CN103097891B - 疾病重症度的检查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及实时地测定疾病重症度的方法，其课题在于提供能够比现有的APACHEII、SOFA评分更详细地判断疾病重症度的检查方法。作为解决手段，通过准确地测定试样中的ATP量，能够建立由ATP量准确且快速地类推“生物生存所需的细胞内能量状态”的方法，进而能够判定疾病重症度。此外，本发明还提供一种新的生物标志物即ATP-乳酸盐能量风险评分(ATP-Lactate Energy Risk Score，A-LES)值，其以ATP浓度作为指标对因疾病的重症化伴随的体内代谢平衡的崩溃而蓄积在试样中的乳酸量进行再评价(具体而言，通过乳酸值mM/ATP浓度mM进行换算)，由此能够判定疾病重症度。另外，本发明还提供一种新的生物标志物即ATP-酮体能量风险评分(ATP-Ketone Energy RiskScore，A-KES)值，其以ATP浓度作为指标对试样中的酮体量进行再评价(具体而言，通过酮体值mM/ATP浓度mM进行换算)，由此能够判定疾病重症度。

Description

疾病重症度的检查方法
技术领域
本发明涉及通过测定试样中含有的三磷酸腺苷(以下称为“ATP”)量来检查疾病重症度的方法。此外，本发明还涉及通过测定试样中的ATP量和作为能量代谢中间代谢产物的乳酸或酮体的量来掌握能量产生状态从而检查疾病重症度的方法。
背景技术
ATP是所有生物用作生存所需的能量的化学物质(核苷酸)。因此，一直以来，为了判定生物试样中含有的微生物的有无而广泛应用ATP的测定。另外，由于ATP主要在细胞内细胞器的线粒体中产生，因此，以前曾经为了测定线粒体的功能而对ATP进行测定。但是，现有的ATP测定技术中没有能高效地提取出生物试样中含有的ATP的技术，因此，生物试样中的ATP浓度的相关信息缺乏准确性，难以使用该数值由ATP量的测定值准确地类推“生物生存所需的细胞内能量状态”。
本发明人建立了极为有效地提取试样中的ATP并准确测定细胞内、组织内的ATP浓度的划时代性的技术(专利文献1：WO2009/096429，核苷酸的提取方法)。通过本方法，能够准确地得到生物试样中的ATP浓度的相关信息。
另一方面，在判定“疾病重症度”的现有技术中，直到目前为止一直在使用根据1985年修改的APACHEII评分(非专利文献1：KnausWA,Draper EA,Wagner DP,Zimmerman JE:A severity of diseaseclassification system.Critical Care Medicine 13:818-829,1985)来判定住院患者的重症度的方法，但APACHEII评分并非实时评分，因此，需要替代该APACHEII评分的风险标志物和评价方法。APACHEII评分是使用急性生理学评分(包括12个项目：1.深部体温、2.平均动脉压、3.心率、4.呼吸次数、5.氧合能力、6.动脉血pH、7.血清Na浓度、8.血清K浓度、9.血清肌酐浓度、10.血细胞压积值、11.白细胞值、12.格拉斯哥昏迷指数)+年龄分数+慢性疾病状态的总分数进行评价的方法。此外，还提出了使用SOFA评分(非专利文献2：Vincent JL,MorenoR,Takala J,Willatts S,De Mendonca A,Bruining H,Reinhart CK,SuterPM,Thijs LG:The SOFA(Sepsis-related Organ Failure Assessment)scoreto describe organ dysfunction/failure.On behalf of the Working Group onSepsis-Related Problems of the European Society of Intensive CareMedicine.Intensive Care Medicine 7:707-710,1996)判定重要器官的损伤度的评价方法。SOFA评分通过急性生理学评分(1.呼吸功能、2.血小板数、3.胆红素值、4.血压、5.格拉斯哥昏迷指数、6.血清肌酐浓度或1天的尿量)的总分数来计算。但是，APACHEII评分、SOFA评分的测定项目多，并且像测定1天尿量这样需要花费时间来进行评价的汇总，因此并非实时标志物，需要建立替代上述评分的评价方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开小册子WO2009/096429号
非专利文献
非专利文献1：Critical Care Medicine 13:818-829,1985
非专利文献2：Intensive Care Medicine 7:707-710,1996
发明内容
发明所要解决的问题
本发明涉及评价疾病重症度的方法，其课题在于提供能够实时地判断疾病重症度的新的生物标志物及其判定基准而不是如上述APACHEII评分或SOFA评分那样将器官损伤度数值化而得到的生理学评分。
用于解决问题的手段
本发明人为了解决上述问题反复进行了深入研究，结果发现，利用本发明人的核苷酸提取方法(专利文献1)，能够准确地测定试样中的ATP量，从而能够建立由ATP量准确地类推“生物生存所需的细胞内能量状态”的方法，进而能够判定疾病重症度，此外还发现，通过将因重症化伴随的体内能量代谢的崩溃而蓄积在血液中的乳酸或酮体的量和血液的ATP浓度作为指标来进行评价(具体而言，通过乳酸浓度mM/ATP浓度mM进行换算和/或通过酮体浓度mM/ATP浓度mM进行换算)，能够实时地判定疾病重症度，从而完成了本发明。
即，本发明包括：[1]一种疾病重症度的检查方法，其特征在于，对试样中的三磷酸腺苷量进行测定；[2]如上述[1]所述的检查方法，其中，测定包括以下的步骤：1)为了测定试样中含有的三磷酸腺苷量，用含有酚化合物的溶液处理试样来提取试样中的三磷酸腺苷；和2)使用三磷酸腺苷测定用试剂对提取出的三磷酸腺苷量进行测定；[3]如上述[2]所述的检查方法，其中，含有酚化合物的溶液为pH4~10的溶液；[4]如上述[2]或[3]所述的检查方法，其中，含有酚化合物的溶液为还含有蛋白变性剂的溶液；[5]如上述[2]~[4]中任一项所述的检查方法，其中，酚化合物为苯酚。
另外，本发明还包括：[6]如上述[1]~[5]中任一项所述的检查方法，其中，试样为由受试者获取的血液，在该血液中的三磷酸腺苷量低于正常值的下限即0.52mM时，判断为异常；[7]如上述[6]所述的检查方法，其中，在血液中的三磷酸腺苷量低于正常值的下限即0.52mM且为0.3mM以上时，将疾病重症度判断为轻度异常；在血液中的三磷酸腺苷量低于0.3mM时，将疾病重症度判断为重度异常；在血液中的三磷酸腺苷量在1天之内没有恢复至0.3mM以上时，将疾病重症度判断为致死的风险高；[8]如上述[1]~[7]中任一项所述的检查方法，其特征在于，进一步对试样中的乳酸量进行测定；[9]如上述[8]所述的检查方法，其中，将试样中的乳酸量(L；mM)相对于三磷酸腺苷量(A；mM)的换算值(A-LES值)即L/A作为疾病重症度指标；[10]如上述[8]或[9]所述的检查方法，其中，试样为由受试者获取的血液，在该血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即3.7时，判断为异常；[11]如上述[10]所述的检查方法，其中，在血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即3.7且为8.0以下时，将疾病重症度判断为轻度异常；在血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过8.0且为25.0以下时，将疾病重症度判断为重度异常；在血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值为超过25.0的高值且持续6小时以上时，将疾病重症度判断为致死的重度异常。
另外，本发明还包括：[12]如上述[1]~[11]中任一项所述的检查方法，其特征在于，进一步对试样中的酮体量进行测定；[13]如上述[12]所述的检查方法，其中，将试样中的酮体量(K；mM)相对于三磷酸腺苷量(A；mM)的换算值(A-KES)即K/A作为疾病重症度指标；[14]如上述[12]或[13]所述的检查方法，其中，试样为由受试者获取的血液，在该血液中的酮体量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即0.25时，判断为异常。
发明效果
根据本发明的检查方法，通过由ATP量准确地类推“生物生存所需的细胞内能量状态”，能够对疾病重症度进行评价和判定。另外，能够将由于所有生命体作为能源摄取的糖、脂质、氨基酸未顺利地产生ATP的能量代谢崩溃状态或ATP产生跟不上过量的能量消耗的代谢崩溃状态等而蓄积在体内的能量代谢中间代谢产物即乳酸或酮体的浓度与ATP浓度相关联来评价和判定疾病重症度。根据本发明的检查方法，能够对以前通过各个测定值单独的信息未能获知的“疾病重症度”以轻度异常状态、重度异常状态、致死的危险性极高的状态等进行评价和判定。
附图说明
图1是表示健康人来源的试样中的ATP值、年龄、性别分布的图(参考例1)。
图2是表示健康人来源的试样中的乳酸值、年龄、性别分布的图(参考例2)。
图3是表示由健康人来源的试样中的ATP量和乳酸量换算得到的A-LES值与其年龄、性别分布的图(参考例3)。
图4A是表示以试样中的ATP值作为指标进行监测时各种患者在集中治疗室内的重症度的经时变化的图(实施例1)。
图4B是表示以A-LES(乳酸值/ATP值)值作为指标进行监测时各种患者在集中治疗室内的重症度的经时变化的图(实施例1)。
图5是表示集中治疗室管理下的患者在入室时和出室时(或死亡时)的APACHEII评分与A-LES值的变迁比较的图(实施例2)。
图6是表示健康小鼠和流感感染重症化小鼠血液中的ATP值、乳酸值、A-LES值、酮体(3-羟基丁酸)值、A-KES值的图(实施例3)。
具体实施方式
作为本发明的疾病重症度的检查方法，只要是对试样中的ATP量进行测定的方法则没有特别限制，也可以测定乳酸、酮体等能量代谢中间代谢产物的量并使用能量代谢中间代谢产物的量与ATP量的比值进行评价和判定。另外，本发明中，“疾病重症度”是指在ATP量的检查时间点的疾病的严重程度，在本说明书中，与“疾病的重症化程度”、“重症化程度”等无区别地使用。通过掌握疾病的重症度，能够了解检查时间点的疾病状态而作为预测以后的病情变迁的指标，并且能够用于治疗方法的选择等治疗方针的确定。即，在疾病重症度为轻度异常的情况下，可观察到治疗效果或者预测到以后病情减轻。另外，在疾病重症度为重度异常的情况下，观察不到治疗效果或者预测到以后病情恶化，最差的情况下还暗示出致死的可能性。
另外，“疾病重症度”中的疾病没有特别限制，可以列举：呼吸系统、血液和循环系统、消化系统、脑神经系统、肾泌尿系统、内分泌系统、感觉系统、生殖系统、骨骼系统和肌肉的疾病、多器官衰竭、感染症等。这些疾病可以是遗传性疾病或生活习惯病等内因性疾病，也可以是由病原菌或病毒的感染引起的疾病，可以优选例示：冠状动脉疾病、感染性心内膜炎、败血症、肺栓塞症、暴发性丙型肝炎、流感肺炎、流感感染症等。
本发明中，试样只要是从生物体采集的组织、体液则没有特别限制，可以优选列举能够成为本发明的检查对象的人(受试者)和除人以外的脊椎动物(受试动物)来源的血液试样。作为受试动物，可以列举：哺乳类、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类，优选猴、马、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等哺乳类动物，其中可以优选例示小鼠。作为血液试样，可以是动脉(Artery：A)血、肺动脉(Pulmonary Artery：PA)血、静脉(Vein：V)血、中心静脉(Central Vein：CV)血、末梢静脉血中的任意一种。通过以下所示的ATP量的测定方法能够确认：在同一受试者中，血液中的ATP量不随血液采集部位的不同而变化(参考表3)。另外，只要不妨碍ATP量和乳酸量或酮体量的测定，也可以适当添加抗凝剂、防腐剂等或者将血液中的特定成分除去或凝结而制成血液试样。
本发明检查方法中的试样中的ATP量的测定方法没有特别限制，利用专利文献1中记载的测定方法能够准确地进行测定，因此优选。特别优选的是，在采血后迅速用含有酚化合物的溶液处理试样来提取试样中的ATP，并对该提取出的ATP量进行测定。
具体而言，利用包括以下步骤的方法来进行。
1)为了测定试样中含有的ATP量，用含有酚化合物的溶液处理试样来提取试样中的ATP；和
2)使用ATP测定用试剂对提取出的ATP量进行测定。
本发明的检查方法中的、提取试样中含有的ATP的步骤中使用的酚化合物只要是含有酚基的化合物且能够提取出试样中的ATP的化合物即可，没有特别限定。特别优选的是苯酚。另外，含有酚化合物的溶液中可以含有蛋白变性剂，作为该蛋白变性剂，可以使用公知的蛋白变性剂，特别是可以优选例示能够在现有的ATP提取方法中使用的蛋白变性剂，例如异硫氰酸胍、高氯酸、TCA、蛋白激酶K等。但是，在试样中含有大量除ATP分解酶以外的蛋白质的情况下，通过添加蛋白变性剂，有时会使蛋白质变性而凝聚。在这种情况下，作为测定对象物的ATP等的核酸有时会埋藏在因变性而凝聚的蛋白质中而难以提取，不能说能够进行准确的测定。另外，也可以将作为现有ATP提取方法的加热处理方法与本发明的核苷酸提取方法组合来进行处理，但在大量含有蛋白质的试样的情况下，有时同样也会使核酸混入因加热而变性的蛋白质中。因此，在不组合蛋白变性剂或加热处理的情况下用含有酚化合物的溶液进行处理有时能够最高效地提取ATP。
上述含有酚化合物的溶液的pH没有特别限定，为了以最高的灵敏度进行测定，优选调节至对于荧光素酶测定试剂等核酸测定试剂而言能够最高效地进行反应的pH。使用该含有酚化合物的溶液对试样进行处理时，无论用例如pH4~10等何种pH的溶液进行处理，均比现有提取方法更有效地提取ATP。例如，在使用荧光素酶试剂测定ATP的情况下，根据荧光素酶的特性，能够在约7~约9的pH下进行有效的测定，因此，优选使本发明的含有酚化合物的溶液的pH为约7~约9，更优选使pH为约8。上述的ATP提取步骤中使用的含有酚化合物的溶液可以用作从试样中提取ATP的试剂。
上述酚化合物的溶剂没有特别限定，可以使用例如TE(10mMTris-HCl pH8.0，1mM EDTA)。也可以根据需要进一步添加稳定剂。本发明的检查方法中的ATP量的测定中，可以根据测定目标对象物而选择适当的测定方法，可以包括公知的方法以及今后开发的所有测定方法。作为上述公知的方法，可以应用利用荧光素-荧光素酶发光反应的方法、利用ATP转化反应的方法等。作为利用荧光素-荧光素酶发光反应的ATP的测定方法，可以列举：对使含有荧光素和荧光素酶的发光试剂与靶ATP在金属离子(镁离子等)的存在下接触而生成的光的发光量进行测定的方法。例如，通过使用作为市售的ATP测定用试剂盒的XL-ATP试剂盒(株式会社アプロサイエンス公司制造)，能够特异性地且准确地测定ATP。
建立本发明的疾病重症度的检查方法时，需要掌握健康人来源的试样中的ATP量。因此，采集健康志愿者的末梢静脉血，通过上述ATP量的测定方法对血中的ATP量进行了测定，结果确认到在一大半健康人中，ATP以0.52-1.3mM的浓度存在。另外，还确认到血中ATP的值不因性别而存在显著差异(参考图1)。本发明中，试样中的ATP量的正常值可以设定为0.52-1.3mM，更详细而言，可以设定为0.52-1.21mM，并且可以将中值设定为0.72mM。另外，正常值的下限可以设定为0.52mM。
本发明的疾病重症度的检查方法中，具体而言，可以根据测得的试样中的ATP量通过以下的方法来评价重症度。对人而言，在试样中的ATP量低于正常值的下限即0.52mM时，可以判断为异常。此外，关于人的疾病重症度，在ATP量低于正常值的下限即0.52mM时，可以根据ATP量的值来判断(1)轻度异常、(2)重度异常。
人的ATP量与疾病重症度的关系可以通过以下基准来判断。
(1)低于0.52mM且为0.3mM以上时判断为轻度异常
(2)低于0.3mM时判断为重度异常。另外，在6-24小时、特别是24小时以内没有恢复至0.3mM以上时，致死的风险高。
本发明中的疾病重症度可以通过进一步测定试样中的作为能量代谢中间代谢产物的乳酸量或酮体量而更有效地根据能量代谢来检查疾病重症度。本发明中的“酮体”是指乙酰乙酸和3-羟基丁酸，不包括丙酮。因此，本发明中，酮体量是指乙酰乙酸和/或3-羟基丁酸的量。由于能够利用快速测定装置在数分钟以内进行测定，因此，常常使用3-羟基丁酸的量作为酮体量的指标。
试样中的乳酸量或酮体量的测定只要是能够准确地测定血中的乳酸量或酮体量的方法，则可以是公知的方法，也可以是今后开发的方法。例如，乳酸量的测定可以使用全自动血气测定装置(860COT，バイアルメディカル公司制造)或简易测定装置(ラクテ一ト·プロ，ARKRAY公司制造)等，酮体量的测定可以使用“总酮体カイノス”或“ケトダイアスティックス(シ一メンスメディカルソリュ一シヨンズ·ダイアグノスティクス株式会社制造)”等，可以分别按照制造商推荐的测定方法来测定。
建立本发明的疾病重症度的检查方法时，优选掌握健康人来源的试样中作为能量代谢中间代谢产物的乳酸量。因此，采集健康志愿者的末梢静脉血，通过上述乳酸量的测定方法对血中的乳酸量进行了测定，结果确认，在男性中显示为2.7mM以下的值，在女性中显示为1.65mM以下的值，在男性和女性中均为2.7mM以下的浓度(参考图2)。各年龄的中值如图所示。需要说明的是，0.8mM以下为测定器材(ラクテ一ト·プロ：ARKRAY公司制造)的检测限以下，用▽表示，并记载为0.8mM来进行计算。
通过使用上述乳酸量计算出相对于通过上述方法测定的ATP量的换算值(A-LES值)，能够以更准确的疾病重症度进行检查。A-LES值可以通过下式I来计算。这样计算而得到的值可以作为由能量代谢引起的疾病的重症度生物标志物(参考图3)。
(式I)
A-LES值=乳酸值(L)mM/ATP值(A)mM
与以ATP量作为基准的情况相比，利用A-LES值能够更细致且更准确地判定疾病重症度。根据A-LES值，可以判断(1)轻度异常、(2)重度异常、(3)致死的重度异常状态。
A-LES值与人的重症度的关系可以通过以下基准来判断。
(1)超过正常值的上限即3.7且为8.0以下时判断为轻度异常
(2)超过8.0且为25.0以下判断为重度异常
(3)超过25.0的高值持续6-24小时、特别是持续24小时以上时，判断为致死的重度异常。另外，对于受试动物，可以根据其种类适当设定基准来判断该A-LES值与重症度的关系。
本发明中的疾病重症度可以通过进一步测定试样中的作为能量代谢中间代谢产物的酮体量而更有效地根据能量代谢来检查疾病重症度。
通过使用上述酮体量计算出相对于通过上述方法测定的ATP量的换算值(A-KES值)，能够以更准确的疾病重症度进行检查。A-KES值可以通过下式II来计算。作为酮体量，可以使用乙酰乙酸和/或3-羟基丁酸的酮体的量，作为该酮体量，由于能够利用快速测定装置在数分钟以内进行测定，因此，优选使用3-羟基丁酸的量作为酮体量，并且常常使用3-羟基丁酸的量作为酮体量。这样计算而得到的值可以作为由能量代谢引起的疾病的重症度生物标志物(参考图6)。
(式II)
A-KES值=酮体值(K)mM/ATP值(A)mM
与以ATP量作为基准的情况相比，利用A-KES值能够更准确地判定疾病重症度。一般认为酮体量(乙酰乙酸值与3-羟基丁酸值的总和)的正常值为130微摩尔/升(0.13mM)以下(参考西ケ谷晴美等,医学检查,45,3,353(1996)；原纳优等,日本临床,48-增刊,323~333(1990))，并且认为血液中的ATP量低于0.52mM时为异常值，因此，可以将以乙酰乙酸值与3-羟基丁酸值的总和作为酮体量时的A-KES值达到0.13mM/0.52mM=0.25以上作为异常。因此，可以将A-KES值(乙酰乙酸值与3-羟基丁酸值的总和/ATP值)的正常值上限即0.25作为指标来判断人的疾病重症度状态。另外，在以3-羟基丁酸值作为酮体量的情况下，也可以同样地设定正常值上限来判断人的疾病重症度状态。需要说明的是，对于受试者或受试动物，可以分别适当设定基准来判断A-KES值与重症度的关系。
实施例
为了帮助理解本发明，以下示出参考例和实施例来具体地说明本发明，但本发明当然不受本实施例的限定。
(参考例1)健康人来源的试样中的ATP量、年龄、性别分布的研究
本参考例中，在建立本发明的疾病重症度的检查方法时，为了掌握健康人来源的试样中的ATP量，对20多岁至90多岁的68名男性、71名女性共计139名健康志愿者的末梢静脉血的ATP量和乳酸量进行了测定。
使用XL-ATP试剂盒(株式会社アプロサイエンス公司制造)，按照操作说明书从试样中提取ATP并测定ATP量。作为ATP提取用试剂，使用将本试剂盒附带的提取试剂A(TE饱和苯酚，成分：含69%苯酚，pH8.0)、提取试剂B(氯仿，成分：含99%氯仿)和无菌超纯水分别以3:5:5的比例混合而得到的试剂。具体而言，将0.1ml采集到的血液添加到ATP提取试剂(提取试剂A 0.3ml、提取试剂B 0.5ml、无菌超纯水0.5ml)中并混合，通过离心等分离成有机溶剂层和水层，然后，回收其上清(水层)，由此提取出血液中的ATP。
测定结果示于图1、表1和表2中。末梢静脉血的ATP值在男女差异方面几乎没有统计学上的显著差异，随着年龄增高，观察到ATP值有集中于低值0.5mM的倾向。中值在20多岁的男性中显示为0.82mM，在20多岁的女性中显示为0.63mM，在30多岁的男性中显示为0.68mM，在30多岁的女性中显示为0.78mM，在40多岁的男性中显示为0.78mM，在40多岁的女性中显示为0.62mM，在50多岁的男性中显示为0.66mM，在50多岁的女性中显示为0.51mM，在60多岁的男性中显示为0.52mM，在60多岁的女性中显示为0.46mM，在70岁以上的高龄男性中显示为0.46mM，在70岁以上的高龄女性中显示为0.45mM。
[表1]
[表2]
(参考例2)健康人来源的试样中的乳酸量、年龄、性别分布的研究
本参考例中，为了掌握健康人来源的试样中的乳酸量，对参考例1所示的共计139名健康志愿者的末梢静脉血的乳酸量进行了测定。乳酸量的测定中，使用全自动血气测定装置(860COT；バイアルメディカル公司)或简易测定装置(ラクテ一ト·プロ；ARKRAY公司)，按照制造商推荐的测定方法来测定。
表1和表2所示的健康人来源的试样中的乳酸量测定值(mM)与其年龄、性别分布示于图2中。共计139名健康志愿者的末梢静脉血的乳酸值在年龄差异、男女差异方面未观察到统计学上的显著差异。中值在20多岁的男性中显示为1.30mM，在20多岁的女性中显示为0.97mM，在30多岁的男性中显示为1.30mM，在30多岁的女性中显示为1.20mM，在40多岁的男性中显示为1.50mM，在40多岁的女性中显示为1.04mM，在50多岁的男性中显示为1.60mM，在50多岁的女性中显示为0.85mM，在60多岁的男性中显示为1.00mM，在60多岁的女性中显示为0.80mM，在70岁以上的高龄男性中显示为1.00mM，在70岁以上的高龄女性中显示为1.00mM。
(参考例3)由健康人来源的试样中的ATP量和乳酸量换算得到的A-LES值与其年龄、性别分布的研究
本实施例中，目的在于基于参考例1和参考例2中得到的健康人来源的试样中的ATP量的测定值和乳酸量的测定值来掌握健康人的A-LES值。
A-LES值根据下式I来计算。
(式I)
A-LES值=乳酸量(L)mM/ATP量(a)mM
表1和表2所示的健康人来源的试样中的A-LES值与其年龄、性别分布示于图3中。20多岁至90多岁的68名男性、71名女性共计139名健康志愿者的A-LES值在年龄差异、男女差异方面未观察到统计学上的显著差异。中值在20多岁的男性中显示为1.99，在20多岁的女性中显示为1.24，在30多岁的男性中显示为1.78，在30多岁的女性中显示为1.64，在40多岁的男性中显示为1.60，在40多岁的女性中显示为1.70，在50多岁的男性中显示为2.00，在50多岁的女性中显示为1.78以下，在60多岁的男性中显示为1.97，在60多岁的女性中显示为1.76以下，在70岁以上的高龄男性中显示为2.03，在70岁以上的高龄女性中显示为1.90。需要说明的是，▽是乳酸值为检测限(0.8mM)以下的样本，因此，表示A-LES值为该值以下。
(参考例4)不同采血部位的血液ATP量的测定值的研究
本参考例中，目的在于确认以采血部位不同的血液作为试样时，各试样是否存在变动。对出于医疗检查目的(氧分压、二氧化碳分压测定等)从同一住院患者的多个部位同时采血而得到的试样，测定各试样的ATP量和乳酸量，并对它们的测定值进行比较研究。ATP量和乳酸量的测定通过与参考例1和参考例3相同的方法进行。
表3中示出了分别从动脉(Artery：A)、肺动脉(Pulmonary Artery：PA)、中心静脉(Central Vein：CV)采血而得到的试样的ATP量。对于中心静脉(CV)血和静脉(V)血而言，通常不对两者进行区分，采用任意一种即可。因此，为了减轻患者负担，不必从除中心静脉(CV)以外的静脉(V)采血。结果，如测定值所示，在从动脉(A)、肺动脉(PA)、中心静脉(CV)采血而得到的试样中含有的ATP量之间未观察到显著差异。由此确定，可以使用在动脉(A)、肺动脉(PA)、中心静脉(CV)、静脉(V)中任意一个采血部位采血而得到的试样的ATP量的测定值来判定“生命的危险状态”。
需要说明的是，表3中，除了ATP量(mM)以外，还示出了乳酸量(mM)和A-LES值：换算值。
[表3]
(实施例1)进入集中治疗室的患者的血中ATP量、乳酸量和A-LES值
本实施例中，在得到德岛大学伦理委员会的批准后，以急救集中治疗室中管理的43名患者为对象，对采集到的静脉末梢血来源的试样中的ATP量和乳酸量进行测定，并使用由所得结果换算得到的A-LES值对患者的重症度进行评价。ATP量和乳酸量的测定通过与参考例1和参考例3中记载的方法相同的方法进行。
将A-LES值和作为现有重症度判定基准的APACHEII评分示于表4~8中。在急救集中治疗室的管理中死亡的患者在43名患者中有P17、P18、P43、P49、P50、P54、P60、P63这8例。
[表4]
A组(轻症→减轻)
[表5]
[表6]
B组(重症→减轻)
[表7]
[表8]
C组(重症→死亡)
对于43名患者中作为A组(从轻症到减轻的组)的P16(流感肺炎)、P27(冠状动脉疾病)、P34(感染性心内膜炎)这3名患者、作为B组(从重症到减轻的组)的P20(败血症)、P32(感染性心内膜炎)这2名患者、作为C组(从重症到死亡的组)的P17(肺栓塞症)、P18(暴发性丙型肝炎)这2名患者，将ATP量的时间变迁示于图4A中。以ATP量作为指标进行监测时，在趋向减轻的病例中，ATP量逐渐增加，最终恢复至正常值(0.52mM以上)而离开急救集中治疗室。
如图4A所示，ATP量低于0.3mM时判断为重度异常，在随着治疗观察到ATP量的增加的情况下，观察到全身状态的改善从而使病情减轻。相反地，ATP量持续6-24小时以上在低于0.3mM的水平变迁时，致死的风险高。需要说明的是，虽然P32的患者在入室时ATP量显示为轻度异常值，但根据以下所示的A-LES值和全身状态而将其分类为重症患者。
将以A-LES(Lac/ATP)值代替ATP量作为指标进行监测的情况示于图4B中。以A-LES值作为指标时，与单独以ATP量作为指标时相比，将作为能量代谢中间代谢产物的乳酸量也纳入考虑的因素，由此，能够以更宽的范围对重症度进行评分，从而更准确地反映疾病重症度。
A组(从轻症到减轻的组)的一大半患者的A-LES值在正常范围内或者未超过8.0，在出室时全部病例均显示为正常范围即3.7以下。B组(从重症到减轻的组)患者在入室最初的A-LES值显示为超过8.0且为25.0以下的重症范围值，并且因疾病的不同而经历各种病程，但减轻的病例在出室时全部病例均显示为正常范围即3.7以下。另外，作为A-LES值对治疗方法的评价起作用的病例，示出了P20的败血症患者的病例。该患者为如下病例：在入室时对处方的抗生素发生暂时性反应而使A-LES值降低，但之后A-LES值持续上升而恶化，在入室第4天更换为根据细菌的敏感性检查而选择的抗生素，结果A-LES值急速降低，从而趋向改善而出室，该病例是显示出A-LES值有益于治疗药剂、治疗方法的效果的监测的病例。另一方面，对于C组的重症患者而言，在恶化而死亡的病例中，一大半患者的A-LES值从入室时开始显示为超过25.0的高值，虽然进行了治疗，但A-LES值在6-24小时以内也未改善至25.0以下。即确认到，只有A-LES值落入正常范围内的患者才能离开集中治疗室。
(实施例2)进入急救集中治疗室时和离开急救集中治疗室时(或死亡时)的APACHEII评分与A-LES变迁的比较
本实施例中，在得到德岛大学伦理委员会的批准后，以由于各种疾病而进入急救集中治疗室的29名患者为对象，将患者入室时和出室时(或死亡时)的APACHEII评分与A-LES值变迁的比较示于图5中。ATP量和乳酸量的测定通过与参考例1和参考例3相同的方法进行，并计算出A-LES值(图5)。
从重症、轻症到减轻的组：16名男性、8名女性患者中一大半患者的APACHEII评分随着A-LES值的降低而降低。另一方面，对于重症患者而言，在恶化而死亡的病例中，APACHEII评分保持高分不变，或者其中虽然观察到APACHEII评分降低的病例，但A-LES值随着病情的恶化而观察到上升倾向，从而良好地反映出重症化的程度。由以上结果表明，A-LES值不仅能够作为实时标志物反映病情，而且还能够对于APACHEII评分高的患者更详细地评价重症化的程度。
(实施例3)健康小鼠、流感病毒感染重症化小鼠来源的试样中的ATP量、乳酸量、A-LES值、酮体量(β-羟基丁酸值)、A-KES值(β-羟基丁酸值/ATP值)
本实施例中，作为在除人以外的脊椎动物(受试动物)来源的血液中ATP量、A-LES值也能够适合用于重症度评价的例子，示出了感染流感病毒后的重症化小鼠的实验体系中的ATP量、乳酸量、A-LES值和酮体量(3-羟基丁酸值)、A-KES值(3-羟基丁酸值/ATP值)。另外，由于测定所需的小鼠血液量的限制，仅测定了3-羟基丁酸值作为酮体量而未测定乙酰乙酸值。因此，A-KES值的测定通过3-羟基丁酸值/ATP值来评价。病毒感染试验中，使4周龄的野生型小鼠(C57BL/6)经鼻感染120PFU的流感病毒(Influenza A/PR/8/34，H1N1)。另一方面，对对照的健康小鼠经鼻施用生理盐水来代替病毒。在刚要出现死亡例之前的第7天对这些小鼠进行采血，测定ATP量、乳酸量、A-LES值、酮体量(3-羟基丁酸值)、A-KES值(β-羟基丁酸值/ATP值)(图6)。
与健康小鼠相比，在感染流感病毒而重症化的小鼠中确认到ATP量的降低和乳酸量的增加。由此，确认到A-LES值的显著上升。由以上结果表明，即使是来自人(受试者)以外的脊椎动物(受试动物)的试样，也能够进行重症度或治疗效果等的评价。另外，重症度的A-LES基准值因动物种类而异，因此，人的基准可以作为参考但并不直接等同。另外，与健康小鼠相比，在感染流感病毒而重症化的小鼠中确认到ATP量的降低和酮体(3-羟基丁酸值)量的增加。由此，确认到A-KES值(3-羟基丁酸值/ATP值)的显著上升。由该结果表明，利用A-KES值也能够进行重症度或治疗效果等的评价。另外，表示重症度的A-KES基准值因酮体量的种类(例如，仅3-羟基丁酸量或者乙酰乙酸量与3-羟基丁酸量的总量等)、动物种类而异。
如上所示，表明血液ATP量反映“生存所需的能量状态”，并且表明血液ATP量成为实时显示疾病重症度的新指标。进而，将作为现有能量代谢的中间代谢产物且在肌肉疲劳或组织氧利用障碍时增加的血液中的乳酸值除以血液ATP而得到A-LES值来进行再评价，由此，能够以灵敏的“能量风险评分”来表示，从而显示出疾病重症度。特别是A-LES值在与能量代谢相关的疾病例如感染症、糖尿病、线粒体脑肌病等代谢疾病、末梢循环障碍、CO中毒、能量代谢的酶缺乏症等疾病中以良好的灵敏度显示疾病重症度，在上述以外的疾病中也成为疾病重症度的实时风险标志物。另外，通过以血液中的酮体量与血液中的ATP量的比即A-KES值进行再评价，也能够判定疾病重症度。
产业上的可利用性
如以上详细说明所示，通过本发明的检查方法，能够基于试样中的ATP量、乳酸量、酮体量、其换算值(A-LES(乳酸/ATP)值；A-KES(酮体/ATP)值)，利用比现有的APACHEII、SOFA评分更客观且更简便的方法来实时地判断疾病重症度。该检查方法揭示了迄今为止没有的“测定疾病重症度的方法”。通过将本发明应用于临床检查，能够迅速掌握患者的疾病重症化的先兆而检验、评价治疗方针的优劣等，其益处不可估量。而且，通过使用A-LES值、A-KES值对某些疾病中的“高危患者”例如被认为是流感感染的高危患者的糖尿病患者、肥胖者、孕妇、人工透析患者、慢性疾病患者详细地进行分类，能够阐明重症化的机理并开发出治疗方法。
本发明也能够适合用于诊断人和家畜等动物的疾病重症度。

Claims (30)

1.三磷酸腺苷测定用试剂在制备用于疾病重症度的检查方法的试剂盒中的应用，所述疾病重症度的检查方法包括以下的步骤I～V：
1)用含有酚化合物的溶液处理由受试者获取的血液来提取血液中的三磷酸腺苷的步骤I；
2)使用三磷酸腺苷测定用试剂对提取出的三磷酸腺苷量进行测定的步骤II；
3)测定血液中的乳酸量的步骤III；
4)求出步骤III中测定的乳酸量相对于步骤II中测定的三磷酸腺苷量的换算值即乳酸量/三磷酸腺苷量的步骤IV；和
5)将步骤IV中求出的换算值作为疾病重症度指标的步骤V。
2.如权利要求1所述的应用，其中，含有酚化合物的溶液为pH4～10的溶液。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中，含有酚化合物的溶液为还含有蛋白变性剂的溶液。
4.如权利要求1或2所述的应用，其中，酚化合物为苯酚。
5.如权利要求3所述的应用，其中，酚化合物为苯酚。
6.如权利要求1或2所述的应用，其中，当血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即3.7时，判断受试者处于异常状态。
7.如权利要求3所述的应用，其中，当血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即3.7时，判断受试者处于异常状态。
8.如权利要求4所述的应用，其中，当血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即3.7时，判断受试者处于异常状态。
9.如权利要求6所述的应用，其中，
当血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即3.7且为8.0以下时，判断受试者处于轻度异常状态；当血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过8.0且为25.0以下时，判断受试者处于重度异常状态；当血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值为超过25.0的高值且持续6小时以上时，判断受试者处于致死的重度异常状态。
10.如权利要求7或8所述的应用，其中，
当血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即3.7且为8.0以下时，判断受试者处于轻度异常状态；当血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值超过8.0且为25.0以下时，判断受试者处于重度异常状态；当血液中的乳酸量相对于三磷酸腺苷量的换算值为超过25.0的高值且持续6小时以上时，判断受试者处于致死的重度异常状态。
11.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，进一步对血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和进行测定。
12.如权利要求3所述的应用，其特征在于，进一步对血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和进行测定。
13.如权利要求4所述的应用，其特征在于，进一步对血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和进行测定。
14.如权利要求5所述的应用，其特征在于，进一步对血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和进行测定。
15.如权利要求6所述的应用，其特征在于，进一步对血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和进行测定。
16.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，进一步对血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和进行测定。
17.如权利要求9所述的应用，其特征在于，进一步对血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和进行测定。
18.如权利要求10所述的应用，其特征在于，进一步对血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和进行测定。
19.如权利要求11所述的应用，其中，将血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值即乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和/三磷酸腺苷量作为疾病重症度指标。
20.如权利要求12～15中任一项所述的应用，其中，将血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值即乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和/三磷酸腺苷量作为疾病重症度指标。
21.如权利要求16所述的应用，其中，将血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值即乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和/三磷酸腺苷量作为疾病重症度指标。
22.如权利要求17或18所述的应用，其中，将血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值即乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和/三磷酸腺苷量作为疾病重症度指标。
23.如权利要求11所述的应用，其中，当血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即0.25时，判断受试者处于异常状态。
24.如权利要求12～15中任一项所述的应用，其中，当血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即0.25时，判断受试者处于异常状态。
25.如权利要求16所述的应用，其中，当血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即0.25时，判断受试者处于异常状态。
26.如权利要求17或18所述的应用，其中，当血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即0.25时，判断受试者处于异常状态。
27.如权利要求19所述的应用，其中，当血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即0.25时，判断受试者处于异常状态。
28.如权利要求20所述的应用，其中，当血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即0.25时，判断受试者处于异常状态。
29.如权利要求21所述的应用，其中，当血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即0.25时，判断受试者处于异常状态。
30.如权利要求22所述的应用，其中，当血液中的乙酰乙酸量和3-羟基丁酸量的总和相对于三磷酸腺苷量的换算值超过正常值的上限即0.25时，判断受试者处于异常状态。
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