CN103113307B - 苯并咪唑类化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药技术领域，苯并咪唑类化合物作为免疫抑制剂在制备治疗T细胞参与的自身免疫性疾病如炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、自身免疫性肾炎药物中的应用。苯并咪唑类化合物系合成的一系列新化合物，其药效显著、机理新颖、口服有效，毒副作用较小，且由于合成路线简单环保、与现有药物相比优势明显。
Description
技术领域
本发明特别属于苯并咪唑类化合物及其应用，属于生物制药技术领域。
背景技术
自身免疫性疾病是一类难治性疾病，其发病多与T淋巴细胞的过度活化有关，目前多采用免疫抑制剂进行治疗。常见的自身免疫性疾病包括炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、自身免疫性肾炎等。自身免疫性疾病目前无治愈方法，现有的治疗药物多为注射剂型，疗效欠佳，毒副作用大，且治疗费用非常昂贵，亟需研发符合药物经济学的新型口服治疗药物。
发明内容
本发明的目的是提供一类苯并咪唑类化合物作为免疫抑制剂在制备治疗T细胞参与的自身免疫性疾病如炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮以及自身免疫性肾炎药物中的应用。
本发明的技术方案：
1、苯并咪唑类化合物，其特征在于为如下结构式
其中R为C3-C7烷烃，或是含氧的C3-C7的烷类。
所述的苯并咪唑类化合物，其特征在于所述的如下结构式任意一个：
其中
苯并咪唑类化合物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于所述的苯并咪唑类化合物为如下结构式
其中R为C1-C7烷烃，或是含氧的C3-C7的烷类。
所述的苯并咪唑类化合物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于所述的苯并咪唑类化合物为如下结构式任意一个：
所述的苯并咪唑类化合物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于所述的自身免疫性疾病为T细胞参与的自身免疫性疾病。
所述的苯并咪唑类化合物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于T细胞参与的自身免疫性疾病为炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮或自身免疫性肾炎。
所述的化合物可以与常规药学辅料制成片剂，胶囊，缓释剂，注射剂等，应用于自身免疫性疾病。
有益效果：
Indian Academy of Sciences，Section A，1969，vol.70，p.81-87
只有合成没有活性报道。
Organic Letters，2007，vol.9，#23p.4749-4751
只有合成没有活性报道。
化合物3-11都为新化合物。但化合物1-11经anti-CD3/anti-CD28活化的小鼠T细胞的增殖试验、anti-CD3/anti-CD28活化小鼠T细胞分泌细胞因子IFN-γ试验、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型及病理检测证实结果综合提示，苯并咪唑类化合物可作为免疫抑制剂在自身免疫性疾病，特别是治疗T细胞参与的自身免疫性疾病如炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、自身免疫性肾炎。
故苯并咪唑类化合物1-11，可作为免疫抑制剂治疗T细胞参与的自身免疫性疾病如炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、自身免疫性肾炎等，药效显著、机理新颖、口服有效，毒副作用较小，且由于合成路线简单环保、与现有药物相比优势明显。
附图说明
图1.苯并咪唑类化合物体外抑制anti-CD3/anti-CD28活化的小鼠T细胞增殖的筛选结果。采用10μg/ml anti-CD3和1μg/ml anti-CD28刺激T细胞活化增殖。将待筛化合物库中的化合物与活化T细胞共敷72h，通过[H3]掺入法考察各待测化合物对于T淋巴细胞增殖的影响。
图2.苯并咪唑类化合物体外抑制anti-CD3/anti-CD28活化的小鼠T细胞分泌IFN-γ筛选结果。anti-CD3/anti-CD28活化的小鼠T细胞可分泌IFN-γ。将待筛化合物库中的化合物与anti-CD3/anti-CD28活化的小鼠T细胞共敷24h后收集上清，ELISA检测各化合物对于Th1细胞因子IFN-γ分泌的抑制作用。
图3.苯并咪唑类化合物对DSS诱导的小鼠结肠炎模型小鼠临床评分的改善效果。通过给小鼠喝含2.5％DSS的水，可诱发溃疡性结肠炎。苯并咪唑类化合物从造模第1天起开始口服给药，每天给予10mg/kg。CsA作为阳性对照，溶于PBS形成悬浮液，每天灌胃给药10mg/kg。溶剂对照组给予PBS作为对照。给药持续至实验观察结束。第9天发病最为严重。苯并咪唑类化合物可不同程度地抑制小鼠的发病程度，其中以化合物1，5，8，9，10效果最为显著。
图4.苯并咪唑类化合物1，5，8，9，10对小鼠小鼠炎症结肠病理组织学检查指标的改善作用。(A)正常结肠组织；(B)DSS模型组肠组织；(C)化合物1(10mg/kg)给药组结肠组织；(D)化合物5(10mg/kg)给药组结肠组织；(E)化合物8(10mg/kg)给药组结肠组织；(F)化合物9(10mg/kg)给药组结肠组织；(G)化合物10(10mg/kg)给药组结肠组织；(H)CsA(10mg/kg)给药组结肠组织。组织切片作HE染色。放大倍数×100。
图5.苯并咪唑类化合物1，5，8，9，10(10mg/kg)对小鼠小鼠炎症结肠病理组织评分的改善作用。
图6.苯并咪唑类化合物1，5，8，9，10(10mg/kg)对DSS诱导小鼠结肠炎模型中小鼠结肠组织炎症因子表达的抑制作用。用ELISA的方法检测。**P＜0.01，vs模型小鼠。
具体实施方式
实施例1
化合物1的制备
N，4-二甲基-2-硝基苯胺(A)的制备
100ml圆底烧瓶中加入4-甲基-2-硝基苯胺(3g，0.02mol)，NaH(60％，1.2g，0.03mol)，THF(50ml)，搅拌0.5h后，加入MeI(4.26g，0.03mol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝8∶1)，得到N，4-二甲基-2-硝基苯胺(A)，产率91％。
N1，4-二甲基-邻苯二胺(B)的制备
100ml圆底烧瓶中加入N，4-二甲基-2-硝基苯胺(A)(1g，6mmol)，Pd/C(0.1g)，MeOH(30ml)通入氢气后反应过夜。反应后处理：过滤除去Pd/C，滤液干燥浓缩得到化合物B，产率95％。
化合物1的制备
50ml圆底烧瓶中加入N1，4-二甲基-邻苯二胺(B)(0.5g，3.6mmol)，苯甲醛(0.4g，3.6mmol)，乙腈(20ml)，搅拌0.5h后，加入30％H2O2(20mmol)，37％HCl(10mmol)，反应1h。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝2∶1)，得到化合物1，产率50％。化合物1的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.71(m，2H)，7.64(s，1H)，7.52(m，3H)，7.32(d，1H)，7.15(d，2H)，4.13(s，3H)，2.50(s，3H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ153.5，143.5，133.5，132.5，130.7，129.7，129.2，128.7，124.2，119.7，109.7，21.6
化合物2的制备
N-乙基，4-甲基-2-硝基苯胺(C)的制备
100ml圆底烧瓶中加入4-甲基-2-硝基苯胺(3g，0.02mol)，NaH(60％，1.2g，0.03mol)，THF(50ml)，搅拌0.5h后，加入溴乙烷(3.24g，0.03mol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝8∶1)，得到化合物N-乙基，4-甲基-2-硝基苯胺(C)，产率89％。
N1-乙基，4-甲基-邻苯二胺(D)的制备
100ml圆底烧瓶中加入N-乙基，4-甲基-2-硝基苯胺(C)(1g，6mmol)，Pd/C(0.1g)，MeOH(30ml)通入氢气后反应过夜。反应后处理：过滤除去Pd/C，滤液干燥浓缩得到化合物D，产率97％。
化合物2的制备
50ml圆底烧瓶中加入N-乙基，4-甲基-2-硝基苯胺(C)(0.5g，3.3mmol)，苯甲醛(0.4g，3.6mmol)，乙腈(20ml)，搅拌0.5h后，加入30％H2O2(20mmol)，37％HCl(10mmol)，反应1h。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝2∶1)，得到化合物2，产率55％。
化合物2的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.70(m，2H)，7.62(s，1H)，7.51(m，3H)，7.30(d，1H)，7.14(d，2H)，4.25(q，2H)，2.50(s，3H)，1.44(t，1H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ153.4，143.5，133.5，132.0，130.7，129.6，129.2，128.7，124.2，119.7，109.4，46.2，21.6，15.3
化合物3的制备
N-异丙基，4-甲基-2-硝基苯胺(E)的制备
100ml圆底烧瓶中加入4-甲基-2-硝基苯胺(3g，0.02mol)，NaH(60％，1.2g，0.03mol)，THF(50ml)，搅拌0.5h后，加入2-溴丙烷(3.66g，0.03mol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝7∶1)，得到N-异丙基，4-甲基-2-硝基苯胺(E)，产率79％。
N1-异丙基，4-甲基-邻苯二胺(F)的制备
100ml圆底烧瓶中加入N-乙基，4-甲基-2-硝基苯胺(E)(1g，6mmol)，Pd/C(0.1g)，MeOH(30ml)通入氢气后反应过夜。反应后处理：过滤除去Pd/C，滤液干燥浓缩得到化合物F，产率97％。
化合物3的制备
50ml圆底烧瓶中加入N-乙基，4-甲基-2-硝基苯胺(F)(0.5g，3.2mmol)，苯甲醛(0.4g，3.6mmol)，乙腈(20ml)，搅拌0.5h后，加入30％H2O2(20mmol)，37％HCl(10mmol)，反应1h。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝2.5∶1)，得到化合物3，产率52％。
化合物3的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.71(m，2H)，7.62(s，1H)，7.52(m，3H)，7.30(d，1H)，7.15(d，2H)，4.45(d，2H)，2.50(s，3H)1.47(d，6H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ154.4，143.5，133.7，132.0，130.7，129.6，129.2，128.7，124.2，119.7，111.4，40.8，21.6，15.7
化合物4的制备
N-丙基，4-甲基-2-硝基苯胺(G)的制备
100ml圆底烧瓶中加入4-甲基-2-硝基苯胺(3g，0.02mol)，NaH(60％，1.2g，0.03mol)，THF(50ml)，搅拌0.5h后，加入1-溴丙烷(3.66g，0.03mol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝7∶1)，得到N-丙基，4-甲基-2-硝基苯胺(G)，产率83％。
N1-丙基，4-甲基-邻苯二胺(H)的制备
100ml圆底烧瓶中加入N-乙基，4-甲基-2-硝基苯胺(E)(1g，6mmol)，Pd/C(0.1g)，MeOH(30ml)通入氢气后反应过夜。反应后处理：过滤除去Pd/C，滤液干燥浓缩得到化合物H，产率96％。
化合物4的制备
50ml圆底烧瓶中加入N-乙基，4-甲基-2-硝基苯胺(F)(0.5g，3.2mmol)，苯甲醛(0.4g，3.6mmol)，乙腈(20ml)，搅拌0.5h后，加入30％H2O2(20mmol)，37％HCl(10mmol)，反应1h。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝2∶1)，得到化合物4，产率48％。
化合物4的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.71(m，2H)，7.62(s，1H)，7.52(m，3H)，7.30(d，1H)，7.14(d，2H)，4.25(q，2H)，2.50(s，3H)，1.82(m，2H)，1.41(t，3H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ153.4，143.5，133.5，132.0，130.7，129.6，129.2，128.7，124.2，119.7，109.4，40.7，21.6，18.9，15.3
化合物5的制备
化合物(I)的制备
250ml圆底烧瓶中加入5-甲基-2-硝基苯胺(12g，0.08mol)，NaH(60％，4.8g，0.12mol)，THF(120ml)，搅拌0.5h后，加入苄基溴(27.2g，0.16mol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝6∶1)，得到化合物(1)，产率58％。
化合物(J)的制备
250ml圆底烧瓶中加入化合物(I)(8g，24mmol)，Pd/C(0.4g)，MeOH(100ml)通入氢气后反应过夜。反应后处理：过滤除去Pd/C，滤液干燥浓缩，柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝2∶1)，得到化合物(J)，产率61％。
化合物5的制备
50ml圆底烧瓶中加入化合物(J)(0.5g，2.4mmol)，K2CO3(0.26g，3.6mmol)，DMF(20ml)搅拌0.5h后，加入MeI(0.4g，3mmol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝2∶1)，得到化合物5，产率78％。
化合物5的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.75(m，2H)，7.67(s，1H)，7.56(m，3H)，7.34(d，1H)，7.15(d，2H)，4.56(s，3H)，2.52(s，3H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ153.5，143.5，133.5，132.5，130.7，129.7，129.2，128.7，124.2，119.7，109.7，21.6，65.6
化合物6的制备
50ml圆底烧瓶中加入化合物(J)(0.5g，2.4mmol)，K2CO3(0.26g，3.6mmol)，DMF(20ml)搅拌0.5h后，加入溴乙烷(0.3g，3mmol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝3∶1)，得到化合物6，产率68％。
化合物6的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.73(m，2H)，7.62(s，1H)，7.51(m，3H)，7.30(d，1H)，7.14(d，2H)，4.65(q，2H)，2.53(s，3H)，1.54(t，3H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ153.2，143.5，133.5，132.0，130.7，129.6，129.2，128.7，124.2，119.7，109.4，64.6，21.6，16.3
化合物7的制备
50ml圆底烧瓶中加入化合物(J)(0.5g，2.4mmol)，K2CO3(0.26g，3.6mmol)，DMF(20ml)搅拌0.5h后，加入溴丙烷(0.4g，3mmol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝3∶1)，得到化合物7，产率65％。
化合物7的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.71(m，2H)，7.62(s，1H)，7.52(m，3H)，7.30(d，1H)，7.14(d，2H)，4.75(t，2H)，2.50(s，3H)，1.82(m，2H)，1.41(t，3H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ153.4，143.5，133.5，132.0，130.7，129.6，129.2，128.7，124.2，119.7，109.4，65.2，21.6，18.9，15.3
化合物8的制备
化合物(K)的制备
100ml圆底烧瓶中加入4-甲基-2-硝基苯胺(3g，0.02mol)，NaH(60％，1.2g，0.03mol)，THF(50ml)，搅拌0.5h后，加入烯丙基溴(3.6g，0.03mol)，反应过夜。反应后处理：
反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝13∶2)，得到化合物(K)，产率89％。
化合物(L)的制备
100ml圆底烧瓶中加入化合物(K)(1g，5mmol)，Pd/C(0.1g)，MeOH(30ml)通入氢气后反应过夜。反应后处理：过滤除去Pd/C，滤液干燥浓缩得到化合物(L)，产率94％。
化合物8的制备
50ml圆底烧瓶中加入化合物(L)(0.5g，3.1mmol)，苯甲醛(0.4g，3.6mmol)，乙腈(20ml)，搅拌0.5h后，加入30％H2O2(20mmol)，37％HCl(10mmol)，反应1h。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝3∶2)，得到化合物8，产率61％。
化合物8的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.71(m，2H)，7.62(s，1H)，7.52(m，3H)，7.30(d，1H)，7.14(d，2H)，5.35(d，1H)，5.25(d，1H)，5.17(d，1H)，2.50(s，3H)，1.82(m，2H)，1.41(t，3H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ153.4，143.5，133.5，132.0，130.7，129.6，129.2，128.7，124.2，119.7，118.2，110.1，109.2，21.6
化合物9的制备
化合物(M)的制备
100ml圆底烧瓶中加入4-甲基-2-硝基苯胺(3g，0.02mol)，TEA(3g，0.03mol)，DCM(50ml)，搅拌0.5h后，加入乙酰氯(3.6g，0.03mol)，反应2h。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝11∶2)，得到化合物(M)，产率89％。
化合物(N)的制备
100ml圆底烧瓶中加入化合物(M)(1g，5mmol)，Pd/C(0.1g)，MeOH(30ml)通入氢气后反应过夜。反应后处理：过滤除去Pd/C，滤液干燥浓缩得到化合物(N)，产率93％。化合物9的制备
50ml圆底烧瓶中加入化合物(L)(0.5g，3.1mmol)，苯甲醛(0.4g，3.6mmol)，乙腈(20ml)，搅拌0.5h后，加入30％H2O2(20mmol)，37％HCl(10mmol)，反应1h。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝4∶3)，得到化合物9，产率47％。
化合物9的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.75(m，2H)，7.67(s，1H)，7.56(m，3H)，7.34(d，1H)，7.15(d，2H)，3.56(s，3H)，2.52(s，3H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ181.2，153.5，143.7，133.5，132.5，131.1，129.9，129.2，128.7，124.2，119.7，109.7，31.6，21.6
化合物10的制备
化合物(O)的制备
100ml圆底烧瓶中加入4-甲基-2-硝基苯胺(3g，0.02mol)，NaH(60％，1.2g，0.03mol)，THF(50ml)，搅拌0.5h后，加入环戊基溴(4.4g，0.03mol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝15∶2)，得到化合物(O)，产率78％。
化合物(P)的制备
100ml圆底烧瓶中加入化合物(O)(1g，4.5mmol)，Pd/C(0.1g)，MeOH(30ml)通入氢气后反应过夜。反应后处理：过滤除去Pd/C，滤液干燥浓缩得到化合物(P)，产率95％。化合物10的制备
50ml圆底烧瓶中加入化合物(L)(0.5g，2.6mmol)，苯甲醛(0.4g，3.6mmol)，乙腈(20ml)，搅拌0.5h后，加入30％H2O2(20mmol)，37％HCl(10mmol)，反应1h。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝3∶1)，得到化合物10，产率55％。
化合物10的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.73(m，2H)，7.60(s，1H)，7.52(m，3H)，7.30(d，1H)，7.15(d，2H)，4.41(m，1H)，2.50(s，3H)，2.08(m，4H)，1.67(m，4H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ154.4，143.5，133.7，132.0，130.7，129.6，129.2，128.7，124.2，119.7，111.4，44.8，34.6，21.6，18.1，17.7
化合物11的制备
化合物(Q)的制备
100ml圆底烧瓶中加入4-甲基-2-硝基苯胺(3g，0.02mol)，NaH(60％，1.2g，0.03mol)，THF(50ml)，搅拌0.5h后，加入环戊基溴(4.9g，0.03mol)，反应过夜。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝7∶1)，得到化合物(Q)，产率80％。
化合物(R)的制备
100ml圆底烧瓶中加入化合物(Q)(1g，4.3mmol)，Pd/C(0.1g)，MeOH(30ml)通入氢气后反应过夜。反应后处理：过滤除去Pd/C，滤液干燥浓缩得到化合物(R)，产率94％。化合物11的制备
50ml圆底烧瓶中加入化合物(R)(0.5g，2.5mmol)，苯甲醛(0.4g，3.6mmol)，乙腈(20ml)，搅拌0.5h后，加入30％H2O2(20mmol)，37％HCl(10mmol)，反应1h。反应后处理：反应体系冷却后，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分液，有机层再用饱和食盐水洗一次。干燥浓缩柱层析纯化(展开剂为PE∶EA＝5∶2)，得到化合物11，产率51％。
化合物11的波谱数据：
1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ7.73(m，2H)，7.60(s，1H)，7.52(m，3H)，7.30(d，1H)，7.15(d，2H)，4.41(m，1H)，2.50(s，3H)，2.02(m，4H)，1.67(m，4H)，1.51(m，2H)
13C NMR(400MHz，CD3Cl)δ153.4，143.5，133.7，132.0，130.7，129.6，129.2，128.7，124.2，119.7，110.4，45.8，34.6，21.5，18.2，17.7，15.9
实施例2
1.苯并咪唑类化合物的药理试验
1)anti-CD3/anti-CD28活化的小鼠T细胞的增殖试验
取小鼠的腹股沟及腋下的4个淋巴结，制备成单细胞悬液。用完全培养基RPMI-1640配成3×106/ml的细胞悬液，种于96孔板中，3×105个细胞每孔，以终浓度10μg/ml anti-CD3和1μg/ml anti-CD28(购自BD PharMingen公司)刺激72h，与化合物共同孵育，同位素氚标法检测淋巴细胞增殖的情况。
2)anti-CD3/anti-CD28活化小鼠T细胞分泌细胞因子IFN-γ试验
取小鼠的腹股沟及腋下的4个淋巴结，制备成单细胞悬液。用完全培养基RPMI-1640配成3×106/ml的细胞悬液，种于96孔板中，3×105个细胞每孔，以终浓度10μg/ml anti-CD3和1μg/ml anti-CD28(购自BD PharMingen公司)刺激24h后收集上清，测上清中IFN-γ的释放量。
3)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
细胞因子IFN-γ的测定根据ELISA试剂盒(R&D公司)描述的方法进行。大致流程如下：从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回4℃。除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100μl/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟。洗板4次。除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育30分钟。洗板4次。加入显色剂100μl/孔，避光37℃孵箱孵育10-15分钟。加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(5分钟内)。每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过标本的OD值可以在标准曲线上计算出其浓度。若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
4)DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型及病理检测
C57BL/6雌性小鼠45只按体重随机分组，分化合物(1，5，8，9，10号化合物，均为10mg/kg)给药组、空白组、模型组共13组，空白组3只，其余各组6只。各药组灌胃给药，从造模第一天开始给药，每天1次，连续10天。空白组及模型组灌胃给PBS，除了空白组，均在小鼠每日饮用水中加入2.5％DSS(葡聚糖硫酸钠盐，购自MP公司)。造模过程中每天测量小鼠体重并观察小鼠粪便，第七天为发病高峰期，此时撤去DSS。第十天处死小鼠，取结肠样本。自造模当天开始，每天给小鼠称重，观察，并进行便血及腹泻评分，并记录小鼠发病率。疾病活动度用大便情况作为疾病活动度(DAI)评价，评分标准见表1。
表1DAl评分细则
于小鼠模型发病高峰期将小鼠处死，打开腹腔，取出结肠组织，排出结肠中的粪便。剪下一段结肠用福尔马林固定。然后梯度脱水，二甲苯透明，将透明好的组织放入融化的石蜡中包埋，将包埋好的组织块切成5μm的薄片，展片与玻璃板上，拷片，H&E染色，封片，观察，拍照。H&E染色可以显示炎性细胞浸润的情况。
丽春红2R-亮绿染色可以通过丽春红2R与髓鞘磷脂成分的结合而使髓鞘呈现粉红色，而轴索，神经束衣以及神经内衣着绿色，变性的髓鞘因为磷脂消失故不着色。切片常规脱蜡至蒸馏水，用丽春红2R染液染色5min，蒸馏水洗，然后再2.5％磷钨酸水溶液中作用1min，用亮绿染液复染4min，再用1％冰醋酸水溶液分化10s，自来水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。其中丽春红2R染色液由丽春红2R1g，冰醋酸1ml，蒸馏水99ml配置；亮绿染液由亮绿1.0g，冰醋酸1ml，蒸馏水99ml配置。
小鼠结肠病理评分标准见表2。
表2组织学评分
↑.increased；↓，decreased.
2.苯并咪唑类化合物的药理试验结果及分析
1)苯并咪唑类化合物体外抑制anti-CD3/anti-CD28活化的小鼠T细胞的增殖
为了评价实施例1所述的苯并咪唑类化合物1-11是否具有免疫抑制活性，首先采用10μg/ml anti-CD3和1μg/ml anti-CD28刺激T细胞活化增殖，将待筛化合物库中的化合物与活化T细胞共敷72h，通过[H3]掺入法考察各待测化合物对于T淋巴细胞增殖的影响。如图1所示，化合物1-11不同程度地抑制了anti-CD3/anti-CD28活化的T细胞的增殖，其中以化合物5，10，11的抑制增殖的效果最为显著。以上结果提示这些苯并咪唑类化合物具有免疫抑制活性。
2)苯并咪唑类化合物抑制anti-CD3/anti-CD28活化小鼠T细胞分泌细胞因子IFN-γ
Th1介导了DSS诱导的小鼠结肠炎的发生，其重要的效应分子就是IFN-γ。因此，为了评价合成的一批苯并咪唑类化合物是否具有改善肠炎的效果，我们考察了这批化合物体外对anti-CD3/anti-CD28活化小鼠T细胞分泌细胞因子子IFN-γ。如图2所示，化合物1-11不同程度地抑制了anti-CD3/anti-CD28活化小鼠T细胞分泌细胞因子子IFN-γ，其中以化合物1，5，8，9，10的抑制增殖的效果最为显著。
3)苯并咪唑类化合物改善了DSS诱导的小鼠结肠炎
接下来，我们进一步考察这批苯并咪唑类化合物体内是否可以抑制Th1介导的免疫疾病模型。DSS(硫酸葡聚糖)能够诱导小鼠溃疡性结肠炎的发生，病变的特点主要表现为炎性细胞的浸润、粘膜层变薄、粘膜腺体受损或消失及溃疡形成。疾病活动度与病理评分结果基本一致，观察动物体重的增减、大便的质地及潜血或便血并综合分析可以动态监测病变的演化过程。从造模第1天起开始口服给药，给药组分别每天给予10mg/kg的不同苯并咪唑类化合物。CsA作为阳性对照，溶于PBS形成悬浮液，每天口服给药10mg/kg。溶剂对照组给予PBS作为对照。给药持续至实验观察结束。如图3所示，在造模第9天时，苯并咪唑类化合物(1，5，8，9，10)均可不同程度地显著改善DSS诱导的小鼠结肠炎的临床评分。进一步，我们发现化合物1，5，8，9，10可显著抑制小鼠的发病严重程度(图4、5)。第10天处死小鼠，取各组小鼠结肠，H&E染色考察各组小鼠病变严重程度。本实验中结肠组织病变主要表现为溃疡形成：粘膜上皮细胞变性坏死脱落、缺损最重者可达肌层、伴炎细胞浸润(淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞)，邻近的粘膜上皮有增生，明显者已完全覆盖溃疡表面；粘膜下层和肌层有不同程度的血管扩张充血和炎细胞浸润。由H&E切片图(图4)及病理评分(图5)可知，化合物1，5，8，9，10可以显著地抑制上述症状产生。我们提取了小鼠结肠组织蛋白，用于分析其中炎性细胞因子的表达量。如图6所示，苯并咪唑类化合物对一些重要的炎症细胞因子如IL-1β，TNF-α，IL-17A及IFN-γ都有较为明显的抑制效果，提示苯并咪唑类化合物的抗炎效果可能与以上细胞因子所涉及的信号通路有关。
以上结果综合提示，苯并咪唑类化合物可作为免疫抑制剂在自身免疫性疾病，特别是治疗T细胞参与的自身免疫性疾病如炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、自身免疫性肾炎。
Claims (6)
1.苯并咪唑类化合物，其特征在于为如下结构式
其中R为C3-C7烷烃。
2.苯并咪唑类化合物，其特征在于所述的如下结构式任意一个：
3.苯并咪唑类化合物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于所述的苯并咪唑类化合物为如下结构式
其中R为C1-C7烷烃。
4.苯并咪唑类化合物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于所述的苯并咪唑类化合物为如下结构式任意一个：
5.根据权利要求3或4所述的苯并咪唑类化合物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于所述的自身免疫性疾病为T细胞参与的自身免疫性疾病。
6.根据权利要求5所述的苯并咪唑类化合物在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于T细胞参与的自身免疫性疾病为炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮或自身免疫性肾炎。
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