CN103122347A - 一种杀灭葡萄球菌的裂解酶及其应用 - Google Patents
一种杀灭葡萄球菌的裂解酶及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种能杀灭葡萄球菌的裂解酶及其应用，同时公开了该酶的氨基酸序列和编码基因序列；采用公开的编码基因所构建的重组裂解酶能在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶表达；该酶能用于在体外高效杀灭各种葡萄球菌，包括临床分离的甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）和甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA），以及用于体内治疗葡萄球菌感染的抗生素；所公开的酶也能快速裂解葡萄球菌的细胞壁并释放胞内的物质，如三磷酸腺苷（ATP）和DNA等，通过检测所释放的物质可以实现对葡萄球菌的各种检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂领域，具体涉及一种能杀灭葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌，的裂解酶和编码基因，以及其在体外杀灭葡萄球菌，体内治疗葡萄球菌感染的抗生素和用于葡萄球菌检测等方面的应用。
技术背景
根据生化反应和产生色素不同，葡萄球菌可分为金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)和腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophytics)等三种。其中金黄色葡萄球菌多为致病菌，表皮葡萄球菌偶尔致病，腐生葡萄球菌一般不致病。金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）是一种常见的革兰氏阳性球菌，能引起人和动物的许多严重的感染，同时也是医院感染常见的病原体之一（Brumfitt, W. and J. Hamilton-Miller (1989). "Methicillin-resistant Staphylococcus aureus." N Engl J Med 320(18): 1188-1196; Maple, P. A., J. M. Hamilton-Miller, et al. (1989). "World-wide antibiotic resistance in methicillin-resistant Staphylococcus aureus." Lancet 1(8637): 537-540; Lowy, F. D. (1998). "Staphylococcus aureus infections." N Engl J Med 339(8): 520-532）。金黄色葡萄球菌易于对抗生素产生抗性，包括常见的各种抗生素，以及新型的抗微生物制剂（Tsiodras, S., H. S. Gold, et al. (2001). "Linezolid resistance in a clinical isolate of Staphylococcus aureus." Lancet 358(9277): 207-208; Mangili, A., I. Bica, et al. (2005). "Daptomycin-resistant, methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia." Clin Infect Dis 40(7): 1058-1060; Skiest, D. J. (2006). "Treatment failure resulting from resistance of Staphylococcus aureus to daptomycin." J Clin Microbiol 44(2): 655-656）。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现和广泛传播给临床治疗带来了前所未有的挑战（Lowy, F. D. (2003). "Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus." J Clin Invest 111(9): 1265-1273; de Lencastre, H., D. Oliveira, et al. (2007). "Antibiotic resistant Staphylococcus aureus: a paradigm of adaptive power." Curr Opin Microbiol 10(5): 428-435; Arias, C. A. and B. E. Murray (2009). "Antibiotic-resistant bugs in the 21st century--a clinical super-challenge." N Engl J Med 360(5): 439-443）。为了应对葡萄球菌的耐药性问题，常需要提取葡萄球菌基因组DNA，用于PCR检测临床菌株是否是MRSA等等。然而，由于葡萄球菌细胞壁坚厚，常规的蛋清溶菌酶对其没有明显的溶壁作用，而具有良好溶壁效果的溶葡萄球菌素价格昂贵，难以普遍应用。
噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染宿主细菌后晚期表达的一种细胞壁水解酶。裂解酶大小通常为25 kD~40 kD，在结构上由两个独立的功能域构成，N-端的催化功能域，和一个决定细胞结合位点的C-端细胞结合功能域（CBD），二者之间由一个小片段链接。序列分析表明，同一类裂解酶的催化域高度保守，而细胞结合域可变，这为构建新的嵌合裂解酶提供了可能。裂解酶具有很高的特异性，只能特异性的识别和裂解特定种类的细菌。此外，裂解酶作用位点很保守，加上噬菌体与细菌共同进化的特异性，宿主菌很难对其产生抗性。裂解酶的这些特点，为其用于临床上耐药细菌的控制和治疗提供了理论的可行性。到目前为止，已有一些能作用于金黄色葡萄球菌的天然裂解酶以及嵌合裂解酶被报道，这些酶可以在体内、体外较好地杀灭金黄色葡萄球菌。但是这些裂解酶大多比较难于可溶性表达，或者活性不高，作用pH范围较窄，一般在pH 5-8。寻找能可溶表达以及高活性的裂解酶对于开发新的抗葡萄球菌的药物，体外控制葡萄球菌的感染，裂解葡萄球菌的细胞壁用于检测等等都具有非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种新的能可溶表达及高活性的杀灭葡萄球菌的裂解酶，以及基于该酶的体内外应用。为临床上金黄色葡萄球菌，特别是多耐药的金黄色葡萄球的治疗和控制提供了新的抗生素分子和灭菌剂，同时为金黄色葡萄球菌的快速检测和分型提供新的高效细胞壁裂解剂。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：
本发明经过生物信息分析，人工设计和合成了一种能编码葡萄球菌裂解酶的基因，并通过体外重组的方法，提供了一种能在体外、体内杀灭葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌的裂解酶（为了叙述方便，将该酶命名为ClyH，将其编码基因命名为ClyH）。
本发明公开的全长ClyH的核酸序列如下：
atggcactgcctaaaacgggtaaaccaacggcaaaacaggtggttgactgggcaatcaatttaatcggcagtggtgtcgatgttgatggttattatggtcggcaatgttgggatttacctaactatatttttaatagatactggaactttaagacaccaggcaacgcaagagatatggcatggtatagatatcctgaagggtttaaagtgtttagaaacacttctgattttgtccctaaaccaggtgatatagcagtgtggacaggtggtaattacaattggaacacttggggacacactggtattgttgtaggtccatcaactaaaagttacttttatagtgtagatcagaattggaataactctaactcttacgttggtagtcctgcagcaaagataaaacatagttattttggtgtaactcattttgttagacccgcatacaaagcagaaccgaaacctacaccaccaggtaccagatctgcatgcggtaaatctgcaagtaaaataacagttggaagtaaagcgccttataaccttaaatggtcaaaaggtgcttattttaatgcgaaaatcgacggcttaggtgctacttcagccactagatacggtgataatcgtactaactatagattcgatgttggacaggctgtatacgcgcctggaacattaatatatgtgtttgaaattatagatggttggtgtcgcatttattggaacaatcataatgagtggatatggcatgagagattgattgtgaaagaagtgttttaa；
所述ClyH的氨基酸序列如下：
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本发明还公开了一种可溶表达ClyH蛋白质及纯化所表达的ClyH蛋白质的方法，其步骤为将ClyH基因克隆后连入表达载体pBAD24中，然后将表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。所表达的蛋白质先经过离子交换纯化，再用磷酸盐（PBS）缓冲液透析处理。
本发明还公开了采用ClyH体外杀灭表皮葡萄球菌以及多种临床分离金黄色葡萄球菌株的效果，证明了该裂解酶的高活性与对葡萄球菌的广谱性。还试验了ClyH对实验动物模型小鼠感染金黄色葡萄菌后的保护效果，以及对细胞毒性的测试，初步证实了其用于治疗葡萄球菌感染抗生素的潜能。
本发明还进一步公开了利用ClyH快速裂解葡萄球细胞壁并释放胞内物质ATP的特点，采用荧光素酶检测释放的ATP来进行葡萄球菌的快速鉴定的方法。其步骤为将待测定细菌与ClyH混合后，加入荧光素酶及其底物于37摄氏度孵育，同时用酶标仪检测混合液发光强度的变化。同时，用没有加入ClyH的菌混合液作为阴性对照。
本发明还进一步公开了利用ClyH快速裂解葡萄球菌细胞壁并释放胞内DNA的特点，以裂解液中释放的DNA为模板，采用PCR方法对葡萄球菌进行各种检测和鉴定的方法。作为例子，提供了用于MRSA鉴定和分型的检测结果。其步骤为将待分析细菌与ClyH混合后于37摄氏度孵育10-15 min，对混合液10000 g离心1 min。取上清做模板，加入MRSA鉴定的两对引物（分别针对femB和mecA）进行PCR来对菌株是否为MRSA进行鉴定。对鉴定为MRSA的菌株，则进一步加入SCCmec分型所需的5对引物进行PCR，对MRSA菌株进行分型。
本发明还提供了一种采用ClyH对于皮肤表面的葡萄球菌进行有效杀灭的方法。其步骤为，先用含有一定浓度ClyH的溶液擦拭小鼠裸露的皮肤（模拟人的皮肤），并等待10秒-2分钟，再用常规的医用消毒剂，如75%酒精或者碘酒等，擦拭消毒。
本发明与现有技术相比，具有以下的主要突出效果和优点：
其一. ClyH由人工设计合成，能采用大肠杆菌可溶性表达，具有酶活性高，能快速裂解葡萄球菌的细胞壁的特点，通过实验证实了该酶能在体外杀灭各种葡萄球菌，包括多种临床分离的金黄色葡萄球菌和耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株。
其二. ClyH细胞毒性低，能显著提高注入致死剂量金黄色葡萄球菌小鼠的存活率，与对照组相比，存活率提高至接近80%，具有应用于体内作为抗感染药物的潜能。
其三. ClyH在体外与葡萄球菌作用后，能快速释放葡萄球菌细胞内的物质，如ATP和DNA等，适合用于对葡萄球菌的各种检测，包括MRSA的鉴定和分型等。
其四. ClyH也能用于皮肤消毒杀灭葡萄球菌，具有比75%酒精更好的杀灭葡萄球菌的效果。
附图说明
图1为ClyH 基因PCR扩增结果。
图2为ClyH杀灭金黄色葡萄球菌标准菌株CCTCC AB91118的裂解曲线。
图3为ClyH杀灭金黄色葡萄球菌标准菌株CCTCC AB91118的电镜验证结果。
图4为ClyH体外杀灭表皮葡萄球菌（编号：B51，B311，B511，B530，C208，D417，D970，ATCC12228）、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA， 编号：AB918，B30，D390，D403，D405，JM113，JM114）以及对不同种类菌株特异性的结果。
图5为ClyH体外杀灭临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株（横坐标上标注的是不同菌的菌株编号）的结果。
图6为ClyH用于模拟皮肤消毒后降低皮肤表面葡萄球菌（ATCC12228）数目的结果比较。
图7为ClyH用于体内杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌提高注射有致死剂量金黄色葡萄球菌（JM968）实验小鼠存活率的结果。
图8为ClyH对于细胞毒性的测试结果。
图9为ClyH用于基于ATP释放的多种葡萄球菌快速检测结果。
图10为ClyH用于多种临床分离菌株的MRSA鉴定PCR检测结果。
图11为ClyH用于多种MRSA菌株分型的PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例及附图对本发明做进一步的详细说明。
本发明通过对葡萄球菌噬菌体裂解酶的催化域和细胞结构域氨基酸序列的分析，设计和人工合成了能表达一种葡萄球菌裂解酶ClyH的基因序列，并通过体外重组到大肠杆菌中表达，获得了该酶。下列实施例中所用的方法如无特别说明均是常规的实验方法。实验中所用到的引物均由上海英骏公司合成。测序均在上海英骏公司完成。所采用的金黄色葡萄球菌标准菌株CCTCC AB91118购自武汉大学菌株保藏中心，表皮葡萄球菌ATCC 12228和非葡萄球菌的菌株购于广东微生物保藏中心。其它均为临床分离菌株，来源于武汉的几个医院，并经过美国Biolog自动微生物鉴定仪鉴定。临床菌株的耐药性经过甲氧西林纸片稀释法进行培养验证。临床分离的金黄色葡萄球菌均在baird-parker琼脂基础（购自广东环凯微生物科技有限公司）上划线分离，然后挑单菌落于TSB培养基中过夜培养，供测试。
实施例1、能杀灭葡萄球菌的裂解酶的构建和表达。
采用包括以下步骤的方法：
1. 经过生物信息学分析目前各种葡萄球菌裂解酶的催化域和细胞壁结合域的特点，在实验室人工设计了一种能编码一种新裂解酶的基因序列。为了叙述方便，我们命名该基因为ClyH，命名该基因所编码的酶为ClyH。ClyH的核酸序列如下：
atggcactgcctaaaacgggtaaaccaacggcaaaacaggtggttgactgggcaatcaatttaatcggcagtggtgtcgatgttgatggttattatggtcggcaatgttgggatttacctaactatatttttaatagatactggaactttaagacaccaggcaacgcaagagatatggcatggtatagatatcctgaagggtttaaagtgtttagaaacacttctgattttgtccctaaaccaggtgatatagcagtgtggacaggtggtaattacaattggaacacttggggacacactggtattgttgtaggtccatcaactaaaagttacttttatagtgtagatcagaattggaataactctaactcttacgttggtagtcctgcagcaaagataaaacatagttattttggtgtaactcattttgttagacccgcatacaaagcagaaccgaaacctacaccaccaggtaccagatctgcatgcggtaaatctgcaagtaaaataacagttggaagtaaagcgccttataaccttaaatggtcaaaaggtgcttattttaatgcgaaaatcgacggcttaggtgctacttcagccactagatacggtgataatcgtactaactatagattcgatgttggacaggctgtatacgcgcctggaacattaatatatgtgtttgaaattatagatggttggtgtcgcatttattggaacaatcataatgagtggatatggcatgagagattgattgtgaaagaagtgttttaa；
根据核酸编码蛋白质的密码子规则，ClyH基因所编码的蛋白质ClyH的氨基酸序列为：
MALPKTGKPTAKQVVDWAINLIGSGVDVDGYYGRQCWDLPNYIFNRYWNFKTPGNARDMAWYRYPEGFKVFRNTSDFVPKPGDIAVWTGGNYNWNTWGHTGIVVGPSTKSYFYSVDQNWNNSNSYVGSPAAKIKHSYFGVTHFVRPAYKAEPKPTPPGTRSACGKSASKITVGSKAPYNLKWSKGAYFNAKIDGLGATSATRYGDNRTNYRFDVGQAVYAPGTLIYVFEIIDGWCRIYWNNHNEWIWHERLIVKEVF；
2. 将所设计的能表达裂解酶ClyH的ClyH基因DNA序列，交由上海生工生物工程有限公司采用商业化的DNA合成方法合成。合成序列装入pUC57质粒中，并经DNA测序仪测序证实与所设计的核酸序列ClyH一致。以ClyH基因为模板，在目的基因的两端分别加入EcoRI和XhoI的酶切位点，引物设计如下：
Upper：5- AAAAGAATTCATGGCACTGCCTAAAACGGGTAAAC -3
EcoRI
Down：5- AAACTCGAGTTAAAACACTTCTTTCACAATC -3
XhoI
以2 μl基因为模板，各加入引物1 μg进行PCR扩增，PCR扩增程序如下：（1）94 ℃，5 min；（2）94 ℃，30 sec，62 ℃，45 sec，72 ℃，45 sec，30个循环；（3）72 ℃，10 min；将产物进行凝胶电泳回收，电泳图谱如图1，ClyH的基因大小为774 bp，与所设计的裂解酶基因片段的大小一致。
2. 将ClyH基因连入表达质粒pBAD24中得到重组载体pB-ClyH，然后将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。
3. ClyH的表达纯化。
将表达菌株BL21(DE3)/pB-ClyH接种到500 mL的培养基中37摄氏度震荡培养，待OD600长到0.6-0.8时，添加L-阿拉伯糖至0.2%，然后将培养基转入16度诱导表达9-12 小时。培养结束后，收集菌体并超声破碎，破碎液10000 g离心30 min，取上清过0.22 μm滤膜，然后将滤过液转入烧杯中，缓缓滴加饱和硫酸铵至终浓度33%，4摄氏度沉淀过夜。10000 g离心30 min收集沉淀，将沉淀溶于PBS后于PBS中透析过夜。
为了确认所要表达的酶ClyH是否成功表达和有活性，将金黄色葡萄球菌CCTCC AB91118过夜培养物10毫升，离心收集后用磷酸缓冲液（PBS）洗涤一次，再重悬于1毫升PBS溶液中。取透析液与上述菌液（混合前，用PBS缓冲液调整菌液浓度，使其与透析液等量的PBS缓冲液混合后在600 nm吸收值接近1.0）等量混合，同时用等量PBS缓冲液与上述菌液混合作为对照，用酶标仪监测混合液在600 nm吸收值随时间的变化。结果显示透析液有明显的杀金黄色葡萄球菌活性。
透析后的粗提液，或者是超声后的上清，过HiTrap Q Sepharose FF column (GE Healthcare)，收集柱流出物。将柱流出物过HiTrap SP Sepharose FF column，然后用含1 M NaCl的50 mM的磷酸缓冲液梯度洗脱，分段收集洗脱峰。采用与上述同样的方法分别测定各收集组分杀金黄色葡萄球菌活性，将有活性的各管混合后于PBS中透析过夜，即为纯化后的酶液。
以上结果显示，由人工设计合成的ClyH基因,可以经过大肠杆菌重组可溶表达ClyH蛋白质,所获得的ClyH具有杀金黄色葡萄球菌活性。
实施例2、ClyH杀灭金黄色葡萄球菌标准菌株CCTCC AB91118的活性和作用位点。
将金黄色葡萄球菌过夜培养物10毫升，离心收集后用磷酸缓冲液（PBS）洗涤一次，再重悬于1毫升PBS溶液中。取2 μg ClyH与上述菌液（混合前，用PBS缓冲液调整菌液浓度，使其与ClyH溶液等量的PBS缓冲液混合后在600 nm吸收值接近1.0）混合，用酶标仪监测混合液在600 nm吸收值的变化。同时，用PBS缓冲液与金黄色葡萄球菌的混合液作为对照。最后得到的裂解曲线见图2。结果显示ClyH能快速的裂解CCTCC AB91118菌株，导致菌液的浊度降低，表现为菌液在600 nm波长的吸收值快速降低，而作为对照的加入同样量PBS缓冲液的金黄色葡萄球菌混合液的浊度基本没有下降。菌液与ClyH作用一分钟后的电镜结果（图3）也显示金黄色葡萄球菌的细胞壁破裂，证实ClyH的作用是裂解细菌的细胞壁。
实施例3、ClyH体外杀灭表皮葡萄球菌、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）以及对不同种类菌株特异性的验证。
为了验证ClyH的杀菌谱，我们选择了几种非葡萄球菌菌株（具体见图4横坐标上标注的菌名）和临床分离的表皮葡萄球菌（菌株编号：B51，B311，B511，B530，C208，D417，D970，ATCC12228）、和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）菌株（菌株编号：AB918，B30，D390，D403，D405，JM113，JM114）一起测试。首先将测试的菌株分别过夜培养，10毫升培养物离心收集后用PBS洗涤一次，然后重悬于1毫升PBS缓冲液中。取2 μg的ClyH与上述菌液(混合前，用PBS缓冲液调整菌液浓度，使其与ClyH溶液等量的PBS缓冲液混合后在600 nm吸收值接近1.0）分别混合，用酶标仪监测混合液在600 nm吸收值的变化30 min。用OD600降低的速率表示不同菌株的裂解效果。同时，用PBS缓冲液与菌液的混合液作为对照。试验得到的杀灭效果见图4。结果显示ClyH能在体外快速地杀灭所有测试的临床分离MSSA菌株以及表皮葡萄球菌株而对其它种类非葡萄球菌的测试菌株没有裂解作用。
实施例4、ClyH体外杀灭临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株的效果
将临床分离得到的多株MRSA菌过夜培养10毫升培养物，分别离心收集并用PBS洗涤一次后，重悬于1毫升PBS缓冲液中。取2 μg的ClyH与上述菌液(混合前，用PBS缓冲液调整菌液浓度，使其与ClyH溶液等量的PBS缓冲液混合后在600 nm吸收值接近1.0）分别混合，同时用酶标仪监测混合液在600 nm吸收值的变化30 min。用OD600降低的速率表示不同菌株的裂解效果。同时，用PBS缓冲液与这些金黄色葡萄球菌的混合液作为对照。试验得到的杀灭效果见图5（横坐标上为所测试菌株的编号）。结果显示ClyH能在体外快速地杀灭所有测试的临床分离MRSA菌株。
实施例5、ClyH用于模拟皮肤消毒后降低皮肤表面葡萄球菌的数目
用灭菌棉球棒分别蘸取用PBS缓冲液配制的不同浓度的表皮葡萄球菌（ATCC12228）液后，将菌液涂在小鼠裸露的皮肤表面，自然干燥后进行测试。测试时，实验组先用灭菌棉球棒蘸取含有10 ug/mLClyH的PBS溶液擦拭，等10 s-2 min后，再用浸湿有75%酒精的棉球棒直接擦拭皮肤表面2-3次后，将擦拭的酒精棉球棒放入50毫升TSB液体培养基中，培养24小时后，采用稀释平板法计数。对照组只采用浸湿有75%酒精的棉球棒擦拭涂有同样浓度菌液的皮肤表面，擦拭皮肤2-3次后将棉球棒放入50毫升TSB液体培养基中，培养24小时后，采用稀释平板法计数。结果统计图见图6。结果显示与只采用75%酒精消毒相比，采用ClyH后能更有效地清除皮肤表面的表皮葡萄球菌。
实施例3,4和5说明了所发明的裂解酶ClyH能用于在体外特异杀灭葡萄球菌，应用时只需将含有该酶的制剂直接作用于所要控制的部位或者物品，酶与菌直接接触作用后就可以杀灭葡萄球菌。
实施例6、ClyH体内杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的效果
实验中所用小鼠为6周大的BALB/c雌性鼠，重约20到22克。在实验小鼠（40只）腹腔注射中致死剂量4×109 的MRSA菌株（编号：JM968）。0.5小时后，将小鼠分为两组，每组20只。实验组小鼠腹腔注射ClyH 100 μg，对照组则注射与ClyH溶液同样体积的PBS缓冲液。每天观测小鼠的存活率，所得到的结果见图7。结果显示ClyH能有效的杀灭体内的MRSA菌，将小鼠的存活率提高至接近80%。
实施例7、ClyH细胞毒性的测试。
将Caco-2细胞以每孔5×103的浓度接种到96孔板中，培养24小时后，向孔板中分别加入一定浓度的ClyH (0.1-1 mg/mL)以及离子霉素（15 mg/mL）和丝裂霉素C（15 mg/mL）。继续培养24小时。培养结束后，向孔板中加入染色剂WST-8，静置后在酶标仪上读取450 nm吸光值。所得到的结果见图8。结果显示即使高浓度的ClyH也无细胞毒性，而作为阳性对照的离子霉素和丝裂霉素均显示了较高的细胞毒性。
实施例6说明了所发明的裂解酶ClyH能用于体内杀灭葡萄球菌，应用时将含有该酶的制剂直接注入体内就可以发挥效果，显著提高了感染有致死剂量金黄色葡萄球菌实验小鼠的存活率。同时，实施例7说明了所发明的裂解酶ClyH基本没有细胞毒性。综合实施例6和7的结果，提示了所发明的裂解酶ClyH能用于作为体内治疗葡萄球菌感染的药物。
实施例8、ClyH用于基于ATP释放的葡萄球菌快速检测
将几种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的过夜培养物10毫升分别离心收集，用PBS洗涤沉淀一次后重悬于1毫升PBS缓冲液中。取2 μg的ClyH与上述菌液分别混合，同时加入0.25 μM的荧光素酶和5 μM的荧光素底物（其中含有12.5 μM辅酶A）。混匀后的反应液置于37摄氏度，用酶标仪监测发光强度的变化。试验得到的鉴定结果见图9。结果显示所测试的金黄色葡萄球菌液都有不同程度的发光增强，原因显然是由于ClyH能裂解金葡菌的细胞壁导致了胞内ATP的释放，荧光素酶能利用所释放的ATP催化底物发光，而作为对照的大肠杆菌溶液，由于ClyH不能裂解其细胞壁，没有ATP释放，从而表现为基本没有发光增强的现象。
实施例9、ClyH用于金黄色葡萄球菌MRSA菌株的PCR鉴定
将多种临床分离的金黄色葡萄球菌过夜培养物10毫升分别离心收集，用PBS洗涤沉淀一次后重悬于1毫升PBS缓冲液中。取2 μg的ClyH与上述菌液分别混合，37摄氏度裂解10-15 min。将裂解后的溶液10000 g离心1 min，取上清1 μl做模板，各加入引物1 μg进行PCR扩增。
扩增femB基因所用引物为：FemB-F (5’-TTACAGAGTTAACTGTTACC-3’)和FemB-R (5’-ATACAAATCCAGCACGCTCT-3’)；
扩增mecA基因所用引物为MecA-F (5’-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA-3’)和MecA-R (5’-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA-3’)。
PCR扩增程序如下：1）94 ℃，5 min；2）94 ℃，30 sec，50 ℃，45 sec，72 ℃，60 sec，30个循环；3）72 ℃，10 min；将产物进行凝胶电泳分析，电泳图谱如图10。femB基因大小为651 bp（Δ指示条带），mecA 基因为310 bp （*指示条带）。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）应同时具有两个基因，而甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）应只有femB基因，只具有mecA基因的为金黄色葡萄球菌的其它菌株。结果显示用ClyH作用金黄色葡萄球菌后的裂解液上清中，存在菌内DNA，以其作为PCR扩增模板，可以扩增出相应的基因片段，用于PCR鉴定MRSA菌株。
实施例10、ClyH用于MRSA分型的PCR鉴定的验证
将多种临床分离的MRSA菌过夜培养物10毫升分别离心收集，用PBS洗涤沉淀一次后重悬于1毫升PBS缓冲液中。取2 μg的ClyH与上述菌液分别混合，37度裂解10-15 min。将裂解后的溶液10000 g离心1 min，取上清1 μl做模板，各加入分型所需的引物1 μg进行PCR扩增，PCR扩增程序如下：1）94 ℃，5 min；2）94 ℃，30 sec，50 ℃，30 sec，72 ℃，30 sec，30个循环；3）72 ℃，10 min；将产物进行凝胶电泳分析，电泳图谱如图11。结果显示用ClyH作用后的裂解液上清中存在菌内DNA，以其作为PCR扩增模板，各种型别的MRSA菌株均能得到很好的鉴定。其中分型所需的4对引物及各型的基因特征如表1所示。
图11和表1中的“I、II、III、IV和V”是SCCmec 型别编号。
实施例8、9和10分别说明了可以利用所发明的裂解酶ClyH能快速裂解葡萄球菌的细胞壁特点，用于释放菌内含有的三磷酸腺苷和DNA等胞内物质，通过检测这些释放的物质来用于葡萄球菌的各种检测。应用时，将ClyH与葡萄球菌直接作用后，就可以释放胞内物质。
附表
表1
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 一种杀灭葡萄球菌的裂解酶及其应用
<140>
<141>
<160> 16
<170>
<210> 1
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 1
MALPKTGKPTAKQVVDWAINLIGSGVDVDGYYGRQCWDLPNYIFNRYWNFKTPGNARDMAWYRYPEGFKVFRNTSDFVPKPGDIAVWTGGNYNWNTWGHTGIVVGPSTKSYFYSVDQNWNNSNSYVGSPAAKIKHSYFGVTHFVRPAYKAEPKPTPPGTRSACGKSASKITVGSKAPYNLKWSKGAYFNAKIDGLGATSATRYGDNRTNYRFDVGQAVYAPGTLIYVFEIIDGWCRIYWNNHNEWIWHERLIVKEVF
<210> 2
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 2
Atggcactgcctaaaacgggtaaaccaacggcaaaacaggtggttgactgggcaatcaatttaatcggcagtggtgtcgatgttgatggttattatggtcggcaatgttgggatttacctaactatatttttaatagatactggaactttaagacaccaggcaacgcaagagatatggcatggtatagatatcctgaagggtttaaagtgtttagaaacacttctgattttgtccctaaaccaggtgatatagcagtgtggacaggtggtaattacaattggaacacttggggacacactggtattgttgtaggtccatcaactaaaagttacttttatagtgtagatcagaattggaataactctaactcttacgttggtagtcctgcagcaaagataaaacatagttattttggtgtaactcattttgttagacccgcatacaaagcagaaccgaaacctacaccaccaggtaccagatctgcatgcggtaaatctgcaagtaaaataacagttggaagtaaagcgccttataaccttaaatggtcaaaaggtgcttattttaatgcgaaaatcgacggcttaggtgctacttcagccactagatacggtgataatcgtactaactatagattcgatgttggacaggctgtatacgcgcctggaacattaatatatgtgtttgaaattatagatggttggtgtcgcatttattggaacaatcataatgagtggatatggcatgagagattgattgtgaaagaagtgttttaa
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 3
AAAAGAATTCATGGCACTGCCTAAAACGGGTAAAC
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 4
AAACTCGAGTTAAAACACTTCTTTCACAATC
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 5
TTACAGAGTTAACTGTTACC
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 6
ATACAAATCCAGCACGCTCT
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 7
GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 8
CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 9
ATTGCCTTGATAATAGCCYTCT
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 10
ATTGCCTTGATAATAGCCYTCT
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 11
CGTCTATTACAAGATGTTAAGGATAAT
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 12
CCTTTATAGACTGGATTATTCAAAATAT
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 13
CCTTTATAGACTGGATTATTCAAAATAT
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 14
CATCCGAGTGAAACCCAAA
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 15
TATACCAAACCCGACAACTAC
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 16
CGGCTACAGTGATAACATCC
Claims (6)
1.一种杀灭葡萄球菌的裂解酶，其特征是一种能裂解葡萄球菌细胞壁的酶，其氨基酸序列为：
MALPKTGKPTAKQVVDWAINLIGSGVDVDGYYGRQCWDLPNYIFNRYWNFKTPGNARDMAWYRYPEGFKVFRNTSDFVPKPGDIAVWTGGNYNWNTWGHTGIVVGPSTKSYFYSVDQNWNNSNSYVGSPAAKIKHSYFGVTHFVRPAYKAEPKPTPPGTRSACGKSASKITVGSKAPYNLKWSKGAYFNAKIDGLGATSATRYGDNRTNYRFDVGQAVYAPGTLIYVFEIIDGWCRIYWNNHNEWIWHERLIVKEVF。
2.一种编码权利要求1所述能裂解葡萄球菌酶的基因，其基因序列为：
atggcactgcctaaaacgggtaaaccaacggcaaaacaggtggttgactgggcaatcaatttaatcggcagtggtgtcgatgttgatggttattatggtcggcaatgttgggatttacctaactatatttttaatagatactggaactttaagacaccaggcaacgcaagagatatggcatggtatagatatcctgaagggtttaaagtgtttagaaacacttctgattttgtccctaaaccaggtgatatagcagtgtggacaggtggtaattacaattggaacacttggggacacactggtattgttgtaggtccatcaactaaaagttacttttatagtgtagatcagaattggaataactctaactcttacgttggtagtcctgcagcaaagataaaacatagttattttggtgtaactcattttgttagacccgcatacaaagcagaaccgaaacctacaccaccaggtaccagatctgcatgcggtaaatctgcaagtaaaataacagttggaagtaaagcgccttataaccttaaatggtcaaaaggtgcttattttaatgcgaaaatcgacggcttaggtgctacttcagccactagatacggtgataatcgtactaactatagattcgatgttggacaggctgtatacgcgcctggaacattaatatatgtgtttgaaattatagatggttggtgtcgcatttattggaacaatcataatgagtggatatggcatgagagattgattgtgaaagaagtgttttaa。
3.权利要求2所述能编码权利要求1所述裂解葡萄球菌酶的基因的用途，其特征是应用时采用该基因来重组表达产生权利要求１所述的能裂解葡萄球菌的酶。
4.权利要求1所述杀灭葡萄球菌的裂解酶的用途，其特征是在体外杀灭葡萄球菌中的应用，应用时将含有该酶的制剂直接作用于所要控制的部位或者物品，用于杀灭葡萄球菌。
5.权利要求1所述杀灭葡萄球菌的裂解酶的用途，其特征是作为治疗葡萄球菌感染的药物中的应用，应用时将含有该酶的制剂注入体内，用于葡萄球菌感染的治疗。
6.权利要求1所述杀灭葡萄球菌的裂解酶的用途，其特征是在葡萄球菌检测中的应用，应用时用所述的酶与葡萄球菌作用后，释放菌内含有的三磷酸腺苷和DNA胞内物质，通过检测这些释放的物质来用于葡萄球菌的检测。
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