级为3级(重度)。

具体实施方式：

以下仅示例性描述本发明，以明确该发明能够重复实现并可达到突出的实质性效果，但不构成对本发明的限制。

本发明提供一种用于判断海洋溢油污染水平的贝类监测方法，包括如下步骤：

(1)贝类生物培养：受试生物贝类实验前洗刷干净，取回后置实验室内水族箱(130cm×50cm×60cm)中暂养5～7d备用。实验用水为沿海自然海水，经砂滤处理，盐度为29.08±0.18，pH为7.85±0.03，温度为(21.05±0.43)℃，暂养期间连续充气，每24h换水一次。投喂小球藻(3×10⁶个/mL)，日投饵2次。暂养期间实验贝类活动正常，健康无病，死亡率低于5％。选择大小均匀，健康的贝类进行分组实验。

(2)石油烃暴露实验：配置一定浓度梯度的石油烃试验液，采用半静水接触染毒法(夏斌等，胜利原油对半滑舌鳎肝脏超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响，载《渔业科学进展》，2011年2月，第32卷第1期：53-59；陈家长等，不同浓度阿维菌素对鲤鱼过氧化氢酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响，载《生态学杂志》，2010，29(4)：680-686)，将暂养过的贝类分成7组，其中1组为对照组，另外6组为试验组，同时设定3个平行组(重复)，分别放入50cm×38.5cm×36cm玻璃缸中。在整个实验过程中持续充气，每隔24h换相同浓度的新鲜试验液，于第15d取样。

(3)抗氧化酶活性的测定：将贝类活体解剖，取出内脏团，于液氮中研磨后称重，经灭菌生理盐水润洗，用滤纸吸干表面水分，迅速称取适量加入组织块重9倍体积的生理盐水(0.9％)中，冰浴匀浆后于4℃条件下离心(3000r/min，10min)，然后取上清用生理盐水配成10％组织匀浆，直接用于SOD、GST和POD活性的测定，然后分别稀释成5％组织匀浆用于GSH-Px和CAT活性的测定；1％组织匀浆用于蛋白含量的测定。肝脏中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。肝脏GSH-Px、GST、SOD、CAT和POD活性的测定均采用南京建成生物公司提供的检测试剂盒，仪器为BIO-RAD美国伯乐imark酶标仪，相应操作按照说明书进行。其中GSH-Px活性定义每毫克蛋白质每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活性单位；GST活性定义每毫克组织蛋白在37℃反应1分钟扣除非酶促反应，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活性单位(U/mg-prot)；SOD活性定义每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个酶活性单位(U/mg蛋白)。CAT活性定义每毫克组织蛋白每秒钟分解1pmol的H₂O₂的量为一个酶活性单位(U/mg蛋白)。POD活性定义37℃条件下每毫克组织蛋白每分钟催化产生1μg的底物的酶量为一个酶活性单位(U/mg-prot)。

(4)整合生物标志物响应与石油烃浓度的剂量-效应关系：将GSH-Px、GST、SOD、CAT和POD活性进行整合，形成整合生物标志物响应指数(Integrated biomarker responses，IBR)：计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X。数据标准化：X标准化得到Y，Y＝(X-m)/s，其中m和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差。当生物标志物的响应为受活化时，Z＝Y；当生物标志物的响应为受抑制时，Z＝-Y。对于每一个生物标志物所有试验水平的Z值最小值为Min，将其绝对值与Z相加得到得分S，S＝Z+|Min|，S≥0。利用星状图表示生物标志物的结果，星状图的每个半径坐标对应每次试验水平的一个生物标志物的得分S。以Si和Si+1代表星状图中顺时针方向上的两个连续得分，n为半径的数目，也就是测定的生物标志物的个数。Ai为第i个和第i+1个半径相连形成的面积，可通过下式计算： $A_i=\frac{S_i}{2}\sin \mathrm{\β}(S_i\cos \mathrm{\β}+S_{i+1}\sin \mathrm{\β}).$ 其中

α＝2π/n，S_n+1＝S₁。总面积即为整合生物标志物响应(IBR)，

绘制IBR与石油烃含量的剂量-效应关系，结果呈现出显著的线性关系。

(5)海洋溢油污染贝类监测评价：海洋溢油事故发生后，根据溢油扩散的范围设置一定数量的站位(S₁，S₂，....S_t)，同时在清洁海域设定对照站位(S₀)，将已经暂养驯化的贝类转移至溢油海域的站位(S₁，S₂，....S_t)和对照站位(S₀)，放置15d后取出，迅速测定溢油海域站位(S₁，S₂，....S_t)和对照站位(S₀)贝类生物体GSH-Px、GST、SOD、CAT和POD活性，并将这些抗氧化酶整合形成IBR，进行方差分析(ANOVA)(优选软件分析，特别优选运用SPSS软件)，并用均值多重比较分析法(LSD法)分析对照组(S₀)与溢油站位(S₁，S₂，....S_t)贝类IBR的差异显著性，当P＞0.05为差异不显著，表明溢油污染对贝类没有产生明显胁迫，基本没有石油污染，设定海洋溢油污染等级为1级(较轻)；当P＜0.05为差异显著，表明溢油污染对贝类中度胁迫，石油污染程度较重，设定海洋溢油污染等级为2级(中度)；当P＜0.01为差异极显著，表明溢油污染对贝类重度胁迫，石油污染程度严重，设定海洋溢油污染等级为3级(重度)。运用此方法从分子水平较为系统而快速的评价海洋溢油对海洋生物的胁迫程度，最终判断海洋溢油污染的等级。

下面本发明将结合实施例作进一步描述：

在本发明中，优选采用菲律宾蛤仔和栉孔扇贝，对石油污染响应敏感，可更加准确响应低剂量海洋溢油污染，结果稳定好，系统误差小，评估准确。以下做详细描述。

实施例1：本发明一种基于整合生物标志物法的海洋溢油污染贝类监测方法，采用以下工艺步骤：

实验受试生物菲律宾蛤仔取自青岛市红岛养殖区。实验前洗刷干净，取回后置实验室内水族箱(130cm×50cm×60cm)中暂养5～7d备用。实验用水为青岛沿海自然海水，经砂滤处理，盐度为29.08±0.18，pH为7.85±0.03，温度为(21.05±0.43)℃，暂养期间连续充气，每24h换水一次。投喂小球藻(3×10⁶个/mL)，日投饵2次。暂养期间实验贝类活动正常，健康无病。选取大小规格(壳长：3.4～3.6cm；壳高：1.0～1.1cm；壳宽：2.0～2.2cm，带壳重：6.2～8.1g)均一的菲律宾蛤仔30个。

胶州湾大公岛发生溢油事故后，根据该海域的水动力状况，在溢油的扩散区域内设置5个站位(S1、S2、S3、S4和S5)，同时在据溢油污染事故发生点的海流上方2000m处设定对照站位S0，迅速移植菲律宾蛤仔至S0、S1、S2、S3、S4和S5站位，15d后取回菲律宾蛤仔，存放到液氮罐中保存(-80℃)，立即返回实验室测定。将菲律宾蛤仔活体解剖，取出内脏团，于液氮中研磨后称重，经灭菌生理盐水润洗，用滤纸吸干表面水分，迅速称取适量加入组织块重9倍体积的生理盐水(0.9％)中，冰浴匀浆后于4℃条件下离心(3000r/min，10min)，然后取上清用生理盐水配成体积比10％组织匀浆，直接用于SOD、GST和POD活性的测定，然后分别稀释成体积比5％组织匀浆用于GSH-Px和CAT活性的测定；体积比1％组织匀浆用于蛋白含量的测定。菲律宾蛤仔肝脏GSH-Px、GST、SOD、CAT和POD活性的测定均采用南京建成生物公司提供的检测试剂盒，仪器为BIO-RAD美国伯乐imark酶标仪，相应操作按照说明书进行。将这些生物标志物进行整合形成整合生物标志物响应(IBR)，运用SPSS软件进行方差分析(ANOVA)，并用均值多重比较分析法(LSD法)分析对照组(S₀)与溢油站位(S₁，S₂，....S_t)贝类IBR的差异显著性(图2)，结果很好的反映海洋溢油污染对贝类的胁迫程度，从而客观准确的评估海洋溢油对海洋环境的污染状况。因此利用本发明规格大小一致的菲律宾蛤仔为生物指示贝类，通过本发明抗氧化酶活性的测定以及整合生物标志物响应(IBR)的计算分析可准确判断海洋溢油污染的等级，可以用于海洋溢油污染的监测。

实施例2：本发明一种基于整合生物标志物法的海洋溢油污染贝类监测方法，采用以下工艺步骤：

实验受试生物栉孔扇贝取自山东长岛养殖区。实验前洗刷干净，取回后置实验室内水族箱(130cm×50cm×60cm)中暂养5～7d备用。实验用水为长岛沿海自然海水，经砂滤处理，盐度为29.25±0.18，pH为7.81±0.03，温度为(21.21±0.43)℃，暂养期间连续充气，每24h换水一次。投喂小球藻(3×10⁶个/mL)，日投饵2次。暂养期间实验贝类活动正常，健康无病。选取大小规格(壳长：4.9～5.1cm；壳高：1.4～1.6cm；壳宽：4.5～4.7cm，带壳重：8.5～11.4g)均一的栉孔扇贝28个。

山东长岛邻近海域发生溢油事故后，根据该海域的水动力状况，在溢油的扩散区域内设置6个站位(S1、S2、S3、S4、S5和S6)，同时在据溢油污染事故发生点的海流上方2000m处设定对照站位S0，迅速移植菲律宾蛤仔至S0、S1、S2、S3、S4、S5和S6站位，15d后取回栉孔扇贝，存放到液氮罐中保存(-80℃)，立即返回实验室测定。将栉孔扇贝活体解剖，取出内脏团，于液氮中研磨后称重，经灭菌生理盐水润洗，用滤纸吸干表面水分，迅速称取适量加入组织块重9倍体积的生理盐水(0.9％)中，冰浴匀浆后于4℃条件下离心(3000r/min，10min)，然后取上清用生理盐水配成体积比10％组织匀浆，直接用于SOD、GST和POD活性的测定，然后分别稀释成体积比5％组织匀浆用于GSH-Px和CAT活性的测定；体积比1％组织匀浆用于蛋白含量的测定。栉孔扇贝肝脏GSH-Px、GST、SOD、CAT和POD活性的测定均采用南京建成生物公司提供的检测试剂盒，仪器为BIO-RAD美国伯乐imark酶标仪，相应操作按照说明书进行。将这些生物标志物进行整合形成整合生物标志物响应(IBR)，运用SPSS软件进行方差分析(ANOVA)，并用均值多重比较分析法(LSD法)分析对照组(S0)与溢油站位(S1，S2，S3、S4、S5和S6)贝类IBR的差异显著性(图3)，结果能很好的海洋溢油污染对贝类的胁迫程度。因此利用本发明规格大小一致的栉孔扇贝为生物指示贝类，通过本发明抗氧化酶活性的测定以及整合生物标志物响应(IBR)的计算分析可准确判断海洋溢油污染的等级，可以用于海洋溢油污染的监测，监测效果良好。

Claims (3)

1.一种用于判断海洋溢油污染水平的贝类监测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)贝类生物培养：受试生物贝类实验前洗刷干净，取回后置实验室内水族箱中暂养5～7d备用；

(2)石油烃暴露实验：配置一定浓度梯度的石油烃试验液，采用半静水接触染毒法，将暂养过的贝类分成7组，其中1组为对照组，另外6组为试验组，同时每组设定3个平行组，分别放入玻璃缸中，在整个实验过程中持续充气，每隔24h换相同浓度的新鲜试验液，于第15d取样；

(3)抗氧化酶活性的测定：将贝类活体解剖，取出内脏团，于液氮中研磨后称重，经灭菌生理盐水润洗，用滤纸吸干表面水分，迅速称取适量加入组织块重9倍体积的生理盐水中，冰浴匀浆后于4℃条件下3000r/min离心10min，然后取上清用生理盐水配成体积比10％组织匀浆，直接用于超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶和过氧化物酶活性的测定，然后分别稀释成体积比5％组织匀浆用于谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性的测定；1％组织匀浆用于蛋白含量的测定；

(4)整合生物标志物响应与石油烃浓度的剂量-效应关系：将超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性进行整合，形成整合生物标志物响应指数IBR：

计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X；

数据标准化：X标准化得到Y，Y＝(X-m)/s，其中m和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；

当生物标志物的响应为受活化时，Z＝Y；当生物标志物的响应为受抑制时，Z＝-Y；

对于每一个生物标志物所有试验水平的Z值最小值为Min，将其绝对值与Z相加得到得分S，S＝Z+|Min|，S≥0；利用星状图表示生物标志物的结果，星状图的每个半径坐标对应每次试验水平的一个生物标志物的得分S；以Si和Si+1代表星状图中顺时针方向上的两个连续得分，n为半径的数目，也就是测定的生物标志物的个数；Ai为第i个和第i+1个半径相连形成的面积，可通过下式计算：

其中α＝2π/n，S_n+1＝S₁；总面积即为整合生物标志物响应(IBR)， $\mathrm{IBR}=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{A}_i;$

绘制IBR与石油烃含量的剂量-效应关系，结果呈现出显著的线性关系；

(5)海洋溢油污染贝类监测评价：海洋溢油事故发生后，根据溢油扩散的范围设置一定数量的站位S1，S2，....St，同时在清洁海域设定对照站位S0，将已经暂养驯化的贝类转移至溢油海域的站位S1，S2，....St和对照站位S0，放置15d后取出，迅速测定溢油海域站位S1，S2，....St和对照站位S0贝类生物体超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性，并将这些抗氧化酶整合形成IBR，进行方差分析，并用均值多重比较分析法分析对照组S0与溢油站位S1，S2，....St贝类IBR的差异显著性，当P＞0.05为差异不显著，表明溢油污染对贝类没有产生明显胁迫，基本没有石油污染；当P＜0.05为差异显著，表明溢油污染对贝类中度胁迫，石油污染程度较重；当P＜0.01为差异极显著，表明溢油污染对贝类重度胁迫，石油污染程度严重。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(1)实验用水为沿海自然海水，经砂滤处理，盐度为29.08±0.18，pH为7.85±0.03，温度为21.05±0.43℃，暂养期间连续充气，每24h换水一次；投喂小球藻2次/日。

3.如权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于步骤(3)中谷胱甘肽过氧化物酶活性定义每毫克蛋白质每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中谷胱甘肽浓度降低1μmol/L为一个酶活性单位；谷胱甘肽转硫酶活性定义每毫克组织蛋白在37℃反应1分钟扣除非酶促反应，使反应体系中谷胱甘肽浓度降低1μmol/L为一个酶活性单位；超氧化物歧化酶活性定义每毫克组织蛋白在1mL反应液中超氧化物歧化酶抑制率达50％时所对应的超氧化物歧化酶量为一个酶活性单位；过氧化氢酶活性定义每毫克组织蛋白每秒钟分解1pmol的H₂O₂的量为一个酶活性单位；过氧化物酶活性定义37℃条件下每毫克组织蛋白每分钟催化产生1μg的底物的酶量为一个酶活性单位。

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