CN103109647A - 一种采集牛肝菌孢子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采集牛肝菌孢子的方法，所述方法包括如下步骤：子实体采集步骤：1)将未散发孢子的菌盖以菌孔朝下的方式架放在底部铺有滤纸的采集容器入口，并使用灭菌的包裹材料将所述菌盖和采集容器盖包裹在一起；2)低温存放步骤：将所述采集容器保存在2℃至15℃的保温箱中；和3)获取孢子步骤：将所述菌盖置于2℃至5℃的温度条件下使孢子释放于所述垫层上。本发明还提供了保存牛肝菌孢子的方法。本发明所述的采集方法和保存方法具有简单、易操作、采集量大、孢子纯净等优点。
Description
技术领域
本发明涉及菌根性食用菌菌种采集和保存的方法，具体地说，本发明涉及一种牛肝菌孢子的采集方法和保存方法。
背景技术
牛肝菌属于担子菌亚门伞菌目中的牛肝菌科(Boletaceae)，除少数品种有毒或味苦而不能食用外，大部分品种均可食用。主要有白、黄、黑牛肝菌。白牛肝菌味道鲜美，营养丰富。该菌菌体较大，肉肥厚，柄粗壮，食味香甜可口，营养丰富，是一种世界性著名食用菌。云南省各族群众喜爱采集鲜菌烹调食用。西欧各国也有广泛食用白牛肝菌的习惯，除新鲜的作菜外，大部分切片干燥，加工成各种小包装，用来配制汤料或做成酱油浸膏，也有制成盐腌品食用。
其中，点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus(L.：Fr.)O.Kuntce)属于粘盖牛肝菌属，于夏秋季松林及混交林地上散生、群生或丛生。河北、黑龙江、吉林、辽宁、山东、江苏、安徽、浙江、香港、台湾、河南、广东、广西、贵州、四川、云南、陕西、甘肃、西藏、福建等均有发生。
点柄粘盖牛肝菌可食用，味较好。东北地区曾大量加工出口或以干品的形式在市场销售。据报道，点柄粘盖牛肝菌具有抗癌作用。对小白鼠肉瘤的抑制率为80％，对艾氏癌的抑制率为70％。主要与油松形成外生菌根，是油松林地的优势菌根性食用菌。目前点柄粘盖牛肝菌还不能人工栽培。为了驯化栽培点柄粘盖牛肝菌，需要寻找适合人工栽培的菌种并提供适合的栽培条件。在驯化栽培过程中，孢子的采集、保存以及菌丝的培养是基础。如何获得大量纯净的孢子是驯化的首要关键步骤。
发明内容
为了解决上述的问题，发明人对点柄粘盖牛肝菌的生物学习性进行了多年持续的调查、采集和试验，发现在常温条件下只能得到极少量的孢子，本发明人偶然发现在低温条件下能够很好地采集到孢子，并且在适当的条件下可以将孢子保存较长的时间。发明人反复比较了牛肝菌子实体成熟度与孢子弹射的相关性，在低温下观察了孢子释放的情况，进行了孢子储藏后萌发情况的试验调查，从而得到了一种牛肝菌孢子采集与保存的方法，从而完成了本发明并获得了令人意外的满意的收集效果。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
1、一种牛肝菌孢子的采集方法，所述方法包括如下步骤：
1)子实体采集步骤：将未散发孢子的菌盖以菌孔朝下的方式架放在底部铺有滤纸的采集容器入口，并使用包裹材料将所述菌盖和采集容器盖包裹在一起；
2)低温存放步骤：将所述采集容器保存在2℃至15℃的保温箱中；和
3)获取孢子步骤：将所述菌盖置于2℃至5℃的温度条件下使孢子释放于所述垫层上。
2、如技术方案1所述的方法，其中，所述采集容器为带有盖子的广口玻璃瓶。
3、如技术方案1或2所述的方法，其中，所述包裹材料为经过灭菌的报纸或牛皮纸。
4、如技术方案1至3中任一项所述的方法，其中，所述滤纸为白色滤纸。
5、如技术方案1至4中任一项所述的方法，其中，所述子实体采集步骤通过如下方式进行：使用灭菌刀片小心取下菌盖，将所述菌盖以菌孔朝下方式架放在经过灭菌的采集容器入口，使用经灭菌的作为所述包裹材料的报纸或牛皮纸将所述菌盖和所述采集容器包裹在一起，并使用橡皮筋包扎固定后置于干净的所述保温箱中。
6、如技术方案1至5中任一项所述的方法，其中，在第1)步骤中，所述子实体的菌孔为可肉眼观察的。
7、如技术方案1至6所述的方法，其中，所述子实体的菌孔宽度为0.10mm至1.00mm。
8、如技术方案1至7中任一项所述的方法，其中，所述子实体的菌孔长度为0.25mm至2.00mm。
9、如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述牛肝菌为点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus(L.：Fr.)O.Kuntce)。
10、如技术方案1至9中任一项所述的方法，其中，所述子实体是无虫的。
11、如技术方案1至10中任一项所述的方法，其中，所述方法中使用的用具为经过无菌处理的用具。
12、如技术方案1至11中任一项所述的方法，其中，所述第3)步骤中的所述释放持续2小时至3小时。
13、一种牛肝菌孢子的保存方法，所述方法包括如下步骤：
1)将牛肝菌孢子释放于滤纸上；
2)将滤纸剪切成条带；
3)将所述条带放入试管中；和
4)将所述试管在2℃至5℃的温度条件下保存。
14、如技术方案13所述的方法，其中，所述滤纸为技术方案1至11中任一项所述的方法得到所述滤纸。
本发明的采集和保存牛肝菌孢子的方法具有简单、易操作、采集量大、孢子纯净等优点。
附图说明
为了更加便于理解本发明，本文在此提供如下附图，但是这些附图只用于说明目的，而不应理解为用于限定本发明，其中：
图1显示了成熟度过高已经散发了孢子的子实体的照片。
图2显示了成熟度达到了能够散发孢子的适合采集的子实体的照片。
图3显示了成熟度过低还没有达到散发孢子程度的子实体的照片。
图4显示根据本发明的一个实施方式适合采集的成熟度达到了能够散发孢子的子实体的电子扫描显微(SEM)照片，其中示出菌孔的长度为320.92μm，宽度为151.89μm。其中成像条件为：放大倍率：158倍；拍摄时间：2012年10月1日；扫描电镜型号：TSCAN5136。
图5显示根据本发明的一个实施方式适合采集的成熟度达到散发孢子的程度的子实体的电子扫描显微(SEM)照片，其中示出菌宽度为162.35μm。其中放大倍率为358倍，其他成像条件与图4相同。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了牛肝菌孢子的采集方法。所述方法包括如下步骤：
1)子实体采集步骤：将未散发孢子的菌盖以菌孔朝下的方式架放在底部铺有滤纸的采集容器入口，并使用包裹材料将所述菌盖和采集容器盖包裹在一起；
2)低温存放步骤：将所述采集容器保存在2℃至15℃的保温箱中；和
3)获取孢子步骤：将所述菌盖置于2℃至5℃的温度条件下使孢子释放于所述垫层上。
在所述低温存放步骤中，保温箱的温度例如可以为2℃至15℃，优选为5℃至12℃，更优选为大于5℃且小于10℃的温度。例如可以为2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃。如果温度过低，则在室外不容易实现，并且可能影响到随后孢子的释放；如果温度过高，则容易失水，影响孢子释放。
在所述获取孢子步骤中，温度可以为2℃至5℃，更优选为4℃至5℃。例如为2℃、3℃、4℃或者5℃，例如保存在设定为如上温度的冰箱中。
所述第3)步骤可以在所述第2)步骤之后立即进行。但是优选所述第3)步骤在所述第2)步骤结束后3小时至10小时(例如3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或者10小时)之后进行，这样可以使孢子能够更好地释放。
另外，在根据第2)步骤中的温度高于5℃的情况下，第二步骤和第三步骤中的间隔时间优选不超过10小时。
低温条件一般认为会降低细胞的活跃度，因而不会将用于采集孢子的子实体保存在低温条件下。本发明人通过多年连续的调查和研究，发现牛肝菌尤其是点柄粘盖牛肝菌的生长环境的地表温度都比较低，在这样的环境条件下也还出现孢子能够自然弹射，而常温反而由于失水收缩等原因而导致弹射失败。于是本发明人进行了一系列的试验研究，终于实现了本发明。
本发明对所述采集容器没有特别的限制。在一些实施方式中，所述采集容器为带有盖子的广口玻璃瓶，例如带有盖子的250ml的广口玻璃瓶，并且在将所述菌盖架放在所述广口玻璃瓶入口之前盖上所述盖子以防止污染。
本发明对包裹材料没有特别的限制。在一些实施方式中，所述包裹材料优选为经过灭菌的报纸或牛皮纸。
本发明对所述垫层没有特别的限制，例如所述垫层可以为滤纸。由于适合采集的牛肝菌的孢子一般呈黄褐色，因此为了便于观察，所以滤纸优选为白色滤纸。
在一些优选的实施方式中，所述子实体采集步骤通过如下方式进行：使用灭菌刀片小心取下菌盖，将所述菌盖以菌孔朝下方式架放在经过灭菌的采集容器入口，使用经灭菌的作为所述包裹材料的报纸或牛皮纸将所述菌盖和所述采集容器包裹在一起，并使用橡皮筋包扎固定后置于干净的所述保温箱中。
为了使子实体能够充分释放孢子并且所释放的孢子具有适合的成熟度从而具有较高的萌发率，在一些优选的实施方式中，选择采集的子实体为菌孔可以用肉眼(即不借助于仪器例如放大镜)能够观察到的子实体。在一些更优选的实施方式中，所述菌孔的宽度为0.10mm至1.00mm，优选为0.12mm至0.8mm，更优选为0.13至0.7mm。例如，所述菌孔的宽度可以为0.10mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm、0.15mm、0.16mm、0.17mm、0.18mm、0.19mm、0.20mm、0.30mm、0.35mm、0.40mm、0.45mm、0.50mm、0.55mm、0.60mm、0.65mm、0.70mm、0.75mm、0.80mm、0.85mm、0.90mm、0.95mm或1.00mm。本文所述的宽度具有本领域技术人员一般理解的意义，即，所述宽度为菌孔上边缘平面上的最小直径。
在一些优选的实施方式中，所述子实体的菌孔长度为0.25mm至2.00mm，更优选为0.30mm至1.50mm，进一步优选为0.35mm至1.00mm。例如，所述最大直径可以为0.25mm、0.26mm、0.27mm、0.28mm、0.29mm、0.30mm、0.32mm、0.34mm、0.36mm、0.38mm、0.40mm、0.45mm、0.50mm、0.55mm、0.60mm、0.65mm、0.70mm、0.75mm、0.80mm、0.85mm、0.90mm、0.95mm、1.00mm、1.10mm、1.20mm、1.30mm、1.40mm、1.50mm、1.60mm、1.70mm、1.80mm、1.90mm或2.00mm。本文所述的长度具有本领域技术人员一般理解的意义，即，所述长度为菌孔上边缘平面上菌孔的最大直径。
在一些优选的实施方式中，优选所述子实体是无虫的，以防止子实体受损或者孢子受到污染。
为了获得纯净的没有杂质的孢子，本发明优选在采集过程使用过的所有用具，包括但不限于所述采集容器及其盖子，垫层(或者滤纸)、包裹材料(或者报纸或牛皮纸)、保温箱以及可选的例如刀片如灭菌刀、剪刀、镊子、橡皮筋等都经过无菌处理。例如，所述无菌处理可以为在121℃高压灭菌30分钟的灭菌处理或者采用酒精进行的表面处理。
在一些优选的实施方式中，所述第3)步骤中的所述释放持续2小时至3小时。本发明经过研究发现，在2℃至5℃(例如2℃、3℃、4℃或5℃)的条件下放置2小时至3小时，子实体的孢子能够充分地释放，从而能够采集到活力得到较好保持并且数量足够多的孢子。
在第二方面，本发明还提供了一种牛肝菌孢子的保存方法，所述方法包括如下步骤：
1)将牛肝菌孢子释放于滤纸上；
2)将滤纸剪切成条带；
3)将所述条带放入试管中；和
4)将所述试管在2℃至5℃的温度条件下保存。
优选的是，所述滤纸为采用本发明的上述采集方法得到的上面释放有牛肝菌孢子的滤纸。例如可以将所述试管保存在温度设定为例如2℃、3℃、4℃或5℃的冰箱中，所述温度更优选为4℃至5℃。
顺便说明的是，本发明所使用的数值范围意指包括该范围的端值和该范围内任意数值以及任意子范围。
实施例
下文将通过实施例来对本发明进行进一步的说明，不过这些实施例仅为说明目的，不应解释为对本发明范围的限制。
牛肝菌孢子采集工具的准备
塑料常温组：采集前一天取250ml的广口玻璃瓶和瓶盖若干个，瓶底部铺圆形滤纸一张，封盖；准备20cm X20cm长宽的牛皮纸或报纸若干张、橡皮筋若干个、灭菌刀片5-10个、剪刀和镊子。将上述物品于121℃高压灭菌30分钟后，置于用酒精表面消毒的塑料常温箱内备用。保温箱组：在采集工具1的基础上，还准备表面酒精消毒的保温箱1-2个。所有用具均为市售产品，没有本发明的专用的特殊产品。
牛肝菌子实体的选择和采集
在7至9月份，在油松林地选择尚未散发孢子的无虫的(菌孔刚刚张开、肉眼可见，请参照图1至3)点柄粘盖牛肝菌子实体，用灭菌刀片小心取下菌盖，使用灭菌刀片小心取下菌盖，将所述菌盖以菌孔朝下方式架放在经过灭菌的广口玻璃瓶口，使用经灭菌的作为所述包裹材料的报纸或牛皮纸将所述菌盖和光口玻璃瓶包裹在一起，并使用橡皮筋包扎固定后快速置于干净的所述保温箱中(保温箱组)，保温箱中的温度保持不超过15℃。另外一些用橡皮筋固定后快速置于塑料常温箱内(塑料常温箱组)。将保温箱和塑料常温箱都带回实验室。
扫描电子显微观测
对于未散发孢子的子实体，使用电镜拍摄其菌孔的开度，所得电镜照片请参见图4和图5。
孢子弹射数量测试
保温箱组：将保温箱放有子实体的采集瓶置于设定为5℃冰箱内，2个小时后观察孢子的弹射情况。塑料常温箱组：将塑料常温箱放有子实体的采集瓶放于室内超净工作台面上，常温遮光静置，6小时后观察孢子弹射情况。并将弹射的孢子量按10个等级(即，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9)进行打分，每组实验设5个重复，结果见下表。
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 保温箱组 | 8 | 8 | 9 | 9 | 8 |
| 塑料常温箱组 | 1 | 2 | 1 | 1 | 0 |
结果发现，在保温箱组中，绝大多数子实体2小时后即释放大量孢子于白色的滤纸上，孢子呈黄褐色。相反，塑料常温箱组的孢子的颜色虽然也是黄褐色，但是孢子弹射量少，部分子实体不弹射孢子。
然后，将经过对孢子数量进行打分的滤纸剪切成6mm条带，将所述条带放入试管中；并将所述试管在2℃至5℃的温度条件下保存备用。
对孢子的萌发进行测定
分别于采集后第1天(采集次日)、1个月、2个月、3个月、6个月，在超净工作台中，用无菌镊子夹取保存于试管的含有孢子的一个条带，用3ml的无菌蒸馏水将孢子条带上的孢子冲洗至100ml无菌三角瓶中，冲洗至孢子条无色为止，然后使用无菌水稀释10倍，得到孢子悬浮液。再将孢子悬浮液接种于90mm PDA培养基表面，每个培养皿的接种量为50μl的所述孢子悬浮液。然后观察孢子萌发情况，结果见下表。
结果表明：保温箱组的孢子萌发数量依存放时间延长而逐渐减少，在6个月时几乎没有孢子萌发，而常温箱组的孢子从一开始萌发的数量就很少，而且在60天之后不再存在能够萌发的孢子。而且，比较而言，保温箱组的孢子在培养时污染少，而塑料常温箱组的孢子污染严重。以上结果表明，低温下获取的孢子纯净、活力强，常温下获取的孢子易被污染、活力弱。
尽管已经描述并指出了本发明的如应用于本发明的优选实施方式的基本的新特征，但是应当理解的是，本领域技术人员可以进行对所阐述的实施例的形式和细节进行各种省略、取代和改变而没有脱离本发明的实质。本发明并不限于以上描述的实施方式，这些实施方式仅出于举例目的而提供，并且可以在所附专利权利要求限定的保护范围内以各种方式加以修改。
Claims (10)
1.一种牛肝菌孢子的采集方法，所述方法包括如下步骤：
1)子实体采集步骤：将未散发孢子的菌盖以菌孔朝下的方式架放在底部铺有滤纸的采集容器入口，并使用包裹材料将所述菌盖和采集容器盖包裹在一起；
2)低温存放步骤：将所述采集容器保存在2℃至15℃的保温箱中；和
3)获取孢子步骤：将所述菌盖置于2℃至5℃的温度条件下使孢子释放于所述垫层上。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述采集容器为带有盖子的广口玻璃瓶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述子实体采集步骤通过如下方式进行：使用灭菌刀片小心取下菌盖，将所述菌盖以菌孔朝下方式架放在经过灭菌的采集容器入口，使用经灭菌的作为所述包裹材料的报纸或牛皮纸将所述菌盖和所述采集容器包裹在一起，并使用橡皮筋包扎固定后置于干净的所述保温箱中。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在第1)步骤中，所述子实体的菌孔为可肉眼观察的。
5.如权利要求1至4所述的方法，其中，所述子实体的菌孔宽度为0.10mm至1.00mm。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述子实体的菌孔长度为0.25mm至2.00mm。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述牛肝菌为点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus(L.：Fr.)O.Kuntce)。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述第3)步骤中的所述释放持续2小时至3小时。
9.一种牛肝菌孢子的保存方法，所述方法包括如下步骤：
1)将牛肝菌孢子释放于滤纸上；
2)将滤纸剪切成条带；
3)将所述条带放入试管中；和
4)将所述试管在2℃至5℃的温度条件下保存。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述滤纸为权利要求1至8中任一项所述的方法得到所述滤纸。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130522 |