CN103131726A - 一种培育耐热转基因水稻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了培育耐热转基因水稻的方法。该方法是将OsXZH1的编码基因通过重组植物表达载体导入水稻中，筛选得到耐热性提高的水稻；所述OsXZH1是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与1)相同功能的有1)衍生的蛋白质。实验证明，转OsXZH1基因水稻株系的耐热性明显高于未转基因的水稻株系。

Description

一种培育耐热转基因水稻的方法

技术领域

本发明涉及培育耐热转基因水稻的方法。

背景技术

干旱和极端温度等环境胁迫严重影响了作物的生长和发育，降低了粮食产量。改善和提高作物对非生物胁迫的抗性一直是农业生产的主要目标之一。水稻是世界上近一半人口的主要粮食资源，但是水稻生产并不能满足消费需求，在未来50年里，水稻生产将会面临巨大的挑战。在中国，目前人口有13亿，人均可耕地仅1.4亩，预计2030年人口将增至16亿，人均可耕地将减少到1亩左右。面对人口增长压力和耕地减少的严峻形势，培育具有抗逆性的新品种，提高粮食产量，将产生重要且深远的影响。

过去，利用传统的育种方法进行耐逆品种的培育进展缓慢。随着植物分子生物学的发展，现已发掘了一些与抗逆相关的新基因。科学家们已逐步了解了这些耐逆相关基因的表达模式及其在抗逆反应中的作用，这为耐逆转基因作物品种的培育开辟了新的途径。将一个基因转入水稻基因组中不会影响水稻的遗传背景，并且能够实现遗传性状的定向改变。因此与传统方法相比，转基因技术在改善水稻的抗逆性方面更有发展潜力。

植物抗逆反应是一个极为复杂的过程，植物的抗逆性状是多基因控制的复杂性状。植物对干旱、高温及寒冷耐受性的强弱往往不只取决于某一单一因子，而是受许多因子影响。一个转录因子可以调控多个与同类性状有关的基因的表达，通过增强一些关键的调节因子基因的作用，可使植物的抗逆性得到改良，提高作物对环境胁迫的抗性。与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的方法相比，从改良或增强一个关键的转录因子基因的调控能力着手，提高作物的抗逆性将是一种更为有效的方法和途径。因此应用转录因子提高植物的抗逆性研究已经成为当今的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供OsXZH1或其编码基因的一个新用途。

本发明所提供的新用途为OsXZH1或其编码基因在培育耐热转基因植物中的应用。

所述OsXZH1是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与1)相同功能的有1)衍生的蛋白质。

本发明还提供了用OsXZH1编码基因培育耐热转基因植物的方法。

本发明所提供的培育耐热转基因植物的方法包括如下步骤：

a)向目的植物中导入OsXZH1的编码基因，得到表达所述OsXZH1的编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，耐热性提高的转基因植物；

所述OsXZH1是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与1)相同功能的由1)衍生的蛋白质。

所述OsXZH1优选为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

序列表中序列2由81个氨基酸残基组成，其预测分子量为7.86KDa，等电点为11.19。生物信息学分析结果发现，基因的编码区不含有典型结构域。

所述OsXZH1的编码基因为下述3)-6)中任一所述的基因：

3)编码序列如序列表中序列1的第26-271位所示；

4)核苷酸序列如序列表中序列1的第12-285位所示；

5)核苷酸序列如序列表中序列1所示；

6)在严格条件下与3)或4)或5)的基因杂交，且编码序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质的基因。

序列表中序列1由288个核苷酸组成，其中前33位为扩增OsXZH1基因的上游引物序列，后28位为扩增OsXZH1基因的下游引物序列的反向互补序列，第26-271位OsXZH1基因的编码序列。

所述OsXZH1的编码基因是通过含有所述OsXZH1的编码基因的重组植物表达载体导入所述目的植物中的。在构建所述重组植物表达载体的过程中，在外源OsXZH1基因的转录起始核苷酸前加上增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。所述重组植物表达载体中启动所述OsXZH1的编码基因转录的启动子是两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子。在本发明的实施例中，所述启动子是用Kpn I与Xho I双酶切载体pJIT163后(小片段)获得的。所述启动子的序列如序列表中序列3的第12-751位所示。

所述重组植物表达载体为pCAMBIA1300-163-OsXZH1，其构建方法包括如下步骤：

a1)将所述两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子插入pCAMBIA1300的Kpn I与Xho I位点，得到含有两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子的复合表达载体pCAMBIA1300-163；

a2)将核苷酸序列如序列表中序列1的第12-285位所示的OsXZH1编码基因插入所述复合表达载体pCAMBIA1300-163中，得到由所述两个串联的花椰菜花叶病毒35s启动子启动所述OsXZH1编码基因的转录的所述重组植物表达载体pCAMBIA1300-163-OsXZH1。

在本发明的实施例中，所述复合表达载体pCAMBIA1300-163具体按照如下方法构建：用Kpn I与Sal I双酶切双元表达载体pCAMBIA1300；同时用Kpn I与Xho I双酶切载体pJIT163；并将获得的pCAMBIA1300酶切后的大片段和pJIT163载体酶切后的小片段连接起来，得到含有两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子的所述复合表达载体pCAMBIA 1300-163。

在本发明的实施例中，所述植物为水稻，具体为93-11。

本发明所提供的OsXZH1基因，是通过利用Affymetrix的水稻表达芯片分析超级稻两优培九母本培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在高温胁迫下的表达水平，最终得到的基因。转OsXZH1基因水稻植株的耐热性检测实验结果显示：pCAMBIA1300-163-OsXZH1-3/93-11转基因植株的存活率最高，达到28％，pCAMBIA1300-163-OsXZH1-7/93-11和pCAMBIA1300-163-OsXZH1-10/93-11转基因植株的存活率分别为16％和18％，而空载体对照pCAMBIA1300-163/93-11的存活率为2.7％。经统计学分析转OsXZH1基因水稻植株的存活率与未转OsXZH1基因的空载体对照pCAMBIA1300-163/93-11植株的存活率之间存在显著差异，具有统计学意义。这表明：转OsXZH1基因的水稻植株的存活率远高于转入pCAMBIA1300-163空载体的对照93-11水稻植株。

附图说明

图1为OsXZH1基因PCR产物凝胶电泳分析。其中，泳道M为DNA Marker(D2000)；泳道1为PCR产物。

图2为重组植物表达载体pCAMBIA1300-163-OsXZH1的Hind III单酶切后凝胶电泳分析结果。其中，泳道M为DNA Marker(D2000)；泳道1和泳道2为pCAMBIA1300-163-OsXZH1的Hind III单酶切酶切产物。

图3为pCAMBIA1300-163-OsXZH1转基因水稻植株中潮霉素基因的PCR扩增检测结果。其中，泳道1为无模板阴性对照；泳道2为转入pCAMBIA1300-163空载体的水稻植株阴性对照；泳道3为重组植物表达载体pCAMBIA1300-163-OsXZH1阳性对照；泳道4-17为潮霉素抗性水稻植株代表9株阳性转OsXZH1基因水稻植株(泳道4为转基因株系L-3，泳道6为转基因株系L-5，泳道7为转基因株系L-6，泳道10为转基因株系L-7，泳道12为转基因株系L-10，泳道13为转基因株系L-11，泳道14为转基因株系L-13，泳道16为转基因株系L-15，泳道17为转基因株系L-17)；泳道M为D2000DNA marker。

图4为转OsXZH1基因水稻T₁代阳性株系与空载体对照163/93-11耐热性实验前后生长状况以及存活率的统计分析。其中，A为转OsXZH1基因株系及空载体对照163/93-11高温胁迫前的图片；B为转OsXZH1基因株系及空载体对照163/93-11高温胁迫6天后的图片；C为转OsXZH1基因各株系及空载体对照163/93-11(CK)高温胁迫6天，正常条件恢复10天后的图片。其中，L3，L-7，L-10分别为T₁代转基因各株系，CK代表163/93-11对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

T₀代转基因水稻表示由愈伤组织得到的转基因植株及其无性系，T₁表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株和无性系。

实施例1、转OsXZH1基因水稻的培育及鉴定

一、转OsXZH1基因表达载体的构建

1、水稻总RNA的提取及cDNA的合成

取新鲜的水稻(Oryza sativa L.)品种培矮64S幼苗叶片，剪碎，用液氮研磨成粉状，立即装入事先装有1.0ml TRIzol提取液的1.5ml离心管中，摇动，使样品与TRIzol提取液充分混合，置-80度保存。加200ul氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。离心后，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入500μl异丙醇，沉淀、离心分离出RNA，再经75％酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的RNase-free的水，充分溶解。所提RNA经DNA酶(Fermentas)处理。

取培矮64s总RNA 2μg进行反转录，加入0.5μg/μl Oligo(dT)1μl，加入去离子水补足到12μl，70℃保温5min后，依次加入5×RT buffer 4μl，20U/μl RNase抑制剂1μl，10mmol/L dNTP 2μl，37℃保温5min后加入200U/μl M-MLV反转录酶1μl，反应终体积为20μl。42℃反应60min，70℃加热10min终止反应。

2、PCR扩增

从GenBank中搜索到OsXZH1的同源序列(AK111059.1)，应用Vector NTI 10.3软件分析设计该基因的PCR引物，上下游引物分别设有Nco I和BamH I酶切位点，上游引物OsXZH1-F：5′-CCATGGAGTAGCCACAAGACAGAAGATGAGGCG-3′(序列表中序列1的前33位，请核实)，下游引物OsXZH1-R：5′-GGATCCATGAAGCGGAGCTACAAGAGCA-3′(序列表中序列1的后28位的反向互补序列，请核实)，以培矮64S cDNA为模板进行PCR扩增；扩增反应条件：95℃4min，94℃30s，58℃45s，72℃1min，33个循环，最后在72℃10min。反应结束后，电泳检测PCR结果(图1)，结果显示扩增出约288bp的OsXZH1基因目的条带，该PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列1，其中序列1的第26-271位为OsXZH1基因的编码序列。

3、PCR产物的纯化

电泳后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒(天为时代)回收目的基因片断。操作程序如下：将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量。向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，使胶块充分溶解。将上一步得到的溶液加到吸附柱中(吸附柱放在收集管中)，13000rpm离心30秒，去除废液，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，13000rpm离心30秒，去除废液，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，13000rpm离心30秒，去除废液，将吸附柱重新放入收集管中，13000rpm离心2分钟。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附柱膜中间位置悬空滴加洗脱缓冲液，室温2分钟。13000rpm离心一分钟收集DNA溶液。

4、DNA连接反应

参照pMD18-T载体说明书，将步骤3的回收片段克隆入pMD18-T载体中，按试剂盒要求建立连接反应体系：pMD18-T载体0.5μl，溶液I 4.5μl，步骤3回收的基因片段2μl，ddH₂O 3μl，总反应体积10μl，16℃过夜连接。

5、大肠杆菌感受态制备及热激转化

制备大肠杆菌DH5α感受态细胞(CaCl₂法)：从37℃培养12-16h的平板中用无菌牙签挑取一个单菌落，转到含有3ml LB培养基的试管中，37℃培养过夜；取0.5mL过夜菌加到含100ml LB液的三角瓶中，37℃剧烈振荡(150-200rpm)培养2-3h，使OD₆₀₀达到0.3-0.4时立即冰浴10min，无菌条件下转到预冷的50ml灭菌离心管中。

连接产物用热激法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α：取一管感受态细胞，于冰上溶解，无菌条件下取5μl连接产物，加到感受态细胞中，用加样器吸打轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，将管迅速转到冰浴中放置2-3min；每管加无抗生素的LB培养基800μl，37℃摇床(100-160rpm)，温和摇振1h左右；取200μl培养液涂于含Amp(氨苄青霉素Ampicillin)的LB琼脂板，37℃培养16h～20h，挑取单克隆菌落于含Amp液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养14h。

6、质粒抽提及酶切鉴定

将培养物倒入1.5ml离心管中，用超低温离心机于4℃下以8000g/min离心1min，弃上清液，重复3次，最后用吸水纸吸干；将细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L TrisCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)，在高温、高压下蒸汽灭菌15min，贮存于4℃冰箱)中，剧烈振荡；加200ul溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，应确保离心管的整个内表面均与溶液II接触，不要振荡，将离心管放置冰上；加入150μl用冰预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，盖紧管口，将管倒置后，温和振荡10s，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管静置于冰上3-5min；微量离心机于4℃，12000g离心5min，将上清液移到另一离心管中；加等量异丙醇放于4℃冰箱中或冰块中30min；在4℃低温离心，12500rpm，20-30min。弃上清液；加70％的乙醇500μl，洗涤，然后低温离心5min，弃上清液；于干燥机中干燥10min；加无菌水100μl，另加RNase 5μl，放在37℃培养箱30min。

将提取到的大肠杆菌质粒用HindIII和EcoRI酶切，放在37℃培养箱2h，将酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，以检测是否为阳性克隆，然后送Invitrogen公司测序。测序结果表明，上述连接到pMD18-T载体中的PCR产物具有序列表中序列1的第26-271位核苷酸序列(OsXZH1基因的编码序列)。构建好的重组载体命名为pMD18-T-OsXZH1。序列表中序列1的第26-271位核苷酸序列编码序列表中序列2的蛋白OsXZH1。

7.转OsXZH1基因表达载体pCAMBIA1300-163-OsXZH1的构建

OsXZH1基因过量表达载体的构建分为两个步骤，用KpnI与Sal I双酶切双元表达载体pCAMBIA1300(上海捷兰生物技术有限公司，货号：CPC054)，同时用KpnI与Xho I(Sal I与Xho I为同尾酶)双酶切中间载体pJIT163(长沙天根生物技术有限公司，货号：P1865-221)，取pCAMBIA1300载体的大片段和pJIT163载体的小片段(含有两个花椰菜花叶病毒35S启动子串联得到的DNA片段，如序列表中序列3所示)连接，得到pCAMBIA1300-163复合表达载体。得到的表达载体pCAMBIA1300-163用Nco I和BamH I酶切，同时用Nco I和BamH I双酶切pMD18-T-OsXZH1重组载体，将得到的OsXZH1基因片段与酶切过的pCAMBIA1300-163载体大片段连接，构建好重组植物表达载体命名为pCAMBIA1300-163-OsXZH1。

通过对pCAMBIA1300-163-OsXZH1载体进行HindIII单酶切鉴定，结果显示，扩增出约1000bp的目的条带(插入基因+部分载体序列)(图2)，与预期结果相一致，这表明OsXZH1基因片段已成功连到上述pCAMBIA1300-163复合表达载体上。

二、转基因水稻的获得及转化体的鉴定

我们选用超级杂交稻的父本93-11(长沙隆平种子公司)作为转化受体，通过植物组织培养技术，采用农杆菌介导法将表达载体转化到水稻愈伤，其后经共培养、筛选抗性愈伤、分化、生根等一系列步骤，最终得到转基因水稻植株。CTAB法提取水稻叶片DNA，利用PCR技术鉴定阳性植株。

具体的操作步骤如下所述：

1、冻融法转化农杆菌

(1)冰上融化农杆菌EHA105感受态细胞。

(2)加入1-2μl步骤一获得的重组植物表达载体pCAMBIA1300-163-OsXZH1或pCAMBIA1300-163空载体，冰浴45分钟，液氮中冷冻1分钟，在37℃水浴3分钟。

(3)加入1ml无抗生素的YEB液体培养基，28℃，摇床震荡(转速为200rpm)培养3小时。

(4)12000rpm离心1分钟以浓缩菌液，再用1ml无抗生素的YEB液体培养基回溶菌体。

(5)将转化后的菌液涂于含50mg/L卡那霉素(Kan)，70mg/L利福平(Rif)的固体LB培养基上，28℃，恒温培养箱培养2-3天。

将转入重组载体pCAMBIA1300-163-OsXZH1的农杆菌EHA105命名为EHA105/pCAMBIA1300-163-OsXZH1；转入pCAMBIA1300-163空载体的农杆菌EHA105命名为EHA105/pCAMBIA1300-163。

2、农杆菌转化到水稻愈伤，获得转基因水稻

取水稻品种93-11(以下简称野生型水稻，以WT表示)种子，70％乙醇水溶液消毒1分钟，无菌水冲洗2-3遍；再用0.1％的升汞溶液振荡消毒10分钟以上，无菌水冲洗4-5遍，然后在无菌条件下分离出幼胚，接在NB培养基(N₆盐分和维生素，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L2，4-D，7g/L琼脂，pH 5.8)上，于25℃暗培养2周，得到水稻WT幼胚的愈伤组织。将愈伤组织切成小块，在NB_0.5(NB培养基，0.5mg/L 2，4-D)培养基上培养2-3周。农杆菌(EHA105/pCAMBIA1300-163-OsXZH1或EHA105/pCAMBIA1300-163)经划线活化后，挑取单菌落，摇至对数期，再按1∶100的比例摇菌至OD₆₀₀＝0.5，6000rpm离心10分钟，收集菌体重悬于AAM-AS(AAM盐分和氨基酸，500mg/L水解酪蛋白，0.5mg/L 2，4-D，100uM/L乙酰丁香酮，pH 5.2)培养基中，将培养好的成熟胚愈伤组织剪成小块收集到一个培养皿中，倒于农杆菌的AAM-AS中侵染20分钟，倒出菌液，用滤纸吸干，然后倒入NB₂C(NB培养基，10g/L葡萄糖，100uM/L乙酰丁香酮，pH 5.2)中，25℃共培养3天。共培养后的愈伤组织用头孢霉素300mg/L的无菌水中冲洗3-4遍，滤纸吸干，转入筛选培养基I(NB_0.5培养基，25mg/L潮霉素，600mg/L头孢霉素)上，25℃共培养2周。共培养后转入筛选培养基II(NB_0.5培养基，50mg/L潮霉素，300mg/L头孢霉素)上，继续筛选2代，2周/代。将筛选得到的抗性愈伤组织放入带有无菌滤纸的培养皿中干燥1天，接种到分化培养基RE₁(MS培养基，1mg/L 6BA，0.5mg/L激动素，0.2mg/L玉米素，0.25mg/LNAA，50mg/L潮霉素)上暗培养1周，再转到光下培养1周。然后转到分化培养基RE₂(MS培养基，1mg/L 6BA，0.5mg/L激动素，0.2mg/L玉米素，0.5mg/LNAA，50mg/L潮霉素)上光下培养2周。待小苗张到2cm左右高时将小苗转移入生根培养基(1/2MS培养基，0.2mg/LNAA)。待小苗长至10cm左右时打开容器封口膜，炼苗2-3天，将小苗移至人工气候室栽培。获得T₀代转OsXZH1基因的93-11植株和转入pCAMBIA1300-163空载体的T₀代转基因水稻93-11。其中，转入pCAMBIA1300-163空载体的T₀代转基因水稻93-11，命名为pCAMBIA1300-163/93-11(简称为163/93-11)。

水稻阳性植株的PCR鉴定：从上述表现出潮霉素抗性的T₀代转基因水稻新鲜叶片中提取微量总DNA。根据表达载体上潮霉素的编码序列设计一对引物，Hyg-F：5′-ACCTGCTGAAACCGAACTG-3′，Hyg-R：5′-CTGCTCCATACAAGCCAACC-3′，PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，循环30次；72℃后延伸10min。以转入pCAMBIA1300-163空载体的T₀代转基因水稻植株(pCAMBIA1300-163/93-11，163/93-11)作为阴性对照，以上述步骤一获得的重组植物表达表达载体pCAMBIA1300-163-OsXZH1作为阳性对照，同时设置未添加模板的PCR反应体系对照。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果如图3所示。结果显示，部分转基因水稻植株PCR扩增出大小约为527bp的目的条带，而无模板的阴性对照和未转基因的水稻植株阴性对照均为扩增出目的条带。扩增出目的条带的水稻植株为阳性转基因植株。共得到了9株阳性T₀代转OsXZH1基因水稻，分别命名为pCAMBIA1300-163-OsXZH1-1/93-11(简称为L-1)、pCAMBIA1300-163-OsXZH1-3/93-11(简称为L-3)、pCAMBIA1300-163-OsXZH1-4/93-11(简称为L-4)、pCAMBIA1300-163-OsXZH1-7/93-11(简称为L-7)、pCAMBIA1300-163-OsXZH1-9/93-11(简称为L-9)、pCAMBIA1300-163-OsXZH1-10/93-11(简称为L-10)、pCAMBIA1300-163-OsXZH1-11/93-11(简称为L-11)、pCAMBIA1300-163-OsXZH1-13/93-11(简称为L-13)、pCAMBIA1300-163-OsXZH1-14/93-11(简称为L-14)。

实施例2、转OsXZH1基因水稻的耐热性检测

为了检测转OsXZH1基因水稻的耐热性，进行了转OsXZH1基因水稻植株苗期耐高温试验。具体操作如下所述：取上述实施例1鉴定阳性的转OsXZH1基因水稻T₁代株系(本实验所选株系为9个阳性株系中的3个，L-3、L-7、L-10)，针对每个阳性株系(L-3、L-7和L-10)，每盆中种植50棵转基因水稻，以及25棵对照(实施例1获得的转入pCAMBIA1300-163空载体的T₁代转基因水稻植株)，每个转基因株系各种植3盆。将转OsXZH1基因植株的T₁代株系和对照在正常条件下生长15天的幼苗移到光照培养箱(45℃，12h光照/12h黑暗)处理6天，移出，正常条件下恢复生长10天后照相和统计存活率。

图4展示了转OsXZH1基因水稻株系与对照在耐热性实验前后生长状况以及存活率的统计数据。在45℃高温胁迫前，T₁代转OsXZH1基因水稻株系与对照水稻植株的株高、存活率、生长状况基本一致，如图4中A所示。高温处理6天后，转基因株系与对照植株均出现叶片枯黄卷曲的现象，如图4中B所示。高温处理后恢复10天后，对照植株基本全部死亡，而转OsXZH1基因的水稻植株存活率较高，如图4中C所示。

对高温胁迫6天，正常条件恢复10天后各组的存活率进行统计分析，发现所选3个转基因株系L-3、L-7、L-10的存活率分别为28％±3.2％、16％±1.1％和18％±2.5％，而对照植株的存活率为2.7％±1.3％。这表明转OsXZH1基因的水稻植株的存活率高于对照植株。

Claims (10)

1.OsXZH1的编码基因在培育耐热转基因植物中的应用；所述OsXZH1是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与1)相同功能的有1)衍生的蛋白质。

2.OsXZH1在培育耐热转基因植物中的应用，所述OsXZH1是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与1)相同功能的有1)衍生的蛋白质。

3.培育耐热转基因植物的方法，包括如下步骤：

a)向目的植物中导入OsXZH1的编码基因，得到表达所述OsXZH1的编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，耐热性提高的转基因植物；

所述OsXZH1是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有与1)相同功能的有1)衍生的蛋白质。

4.根据权利要求1所述的应用或权利要求3所述的方法，其特征在于：所述OsXZH1的编码基因为下述3)-6)中任一所述的基因：

3)编码序列如序列表中序列1的第26-271位所示；

4)核苷酸序列如序列表中序列1的第12-285位所示；

5)核苷酸序列如序列表中序列1所示；

6)在严格条件下与3)或4)或5)的基因杂交，且编码序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质的基因。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述OsXZH1的编码基因是通过含有所述OsXZH1的编码基因的重组植物表达载体导入所述目的植物中的；所述重组植物表达载体中启动所述OsXZH1的编码基因转录的启动子是两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于：所述两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子的序列为序列表中序列3的第12-751位。

7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于：所述重组植物表达载体为pCAMBIA1300-163-OsXZH1，其构建方法包括如下步骤：

a1)将所述两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子插入pCAMBIA1300的Kpn I与Xho I位点，得到含有两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子的复合表达载体pCAMBIA1300-163；

a2)将核苷酸序列如序列表中序列1的第12-285位所示的OsXZH1编码基因插入所述复合表达载体pCAMBIA1300-163中，得到由所述两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子启动所述OsXZH1编码基因转录的所述重组植物表达载体pCAMBIA1300-163-OsXZH1。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于：所述复合表达载体pCAMBIA1300-163按照如下方法构建：用Kpn I与Sal I双酶切双元表达载体pCAMBIA1300；同时用Kpn I与Xho I双酶切载体pJIT163；并将获得的pCAMBIA1300酶切后的大片段和pJIT163载体酶切后的小片段连接起来，得到含有两个同向串联的花椰菜花叶病毒35s启动子的所述复合表达载体pCAMBIA1300-163。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为水稻。

10.根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于：所述水稻为93-11。

Images