CN103100089B - 一种口服pH响应性肠靶向载体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于pH响应性靶向载体领域，提供了一种口服pH响应性肠靶向载体，该载体由海藻酸钙凝胶内核和包裹海藻酸钙凝胶内核的硫酸鱼精蛋白层组成，所述载体呈球状，其粒径为4.1 mm ~ 4.6 mm。制备所述载体的工艺步骤如下：（1）配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液；（2）制备海藻酸钙凝胶内核；（3）吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层。本发明还提供了一种所述口服pH响应性肠靶向载体在包埋益生菌、营养素或药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于pH响应性靶向载体领域，特别涉及一种pH响应性肠靶向载体及其制备方法，以及该载体在包埋益生菌、营养素或药物中的应用。
背景技术
益生菌被足量摄入至宿主肠道后，能对宿主产生以下保健功能：1）整肠作用，维持肠道菌群平衡，防治腹泻；2）缓解乳糖不耐症，促进机体营养吸收；3）增强免疫力；4）降低高血压；5）降低胆固醇；6）预防癌症，抑制肿瘤生长等。因而益生菌产品已被广泛用于保健、医药等领域。但由于益生菌的耐受性较差，活菌制剂进入消化道后难以经受低pH值的胃酸、胆汁酸等的作用，使之难以有足够的活菌数量到达肠道、进行增殖并发挥作用。此外，一些营养素和药物同样对低pH值的胃酸、胆汁酸等较敏感，要有足够的营养素或药物量才能在肠道发挥作用，因此需对其进行保护以免受胃酸等的破坏。
目前益生菌的保护方法主要是将益生菌用载体包埋，利用载体材料自身的传质阻力以阻止胃酸等与益生菌相接触而起到保护作用。最常见的对益生菌进行包埋的技术是将益生菌包埋于海藻酸钙凝胶载体中，有研究表明将益生菌包埋于用壳聚糖包裹的海藻酸盐微球中相比于游离益生菌在通过胃肠道时益生菌的存活率有所提高，但由于仅依靠载体材料自身的传质阻力来抵御胃酸的破坏，保护效果不够理想。目前尚无采用具有pH响应性的肠靶向材料对益生菌进行包埋的报道。
肠靶向药物载体在用药后载体被人体降解、定点在肠道释放药物，对酸敏感药物的给药具有重要的意义。但目前关于肠靶向药物载体的研究多集中在微米或纳米级别，其存在载药量较小、材料用量较大的缺点。目前市场上供应的营养素多为片剂或胶囊剂，所采用的辅料或者载体不能起到保护酸敏感的营养素的作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种口服pH响应性肠靶向载体及其制备方法，所述载体载药量大，具有良好的肠靶向pH响应性，且在肠道中具有很快的溶解速度，本发明还提供了一种所述载体在包埋益生菌、营养素或药物中的应用，为酸敏感的益生菌、营养素或药物的保护提供了一种新的途径。
本发明提供的口服pH响应性肠靶向载体，由海藻酸钙凝胶内核和包裹海藻酸钙凝胶内核的硫酸鱼精蛋白层组成。
本发明提供的口服pH响应性肠靶向载体呈球状，其粒径为4.1 mm ~4.6 mm。
本发明所述口服pH响应性肠靶向载体的制备方法，工艺步骤如下：
（1）配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液
外相流体的配制：在常压、室温将海藻酸钠加入搅拌下的无菌水中并继续搅拌，当海藻酸钠完全溶解即形成外相流体，所述外相流体中海藻酸钠的浓度为10 g/L ~30 g/L；
内相流体的配制：在常压、室温将海藻酸钠加入搅拌下的无菌水中并继续搅拌，当海藻酸钠完全溶解即形成内相流体，所述内相流体中海藻酸钠的浓度为10 g/L ~30 g/L；
硝酸钙溶液的配制：在常压、室温将硝酸钙加入无菌水中并搅拌，当硝酸钙完全溶解即形成硝酸钙溶液，所述硝酸钙溶液中硝酸钙的浓度为50 g/L ~150 g/L；
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：在常压、室温将硫酸鱼精蛋白加入无菌水中并搅拌，当硫酸鱼精蛋白完全溶解即形成硫酸鱼精蛋白溶液，所述硫酸鱼精蛋白溶液中硫酸鱼精蛋白的浓度为1 g/L ~5 g/L；
（2）制备海藻酸钙凝胶内核
分别将步骤（1）配制的外相流体、内相流体注入共挤出装置，形成单分散的水包水海藻酸钠液滴，采用盛有所述硝酸钙溶液的收集容器收集所述海藻酸钠液滴，然后在常压、室温下静置交联反应10 min~60min即形成海藻酸钙凝胶内核；
所述外相流体的流量为10 mL/h ~20 mL/h，内相流体的流量为20mL/h ~80 mL/h；所述硝酸钙溶液的量以能完全淹没所述海藻酸钠液滴为限；
（3）吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层
在常压、室温将步骤（2）制备的海藻酸钙凝胶内核加入搅拌下的所述硫酸鱼精蛋白溶液中并继续搅拌10 min ~30 min，然后进行固液分离并将分离出的固态颗粒用生理盐水洗涤去除未吸附的硫酸鱼精蛋白，即得口服pH响应性肠靶向载体；所述硫酸鱼精蛋白溶液的量以能完全淹没所述海藻酸钙凝胶内核为限。
本发明还提供了一种口服pH响应性肠靶向载体在包埋益生菌、营养素或药物中的应用。
本发明所述口服pH响应性肠靶向载体采用以下方法包埋益生菌、营养素或药物：
（1）配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液
外相流体的配制：在常压、室温将海藻酸钠加入搅拌下的无菌水中并继续搅拌，当海藻酸钠完全溶解即形成外相流体，所述外相流体中海藻酸钠的浓度为10 g/L ~30 g/L；
内相流体的配制：在常压、室温将海藻酸钠加入搅拌下的无菌水中并继续搅拌使海藻酸钠完全溶解形成海藻酸钠溶液，然后将益生菌、营养素或药物加入搅拌下的海藻酸钠溶液中，当其混合均匀即形成内相流体，所述内相流体中海藻酸钠的浓度为10 g/L ~30 g/L，所述益生菌、营养素或药物按照需要量添加；
硝酸钙溶液的配制：在常压、室温将硝酸钙加入无菌水中并搅拌，当硝酸钙完全溶解即形成硝酸钙溶液，所述硝酸钙溶液中硝酸钙的浓度为50 g/L ~150 g/L；
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：在常压、室温将硫酸鱼精蛋白加入无菌水中并搅拌，当硫酸鱼精蛋白完全溶解即形成硫酸鱼精蛋白溶液，所述硫酸鱼精蛋白溶液中硫酸鱼精蛋白的浓度为1 g/L ~5 g/L；
（2）制备包埋有益生菌、营养素或药物的海藻酸钙凝胶内核
分别将步骤（1）配制的外相流体、内相流体注入共挤出装置中，形成单分散的含益生菌、营养素或药物的水包水海藻酸钠液滴，采用盛有所述硝酸钙溶液的收集容器收集所述含益生菌、营养素或药物的海藻酸钠液滴，然后在常压、室温下静置交联反应10 min~60 min，即形成包埋有益生菌、营养素或药物的海藻酸钙凝胶内核；
所述外相流体的流量为10 mL/h ~20 mL/h，内相流体的流量为20mL/h ~80 mL/h；所述硝酸钙溶液的量以能完全淹没所述含益生菌、营养素或药物的海藻酸钠液滴为限；
（3）吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层
在常压、室温将步骤（2）制备的包埋有益生菌、营养素或药物的海藻酸钙凝胶内核加入搅拌下的硫酸鱼精蛋白溶液中并继续搅拌10 min~30 min，然后进行固液分离并将分离出的固态颗粒用生理盐水洗涤去除未吸附的硫酸鱼精蛋白，即完成益生菌、营养素或药物的包埋操作；所述硫酸鱼精蛋白溶液的量以能完全淹没所述包埋有益生菌、营养素或药物的海藻酸钙凝胶内核为限。
对于小分子药物或小分子营养素，可使用发明所述口服pH响应性肠靶向载体按下述方法进行包埋：将所述口服pH响应性肠靶向载体浸泡于药物或营养素浓度为饱和的溶液中，浸泡时间以药物或营养素扩散进入载体达到平衡为限，然后将包埋了药物或营养素的口服pH响应性肠靶向载体分离出，即完成小分子药物或小分子营养素的包埋操作。
上述口服pH响应性肠靶向载体的制备方法以及采用所述口服pH响应性肠靶向载体包埋益生菌、营养素或药物的方法中，吸附硫酸鱼精蛋白层的时间根据对pH响应性要求选择，吸附时间越长，硫酸鱼精蛋白层越厚，pH响应性越好。
上述口服pH响应性肠靶向载体的制备方法以及采用所述口服pH响应性肠靶向载体包埋益生菌、营养素或药物的方法中，所使用的溶液、容器和共挤出装置在使用前均需进行灭菌处理，整个操作过程在无菌操作台上完成。
本发明制备的包埋有益生菌、营养素或药物的口服pH响应性肠靶向载体的工作原理如下：在不同的pH环境下，包埋有益生菌、营养素或药物的海藻酸钙凝胶内核与吸附在其表面的硫酸鱼精蛋白分子间存在不同的静电吸附作用，当本发明制备的包埋有益生菌、营养素或药物的口服pH响应性肠靶向载体经过pH值较低的胃部环境时，所述载体表面的孔隙处于“关闭”状态，因而包埋于其中的益生菌、营养素或药物不会释放，包埋于其中的益生菌、营养素或药物此时可免受低pH值环境的破坏而保持良好的活性；当所述包埋有益生菌、营养素或药物的口服pH响应性肠靶向载体到达pH值较高肠道环境中时，硫酸鱼精蛋白作为肠道环境中胰蛋白酶的底物被分解，而胰蛋白酶在分解硫酸鱼精蛋白时需要消耗海藻酸钙凝胶内核中的钙离子，从而吸附有硫酸鱼精蛋白的海藻酸钙凝胶内核能快速溶解并将其包埋的益生菌、营养素或药物在肠道中释放出来并发挥作用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所述口服pH响应性肠靶向载体，由于其表面吸附了一层硫酸鱼精蛋白，因而具有良好的pH响应性智能保护功能，且在肠道中具有很快的溶解速度，是一种携带益生菌、营养素或药物进入肠道的新型载体。
2、本发明所述口服pH响应性肠靶向载体的粒径为毫米级，相对于微米或纳米级的载体来说具有更大的载药量及更少的原材料耗费量。
3、本发明所述口服pH响应性肠靶向载体，由可生物降解的天然产物制备而成，因而不会对服用者造成伤害，也不会产生不良反应。
4、本发明所述口服pH响应性肠靶向载体用于包埋益生菌、营养素或药物的包埋工艺简单、包埋条件温和，无高温高压等苛刻要求，有利于工业化生产。
附图说明
图1是本发明所述口服pH响应性肠靶向载体的制备方法示意图；
图2是实施例4所述包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体的制备方法示意图；
图3是实施例4所述包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体在胃和肠道中的响应机理示意图，其中，a）为在胃中的响应机理示意图，b）为在肠道中的响应机理示意图；
图4是实施例4所述包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核与包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体的光学照片，其中，a）为包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核，b）为包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体，图中的标尺的长度为4 mm；
图5是实施例1所述海藻酸钙凝胶内核与口服pH响应性肠靶向载体在模拟胃液中的VB12扩散曲线；
图6是游离干酪乳酸杆菌、实施例4所述包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核、包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体经过模拟胃液浸泡0h、1h和2h后的活菌数量及存活率；其中，a）为活菌数量图，b）存活率图；
图7是实施例4所述包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核、包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体中的干酪乳酸杆菌分别在模拟胃液及模拟肠液中的溶出度曲线；
图中，1—海藻酸钠水包水液滴、2—海藻酸钙凝胶内核、3—硫酸鱼精蛋白层、4—干酪乳酸杆菌。
具体实施方式
下面结合附图通过实施例对本发明所口服pH响应性肠靶向载体及其制备方法与应用作进一步说明。下述各实施例中，海藻酸钠、硝酸钙均为分析纯；所使用的溶液、容器和共挤出装置在使用前均需进行灭菌处理，整个操作过程在无菌操作台上完成。
实施例1
图1为口服pH响应性肠靶向载体的制备方法示意图，该载体的制备方法如下：
（1）配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液
外相流体的配制：在常压、室温下将海藻酸钠加入搅拌下的无菌水中并继续搅拌，当海藻酸钠完全溶解，即形成海藻酸钠的浓度为20 g/L的外相流体；
内相流体的配制：内相流体与外相流体相同；
硝酸钙溶液的配制：在常压、室温下将硝酸钙加入无菌水中并搅拌，当硝酸钙完全溶解，即成形浓度为100 g/L硝酸钙溶液；
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：在常压、室温下将硫酸鱼精蛋白加入无菌水中并搅拌，当硫酸鱼精蛋白溶解即形成浓度为2.5 g/L的硫酸鱼精蛋白溶液；
（2）制备海藻酸钙凝胶内核
分别将步骤（1）配制的外相流体、内相流体由与注射泵相连接的外相、内相流体注射器注入共挤出装置的圆形管和方形管中（所述共挤出装置的结构见J.Y. Wang 等, Novel calcium-alginate capsules with aqueous core and thermo-responsive membrane.J. Colloid. Interf. Sci. 353, 2011, 第63页图2），形成单分散的水包水海藻酸钠液滴，采用盛有所述硝酸钙溶液的收集容器收集所述海藻酸钠液滴，然后在常压、室温下静置交联反应30 min即形成海藻酸钙凝胶内核；所述外相流体的流量为10 mL/h，内相流体的流量为40 mL/h；所述硝酸钙溶液的量以能完全淹没所述海藻酸钠液滴为限；
（3）吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层
在常压、室温将步骤（2）制备的海藻酸钙凝胶内核直接加入搅拌下的硫酸鱼精蛋白溶液中并继续搅拌20 min，然后进行固液分离并将分离出的固态颗粒用生理盐水洗涤3次以去除未吸附的硫酸鱼精蛋白，即得口服pH响应性肠靶向载体，将所得载体于生理盐水中保存待用；所述硫酸鱼精蛋白溶液的量以能完全淹没所述海藻酸钙凝胶内核为限。
本实施例制备的口服pH响应性肠靶向载体的平均粒径为4.3 mm。
将本实施例制备的海藻酸钙凝胶内核与口服pH响应性肠靶向载体各80颗分别浸泡于浓度为0.4 mmol/L的VB12水溶液中，每天更换新鲜的VB12水溶液直至所述凝胶内核及载体内外的VB12浓度达到平衡为止，然后将上述凝胶内核与载体取出放入100 mL 、37 °C、pH=2.5的模拟胃液中进行VB12扩散实验，每隔5 min通过紫外分光光度计检测模拟胃液在波长为361 nm处的吸光度值，通过标准曲线计算出模拟胃液中VB12的浓度，按照公式ln[(Cf-Ci)/(Cf-Ct)]计算出VB12扩散浓度（式中，Ci、Ct和Cf分别表示最初时模拟胃液中VB12的浓度、时间t时模拟胃液中VB12的浓度和扩散达平衡状态时模拟胃液中VB12的浓度），绘制得到如图5所示的海藻酸钙凝胶内核与口服pH响应性肠靶向载体在模拟胃液中的VB12扩散曲线。由图5可知：在pH=2.5的模拟胃液中，VB12透过海藻酸钙凝胶内核的速率（图5中海藻酸钙凝胶内核的直线斜率）远高于其透过口服pH响应性肠靶向载体的速率（图5中口服pH响应性肠靶向载体的直线斜率），表明在pH=2.5的模拟胃液中，口服pH响应性肠靶向载体表面的孔隙处于“关闭”状态，VB12分子被阻挡而无法扩散进入载体外的模拟胃液中，说明口服pH响应性肠靶向载体对包埋于其中的pH敏感性物质具有良好的保护效果。
实施例2
图1为口服pH响应性肠靶向载体的制备方法示意图，该载体的制备方法如下：
（1）配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液
配制海藻酸钠的浓度为30 g/L的外相流体，海藻酸钠的浓度为10 g/L的内相流体，浓度为150 g/L的硝酸钙溶液，浓度为1 g/L的硫酸鱼精蛋白溶液，配制方法同实施例1；
（2）制备海藻酸钙凝胶内核
制备单分散的水包水海藻酸钠液滴使用共挤出装置与实施例1相同，分别将步骤（1）配制的外相流体、内相流体由与注射泵相连接的外相、内相流体注射器注入共挤出装置的圆形管和方形管中，形成单分散的水包水海藻酸钠液滴，采用盛有所述硝酸钙溶液的收集容器收集所述海藻酸钠液滴，然后在常压、室温下静置交联反应60 min即形成海藻酸钙凝胶内核；所述外相流体的流量为20 mL/h，内相流体的流量为80 mL/h；所述硝酸钙溶液的量以能完全淹没所述海藻酸钠液滴为限；
（3）吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层
在常压、室温将步骤（2）制备的海藻酸钙凝胶内核直接加入搅拌下的硫酸鱼精蛋白溶液中并继续搅拌10 min，然后进行固液分离并将分离出的固态颗粒用生理盐水洗涤3次以去除未吸附的硫酸鱼精蛋白，即得口服pH响应性肠靶向载体，将所得载体于生理盐水中保存待用；所述硫酸鱼精蛋白溶液的量以能完全淹没所述海藻酸钙凝胶内核为限。
本实施例制备的口服pH响应性肠靶向载体的平均粒径为4.1 mm。
实施例3
图1为口服pH响应性肠靶向载体的制备方法示意图，该载体的制备方法如下：
（1）配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液
配制海藻酸钠的浓度为10 g/L的外相流体，海藻酸钠的浓度为30 g/L的外相流体，浓度为50 g/L的硝酸钙溶液，浓度为5 g/L的硫酸鱼精蛋白溶液，配制方法同实施例1；
（2）制备海藻酸钙凝胶内核
制备单分散的水包水海藻酸钠液滴使用共挤出装置与实施例1相同，分别将步骤（1）配制的外相流体、内相流体由与注射泵相连接的外相、内相流体注射器注入共挤出装置的圆形管和方形管中，形成单分散的水包水海藻酸钠液滴，采用盛有所述硝酸钙溶液的收集容器收集所述海藻酸钠液滴，然后在常压、室温下静置交联反应10 min即形成海藻酸钙凝胶内核；所述外相流体的流量为20 mL/h，内相流体的流量为20 mL/h；所述硝酸钙溶液的量以能完全淹没所述海藻酸钠液滴为限；
（3）吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层
在常压、室温将步骤（2）制备的海藻酸钙凝胶内核直接加入搅拌下的硫酸鱼精蛋白溶液中并继续搅拌30 min，然后进行固液分离并将分离出的固态颗粒用生理盐水洗涤3次以去除未吸附的硫酸鱼精蛋白，即得口服pH响应性肠靶向载体，将所得载体于生理盐水中保存待用；所述硫酸鱼精蛋白溶液的量以能完全淹没所述海藻酸钙凝胶内核为限。
本实施例制备的口服pH响应性肠靶向载体的平均粒径为4.6 mm。
实施例4
本实施例采用实施例1制备的口服pH响应性肠靶向载体包埋干酪乳酸杆菌，制备方法如图2所示，包埋步骤如下：
（1）配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液
外相流体的配制：在常压、室温下将海藻酸钠缓慢加入搅拌下的无菌水中并继续搅拌，当海藻酸钠完全溶解，即形成海藻酸钠的浓度为20g/L的外相流体；
内相流体的配制：在常压、室温下将海藻酸钠缓慢加入搅拌下的无菌水中并继续搅拌使海藻酸钠完全溶解形成海藻酸钠溶液，然后将干酪乳酸杆菌加入搅拌下的海藻酸钠溶液中，当其混合均匀即形成内相流体，所述内相流体中海藻酸钠的浓度为20 g/L，干酪乳酸杆菌的活菌浓度约为107 CFU/mL；
硝酸钙溶液的配制：在常压、室温下将硝酸钙加入无菌水中并搅拌，当硝酸钙完全溶解即成形浓度为100 g/L硝酸钙溶液；
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：在常压、室温下将硫酸鱼精蛋白加入无菌水中并搅拌，当硫酸鱼精蛋白完全溶解即形成浓度为2.5 g/L的硫酸鱼精蛋白溶液；
（2）制备包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核
分别将步骤（1）配制的外相流体、内相流体由与注射泵相连接的外相、内相流体注射器注入共挤出装置的圆形管和方形管中（所述共挤出装置的结构见J.Y. Wang 等, Novel calcium-alginate capsules with aqueous core and thermo-responsive membrane.J. Colloid. Interf. Sci. 353, 2011, 第63页图2），形成单分散的含干酪乳酸杆菌的水包水海藻酸钠液滴，采用盛有所述硝酸钙溶液的收集容器收集所述含干酪乳酸杆菌的海藻酸钠液滴，然后在常压、室温下静置交联反应30 min，即形成包埋干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核；所述外相流体的流量为10 mL/h，内相流体的流量为40 mL/h；所述硝酸钙溶液的量以能完全淹没所述含干酪乳酸杆菌的海藻酸钠液滴为限；
（3）吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层
在常压、室温将步骤（2）制备的包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核直接加入搅拌下的硫酸鱼精蛋白溶液中并继续搅拌20 min，然后进行固液分离并将分离出的固态颗粒用生理盐水洗涤3次以去除未吸附的硫酸鱼精蛋白，即完成干酪乳酸杆菌的包埋操作；所述硫酸鱼精蛋白溶液的量以能完全淹没所述包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核为限。
本实施制备的包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体在胃和肠道中的响应机理如图3所示。当包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体经过pH值较低的胃部环境时，所述载体表面的孔隙处于“关闭”状态，因而包埋于其中的干酪乳酸杆菌不会释放，包埋于其中的干酪乳酸杆菌此时可免受的破坏而保持良好的活性（图3a））；当所述包埋干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体到达pH值较高肠道环境中时，由于肠道环境中胰蛋白酶的存在，吸附有硫酸鱼精蛋白的载体能快速溶解并将其包埋的干酪乳酸杆菌释放出来并在肠道中发挥作用（图3b））。
将本实施例制备的包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核与包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体分别置于生理盐水中保存，其光学照片分别如图4a）和图4 b）所示。图4a）显示，包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核呈外层透明、内部乳白色的结构，内部的乳白色主要是由于包埋的干酪乳酸杆菌是一种乳白色的沉淀物；图4b）显示，包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体整体呈乳白色不透明的球体，这是由于海藻酸钙凝胶内核表面吸附了乳白色的硫酸鱼精蛋白分子。包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核的平均粒径为3.8 mm，变异系数（CV）为2.72%，包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体的平均粒径为4.3 mm，变异系数（CV）为2.68%，二者均具有良好的单分散性。
将本实施例制备的包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核、包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体各20颗、以及相同活菌浓度的游离干酪乳酸杆菌悬液分别浸泡于15 mL、37 °C、pH=2.5的模拟胃液中维持1h和2h，然后取出分别置于15 mL 0.06 mol/L的柠檬酸钠水溶液中震荡至溶解完全，通过平板计数法检测经模拟胃液浸泡0h、1 h和2h后干酪乳酸杆菌的活菌数量及存活率，实验结果如图6所示。由图6可知，游离的干酪乳酸杆菌在浸泡1h时已检测不到活菌的存在，而包埋于海藻酸钙凝胶内核的干酪乳酸杆菌在浸泡1h及2h后的存活率分别为18.96%和0.78%，包埋于口服pH响应性肠靶向载体的干酪乳酸杆菌在浸泡1h及2h后的存活率分别为46.57%和32.41%，远高于包埋于海藻酸钙凝胶内核的干酪乳酸杆菌的存活率。说明口服pH响应性肠靶向载体对干酪乳酸杆菌在低pH的胃酸中起到了优良的保护作用。
将本实施例制备的包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核与包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体各60颗分别浸泡于37 °C的50 mL pH=2.5的模拟胃液中2h，然后再浸泡于50 mL pH=7.0的模拟肠液中，在一定时间间隔通过紫外分光光度计于600 nm波长下检测其吸光度值得到干酪乳酸杆菌的溶出度OD600，包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核、包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体中的干酪乳酸杆菌在模拟胃液及模拟肠液中的溶出度曲线如图7所示。包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核与包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体在pH=2.5的模拟胃液中均不溶出干酪乳酸杆菌，在pH=7.0的模拟肠液中，包埋有干酪乳酸杆菌的口服pH响应性肠靶向载体不断溶解并释放出干酪乳酸杆菌，约50 min后即完全溶解，干酪乳酸杆菌被完全释放出来，而包埋有干酪乳酸杆菌的海藻酸钙凝胶内核在pH=7.0的模拟肠液中缓慢溶胀并缓慢释放干酪乳酸杆菌，6 h后才完全崩解将干酪乳酸杆菌完全释放出来，表明口服pH响应性肠靶向载体具有比海藻酸钙凝胶内核更加优良的肠溶性。
实施例5
本实施例采用实施例2制备的口服pH响应性肠靶向载体包埋叶酸，包埋步骤如下：
（1）配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液
配制海藻酸钠的浓度为30 g/L的外相流体，海藻酸钠浓度为10 g/L、叶酸的浓度为0.4 g/L的内相流体，浓度为150 g/L的硝酸钙溶液，浓度为1 g/L的硫酸鱼精蛋白溶液，配制方法同实施例4；
（2）制备包埋有叶酸的海藻酸钙凝胶内核
制备单分散的含叶酸的水包水海藻酸钠液滴使用共挤出装置与实施例1相同，分别将步骤（1）配制的外相流体、内相流体由与注射泵相连接的外相、内相流体注射器注入共挤出装置的圆形管和方形管中，形成单分散的含叶酸的水包水海藻酸钠液滴，采用盛有所述硝酸钙溶液的收集容器收集所述含叶酸的海藻酸钠液滴，然后在常压、室温下静置交联反应60 min，即形成包埋叶酸的海藻海藻酸钙凝胶内核酸钙载体；所述外相流体的流量为20 mL/h，内相流体的流量为80 mL/h；所述硝酸钙溶液的量以能完全淹没所述含叶酸的海藻酸钠液滴为限；
（3）吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层
在常压、室温将步骤（2）制备的包埋有叶酸的海藻酸钙凝胶内核直接加入搅拌下的硫酸鱼精蛋白溶液中并继续搅拌10 min，然后进行固液分离并将分离出的固态颗粒用生理盐水洗涤3次以去除未吸附的游离硫酸鱼精蛋白，即完成叶酸的包埋操作；所述硫酸鱼精蛋白溶液的量以能完全淹没所述包埋有叶酸的海藻酸钙凝胶内核为限。
实施例6
本实施例采用实施例3制备的口服pH响应性肠靶向载体包埋胰岛素，包埋步骤如下：
（1）配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液
配制海藻酸钠的浓度为10 g/L的外相流体，海藻酸钠浓度为30 g/L、胰岛素的浓度为104 IU/L的内相流体，浓度为50 g/L的硝酸钙溶液，浓度为5 g/L的硫酸鱼精蛋白溶液，配制方法同实施例4；
（2）制备包埋有胰岛素的海藻酸钙凝胶内核
制备单分散的含胰岛素的水包水海藻酸钠液滴使用共挤出装置与实施例1相同，分别将步骤（1）配制的外相流体、内相流体由与注射泵相连接的外相、内相流体注射器注入共挤出装置的圆形管和方形管中，形成单分散的含胰岛素的水包水海藻酸钠液滴，采用盛有硝酸钙溶液的收集容器收集所述含胰岛素的海藻酸钠液滴，然后在常压、室温下静置交联反应10 min即形成包埋胰岛素的海藻酸钙凝胶内核；所述外相流体的流量为20 mL/h，内相流体的流量为20 mL/h；所述硝酸钙溶液的量以能完全淹没所述含胰岛素的海藻酸钠液滴为限；
（3）吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层
在常压、室温将步骤（2）制备的包埋有胰岛素的海藻酸钙凝胶内核直接加入搅拌下的硫酸鱼精蛋白溶液中并继续搅拌30 min，然后进行固液分离并将分离出的固态颗粒用生理盐水洗涤3次以去除未吸附的游离硫酸鱼精蛋白，即完成胰岛素的包埋操作；所述硫酸鱼精蛋白溶液的量以能完全淹没所述包埋有胰岛素的海藻酸钙凝胶内核为限。
Claims (3)
1.一种口服pH响应性肠靶向载体，其特征在于所述载体由海藻酸钙凝胶内核(2)和包裹海藻酸钙凝胶内核的硫酸鱼精蛋白层(3)组成，所述载体呈球状，其粒径为4.1mm～4.6mm。
2.权利要求1所述口服pH响应性肠靶向载体在包埋益生菌、营养素或药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述口服pH响应性肠靶向载体包埋益生菌、营养素或药物的步骤如下：
(1)配制外相流体、内相流体、硝酸钙溶液和硫酸鱼精蛋白溶液
外相流体的配制：在常压、室温将海藻酸钠加入搅拌下的无菌水中并继续搅拌，当海藻酸钠完全溶解即形成外相流体，所述外相流体中海藻酸钠的浓度为10g/L～30g/L；
内相流体的配制：在常压、室温将海藻酸钠加入搅拌下的无菌水中并继续搅拌使海藻酸钠完全溶解形成海藻酸钠溶液，然后将益生菌、营养素或药物加入搅拌下的海藻酸钠溶液中，当其混合均匀即形成内相流体，所述内相流体中海藻酸钠的浓度为10g/L～30g/L，所述益生菌、营养素或药物按照需要量添加；
硝酸钙溶液的配制：在常压、室温将硝酸钙加入无菌水中并搅拌，当硝酸钙完全溶解即形成硝酸钙溶液，所述硝酸钙溶液中硝酸钙的浓度为50g/L～150g/L；
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：在常压、室温将硫酸鱼精蛋白加入无菌水中并搅拌，当硫酸鱼精蛋白完全溶解即形成硫酸鱼精蛋白溶液，所述硫酸鱼精蛋白溶液中硫酸鱼精蛋白的浓度为1g/L～5g/L；
(2)制备包埋有益生菌、营养素或药物的海藻酸钙凝胶内核
分别将步骤(1)配制的外相流体、内相流体注入共挤出装置中，形成单分散的含益生菌、营养素或药物的水包水海藻酸钠液滴，采用盛有所述硝酸钙溶液的收集容器收集所述含益生菌、营养素或药物的海藻酸钠液滴，然后在常压、室温下静置交联反应10min～60min，即形成包埋有益生菌、营养素或药物的海藻酸钙凝胶内核；
所述外相流体的流量为10mL/h～20mL/h，内相流体的流量为20mL/h～80mL/h；所述硝酸钙溶液的量以能完全淹没所述含益生菌、营养素或药物的海藻酸钠液滴为限；
(3)吸附硫酸鱼精蛋白形成硫酸鱼精蛋白层
在常压、室温将步骤(2)制备的包埋有益生菌、营养素或药物的海藻酸钙凝胶内核加入搅拌下的硫酸鱼精蛋白溶液中并继续搅拌10min～30min，然后进行固液分离并将分离出的固态颗粒用生理盐水洗涤去除未吸附的硫酸鱼精蛋白；所述硫酸鱼精蛋白溶液的量以能完全淹没所述包埋有益生菌、营养素或药物的海藻酸钙凝胶内核为限。
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