CN103120125A - 一种高通量筛选耐盐植物的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量筛选耐盐植物的方法及装置，通过在植物生物反应器中大批量培养筛选材料，在同一装置中方便地提供和更换盐胁迫条件并进行培养筛选，从大量植物群体中获得具有耐盐性的植物变异体并扩繁，包括以下步骤：1）植物体批量获得；2）耐盐植株的筛选；3）耐盐株系的规模扩繁。本发明涉及到装置的分体式的设计，即装置的储液罐为可拆卸连接的，实现不同培养液的更换。本发明的方法及装置提供了一种实现植物抗盐筛选和后续培养的连续操作，大大减小工作量以及极大的提高筛选和进一步扩繁的效率。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种栽培技术领域，特别涉及一种在植物组织培养条件下高通量筛选耐盐植物的方法及装置。
背景技术
在自然界条件下，由于不同的地理位置和气候条件以及人类活动等多方面原因，造成了各种不良环境，超出了植物正常生长、发育所能忍受的范围，致使植物受到伤害甚至死亡。这些对植物产生伤害的环境称为逆境或胁迫。而植物对不良环境的适应性和抵抗力为抗逆性或抗性。
植物抗逆是植物对抗不良环境，比如抗旱、抗盐碱、抗涝、抗风、抗冻、抗病虫害等的能力。植物的环境胁迫因素分物理、化学和生物三大类。其中，物理类有：干旱、热害、冷害、冻害、淹水(涝，渍)、光辐射、机械损伤、电伤害、磁伤害、风害等；化学类有：元素缺乏、元素过剩、低pH、高pH、盐碱、空气污染、杀虫剂和除草剂、毒素、生化互作物质等；生物类有：竞争、抑制、生化互作、共生微生物缺乏、人类活动、病虫害、动物危害、有害微生物等。
随着土地盐碱化程度加重，以及对沿海滩涂地区的土地利用的需求逐渐增多，对植物抗盐特性的挖掘变得尤为重要，对抗盐植物的发掘和开发的需求也变得越来越迫切。植物的抗盐性来自两个方面，一是自然进化适应获得；二是人工选择培育，通过诱变筛选、杂交育种、基因工程等方法，进行植物抗盐性能的改良；另外还可通过人工保护和调控措施，增强植物抗盐性。
自然进化耗时漫长，是一种效率低的方法。人工培育中的杂交方法时间也比较长，而且需要考虑多方面的因素，因此效率也不高，而基因工程由于其定向的进行相关抗盐及耐盐基因的转移使植物具有相关的抗盐特性，是一种高效的操作方式，但现阶段人们对于转基因的理解不足导致了这种方式具有一定的局限性。诱变筛选方式是一种效率较高的方法，是提供足够的材料在诱变后得到相应的变异，并利用一定的盐浓度环境来进行抗盐植物株系筛选的一种方法，其中通过植物组织培养，后通过诱变后提供一定盐浓度的环境来进行植物的抗盐植物的筛选有很高的应用潜力，已利用其筛选出多种有用植物。
其也有许多缺点和不足，如利用组织培养方法进行抗盐筛选一般是小概率事件，因此需要大量的筛选材料，而常规的方法获得大量筛选材料的效率比较低，因此需要一种方法在短时间内提供大量的筛选材料；抗盐植物筛选一般需要多个步骤的渐进式提供不同浓度的盐分条件，以使具有变异的株系存活保存下来，而常规方法需要做大量的工作来将筛选材料转移到不同的盐浓度环境中，工作量巨大，因此需要一种方法来降低工作量；抗盐植物需要推广利用时，需要短时间内获得大量的种植材料，而一般情况下初始材料的量比较小，需要长时间的扩繁工作，因此迫切需要一种快速大规模的扩繁方法。
发明内容
本发明的目的是提供了一种在植物组织培养条件下高通量筛选耐盐植物的方法及其所需装置。
为实现上述目的，本发明提供了一种高通量筛选耐盐植物的方法，通过在植物培养反应器装置中大批量培养筛选材料，在同一装置中方便地提供和更换盐胁迫条件并进行培养筛选，从大量植物群体中获得具有耐盐性的植物变异体并扩繁，以获得具有耐盐性的植物，具体包括以下步骤：
（1）植物体批量获得：将植物体处理后接种入植物培养反应器装置中进行培养参数设定后，进行规模化培养，根据需要进行下一步的操作；
其中所述的培养参数包括培养基、培养基pH、浸没频率、接种密度、培养条件和培养时间；
培养基为根据植物种类的不同进行不同培养基的确定及激素种类及浓度的选择，包含现有的培养基类型及通过改良后的培养基类型；
培养基pH为用于培养扩繁的pH为植物适宜生长的范围为5.0~7.0；
浸没频率可以根据植物种类不同调整不同的浸没频率，范围为1min/24h~24h/24h；
接种密度的范围为3 ~600个/L；
培养条件为光照强度1000~50000lux，光照时间5~20 h/d，培养温度25±1℃；
培养时间依据不同植物生长状态来确定，一般生长时间为10~90d，以植物体长满培养容器为宜，期间培养液的消耗可以通过装置中方便拆卸组装的储液罐结构来进行更新或补充；
（2）耐盐植株的筛选：通过植物培养反应器装置分体式的设计将培养液更换为0.5%的EMS溶液，将获得的植株经0.5%的EMS诱变剂处理诱变3小时后，再进行培养液的更换，在培养液中设置一定的盐浓度和梯度，培养筛选以获得具有抗盐特征的植物株系，其中盐是指氯化钠作为胁迫元素，浓度为0.1%~3.0%；
（3）抗盐株系的规模扩繁：在同一装置中对筛选后得到的抗盐株系，通过一定的培养条件，尤其是盐浓度下进行进一步的抗盐植株稳定性筛选和规模化扩繁，所述一定的培养条件是指培养的环境既可以是具有一定盐浓度存在的的培养条件，也可以是不含盐的培养条件，所述一定盐浓度存在的情况为盐浓度为0.1%~3.0%。
作为本发明方法的优选技术方案为，所述培养基pH的范围为5.5~6.5；所述浸没频率的范围为3min/18h~30min/3h；所述接种密度的范围为60 ~150个/L；所述培养条件为光照强度1500~2000 lux，光照时间8~18 h/d；所述培养时间为20~40d。
本发明涉及到装置的分体式的设计，可以通过换液的时机提供不同的盐浓度，实现对植物体进行抗盐筛选的目的。在筛选得到抗逆植物株系后，通过一定的培养条件，尤其是盐浓度下进行进一步的抗逆植株稳定性筛选和规模化扩繁。本发明的方法及装置提供了一种实现植物抗盐筛选和后续培养的连续操作，大大减小工作量以及极大的提高筛选和进一步扩繁的效率。
本发明还提供了用于一种高通量筛选耐盐植物的方法的装置，包括空气除菌器、连接管、反应器罐体盖子、反应器培养罐体、培养液连接管、储液罐、储液罐盖子、充气泵和时控器，所述反应器培养罐体为上下开口并且中空的容器，上端与所述反应器罐体盖子可拆卸连接，下端与所述储液罐可拆卸连接，在所述反应器罐体盖子上方设置有凸嘴，所述凸嘴通过所述连接管与所述空气除菌器连接，在所述反应器培养罐体的中间设置有挡板，在所述挡板下方的中间位置设置有向下突出的凸嘴，在所述凸嘴上连接有培养液连接管，在所述反应器培养罐体的外侧，位于所述挡板下方的位置设置有横向的凸嘴，所述凸嘴通过所述连接管与所述空气除菌器连接，所述充气泵连接在所述反应器培养罐体侧面的空气除菌器外侧，所述时控器连接在所述充气泵的外侧，另外还设置有多个用于更换的所述储液罐，在用于更换的所述储液罐上可拆卸连接有所述储液罐盖子。
作为本发明装置的进一步改进，在所述凸嘴与挡板连接的位置设置有过滤网。
作为本发明装置的优选技术方案，所述可拆卸连接为螺纹连接或者卡槽连接；所述反应器培养罐体的直径为5~50cm，高度为10~50c；其中更进一步的优选为所述反应器培养罐体的直径为10~30cm，高度为20~40cm。
其中，空气除菌器用于过滤空气，使培养反应器内进出的空气处于无菌状态；连接管为可耐高温高压灭菌材料，用于连接反应器罐体盖子和空气除菌器以及反应器培养罐体和空气除菌器；反应器罐体盖子具有螺纹、卡槽或其他方式与反应器罐体连接，且上部可通过连接管与空气除菌器连接，实现罐体中气压的排放；反应器罐体盖子为可耐高温高压（121℃,30 min）灭菌材料，且材料为可透光材料，以利于培养时光的通过，从而使植物培养时光照的供给。反应器培养罐体为培养植物组织的部分，罐体中部设置挡板，挡板中间位置具有向下突出的凸嘴，用于连接培养液连接管，且凸嘴与挡板连接位置具有过滤网，防止培养的外植体掉入，反应器培养罐体下部具有螺纹、卡槽或者其他方式可与储液罐密封连接。反应器培养罐体外部，在螺纹上部与挡板两者的中间位置具有横向突出的凸嘴，可通过连接管与空气除菌器相连接，实现无菌空气进入反应器的目的。反应器培养罐体材质可耐高温高压（121℃,30 min）灭菌材料，且材料为可透光材料，从而保证植物培养时光照的供给。培养液连接管可连接到反应器培养罐体，长度为可接触到储液罐的底部位置。储液罐用于储存培养液，上部具有螺纹、卡槽或其他方式与反应器培养罐体下部密封结合，储液罐材质可耐高温高压（121℃,30 min）灭菌材料。另外用于更换的储液罐还设置有储液罐盖子，具有与储液罐相配合的螺纹、卡槽或其他方式可与储液罐密封结合，在反应器培养过程的换液步骤中用于单独对培养液进行灭菌时应用。充气泵用于提供工作时的气压动力，所述的空气泵的气压压力需配合储液罐中液体的量，以使培养液在2min内泵到培养室中为宜。时控器通过控制电流的通断来控制充气泵的工作，通过控制电流的通断频率来实现反应器的浸没频率。
本发明相对现有技术具有如下的优点及效果：
（1）节省成本。与传统组织培养方式相比，采用本发明的装置及方法进行大规模植物组织培养可以节省大量的不能重复利用的物料（如琼脂等）的消耗，并且培养容器体积的增加以及接种过程的简化和培养过程的自动化程度的提高使人力的消耗也大大减少。因此具有降低植物组织培养成本的作用。
（2）可实现大规模快繁。本发明与传统的组织培养室可以很好的配合进行大规模筛选和快繁，因而从更大的群体中获得耐盐变异株。并且通过对组织培养微环境的调整可以大大提高扩繁效率，并且可以使植物处于最佳的生长发育代谢状态，提高组培苗的质量和品质。并且本发明所述的装置可根据生产规模进行放大。规模化扩繁可为抗逆筛选提供足够量的筛选材料，并且在筛选得到抗逆株系后可以迅速的通过规模快繁得到足够量的抗逆植株。
（5）提高抗盐植物筛选效率。
经过诱变后通过对培养液中盐分的添加变化，来进行抗盐植物的筛选，同一批次的组培或通过诱变的组培材料可以将大量群体暴露于不同浓度的含盐液体培养基中进行筛选，并可以进一步的对筛选得到的抗盐作物进行规模培养。因此本发明具有应用于大规模进行抗盐作物筛选的潜力，并具有高效筛选特点以及利于后续抗盐株系规模化扩繁的优点。
附图说明
图1是本发明的方法流程图；
图2是本发明的装置分解图；
图3是本发明更换培养液示意图；
其中，1-空气除菌器，2-连接管，3-反应器罐体盖子，4-反应器培养罐体，5-培养液连接管，6-储液罐，7-储液罐盖子，8-充气泵，9-时控器，10-挡板，11-凸嘴，12-过滤网。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的优选技术方案。
本发明的一种高通量筛选耐盐植物的方法，通过在植物培养反应器装置中大批量培养筛选材料，在同一装置中方便地提供和更换盐胁迫条件并进行培养筛选，从大量植物群体中获得具有耐盐性的植物变异体并扩繁，以获得具有耐盐性的植物，具体包括以下步骤：
（1）植物体批量获得：将植物体处理后接种入植物培养反应器装置中进行培养参数设定后，进行规模化培养，根据需要进行下一步的操作；
其中所述的培养参数包括培养基、培养基pH、浸没频率、接种密度、培养条件和培养时间；
培养基为根据植物种类的不同进行不同培养基的确定及激素种类及浓度的选择，包含现有的培养基类型及通过改良后的培养基类型；
培养基pH为用于培养扩繁的pH为植物适宜生长的范围为5.0~7.0，优选为5.5~6.5；
浸没频率可以根据植物种类不同调整不同的浸没频率，范围为1min/24h~24h/24h，优选为3min/18h~30min/3h；
接种密度的范围为3 ~600个/L，优选为60 ~150个/L；
培养条件为光照强度1000~50000lux，优选为1500~2000 lux，光照时间5~20 h/d，优选为8~18 h/d，培养温度25±1℃；
培养时间依据不同植物生长状态来确定，一般生长时间为10~90d，优选为20~40d，以植物体长满培养容器为宜，期间培养液的消耗可以通过装置中方便拆卸组装的储液罐结构来进行更新或补充；
（2）耐盐植株的筛选：通过植物培养反应器装置分体式的设计将培养液更换为0.5%的EMS溶液，将获得的植株经0.5%的EMS诱变剂处理诱变3小时后，再进行培养液的更换，在培养液中设置一定的盐浓度和梯度，培养筛选以获得具有抗盐特征的植物株系，其中盐是指氯化钠作为胁迫元素，浓度为0.1%~3.0%；
（3）抗盐株系的规模扩繁：在同一装置中对筛选后得到的抗盐株系，通过一定的培养条件，尤其是盐浓度下进行进一步的抗盐植株稳定性筛选和规模化扩繁，所述一定的培养条件是指培养的环境既可以是具有一定盐浓度存在的的培养条件，也可以是不含盐的培养条件，所述一定盐浓度存在的情况为盐浓度为0.1%~3.0%。
本发明涉及到装置的分体式的设计，可以通过换液的时机提供不同的盐浓度，实现对植物体进行抗盐筛选的目的。在筛选得到抗逆植物株系后，通过一定的培养条件，尤其是盐浓度下进行进一步的抗逆植株稳定性筛选和规模化扩繁。本发明的方法及装置提供了一种实现植物抗盐筛选和后续培养的连续操作，大大减小工作量以及极大的提高筛选和进一步扩繁的效率。
本发明还提供了用于一种高通量筛选耐盐植物的方法的装置，包括空气除菌器1、连接管2、反应器罐体盖子3、反应器培养罐体4、培养液连接管5、储液罐6、储液罐盖子7、充气泵8和时控器9，所述反应器培养罐体4为上下开口并且中空的容器，上端与所述反应器罐体盖子3可拆卸连接，下端与所述储液罐6可拆卸连接，在所述反应器罐体盖子3上方设置有凸嘴11，所述凸嘴11通过所述连接管2与所述空气除菌器1连接，在所述反应器培养罐体4的中间设置有挡板10，在所述挡板10下方的中间位置设置有向下突出的凸嘴11，在所述凸嘴11上连接有培养液连接5管，在所述凸嘴11与挡板10连接的位置还设置有过滤网12，在所述反应器培养罐体4的外侧，位于所述挡板10下方的位置设置有横向的凸嘴11，所述凸嘴11通过所述连接管2与所述空气除菌器1连接，所述充气泵8连接在所述反应器培养罐体4侧面的空气除菌器1外侧，所述时控器9连接在所述充气泵8的外侧，另外还设置有多个用于更换的所述储液罐6，在用于更换的所述储液罐6上可拆卸连接有所述储液罐盖子7，其中所述可拆卸连接为螺纹连接或者卡槽连接；所述反应器培养罐体4的直径为5~50cm，高度为10~50c；其中更进一步的优选为所述反应器培养罐体4的直径为10~30cm，高度为20~40cm。
其中，空气除菌器用于过滤空气，使培养反应器内进出的空气处于无菌状态；连接管为可耐高温高压灭菌材料，用于连接反应器罐体盖子和空气除菌器以及反应器培养罐体和空气除菌器；反应器罐体盖子具有螺纹、卡槽或其他方式与反应器罐体连接，且上部可通过连接管与空气除菌器连接，实现罐体中气压的排放；反应器罐体盖子为可耐高温高压（121℃,30 min）灭菌材料，且材料为可透光材料，以利于培养时光的通过，从而使植物培养时光照的供给。反应器培养罐体为培养植物组织的部分，罐体中部设置挡板，挡板中间位置具有向下突出的凸嘴，用于连接培养液连接管，且凸嘴与挡板连接位置具有过滤网，防止培养的外植体掉入，反应器培养罐体下部具有螺纹、卡槽或者其他方式可与储液罐密封连接。反应器培养罐体外部，在螺纹上部与挡板两者的中间位置具有横向突出的凸嘴，可通过连接管与空气除菌器相连接，实现无菌空气进入反应器的目的。反应器培养罐体材质可耐高温高压（121℃,30 min）灭菌材料，且材料为可透光材料，从而保证植物培养时光照的供给。培养液连接管可连接到反应器培养罐体，长度为可接触到储液罐的底部位置。储液罐用于储存培养液，上部具有螺纹、卡槽或其他方式与反应器培养罐体下部密封结合，储液罐材质可耐高温高压（121℃,30 min）灭菌材料。另外用于更换的储液罐还设置有储液罐盖子，具有与储液罐相配合的螺纹、卡槽或其他方式可与储液罐密封结合，在反应器培养过程的换液步骤中用于单独对培养液进行灭菌时应用。充气泵用于提供工作时的气压动力，所述的空气泵的气压压力需配合储液罐中液体的量，以使培养液在2min内泵到培养室中为宜。时控器通过控制电流的通断来控制充气泵的工作，通过控制电流的通断频率来实现反应器的浸没频率。
所述植物体为花粉、胚性细胞、种胚、植物营养细胞、植物组织、植物器官、丛生芽等形态，尤其包括通过物理和化学诱变后上述形态。所述植物培养用反应器装置是利用间歇浸没原理设计的植物生物反应器变型。
“诱变”指的是通过物理方法，如辐射、紫外光、离子束等；化学方法如烷化剂、天然碱基类似物，亚硝基化合物、碱基类似物等。物理方法诱变通过外置的附加装置来实现。化学诱变可通过装置中方便拆卸组装的储液罐结构，在更换培养液的同时将化学诱变因子添加到培养液中来实现。
“同一装置中”是指在筛选完毕后存活的具有抗盐特性的株系不必取出，直接在装置中进行操作。所述“一定的培养条件”是指培养的环境既可以是具有一定盐浓度存在的的培养条件，也可以是不含盐的培养条件。所述一定盐浓度存在的情况为盐浓度为0.1%~3.0%。
实施例1
通过植物培养反应器装置进行半夏耐盐育种的方法，具体操作步骤如下：
（1）半夏种苗的批量获得：所述培养参数主要有：将半夏丛生芽接种入植物培养反应器装置中，接种密度：60个/L，调整好培养因素后进行培养。其中：培养基配方为：Ms+1.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30 g/L蔗糖；培养基pH：5.8；浸没频率：5min/12h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：40d后植物体长满培养容器。
（2）半夏抗盐株系的筛选：通过植物培养反应器装置分体式的设计将培养液更换为0.5%的EMS溶液，将获得的半夏植株经0.5%的EMS诱变剂处理诱变3小时后，再进行培养液的更换，更换的新鲜培养液为Ms+1.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.0 g/L氯化钠；培养基pH：5.8。通过60 d的培养，不能耐受诱变剂伤害以及氯化钠浓度的半夏植株相继死亡或不再生长，从而获得了继续生长的可耐受1.0 g/L氯化钠浓度的抗盐株系3株。
（3）抗盐半夏株系的规模扩繁：在同一装置中，将死亡及不再生长的半夏取出后，留下抗盐株系进行扩繁，扩繁培养基配方为：Ms+1.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.0 g/L氯化钠；培养基pH：5.8；浸没频率：5min/6h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：60d后即可得到大量的抗盐植株。
其中植物培养反应器装置的可拆卸连接为螺纹连接，装置主体直径为20cm，装置主体高度30cm。
实施例2
通过植物培养反应器装置进行铁皮石斛耐盐植物筛选的方法，具体操作步骤如下：
（1）铁皮石斛种苗的批量获得：所述培养参数主要有：将石斛原球茎接种入植物培养反应器装置中，接种密度：300个/L，调整好培养基后进行培养。其中：培养基配方为：Ms+0.2mg/L NAA+30 g/L蔗糖；培养基pH：5.8；浸没频率：10min/3h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：40d后石斛原球茎长满培养容器。
（2）铁皮石斛抗盐株系的筛选：通过植物培养反应器装置分体式的设计将培养液更换为0.5%的EMS溶液，将获得的半夏植株经0.5%的EMS诱变剂处理诱变3小时后，再进行培养液的更换，更换的新鲜培养液为Ms+0.2mg/L NAA+30 g/L蔗糖+0.5 g/L氯化钠；培养基pH：8.0。通过60 d的培养，不能耐受诱变剂伤害以及高碱性条件的植株相继死亡或不再生长，从而获得了继续生长的可耐受0.5 g/L氯化钠抗盐株系6株。
（3）抗盐性铁皮石斛株系的规模扩繁：在同一装置中，将死亡及不再生长的石斛取出后，留下抗盐性株系进行扩繁，扩繁培养基配方为：Ms+0.2mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.0 g/L氯化钠；培养基pH：8.0；浸没频率：5min/6h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：90d后即可得到大量的抗盐植株。
其中植物培养反应器装置的可拆卸连接为卡槽连接，装置主体直径为30cm，装置主体高度40cm。
实施例3
通过植物培养反应器装置进行红叶石楠耐盐育种的方法，具体操作步骤如下：
（1）红叶石楠种苗的批量获得：所述培养参数主要有：将红叶石楠丛生芽接种入植物培养反应器装置中，接种密度：50个/L，调整好培养因素后进行培养。其中：培养基配方为：Ms+2.5 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30 g/L蔗糖；培养基pH：5.8；浸没频率：5min/6h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：40d。
（2）红叶石楠抗盐株系的筛选：通过植物培养反应器装置分体式的设计将培养液更换为0.5%的EMS溶液，将获得的植株经0.5%的EMS诱变剂处理诱变3小时后，再进行培养液的更换，更换的新鲜培养液为Ms+2.5 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.5g/L氯化钠；培养基pH：5.8。通过60 d的培养，不能耐受诱变剂伤害以及氯化钠浓度的植株相继死亡或不再生长，从而获得了继续生长的可耐受1.5 g/L氯化钠浓度的抗盐株系1株。
（3）抗盐株系的规模扩繁：在同一装置中，将死亡及不再生长的红叶石楠植株取出后，留下抗盐植株进行扩繁，扩繁培养基配方为：Ms+2.5 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.5 g/L氯化钠；培养基pH：5.8；浸没频率：5min/6h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：90d后即可得到大量的抗盐植株。
其中植物培养反应器装置的可拆卸连接为螺纹连接，装置主体直径为20cm，装置主体高度30cm。
实施例4
通过植物培养反应器装置进行红叶石楠耐盐育种的方法，具体操作步骤如下：
（1）红叶石楠胚状体的批量获得：所述培养参数主要有：将红叶石楠丛生芽接种入植物培养反应器装置中，接种密度：50个/L，调整好培养因素后进行培养。其中：培养基配方为：Ms+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30 g/L蔗糖；培养基pH：5.8；浸没频率：10min/2h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间16 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：30d。
（2）红叶石楠抗盐株系的筛选：通过植物培养反应器装置分体式的设计将培养液更换为0.5%的EMS溶液，将获得的胚状体经0.5%的EMS诱变剂处理诱变3小时后，再进行培养液的更换，更换的新鲜培养液为Ms+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.5g/L氯化钠；培养基pH：5.8。通过60 d的培养，不能耐受诱变剂伤害以及氯化钠浓度的植株相继死亡或不再生长，从而获得了继续生长的可耐受1.5 g/L氯化钠浓度的抗盐株系10株。
（3）抗盐株系的规模扩繁：在同一装置中，将死亡及不再生长的红叶石楠植株取出后，留下抗盐植株进行扩繁，扩繁培养基配方为：Ms+2.5 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.5 g/L氯化钠；培养基pH：5.8；浸没频率：5min/12h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：90d后即可得到大量的抗盐植株。
其中植物培养反应器装置的可拆卸连接为卡槽连接，装置主体直径为30cm，装置主体高度40cm。
本发明的原理是：
首先本发明通过装置培养足够量的植物体，为进行抗盐筛选提供足够多的材料。本发明下部采用分体式的设计，下部的储液罐可以方便的拆卸，经过一段时间的培养得到足够量的培养物后通过进行诱变后得到具有变异的植物细胞，然后通过换液的时机添加具有不同盐浓度的培养基，从而实现对植物体的抗盐筛选，并且可以通过多次换液实现多个盐浓度梯度的变化，实现对植物体不同盐浓度条件下进行筛选的目的。而且在筛选得到抗盐植物株系后，可以在装置内持续的进行扩大培养来得到足够数量的具有抗盐性状的植物。从而实现筛选和扩大培养的操作，大大减小工作量以及极大的提高筛选和进一步扩繁的效率。
本发明相对现有技术具有如下的优点及效果：
（1）节省成本。与传统组织培养方式相比，采用本发明的装置及方法进行大规模植物组织培养可以节省大量的不能重复利用的物料（如琼脂等）的消耗，并且培养容器体积的增加以及接种过程的简化和培养过程的自动化程度的提高使人力的消耗也大大减少。因此具有降低植物组织培养成本的作用。
（2）可实现大规模快繁。本发明与传统的组织培养室可以很好的配合进行大规模筛选和快繁，因而从更大的群体中获得耐盐变异株。并且通过对组织培养微环境的调整可以大大提高扩繁效率，并且可以使植物处于最佳的生长发育代谢状态，提高组培苗的质量和品质。并且本发明所述的装置可根据生产规模进行放大。规模化扩繁可为抗逆筛选提供足够量的筛选材料，并且在筛选得到抗逆株系后可以迅速的通过规模快繁得到足够量的抗逆植株。
（5）提高抗盐植物筛选效率。
经过诱变后通过对培养液中盐分的添加变化，来进行抗盐植物的筛选，同一批次的组培或通过诱变的组培材料可以将大量群体暴露于不同浓度的含盐液体培养基中进行筛选，并可以进一步的对筛选得到的抗盐作物进行规模培养。因此本发明具有应用于大规模进行抗盐作物筛选的潜力，并具有高效筛选特点以及利于后续抗盐株系规模化扩繁的优点。
还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种高通量筛选耐盐植物的方法，其特征在于：通过在植物培养反应器装置中大批量培养筛选材料，在同一装置中方便地提供和更换盐胁迫条件并进行培养筛选，从大量植物群体中获得具有耐盐性的植物变异体并扩繁，以获得具有耐盐性的植物，具体包括以下步骤：
（1）植物体批量获得：将植物体处理后接种入植物培养反应器装置中进行培养参数设定后，进行规模化培养，根据需要进行下一步的操作；
其中所述的培养参数包括培养基、培养基pH、浸没频率、接种密度、培养条件和培养时间；
培养基为根据植物种类的不同进行不同培养基的确定及激素种类及浓度的选择，包含现有的培养基类型及通过改良后的培养基类型；
培养基pH为用于培养扩繁的pH为植物适宜生长的范围为5.0~7.0；
浸没频率可以根据植物种类不同调整不同的浸没频率，范围为1min/24h~24h/24h；
接种密度的范围为3 ~600个/L；
培养条件为光照强度1000~50000lux，光照时间5~20 h/d，培养温度25±1℃；
培养时间依据不同植物生长状态来确定，一般生长时间为10~90d，以植物体长满培养容器为宜，期间培养液的消耗可以通过装置中方便拆卸组装的储液罐结构来进行更新或补充；
（2）耐盐植株的筛选：通过植物培养反应器装置分体式的设计将培养液更换为0.5%的EMS溶液，将获得的植株经0.5%的EMS诱变剂处理诱变3小时后，再进行培养液的更换，在培养液中设置一定的盐浓度和梯度，培养筛选以获得具有抗盐特征的植物株系，其中盐是指氯化钠作为胁迫元素，浓度为0.1%~3.0%；
（3）抗盐株系的规模扩繁：在同一装置中对筛选后得到的抗盐株系，通过一定的培养条件，尤其是盐浓度下进行进一步的抗盐植株稳定性筛选和规模化扩繁，所述一定的培养条件是指培养的环境既可以是具有一定盐浓度存在的的培养条件，也可以是不含盐的培养条件，所述一定盐浓度存在的情况为盐浓度为0.1%~3.0%。
2.如权利要求1所述的一种高通量筛选耐盐植物的方法，其特征在于：所述培养基pH的范围为5.5~6.5；所述浸没频率的范围为3min/18h~30min/3h；所述接种密度的范围为60 ~150个/L；所述培养条件为光照强度1500~2000 lux，光照时间8~18 h/d；所述培养时间为20~40d。
3.用于权利要求1的装置，其特征在于：包括空气除菌器（1）、连接管（2）、反应器罐体盖子（3）、反应器培养罐体（4）、培养液连接管（5）、储液罐（6）、储液罐盖子（7）、充气泵（8）和时控器（9），所述反应器培养罐体（4）为上下开口并且中空的容器，上端与所述反应器罐体盖子（3）可拆卸连接，下端与所述储液罐（6）可拆卸连接，在所述反应器罐体盖子（3）上方设置有凸嘴（11），所述凸嘴（11）通过所述连接管（2）与所述空气除菌器（1）连接，在所述反应器培养罐体（4）的中间设置有挡板（10），在所述挡板（10）下方的中间位置设置有向下突出的凸嘴（11），在所述凸嘴（11）上连接有培养液连接管（5），在所述反应器培养罐体（4）的外侧，位于所述挡板（10）下方的位置设置有横向的凸嘴（11），所述凸嘴（11）通过所述连接管（2）与所述空气除菌器（1）连接，所述充气泵（8）连接在所述反应器培养罐体（4）侧面的空气除菌器（1）外侧，所述时控器（9）连接在所述充气泵（8）的外侧，另外还设置有多个用于更换的所述储液罐（3），在用于更换的所述储液罐（3）上可拆卸连接有所述储液罐盖子（7）。
4.如权利要求3所述的装置，其特征在于：在所述凸嘴（11）与挡板（10）连接的位置设置有过滤网（12）。
5.如权利要求3所述的装置，其特征在于：所述可拆卸连接为螺纹连接或者卡槽连接。
6.如权利要求3或4或5所述的装置，其特征在于：所述反应器培养罐体（4）的直径为5~50cm，高度为10~50c。
7.如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述反应器培养罐体（4）的直径为10~30cm，高度为20~40cm。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130529 |