CN103099782A - 核-壳型纳米药物颗粒、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，包括吸附有化疗药物和表观遗传学药物的疏水性聚合物内核；包裹所述疏水性内核的单层脂类分子层；以及靶向肿瘤细胞的亲水性外壳。本发明还涉及该核-壳型纳米药物颗粒的制备方法，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明将纳米包裹、化疗药物和表观遗传学药物三者相结合，具有改善药物递送靶向性、提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，以及抑制肿瘤细胞耐药性等优势。

Description

核-壳型纳米药物颗粒、其制备方法及应用

【技术领域】

本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体涉及一种靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，其制备方法及应用。

【背景技术】

传统的肿瘤治疗手段主要有手术切除、放疗及化疗。手术切除与放疗主要应用于切除或杀死肿瘤的原发病灶以及其它可见的肿瘤组织。由于肿瘤发展晚期获得的肿瘤细胞转移侵袭能力，使得肿瘤细胞的全身分布变得难以跟踪，极大地限制了手术切除与放疗方法对晚期癌症的治疗效果。

以化疗为基础的药物治疗方法具有无创、可全身治疗的特点，对扩散的肿瘤细胞同样具有杀伤效果，无疑是最具潜力的治疗手段。可是尽管近年来新的化疗药物不断出现，化疗方案不断改进，但临床化疗效果并不理想。虽然部分癌症目前通过药物治疗可以完全治愈，部分癌症通过药疗可延长生存期，但是大部分常见实体瘤如肺癌、肝癌、结肠癌等还无法通过药物得到有效治疗。肿瘤病人总生存率和生活质量改善还不理想。

化疗效果不佳的原因主要有两方面。其一在于肿瘤组织和肿瘤组织的特殊的生理结构和性质。肿瘤组织血管少，而肿瘤周围致密的纤维结构和肿瘤病灶内渗透压过高致使药物难以达到肿瘤中心区，而肿瘤的多药耐药性(Multdrugresistance，MDR)使得药物无法在肿瘤细胞内聚集，进而导致药疗失效，这也是导致化疗失败的主要障碍之一。另一方面在于化疗药物的作用机制，是对细胞生长进行抑制或直接杀死细胞，目前的化疗药物无法有效区分正常细胞与肿瘤细胞，因而具有较强的毒副作用，在杀死肿瘤细胞的同时也会对正常细胞与组织造成较强的损伤，给病人带来一些额外的痛苦。

因此肿瘤药物治疗的关键科学问题在于如何在化疗过程中有效克服这些肿瘤治疗领域的难题和障碍，将抗肿瘤药物准确有效地输送到肿瘤部位和转移病灶。

基于纳米包裹的药物传递技术相较传统的给药方式有众多优点，已成为一种新兴的有效治疗手段。例如纳米药物传递技术可通过EPR效应(enhancedpermeability and retention effect)实现药物在肿瘤组织中的特异聚集；纳米包裹可保护药物免除体内清除系统的作用，以延长药物的作用时间与效果；纳米包裹技术还可实现多重药物包裹，可同时包裹多种不同性质的治疗药物，包括用基因治疗药物如siRNA等，以实现综合治疗与降低耐药性等目的；纳米药物表面可根据需要进行多种修饰，可连接多种蛋白配体或小分子物质以实现纳米药物的特异性定位，并可经表面修饰在时间与空间上控制药物的释放过程。

因此，纳米颗粒介导的药物传输载体系统是一种极具潜力的癌症治疗手段，目前已有多个应用纳米技术包裹常规化疗药物的研究正在进行中，然而目前的研究仍不能很好的克服肿瘤细胞的耐药性以及常规化疗药物的毒副作用等重要问题。

现今人们已认识到，肿瘤细胞中由表观遗传学修饰引起的多个抑癌基因失活对肿瘤发生发展有重要作用。其中一些重要基因失活也直接导致了肿瘤细胞对常规药物的耐药性，例如DNA错配修复蛋白hMLH1与促凋亡蛋白CASP8。表观遗传学修饰引起的基因表达失活主要包括DNA甲基化引起的表达失活与组蛋白的去乙酰化引起的染色体重构，对应的具抗肿瘤潜力的药物包括DNA甲基化抑制剂(如5-氮-2′-脱氧胞苷)与抗组蛋白去乙酰化抑制剂(如TSA)。这类表观遗传学药物相比常规化疗药物具有更小的毒性，可同时激活多个抑癌基因的表达。

抗DNA甲基化药物与常规化疗药物联用后，可有效地逆转肿瘤耐药细胞对常规化疗药物的耐药性，例如抗甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷(以下亦可用Aza表示)可有效提高耐药细胞A2780/cp70对顺铂的敏感性。此外，肿瘤组织内的基因甲基化标志物在不同肿瘤与肿瘤的不同发展阶段的甲基化情况均有所不同，在癌症病人中检测甲基化标志物的甲基化状况还可应用于指导针对具体病人的个性化治疗方式，以及作为治疗后的预后恢复指标。

目前纳米包裹常规化疗药物方面有较多研究，但仍不能很好克服肿瘤细胞耐药性的问题与常规化疗药物尤其是在高剂量时对正常细胞的杀伤问题。化疗药物与表观遗传学药物联用后可大大提高肿瘤细胞对常规化疗药物的敏感性，但是将二者同时包载在纳米载体中形成纳米载药传递系统的研究还尚未有报道，如何将二种药物同时有效地运送到肿瘤组织仍有待解决。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是改善化疗药物的靶向性，减小细胞毒性；提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药性，以促进化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力。

为此，本发明一方面提供靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，包括：疏水性内核，所述疏水性内核包括疏水性多聚物，以及吸附在所述疏水性多聚物上的至少一种化疗药物和至少一种表观遗传学药物；包裹所述疏水性内核的单层脂类分子层，所述脂类分子具有面向所述疏水性内核的疏水部分和面向所述核-壳型纳米药物颗粒外部的亲水部分；以及靶向肿瘤细胞的亲水性外壳，所述亲水性外壳由具有脂端和与所述脂端共价交联的亲水端的两亲性大分子化合物构成，所述脂端可帮助所述两亲性大分子化合物插入所述单层脂类分子层，并且所述亲水端延伸在所述纳米药物颗粒外部。

所述疏水性多聚物可选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚已内酯等。

所述化疗药物可选自多柔比星、表柔比星、紫杉醇、去甲长春花碱、顺铂等。

所述表观遗传学药物可选自5-氮杂-胞苷、5-氮杂-2′-脱氧胞苷、RG108、曲古抑菌素A、付立诺他、帕比司他、N-羟基-3-(3-苯基氨基磺酰基苯基)丙烯酰胺、缩酚酸肽、丙戊酸、丁酸苯酯、AN-9、恩替诺特、Mocetinostat、4-乙酰氨基-N-(2′-氨基苯基)-苯甲酰胺等。

所述脂类分子可选自卵磷脂、脑磷脂。

所述两亲性大分子化合物的所述脂端可为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺，所述亲水端可为羧基修饰的聚乙二醇。

所述化疗药物和所述表观遗传学药物的质量之和可为所述疏水性聚合物质量的5％至50％。

所述化疗药物和所述表观遗传学药物的重量比率可为0.05∶1至2∶1。

本发明另一方面提供一种制备该靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒的方法，包括：于疏水溶剂中，将所述疏水性多聚物与所述化疗药物和所述表观遗传学药物混合溶解，得到疏水液；于亲水溶剂中，将所述脂类分子与所述两亲性大分子化合物混合溶解，得到亲水液；于50-80℃温浴亲水液，伴随温和搅拌添加疏水液至亲水液中，得到混合液；温浴条件下，混匀所述混合液，再温和搅拌，以得到所述核-壳型纳米药物颗粒的溶液。

该制备方法还可包括：以可截留纳米药物的滤膜，用重蒸水超滤离心所述核-壳型纳米药物颗粒的溶液，并用pH7.4的磷酸盐缓冲液回收所述核-壳型纳米药物颗粒。

本发明再一方面提供该核-壳型纳米药物颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果在于，通过将纳米包裹技术、化疗药物及表观遗传学药物三者相结合，实现了基于纳米药物包裹技术的、可降低常规化疗药物细胞毒性、提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性、抑制肿瘤细胞耐药性等多重目的的有效药物传递与治疗方法。该方案综合了纳米包裹技术、化疗药物与表观遗传学药物三者的优点，可以有效抑制肿瘤细胞的生长。

【附图说明】

图1为根据本发明一实施例的核-壳型纳米药物颗粒结构的示意图。

图2为根据本发明另一实施例，制备图1的核-壳型纳米药物颗粒的流程图。

图3图示根据本发明的核-壳型纳米药物颗粒与肿瘤细胞的作用。

图4图示根据本发明的核-壳型纳米药物颗粒在抑制肿瘤细胞生长中的作用。

图5图示根据本发明的核-壳型纳米药物颗粒在促进肿瘤细胞调亡中的作用。

图6图示根据本发明的核-壳型纳米药物颗粒在抑癌基因表达激活中的作用。

【具体实施方式】

本发明综合了纳米包裹技术、化疗药物与表观遗传学药物三者的优点，有效抑制肿瘤细胞的生长。利用纳米药物递送的EPR效应，提高药物对肿瘤细胞的靶向性，降低细胞毒性，并延长药物的作用时间和效果；通过表观遗传学药物与化疗药物的组合，激活抑癌基因的表达，提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性，逆转肿瘤细胞耐药性；从而利用三者之间的协同作用，更有效地抑制肿瘤细胞的生长，并杀死肿瘤细胞。

本发明的纳米药物颗粒为靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，其内核为疏水性的，由疏水性多聚物构成，该疏水性多聚物能够将化疗药物和表观遗传学药物同时吸附于其上。例如，本发明的疏水性多聚物可为乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚已内酯等，但不排除其他可用的疏水性聚合物。

内核中含有的药物可以为至少一种化疗药物与至少一种表观遗传学药物的组合，但不排除还包括其他药物，如siRNA、miRNA、抗癌基因等基因药物、或抗肿瘤辅助治疗药物，如昂丹司琼、亚叶酸钙等。

常用的化疗药物包括抗肿瘤抗生素类，如多柔比星、表柔比星；抗肿瘤动植物成分药类，如紫杉醇、去甲长春花碱等；抗代谢药，如5-氟尿嘧啶等；烷化剂，如环磷酰胺等；抗肿瘤激素类，如阿他美坦等；杂类，如顺铂等。

常用的表观遗传学药物主要包括DNA甲基化抑制剂，如5-氮杂-胞苷、5-氮杂-2′-脱氧胞苷、Zebularine、RG108、曲古抑菌素A、付立诺他、帕比司他、N-羟基-3-(3-苯基氨基磺酰基苯基)丙烯酰胺、缩酚酸肽、丙戊酸、丁酸苯酯、AN-9、恩替诺特、Mocetinostat、4-乙酰氨基N-(2′-氨基苯基)-苯甲酰胺(N-Acetyldinaline)等。表观遗传学药物可以激活抑癌基因的表达，激活对肿瘤细胞的抑癌活性，以及抑制肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，因此其与化疗药物同时存在时可大大提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤。

包裹疏水性内核的为一单层脂类分子，该脂类分子可为卵磷脂(大豆磷脂酰胆碱)、脑磷脂，或是其他可与多聚物内核相互作用形成脂类单分子层的脂类分子。脂类分子的疏水部分面向疏水性内核，并将疏水性内核包裹起来；其亲水部分则与水相环境相互作用，以形成稳定的纳米药物颗粒。

核-壳型纳米药物颗粒外壳由两亲性大分子化合物构成，用于提高纳米药物颗粒的水相稳定性，保护纳米药物颗粒在体内的作用时间，并可以化学修饰以提供纳米药物的靶向性等功能。两亲性大分子化合物的亲水端靶向肿瘤细胞，其脂端则可帮助将分子插入单层脂类分子层，亲水端与脂端共价交联，靶向肿瘤细胞。例如，两亲性大分子可为DSPE-PEG2000-COOH，其脂端为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，其亲水端为羧基修饰的聚乙二醇2000(PEG2000-COOH)。两亲性大分子化合物的脂端部分和亲水端部分可进一步修饰，如用叶酸、或可特异性结合肿瘤表面受体的配体分子修饰，以提高对肿瘤细胞的靶向性。

本发明的核-壳型纳米药物颗粒中，化疗药物和表观遗传学药物的各自的量依多聚物的药物结合效率，以及治疗需要的药物浓度来决定。通常，化疗药物和表观遗传学药物的重量比率可为0.05∶1至2∶1。它们的总量可为所述疏水性聚合物质量的5％至50％，例如可为10％。

脂类分子、两亲性大分子的摩尔比率可根据具体的分子、药物、多聚物的种类，以及所需的纳米颗粒性质来调整，通常可在6∶1至6∶5的范围，例如可为6∶4。

图1所示为根据本发明一实施例的核-壳型纳米药物颗粒的结构示意图。从图中可见，该核-壳型纳米药物颗粒的内核部分为PLGA聚合物，以及化疗药物多柔比星、表观遗传学药物5-氮-2'-脱氧胞苷。多柔比星(DOX)和5-氮-2'-脱氧胞苷(Aza)吸附在PLGA聚合物上，形成疏水性内核。包覆内核的是单层卵磷脂分子层，卵磷脂的疏水部分包裹内核，形成纳米颗粒；卵磷脂的亲水部分则处于纳米颗粒外层，促使纳米颗粒得以稳定形成。在卵磷脂层外部的是亲水性外壳，其由两亲性大分子(DSPE-PEG2000-COOH)构成，脂端(DSPE，二硬酯酰磷脂酰乙醇胺)因其疏水性，而可帮助将PEG部分插入到卵磷脂单分子层的疏水部分中，亲水端(PEG2000-COOH，羧基修饰的聚乙二醇2000)延伸在纳米药物颗粒之外。羧基部分的亲水性有助于进一步提高纳米药物颗粒的水相稳定性，并促使纳米药物颗粒靶向于肿瘤细胞。

本发明还提供制备该核-壳型纳米药物颗粒的方法，如图2所示，主要包括以下步骤：

首先，制备疏水液I。疏水液I中包含混合在疏水溶剂(如乙腈)中的疏水性多聚物、至少一种化疗药物，以及至少一种表观遗传学药物，即用于形成核-壳型纳米药物颗粒内核部分的组分。药物的加入顺序没有限制。可通过搅拌、震荡、超声等方式来帮助均匀混合。

其次，制备亲水液II。亲水液II中包含溶解在亲水溶剂(如乙醇或各浓度的乙醇水溶液，优选为4％乙醇水溶液)中的脂类分子和两亲性大分子化合物，即用于形成核-壳型纳米药物颗粒的脂类单分子层及亲水性外壳部分的组分。可通过搅拌、震荡、超声等方式来促进溶解。

然后，在温浴环境中，伴随温和搅拌，将疏水液I添加到亲水液II中，以形成混合液。温浴温度可在50-80℃，优选为65℃。添加过程温和进行，可逐滴添加。温浴的作用是提供合适的溶剂挥发条件，促进多聚物与脂类相互作用。

接着，继续在温浴条件下，混匀混合液，促进疏水液I与亲水液II的混合作用，以使吸附有药物的疏水性聚合物能够被亲水液中的脂类分子包裹。可采用多种方法来实现混匀，如剧烈震荡、搅拌、超声等。之后，温和搅拌一段时间，使得在溶液中形成稳定的纳米药物颗粒。

形成在溶液中的纳米药物颗粒可以进一步纯化和浓缩。以可截留纳米药物的滤膜，例如通过在分子量截流的超滤离心管中用重蒸水洗涤，并离心，再用pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液回收该核-壳型纳米药物颗粒。截留的分子量根据所需获得的纳米药物粒径来选定，例如可为10kD，或其他分子量。超滤离心的目的是去除未被包裹的各种小分子与聚合物分子。

在检测本发明的核-壳型纳米药物颗粒时，可用90％DMSO将其溶解，以检测所包裹药物的浓度。同时也可根据需要检测纳米颗粒的其它物理化学性质，如平均粒径，表面电荷等。

实施例

原料与试剂：

乳酸-羟基乙酸共聚物：Sigma-Aldrich；多柔比星：Jinhe Bio-Technology Co.Ltd；5-氮-2′-脱氧胞苷：Sigma-Aldrich；卵磷脂：Avanti；DSPE-PEG-COOH：Avanti；乙腈；乙醇；重蒸水；PBS缓冲液；DMSO；培养基：1640(Hyclone)；Hoechst染料：Sigma-A1drich，1：1000稀释；Dio荧光染料：Life Technologies；MTS(3-(4，5一二甲基噻唑-2)-5-(3-羧基-甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐)：Promega；Annexin V FITC凋亡检测试剂盒：BD Pharmingen；碘化丙啶：Sigma-Aldrich；PCR引物于Invitrogen合成；PCR反应用Taq Gold：AppliedBiosystems；逆转录(RT)试剂盒：Applied Biosystems；实验中所用细胞系均来自ATCC细胞库。

制备核-壳型纳米药物颗粒的制备

实施例1-包裹DOX与Aza的纳米药物颗粒的制备

制备疏水液I：将包含2mg/ml PLGA的乙腈溶液与多柔比星(DOX)、5-氮-2’-脱氧胞苷(Aza)相混合，DOX与Aza的质量之和为PLGA质量的10％，DOX与Aza的比例O.2∶1，。

制备亲水液II：将分别包含1mg/ml卵磷脂与包含25mg/mlDSPE-PEG2000-C00H的水溶液按卵磷脂：DSPE-PEG2000-COOH摩尔比6:4混合，并稀释于4％的乙醇溶液中，卵磷脂与DSPE-PEG2000-COOH的总质量为PLGA质量的20％。

制备混合液：将亲水液II在65℃温浴3分钟后，于温和搅拌下逐滴加入带有药物的PLGA疏水液I，混合完成后剧烈振荡3分钟，再于65℃混合搅拌4小时，得包裹药物的纳米颗粒的溶液。

纯化：将制备所得的纳米药物颗粒溶液在分子量截流10 kD的超滤离心管中用重蒸水洗涤3次，离心15分钟。用pH 7.4 PBS溶液回收纳米颗粒。

对照实施例A-包裹DOX的纳米药物颗粒的制备

制备方法与实施例1类似，区别在于疏水液I中仅使用多聚物总质量10％的DOX，而不使用Aza。

对照实施例B-包裹Aza的纳米药物颗粒的制备

制备方法与实施例1类似，区别在于疏水液I中仅使用多聚物总质量10％的Aza，而不使用DOX。

纳米药物颗粒的表征

1、包裹药物的浓度

以90％DMSO分别溶解包裹DOX、Aza、DOX+Aza的纳米药物颗粒(NPs+DOX、NPs+Aza、NPs+DOX+Aza)后，使用荧光光谱仪在480nm处检测DOX的吸收峰值，用紫外光谱仪在260nm处检测Aza的吸收峰值，在与DOX或Aza标准浓度样本的吸收标准曲线对照后可得出所包裹的药物浓度。

三种包裹方式的包裹效率分别为NPs+Aza+Dox：20-40％，NPs+Aza：20-40％，NPs+DOX：20-40％。

2、平均粒径

表征方法：所得纳米药物用Zeta Pals instrument(Brookhaven，USA)检测颗粒粒径分布。

3、表面电荷

表征方法：所得纳米药物用DelsaTM Nano C(Beckman Instruments，USA)检测颗粒表面电势分布。

以上表征结果示于下表中。

纳米药物(NPs)	平均粒径	表面电势
			NPs	93.6±24.5nm	-34.10mV
NPs+Aza	91.3±25nm	-28.65mV
			NPs+Dox	104.4±27.6nm	-32.78mV
NPs+Aza+Dox	80.7±20.1nm	-34.07mV

数据表明所得纳米药物粒径分布在80-105nm间，具典型纳米颗粒特征(粒径分布处于30-300nm颗粒可称为纳米颗粒)。这样范围的表面电势有助于提高纳米药物在水溶液中的稳定性，并且可减小由电荷引起的对细胞额外杀伤作用。因此，根据纳米药物基础物化性质检测，本发明中制备的核-壳型纳米药物颗粒具备合适的粒径及适用于细胞处理的表面电势。

体外肿瘤细胞生长实验

使用本发明的实施例1以及对照实施例A制备的纳米药物颗粒进行体外细胞实验，以阐述纳米药物颗粒与肿瘤细胞的作用。

1、荧光显微镜观察：

将制备的纳米药物NPs+DOX、NPs+DOX+Aza分别加入体外用1640(Hyclone)完全培养基培养中的乳腺癌细胞系MB231中。MB231细胞以2×105细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时后加入各纳米药物颗粒。

将荧光染料Dio(在制备时将Dio加入亲水液II中，Dio会随机整合于单层脂类分子层中)整合于带纳米药物颗粒的单层脂类分子层，用于当与肿瘤细胞相互作用时，指示纳米药物颗粒的位置。得到NPs-DOX、NPs-Aza-DOX-Dio。

药物作用浓度为DOX1μg/ml，Aza5μM，孵育2小时，PBS洗两次去除未被细胞吸收的纳米药物颗粒，细胞用4％PFA(多聚甲醛)固定半小时后用PBS洗3次，再加入Hoechst(Sigma-Aldrich，1∶1000稀释)染料染细胞核10分钟，荧光显微镜下观察。

结果示于图3中，图中A1-A4所示为NPs-DOX的荧光图像；B1-B4为NPs-Aza-DOX-Dio的荧光图像。

其中A1和B1分别为：用蓝色荧光检测Hoechst染色的细胞核；A2和B2分别为：用红色荧光检测DOX的荧光；A3和B3为用绿色荧光检测Dio染料的荧光；A4和B4为三种荧光图像的整合。

可见，MB231细胞与包裹DOX的纳米药物颗粒相作用2小时后，DOX可进入到细胞中，MB231与同时包裹Aza、DOX的纳米药物颗粒相作用2小时后，DOX与Dio的荧光均定位于细胞内，DOX与Dio的荧光在细胞内共定位。这些结果证明，携带化疗药物与表观遗传学药物的纳米药物可有效地被细胞吞噬，以将药物输送入细胞中。即，本发明的纳米颗粒联合包裹化疗药物与表观遗传学药物可有效进入肿瘤细胞。

2、MB231细胞生长状态检测：

MB231以2×103细胞/孔的密度接种于96孔板上，培养基中分别加入DOX、Aza、DOX+Aza、NPs+DOX、NPs+Aza、NPs+DOX+Aza(DOX浓度1μg/ml，Aza浓度为5μM)，以PBS溶液作为无药物处理空白对照，每24小时用MTS法在490nm检测细胞活性。

结果示于图4中。从图中可见，纳米包裹可大大降低化疗药物的细胞毒性(NPs+DOX与DOX比较)；单独包裹表观遗传学药物时对肿瘤细胞的生长可不必具有明显的抑制作用(NPs与NPs+Aza比较)；但当同时包裹表观遗传学药物与化疗药物时，表观遗传学药物时可大大提高化疗药物对肿瘤细胞生长的抑制作用(NPs+Aza+DOX，与NPs-DOX比较)。这说明根据本发明的核-壳型纳米药物颗粒中，纳米包裹、化疗药物与表观遗传学药物，三者之间存在明显的协同作用，协同作用可显著提高对肿瘤细胞生长的抑制作用。

体外肿瘤细胞凋亡实验

将纳米药物颗粒(NPs、NPs+DOX、NPs+Aza、NPs+DOX+Aza)加入体外用1640(Hyclone)完全培养基培养中的乳腺癌细胞系HONE1中，HONE1细胞以1×10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时后加入纳米药物(DOX0.1μg/ml，Aza5μM)，继续培养3天收集细胞，用Annexin V FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡状态。

结果示于图5中，图中横坐标为Annexin V FITC标记的荧光强度，为细胞凋亡的主要指标；纵坐标为PI染色(碘化丙啶)的荧光强度，PI只能染上死细胞的细胞核，因此可作为凋亡的辅助指标，图5中的十字线分割每个小图为4个区域，其中右上区为晚期凋亡细胞，右下为早期凋亡细胞，二者合计为总凋亡细胞数，以百分比示例于每小图的右上。

纳米药物同时包裹表观遗传学药物与化疗药物时可大大促进肿瘤细胞的凋亡。培养的HONE1细胞中分别加入不带药物的PBS对照、不带药物的纳米颗粒对照(NPs)、带表观遗传学药物Aza的纳米药物、带化疗药物DOX的纳米药物、与同时带Aza与DOX的纳米药物，药物作用3天后收集细胞后用AnnexinV凋亡试剂盒检测细胞的凋亡状况(以百分比标记于每个小图的右上角)，结果表明Aza与DOX同时存在时可大大促进肿瘤细胞的凋亡过程。

可见，与不加药的PBS对照、不带药的纳米颗粒(NPs)，及只带单种药物的纳米药物(NPs+Aza与NPs+DOX)相比较携带两种药物的纳米药物(NPs+Aza+DOX)对细胞凋亡的促进作用大大提高，证明纳米技术同时包裹化疗药物与表观遗传学药物对肿瘤细胞有有效杀伤作用。

抑癌基因表达激活实验

在所述培养细胞中添加不带药的纳米颗粒对照(NPs)、自由形式存在的Aza、或带Aza的纳米药物(NPs+Aza)，Aza作用浓度为5μM，加药培养3天后收集的细胞提取总RNA，经逆转录反应后，以抑癌基因DLC1为例，检测抑癌基因在肿瘤细胞中的表达变化。

结果示于图6中，以半定量RT-PCR法检测抑癌基因在纳米药物处理后的表达变化情况，条带强弱对应所检测基因表达的强弱，DLC1为检测的抑癌基因，GAPDH为实验对照，在不同样本中GAPDH应表达一致。

纳米颗粒包裹表观遗传学药物可激活抑癌基因表达。培养的HONE1细胞中分别加入不带药物的纳米颗粒对照(NPs)、自由状态的表观遗传学药物Aza、与带表观遗传学药物Aza的纳米药物处理3天后收集细胞，提取RNA，经逆转录反应后检测抑癌基因DLC1的表达。结果表明自由状态下的Aza与纳米药物包裹的Aza均可有效地恢复抑癌基因DLC1在肿瘤细胞HONE1中的表达。当Aza存在时(Aza或NPs+Aza)可促进肿瘤细胞重新表达被表观遗传学修饰抑制的抑癌基因。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (11)

1.一种靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒，包括：

疏水性内核，所述疏水性内核包括疏水性多聚物，以及吸附在所述疏水性多聚物上的至少一种化疗药物和至少一种表观遗传学药物；

包裹所述疏水性内核的单层脂类分子层，所述脂类分子具有面向所述疏水性内核的疏水部分和面向所述核-壳型纳米药物颗粒外部的亲水部分；以及

靶向肿瘤细胞的亲水性外壳，所述亲水性外壳由具有脂端和与所述脂端共价交联的亲水端的两亲性大分子化合物构成，所述脂端可帮助所述两亲性大分子化合物插入所述单层脂类分子层，并且所述亲水端延伸在所述纳米药物颗粒外部。

2.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述疏水性多聚物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚已内酯。

3.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述化疗药物选自多柔比星、表柔比星、紫杉醇、去甲长春花碱、顺铂。

4.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述表观遗传学药物选自5-氮杂-胞苷、5-氮杂-2′-脱氧胞苷、Zebularine、RG108、曲古抑菌素A、付立诺他、帕比司他、N-羟基-3-(3-苯基氨基磺酰基苯基)丙烯酰胺、缩酚酸肽、丙戊酸、丁酸苯酯、AN-9、恩替诺特、Mocetinostat、4-乙酰氨基-N-(2′-氨基苯基)-苯甲酰胺。

5.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述脂类分子选自卵磷脂、脑磷脂。

6.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述两亲性大分子化合物的所述脂端为二硬酯酰磷脂酰乙醇胺，所述亲水端为羧基修饰的聚乙二醇。

7.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述化疗药物和所述表观遗传学药物的质量之和为所述疏水性聚合物质量的5％至50％。

8.根据权利要求1所述的核-壳型纳米药物颗粒，其中，所述化疗药物和所述表观遗传学药物的重量比率为0.05∶1至2∶1。

9.制备权利要求1至8中任一项所述的靶向肿瘤细胞的核-壳型纳米药物颗粒的方法，包括：

于疏水溶剂中，将所述疏水性多聚物与所述化疗药物和所述表观遗传学药物混合溶解，得到疏水液；

于亲水溶剂中，将所述脂类分子与所述两亲性大分子化合物混合溶解，得到亲水液；

于50-80℃温浴亲水液，伴随温和搅拌添加疏水液至亲水液中，得到混合液；

温浴条件下，混匀所述混合液，再温和搅拌，以得到所述核-壳型纳米药物颗粒的溶液。

10.根据权利要求9所述的制备方法，还包括：

以可截留纳米药物的滤膜，用重蒸水超滤离心所述核-壳型纳米药物颗粒的溶液，并用pH7.4的磷酸盐缓冲液回收所述核-壳型纳米药物颗粒。

11.权利要求1至8中任一项所述的核-壳型纳米药物颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

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